CN108935912B - 一种具有dpp-ⅳ抑制和抗疲劳功能的鱼肉蛋白肽及其制备方法 - Google Patents
一种具有dpp-ⅳ抑制和抗疲劳功能的鱼肉蛋白肽及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及功能性食品加工领域，具体公开了一种具有DPP‑Ⅳ抑制和抗疲劳功能的鱼肉蛋白肽及其制备方法，所述制备方法包括：将鱼肉蛋白液先经过碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解，再经过风味蛋白酶的酶解，收集分子量小于2000道尔顿的蛋白肽液，再经过层析分离，即得鱼肉蛋白肽。本发明以鱼肉为原料，通过对鱼肉的超高压、高温、高频超声波等预处理，在不添加任何酸和碱条件下，利用多种蛋白复合酶进行分步酶解，通过膜分离、凝胶分离及反相HPLC分离技术，开发了具有DPP‑Ⅳ抑制和抗疲劳功能的鱼肉蛋白肽。
Description
技术领域
本发明涉及功能性食品加工领域，具体地说，涉及一种具有DPP-Ⅳ抑制和抗疲劳功能的鱼肉蛋白肽及其制备方法。
背景技术
降血糖功能因子是指能降低糖尿病患者血糖浓度以及改善其症状的生物活性成分。目前研究较多的天然产物类降糖因子、矿物质类降糖因子、维生素类降糖因子，其作用机理各不相同。天然产物类降糖因子按化学结构可分为黄酮类、活性多糖类、生物碱类、皂甙类、萜类、共轭亚油酸、多肽类等。自人工合成胰岛素以来，磺脲类药物、双胍类、胰岛素增敏剂、糖抑制剂等各种口服或注射的药物相继问世，然而化学药物常产生一定的毒副作用，天然降血糖成分具有作用温和而持久，性质稳定，几乎无毒性反应，还可多种降糖成分并存，综合起作用等优点，备受患者以及和医学界的青睐，也成为了降血糖功能因子的主要研究方向。
目前关于降血糖功能肽开发的专利申请和授权情况来看，主要有CN201410129977.3公开了一种利用蚕蛹制备降血糖肽的方法，CN201610134873.0公开了一种牡丹籽降血糖肽，CN201310290233.5公开了一种利用带鱼制备二肽基肽酶IV抑制肽的方法，CN201410498361.3公开了一种源于鹿蛋白的DPP-IV抑制肽GPGSPGGPL，其氨基酸序列为Gly-Pro-Gly-Ser-Pro-Gly-Gly-Pro-Leu。多肽GPGSPGGPL具有DPP-IV抑制活性及降血糖活性，CN201410455009.1公开了一种豆渣蛋白质的提取方法及其用于制备DPP-IV抑制肽的方法。然而，目前国内外均未见以Ala-Ala-Leu-Glu-Gln-Thr-Glu-Arg、Leu-Leu-Asp-Leu-Gly-Val-Pro肽为主体的DPP-IV抑制肽的文献报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明以鱼肉为原料，经过大量的实验，开发了一种具有较好DPP-Ⅳ抑制和抗疲劳功能的鱼肉蛋白肽及其制备方法。
第一方面，本发明首先提供一种具有DPP-Ⅳ抑制和抗疲劳功能的鱼肉蛋白肽的制备方法，包括：将鱼肉蛋白液先经过碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解，再经过风味蛋白酶的酶解，收集分子量小于2000道尔顿的蛋白肽液，再经过层析分离，即得所述鱼肉蛋白肽。
进一步地，所述碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量之和为鱼肉蛋白液中蛋白质量的0.3％-0.8％，所述碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为1-2:1:1；所述碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解条件为在50-60℃下进行酶解反应1.0-2.5h。
所述风味蛋白酶的质量为鱼肉蛋白液中蛋白质量的0.1％-0.2％，所述风味蛋白酶的酶解条件为在50-60℃下进行酶解反应0.25-0.5h。
更进一步地，经风味蛋白酶酶解后，将所得酶解液置于90-95℃下保温10-20分钟，冷却至室温，通过硅藻土进行分离，收集分离液；再对所述分离液进行超滤，收集分子量小于2000道尔顿的蛋白肽液。
作为优选，所述超滤为二步处理，先利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再利用孔径为2000道尔顿的陶瓷膜超滤，将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来。
进一步地，将所述分子量小于2000道尔顿的蛋白肽液经过层析分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼肉蛋白肽。
更进一步地，本发明所述鱼肉蛋白液以鱼肉为原料，经100-200Mpa超高压处理后，将鱼肉打浆，加入1.0-3.0倍水，匀浆、离心、去脂，再置于85-90℃下经90-120kH超声波处理20-30分钟而得。
作为一种优选方案，所述制备方法具体包括如下步骤：
(1)选用新鲜或冷冻鱼肉，用符合饮用水卫生标准的清洁水洗净后，先经过100-200Mpa处理1-2分钟，用打浆机将鱼肉打成浆，然后加入1.0-3.0倍鱼肉重量的水，通过8000-10000rpm分散均质机匀浆1-3min，得到鱼肉浆液，通过6000g离心10-15min，去上层脂肪，得到去脂的鱼肉蛋白液；
(2)将步骤(1)得到的鱼肉蛋白液，在85-90℃下，经90-120kH超声波处理20-30分钟，改变鱼肉蛋白的组织结构；
(3)调节鱼肉蛋白液中蛋白含量为9-11％，第一步利用0.3-0.8％复合蛋白酶，在50-60℃条件下进行酶解反应1.0-2.5h；第二步利用0.1-0.2％风味蛋白酶，在50-60℃条件下进行酶解反应0.25-0.5h；之后在90-95℃下保温10-20分钟使酶失去活性，冷却至室温，通过硅藻土进行过滤分离，收集分离液；
其中，所述复合蛋白酶由碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按照质量比1-2:1:1组成；
(4)将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来。
(5)取分子量为小于2000道尔顿的蛋白肽液，经过SephadexG-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5-90％乙腈溶液作为洗脱液，取19-20分收集的肽溶液；
(6)将步骤(5)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼肉蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对鱼肉蛋白肽粉的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Ala-Ala-Leu-Glu-Gln-Thr-Glu-Arg、Leu-Leu-Asp-Leu-Gly-Val-Pro的肽的含量为50-59％。
在本发明的具体实施方式中，选用鲢鱼作为一种示例性说明。
需要说明的是，由本发明所述方法制备得到的鱼肉蛋白肽也属于本发明的保护范围。
利用本发明所制备的鱼肉蛋白肽制备药物或功能性食品的应用也属于本发明的保护范围。
其中，所述药物或功能性食品的功能依赖于本发明所述鱼肉蛋白肽的DPP-IV抑制和抗疲劳功能。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明以鱼肉为原料，通过对鱼肉超高压、高温、高频超声波等预处理，在不添加任何酸和碱条件下，利用多种蛋白复合酶进行分步酶解，通过膜分离、凝胶分离及反相HPLC分离技术，开发了具有特定氨基酸多肽序列(Ala-Ala-Leu-Glu-Gln-Thr-Glu-Arg、Leu-Leu-Asp-Leu-Gly-Val-Pro)的具有DPP-Ⅳ抑制和抗疲劳功能的鱼肉蛋白肽，建立一套简单高效的多功能鱼肉蛋白肽的制备方法。
更为具体地，本发明具有的优点如下:(1)本发明开发的鱼肉蛋白肽整个加工过程中没有添加酸或碱进行pH的调整，产品保持较好的功能特性，产品灰分含量低，小于1％。(2)开发的蛋白肽具有较好的DPP-Ⅳ抑制功能(IC50值)小于0.25mg/mL和抗疲劳功能。(3)本发明利用超高压结合特定频率超声波技术处理的鱼肉蛋白液，可以明显改善鱼肉蛋白对酶的敏感性，降低酶的使用量。(4)开发的产品安全，本发明采用多种食品级复合蛋白酶(碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶)，经在温和条件下，经过适度酶解获得特定分子量和肽组成的鱼肉蛋白肽，不加任何添加剂，为100％鱼肉蛋白肽。(5)本发明开发的蛋白肽，通过硅藻土过滤具有良好的风味和色泽，能广泛应用于特需食品和营养食品。(6)本发明开发鱼肉蛋白肽中分子量小于1000的肽的比例为90％以上，具有较明确的肽的组成，其中Ala-Ala-Leu-Glu-Gln-Thr-Glu-Arg、Leu-Leu-Asp-Leu-Gly-Val-Pro的肽的含量为50％以上。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1具有DPP-Ⅳ抑制和抗疲劳功能的鱼肉蛋白肽的制备方法
(1)选用新鲜鱼肉100克，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,鱼肉先经过超高压(100Mpa)处理2分钟，用打浆机将鱼肉打成浆，然后加入1.0倍鱼肉重量的水，通过8000rpm分散均质机匀浆3min，得到鱼肉浆液。通过6000g离心10min，去上层脂肪，得到去脂的鱼肉蛋白液。
(2)将步骤(1)得到的鱼肉蛋白液，温度调整到85℃，利用超声波发生器经超声波(频率为100kH)处理30分钟，改变鱼肉蛋白的组织结构。
(3)调节鱼肉蛋白液中蛋白含量为11％，第一步利用0.8％复合蛋白酶(由碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，它们之间的质量比为1:1:1)，在50℃条件下进行酶解反应1.5h；然后进行第二步利用0.2％风味蛋白酶，在55℃条件下进行酶解反应0.5h；在95℃下保温10分钟，冷却至室温，通过硅藻土进行过滤分离，收集分离液。
(4)将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来。
(5)取分子量为小于2000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5-90％乙腈溶液作为洗脱液，取19-20分收集的肽溶液。
(6)将步骤(5)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼肉蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对鱼肉蛋白肽粉的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Ala-Ala-Leu-Glu-Gln-Thr-Glu-Arg、Leu-Leu-Asp-Leu-Gly-Val-Pro的肽的含量为55％。
实施例2具有DPP-Ⅳ抑制和抗疲劳功能的鱼肉蛋白肽的制备方法
(1)选用冷冻鲢鱼肉500克，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,鱼肉先经过超高压(200Mpa)处理1分钟，用打浆机将鱼肉打成浆，然后加入2.0倍鱼肉重量的水，通过10000rpm分散均质机匀浆1min，得到鱼肉浆液。通过6000g离心10min，去上层脂肪，得到去脂的鱼肉蛋白液。
(2)将步骤(1)得到的鱼肉蛋白液，温度调整到90℃，利用超声波发生器经超声波(频率为120kH)处理20分钟，改变鱼肉蛋白的组织结构。
(3)调节鱼肉蛋白液中蛋白含量为9％，第一步利用0.5％复合蛋白酶(由碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，它们之间的质量比为2:1:1)，在55℃条件下进行酶解反应2.5h；然后进行第二步利用0.1％风味蛋白酶，在50℃条件下进行酶解反应0.25h；在90℃下保温20分钟，冷却至室温，通过硅藻土进行过滤分离，收集分离液。
(4)将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来。
(5)取分子量为小于2000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5-90％乙腈溶液作为洗脱液，取19-20分收集的肽溶液。
(6)将步骤(5)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼肉蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对鱼肉蛋白肽粉的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Ala-Ala-Leu-Glu-Gln-Thr-Glu-Arg、Leu-Leu-Asp-Leu-Gly-Val-Pro的肽的含量为56％。
实施例3具有DPP-Ⅳ抑制和抗疲劳功能的鱼肉蛋白肽的制备方法
(1)选用冷冻鲢鱼肉1000克，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,鱼肉先经过超高压(150Mpa)处理1分钟，用打浆机将鱼肉打成浆，然后加入3.0倍鱼肉重量的水，通过9000rpm分散均质机匀浆2min，得到鱼肉浆液。通过6000g离心10min，去上层脂肪，得到去脂的鱼肉蛋白液。
(2)将步骤(1)得到的鱼肉蛋白液，温度调整到90℃，利用超声波发生器经超声波(频率为110kH)处理25分钟，改变鱼肉蛋白的组织结构。
(3)调节鱼肉蛋白液中蛋白含量为10％，第一步利用0.6％复合蛋白酶(由碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，它们之间的质量比为2:1:1)，在55℃条件下进行酶解反应2.0h；然后进行第二步利用0.2％风味蛋白酶，在60℃条件下进行酶解反应0.5h；在95℃下保温15分钟，冷却至室温，通过硅藻土进行过滤分离，收集分离液。
(4)将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来。
(5)取分子量为小于2000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5-90％乙腈溶液作为洗脱液，取19-20分收集的肽溶液。
(6)将步骤(5)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼肉蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对鱼肉蛋白肽粉的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Ala-Ala-Leu-Glu-Gln-Thr-Glu-Arg、Leu-Leu-Asp-Leu-Gly-Val-Pro的肽的含量为57％。
对比例1具有降血糖功能的鱼肉蛋白肽
1、选用鲢鱼肉500克，用打浆机将鱼肉打成浆；然后在打好的鱼肉浆中加入1.8倍鱼肉重量的水，温度调节到90℃，搅拌10分钟。
2、将步骤1鱼肉浆的温度调节到80℃，然后按照菠萝蛋白酶与鱼肉质量比为1：200加入菠萝蛋白酶2.5克，酶解1.0小时，然后将温度冷却至45℃，按照风味蛋白酶与鱼肉质量比为1：400加入风味蛋白酶1.25克，酶解1.5小时，在6000g条件下离心5min，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，取分子量小于5000道尔顿的蛋白肽液。通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼肉蛋白肽粉。
实验例1鱼肉蛋白肽DPP-Ⅳ抑制能力的测定试验
试验样品：样品1、2、3分别为实施例1、实施例2、实施例3制备的鱼肉蛋白肽粉；样品4为对比例1制备的鱼肉蛋白肽粉；样品Ala-Ala-Leu-Glu-Gln-Thr-Glu-Arg和样品Leu-Leu-Asp-Leu-Gly-Val-Pro为按照氨基酸序列Ala-Ala-Leu-Glu-Gln-Thr-Glu-Arg和Leu-Leu-Asp-Leu-Gly-Val-Pro通过人工合成的蛋白肽。
按照如下方法进行：
将样品用100mmol/L的Tris-HCL(pH8.0)缓冲液稀释至合适的浓度，吸取25μL样品稀释液与25μL底物(浓度为1.6mmol/L)混合，加入到96孔酶标板中。在37℃下孵育10min后，加入50μL DPP-IV酶液(酶活力为8U/L)，混匀后在37℃下精确孵育60min，立即加入100μL1mol/L的醋酸-醋酸钠(pH 4.0)缓冲液终止反应，于405nm下测吸光值A，并根据下列公式计算样品的DPP-IV抑制率。
DPP-IV抑制率％＝{1-(A样品-A样品空白对照)/(A阴性对照-A阴性空白对照)}×100
A样品：为样品反应液在405nm处的吸光值A；
A样品空白对照：以Tris-HCL缓冲液代替DPP-IV酶液作为样品空白对照的吸光值A；
A阴性对照：以Tris-HCL缓冲液代替样品作为阴性对照的吸光值；
A阴性空白对照：以Tris-HCL缓冲液代替DPP-IV酶液和样品作为阴性空白对照的吸光值
DPP-IV抑制的IC50值测定：
测定样品在不同浓度下的DPP-IV抑制率，以多肽浓度的对数值与抑制率做回归曲线，得到回归方程，由此计算IC50，即50％的DPP-IV酶活性抑制是肽的浓度。
从表1可以看出，本发明的产品具有非常好的DPP-IV抑制活性(IC50小于0.25mg/mL)。
表1本发明鱼肉蛋白肽的DPP-IV抑制试验结果
实验例2本发明鱼肉蛋白肽延缓疲劳功能的测定试验
试验样品：样品1、2、3分别为实施例1、实施例2、实施例3制备的鱼肉蛋白肽，样品4为对比例1制备的鱼肉蛋白肽粉，样品5为实施例1步骤(1)所得的鱼肉蛋白液直接经过冷冻干燥得到的鱼肉蛋白粉。
按照如下方法进行：
1.1实验动物饲养与分组
240只清洁级昆明种小鼠，于洁净动物实验室适应性饲养一周，每8-10只一笼，分笼饲养，保持垫料干燥卫生，每三天换洗一次。每天按时打扫，做好消毒灭菌等工作，保证洁净动物实验室干净整洁。室温25±2℃，相对湿度50±5％，光照明暗间隔为12h，以鼠标准饲料常规饲养，自由进食和饮水，每周记录一次小鼠体重。经过一周的适应期后，200只小鼠随机分为6组，即空白组、样品1组、样品2组、样品3组、样品4组、样品5组。空白组小鼠灌胃等量的生理盐水，其它5组的剂量设为140mg/kg/d，每天上午9:00-10:30期间灌胃，灌胃30天后，检测受试样品的抗疲劳功效。
1.1.1负重游泳实验
末次给样30min后，从各组中随机取10只小鼠，将其尾根部缠绕5％体重的铅皮后，放置于游泳箱中游泳。水深不少于30cm，水温25±1℃，记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，即小鼠负重游泳时间。
1.1.2肝糖原、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定
末次给样30min后，从各组中随机取10只小鼠拔眼球采全血，将收集到的血液于3000r/min离心10min，取血清备用，按照CAT、SOD和GSH-Px测试盒进行测定。采血完成后，立即解剖小鼠，取肝脏经生理盐水漂洗后用滤纸吸干，精确称取肝脏100mg，按照肝糖原检测试剂盒说明进行测定。
1.1.3全血乳酸测定
各组中随机取10只小鼠，末次给样30min后采血，然后在温度为30℃的水中不负重游泳10min后停止，用毛细管从眼内毗采血，分别测定游泳前、游泳10min后、游泳后休息20min的全血乳酸含量。
表2本发明鱼肉蛋白肽对小鼠抗疲劳能力的影响
从表2可以看出，鱼肉蛋白肽可以延长小鼠的游泳时间，可以改善小鼠能量代谢体系，促进肝糖原的合成，从而贮存更多的能源物质，提升CAT、SOD及GSH-Px酶的活力,延缓体力疲劳；对短时间运动后乳酸水平的升高有明显的抑制作用，可以在一定程度上帮助机体延缓乳酸的堆积；休息20min后，乳酸含量均有显著地下降，可以帮助机体加速清除乳酸的堆积。本发明开发的产品样品1、样品2、样品3显著优于样品4和样品5。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (3)
1.一种具有DPP-Ⅳ抑制和抗疲劳功能的鱼肉蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
(1)将新鲜或冷冻鲢鱼鱼肉洗净后，经过100-200Mpa处理1-2分钟，用打浆机将鱼肉打成浆，然后加入1.0-3.0倍鱼肉重量的水，通过8000-10000rpm分散均质机匀浆1-3min，得到鱼肉浆液，通过6000g离心10-15min，去上层脂肪，得到去脂的鱼肉蛋白液；
(2)将步骤(1)得到的鱼肉蛋白液，在85-90℃下，经90-120kH超声波处理20-30分钟；
(3)调节鱼肉蛋白液中蛋白含量为9-11％，第一步利用0.3-0.8％复合蛋白酶，在50-60℃条件下进行酶解反应1.0-2.5h；第二步利用0.1-0.2％风味蛋白酶，在50-60℃条件下进行酶解反应0.25-0.5h；之后在90-95℃下保温10-20分钟，冷却至室温，通过硅藻土进行过滤分离，收集分离液；
其中，所述复合蛋白酶由碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按照质量比1-2:1:1组成；
(4)将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为5000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来；
(5)取分子量为小于2000道尔顿的蛋白肽液，经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以5-90％乙腈溶液作为洗脱液，取19-20分收集的肽溶液；通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼肉蛋白肽粉。
2.由权利要求1所述的制备方法制备得到的鱼肉蛋白肽。
3.权利要求2所述的鱼肉蛋白肽在制备药物或功能性食品中的应用。
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