CN108913732B

CN108913732B - 一种莫纳可林j异源生产的方法及应用

Info

Publication number: CN108913732B
Application number: CN201810857983.9A
Authority: CN
Inventors: 蔡孟浩; 刘一奇; 张元兴
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2018-07-31
Filing date: 2018-07-31
Publication date: 2022-02-08
Anticipated expiration: 2038-07-31
Also published as: CN108913732A

Abstract

本发明涉及一种异源生产莫纳可林J的毕赤酵母工程菌的改造及应用。本发明中，通过基因重组技术对酵母工程菌株进行优化改造，获得可生产莫纳可林J或其中间产物二氢莫纳可林L的酵母工程菌。所述酵母工程菌的目的产物产量显著增加，为工业生产莫纳可林J及其下游产物提供了新的途径。

Description

一种莫纳可林J异源生产的方法及应用

技术领域

本发明属于生物工程领域；更具体的，本发明涉及一种异源生产莫纳可林J的毕赤酵母工程菌的改造及应用。

背景技术

辛伐他汀是人工半合成药物，因其对人体内胆固醇生物合成有明显抑制作用而被作为降血脂药物广泛使用。目前，工业生产辛伐他汀主要源于前体莫纳可林J的生物法或化学法转化，而莫纳可林J的工业获得源于土曲霉发酵产物洛伐他汀的水解。在该辛伐他汀生产过程中，莫纳可林J可以经酶催化一步转化为辛伐他汀，而水解洛伐他汀得到莫纳可林J的过程为全化学法水解，步骤较复杂、副产物多且需要引入催化剂。使用微生物底盘细胞进行一步法异源合成莫纳可林J，能够替代化学水解法，避免以上问题，为莫纳可林J及辛伐他汀的工业生产提供新的方法。

毕赤酵母(Pichia pastoris)是优良的微生物底盘细胞，因其能够表达广泛的重组蛋白而受到广泛关注，作为一个公认安全的微生物已经被用来成功表达了超过1000多个重组蛋白。毕赤酵母能够在成分确定的培养基中快速生长到高密度，具有进行复杂蛋白翻译后修饰功能以指导蛋白正确折叠。除此之外，毕赤酵母是天然的甲基营养性微生物，它能够在甲醇为唯一碳源的条件下生长到高密度、甲醇代谢能力强。甲醇是煤化工行业的副产物，可由天然气合成，也可以通过空气中的二氧化碳进行还原而得到，而甲醇相比常用的发酵型糖类，其还原力更强，能够为异源产物的合成提供更多的驱动力。甲醇这种大体量、低价格、可再生的特点促使其逐步发展成为生物化学衍生产品的良好原料。同时毕赤酵母已有成熟配套的异源表达载体，针对毕赤酵母的转化、筛选以及规模放大的研究已经开展多年，毕赤酵母可以作为一个良好的底盘细胞用来合成生产高附加值生物制品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以乙醇为底物的通过重组酵母工程菌混合共培养，以异源合成莫纳可林J的方法。

在本发明的第一方面，提供一种二氢莫纳可林L的异源生产方法，包括：(1)提供酵母工程菌，使其表达外源的下组基因的表达盒：lovB，lovC，lovG，npgA，并以乙醇诱导型启动子驱动表达转录激活因子uta；(2)以乙醇作为碳源、前体和/或诱导剂，培养(1)的酵母工程菌，从而生成产物二氢莫纳可林L。

在本发明的另一方面，提供一种莫纳可林J的异源生产方法，包括：(a)提供酵母工程菌，使其表达外源的下组基因的表达盒：lovB，lovC，lovG，npgA，并以乙醇诱导型启动子驱动表达转录激活因子uta；(b)提供酵母工程菌，使其表达外源的下组基因的表达盒：lovA，cpr，并以乙醇诱导型启动子驱动表达转录激活因子uta；(c)以乙醇作为碳源、前体和/或诱导剂，培养(a)和(b)的酵母工程菌的混合菌，从而生成产物莫纳可林J。

在一个优选例中，(1)或(a)中，所述的酵母工程菌还表达外源的乙醇脱氢酶ADH、乙酰辅酶A合成酶ACS和乙酰辅酶A脱羧酶ACC。

在另一优选例中，(1)或(a)中，以P_AOX1R作为驱动lovB，lovC，lovG，npgA表达的启动子；或

(b)中，以P_AOX1R作为驱动lovA，cpr表达的启动子；或

(1)或(a)或(b)中，以P_ICL1为乙醇诱导型启动子。

在另一优选例中，(c)中，(a)和(b)的酵母工程菌的混合菌中，(a)菌:(b)菌的比例为1:0.1～1；优选地为1:0.2～0.5(菌群中两种酵母细胞的数量之比)；或，步骤(2)或(c)中，以添加乙醇(添加0.2～1％；较佳地0.3～0.8％；更佳地0.4～0.6％)的酵母基础氮源培养基进行培养，在发酵前期使用葡萄糖作为碳源进行补料；在菌体湿重达到200～400g/L(较佳地250～350g/L；更佳地280～320g/L)后，之后切换碳源至乙醇补料。

在另一优选例中，所述的基因lovB，lovC，lovG，npgA，lovA，cpr来源于土曲霉。

在另一优选例中，所述的lovB基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:1序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上，如98％～99％)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的lovC基因具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:2序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上，如98％～99％)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的lovG基因具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:3序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上，如98％～99％)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的npgA基因具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:4序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上，如98％～99％)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的lovA基因具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:5序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上，如98％～99％)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的cpr基因具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:6序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上，如98％～99％)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的uta基因具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:6序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上，如98％～99％)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的乙醇脱氢酶ADH的编码基因具有SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:20序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上，如98％～99％)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的乙酰辅酶A合成酶ACS的编码基因具有SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:21序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上，如98％～99％)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的乙酰辅酶A脱羧酶ACC的编码基因具有SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQ ID NO:22序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上，如98％～99％)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，启动子P_AOX1R的基因序列具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，启动子P_ICL1的基因序列具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供一种用于生产二氢莫纳可林L的酵母工程菌，所述酵母工程菌中包含外源的下组基因的表达盒：lovB，lovC，lovG，npgA，以及转录激活因子uta；较佳地，其还包含外源的乙醇脱氢酶ADH、乙酰辅酶A合成酶ACS和乙酰辅酶A脱羧酶ACC的编码基因。

在本发明的另一方面，提供一种用于生产莫纳可林J的酵母工程菌，所述酵母工程菌中包含外源的下组基因的表达盒：lovA，cpr，以及转录激活因子uta。

在一个优选例中，所述的酵母工程菌是甲醇营养型酵母；较佳地，所述的甲醇营养型酵母包括毕赤酵母。

在另一优选例中，所述的毕赤酵母是毕赤酵母GS115。

在另一优选例中，所述的酵母工程菌用于以乙醇作为碳源、前体和/或诱导剂，生产二氢莫纳可林L或莫纳可林J。

在本发明的另一方面，提供一种用于生产莫纳可林J或其中间体的试剂盒，所述的试剂盒中包含所述的酵母工程菌。

在本发明的另一方面，提供一种用于生产莫纳可林J或其中间体的试剂盒，所述试剂盒中包含一构建物，其包括下组基因的表达盒：lovB，lovC，lovG，npgA、转录激活因子uta，和/或，另一构建物，其包括下组基因的表达盒：lovA，cpr、转录激活因子uta。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括含有乙醇作为碳源、前体和/或诱导剂的培养基。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、人工转录系统P_ICL1-UTA_P_AOX1R以及对照在乙醇或甲醇条件下的GFP表达强度。

图2、毕赤酵母工程菌株发酵生产二氢莫纳可林L的示意图；其中，DML，二氢莫纳可林L；WT，毕赤酵母野生型菌株。

图3、双菌株混合培养生产莫纳可林J的示意图；其中，MJ，莫纳可林J；WT，毕赤酵母野生型。

图4、双菌株不同初始接种比例混合培养生产莫纳可林J的发酵产量图；其中，MJ，莫纳可林J。

图5、双菌株最优初始接种比例混合培养生产莫纳可林J的5L反应器发酵曲线图；其中，MJ，莫纳可林J。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，通过基因重组技术对酵母工程菌株进行优化改造，获得可生产莫纳可林J或其中间产物二氢莫纳可林L的酵母工程菌。所述酵母工程菌的目的产物产量显著增加，为工业生产莫纳可林J及其下游产物提供了新的途径。

术语

如本文所用，所述的“表达盒”或“基因表达盒”是指包含有表达目的多肽所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等；这些元件是操作性相连的。

如本文所用，所述的“表达构建物”是指重组DNA分子，它包含预期的核酸编码序列，其可以包含一个或多个基因表达盒。所述的“构建物”通常被包含在表达载体中。

如本文所用，所述的“外源”或“异源”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系，或者来自不同来源的蛋白(或核酸)与宿主细胞之间的关系。例如，如果核酸与宿主细胞的组合通常不是天然存在的，则核酸对于该宿主细胞来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

基因及其表达系统

本发明中，通过在酵母工程菌中转化入多基因组合来实现莫纳可林J或其中间体二氢莫纳可林L在酵母工程菌中的高效生产。对于生产二氢莫纳可林L所用的基因包括：lovB，lovC，lovG，npgA；对于生产莫纳可林J所用的基因包括：lovB，lovC，lovG，npgA，lovA，cpr。在本发明的优选实施方式中，来自土曲霉的lovB，lovC，lovG，npgA，lovA，cpr基因分别具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

为了优化莫纳可林J或其中间体二氢莫纳可林L的产量，本发明人进行了针对工程菌以及发酵培养基的进一步的优化，实现以乙醇为底物高产二氢莫纳可林L或莫纳可林J。在本发明的优选方式中，使用乙醇诱导型启动子(优选地为P_ICL1)来驱动转录激活因子UTA表达，同时驱动莫纳可林J合成相关基因的表达。由于UTA具有招募RNA聚合酶活性，同时能够与莫纳可林J合成相关基因的启动子(如P_AOX1R)结合，因此乙醇诱导型启动子(优选地为P_ICL1)的乙醇诱导信号将通过该人工转录装置放大，进而达到增强莫纳可林J合成相关基因表达的目的。在本发明的优选实施方式中，启动子P_ICL1的核苷酸序列见SEQ ID NO:9，转录激活因子uta的核苷酸序列见SEQ ID NO:7，启动子P_AOX1R的核苷酸序列见SEQ ID NO:8。

在本发明的优选方式中，为进一步提升乙醇转化为乙酰辅酶A及丙二酰辅酶A的代谢通量，本发明人过表达了乙醇脱氢酶ADH、乙酰辅酶A合成酶ACS和乙酰辅酶A脱羧酶ACC，进一步提升二氢莫纳可林L的产量。

上述的基因可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自动植物或微生物。此外，所述的基因也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来获得所述的基因，或者通过人工合成的方法来获得所述的基因。在本发明的优选实施方式中，adh具有SEQID NO:20所示的核苷酸序列，acs具有SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列，acc具有SEQ IDNO:22所示的核苷酸序列。

上述提及的基因的核苷酸序列可以与SEQ ID NO:1～9、20～22所示的列相同，也可以是它们的简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有同功能的蛋白质，但与选自SEQ ID NO:1～9、20～22所示的序列有差别的核酸序列。

所述的基因可以包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

本发明还涉及所述的基因的变异体，其编码的多肽与其相应的野生型多肽在氨基酸序列上不同，是野生型多肽的片段、类似物或衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少70％，较佳地至少80％相同性的多核苷酸，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与相应的野生型多肽有相同的生物学功能和活性。

应理解，虽然本发明的多个基因优选获自特定的物种，但是获自其它物种的他们的同源基因(如具有80％以上，如90％、95％、甚至98％、99％序列相同性)也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明的各基因的全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，扩增而得有关序列。当序列较长时，可以进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体经基因工程产生的宿主细胞。

本发明中，各基因的序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

各基因的序列可以分别插入到重组表达载体中，多个重组表达载体共转宿主细胞；多个基因的表达盒也可以以串联的方式插入到同一重组表达载体中，转入宿主细胞。所述的重组表达载体还可包含与所述基因的序列操作性相连的表达调控序列，以便于蛋白的表达。应理解，在本领域人员了解了本发明的技术内容后，可以方便地构建重组表达载体。获得的重组表达载体也包含在本发明中。

表达调控序列或表达盒中，根据不同的需要，可以应用诱导型或组成型的启动子，诱导型的启动子可实现更可控的蛋白表达以及化合物生产，有利于工业化应用。

包含上述的适当基因序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。本发明中，所述的宿主细胞优选的是酵母工程菌，更优选的是甲醇营养型酵母细胞，如毕赤酵母。

合成方法

本发明提出了一种以乙醇为碳源、前体、诱导剂的莫纳可林J异源生产方法，通过检测毕赤酵母在乙醇中的生长以及确定乙醇代谢通路流向，验证了毕赤酵母以乙醇为底物能够供应足量前体乙酰辅酶A。经人工改造甲醇营养型酵母细胞内的转录调控遗传线路，提高乙醇诱导启动子的转录强度，增强异源途径酶的表达。本发明的酵母表达系统以及发酵方法，使得莫纳可林J在毕赤酵母中的异源合成量达到2.2g/L。

为进一步提升莫纳可林J在毕赤酵母中的生产量，本发明通过以乙醇为底物提升毕赤酵母中的胞质乙酰辅酶A代谢通量，同时通过人工设计构建乙醇诱导的转录装置，提升异源酶基因的转录表达。在保证前体充足与酶高效表达的前提下，促进产物莫纳可林J合成。

二氢莫纳可林L经酶LovA的催化氧化合成莫纳可林J，为了避免在单细胞中引入过多外源基因导致代谢压力，本发明人提出了构建双菌株共培养的策略。本发明人还发现，在共培养体系中，两个菌株的初始混合比例会一定程度上影响菌株的生长和产物的合成，因此本发明人对初始接种比例进行了优化，得到较优的初始接种比例。

乙酰辅酶A是细胞基础代谢的核心中间代谢产物，它是由一个乙酸分子和辅酶A通过硫酯键连接而成，能够为细胞内各种生化反应提供酰基基团，是蛋白酰基化的底物，参与酶转录与功能调控。同时，乙酰辅酶A还是一系列生物活性物质的前体分子，包括脂肪酸、萜类化合物、聚酮类化合物等。随着运用微生物工厂概念合成目标化合物研究的深入，人们对于微生物宿主中的前体供应问题也愈加重视，通过针对乙酰辅酶A代谢网络进行理性改造，促使碳源代谢产生的物质能量流更多的流向乙酰辅酶A，而作为目标化合物的底物提升终产物合成。乙醇是可用于提高乙酰辅酶A供应的前体，通过补加乙醇能够提升乙酰辅酶A衍生物的合成。

在单个宿主细胞中进行异源途径构建和代谢工程改造往往会对宿主细胞的生长、代谢带来负担，引起终产物合成量的下降。本发明中，通过理性设计多细胞共培养菌群体系，将复杂的生物合成途径分配到独立的微生物细胞、调节各细胞接种比例能够在菌群共培养体系中优化异源途径、缓解代谢压力，促进产物合成。合成生物学元件与传统的分子操作技术的结合使用，能够人工设计构建启动子转录调控网络，增强启动子的转录强度，继而提高异源蛋白的表达。

在本发明的具体实施例中，首先构建了以乙醇为底物合成二氢莫纳可林L的重组毕赤酵母菌株。使用人工设计的启动子P_AOX1R来驱动基因lovB,lovC,lovG,npgA表达，使用启动子P_ICL1驱动转录激活因子UTA表达，以乙醇为底物经培养发酵能够生产二氢莫纳可林L。为进一步提升乙醇转化为乙酰辅酶A及丙二酰辅酶A的代谢通量，本发明过表达了乙醇脱氢酶ADH、乙酰辅酶A合成酶ACS和乙酰辅酶A脱羧酶ACC，进一步提升二氢莫纳可林L的合成，得到二氢莫纳可林L的高产菌株P.p/DML。重组菌P.p/DML经发酵可以生产二氢莫纳可林L，二氢莫纳可林L进入重组菌P.p/sAR经催化氧化合成莫纳可林J。其中重组菌株中，包括了组成型启动子P_GAP驱动转录激活因子UTA表达的表达盒，以及人工合成启动子P_AOX1R驱动lovA和cpr表达的表达盒。

在本发明的具体实施例中，经摇瓶水平培养得到的较优发酵策略，放大到5L反应器中进行工艺放大小试，对莫纳可林J的规模生产能力进行评价。分别培养共培养菌株P.p/DML和P.p/sAR至对数生长期，按照摇瓶的最优初始接种比例进行混合接种。在发酵前期，使用葡萄糖为碳源维持菌株快速生长，同时抑制启动子P_ICL1启动，阻遏异源途径表达。在菌体湿重生长至300g/L时，切换碳源到乙醇，开启异源途径表达，间隔8h取样进行菌体湿重和莫纳可林J产量测定，最终在96h得到莫纳可林J产量2.2g/L。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料

LLB培养基为：1％(w/v)蛋白胨、0.5％(w/v)酵母粉、0.5％(w/v)氯化钠。

YPD培养基为：2％(w/v)蛋白胨、1％(w/v)酵母粉、2％(w/v)葡萄糖。

MGY培养基为：0.67％(w/v)Yeast nitrogen base(YNB，酵母基础氮源培养基)、1％(w/v)甘油。

毕赤酵母生产菌株的乙醇发酵，使用YNE培养基为：1.34％(w/v)酵母基础氮源培养基(YNB)、0.5％(v/v)乙醇，每24h添加一次乙醇。

固体、液体培养基均于121℃、高压灭菌20min，50％(w/v)葡萄糖单独配成溶液，使用0.22μm孔径无菌滤膜过滤除菌，使用时依照最终使用浓度在超净台加入对应体积的葡萄糖母液。

抗生素使用量：氨苄青霉素，50μg/ml；博来霉素，大肠杆菌培养使用50μg/ml；毕赤酵母培养使用100μg/ml；遗传霉素，250μg/ml。

蛋白胨、酵母粉和麦芽提取物购自北京拜尔迪生物技术有限公司。

基础氮源培养基YNB购自Sigma公司。

葡萄糖、甘油、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氨水、磷酸二氢钾、磷酸一氢钾、磷酸和氯化钠等购自国药集团化学试剂有限公司。

DNA纯化回收试剂盒、质粒小提试剂盒和酵母基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

PCR引物、基因全合成和质粒测序等由苏州金唯智生物科技有限公司完成，PCR高保真酶和限制性内切酶均购自TaKaRa。

单片段无缝克隆试剂盒及多片段无缝组装试剂盒均购自南京诺唯赞公司。

实施例1、莫纳可林J生物合成基因异源表达质粒的构建

1.pZ_UTA_P_AOX1R-BCGN质粒的构建

以毕赤酵母商业化质粒pPIC ZB(Invitrogen)为起始，依照启动子P_AOX1R的序列全合成启动子片段，使用BglⅡ和XhoⅠ酶切质粒pPIC ZB，经琼脂糖电泳去除原始的AOX1启动子片段，将启动子P_AOX1R片段与酶切后的质粒片段进行无缝克隆，经单克隆筛选和测序验证，即可得到质粒pZ_P_AOX1R。

依照UTA核苷酸序列全合成uta片段，同时设计引物以毕赤酵母基因组为模版扩增可以得到启动子P_ICL1片段，通过OverlapPCR技术将uta片段与P_ICL1片段进行体外连接，将连接后的P_ICL1-UTA片段与酶切后的pPIC ZB片段进行无缝克隆，可以得到质粒pZ_P_ICL1-UTA。

PCR扩增lovB(SEQ ID NO:1)、lovC(SEQ ID NO:2)、lovG(SEQ ID NO:3)和npgA(SEQ ID NO:4)的基因片段，将各基因片段分别与线性化质粒pZ_P_AOX1R进行无缝克隆，分别获得质粒pZ_P_AOX1R-LovB、pZ_P_AOX1R-LovC、pZ_P_AOX1R-LovG和pZ_P_AOX1R-NpgA。

使用内切酶BamHI单酶切质粒pZ_P_AOX1R-LovB，设计引物对TT～lacOcAOX-F(SEQ IDNO:10)和BamH～TT-R(SEQ ID NO:11)，以质粒pZ_P_AOX1R-LovC为模板，经PCR扩增可得表达盒片段，将该片段与线性化质粒pZ_P_AOX1R-LovB进行无缝克隆，经菌落PCR验证可以获得质粒pZ_P_AOX1R-BC。继续使用同样的方法，可以在此质粒的基础上继续插入lovG和npgA的表达盒片段，得到质粒pZ_P_AOX1R-BCGN。

在质粒pZ_P_ICL1-UTA质粒的基础上，使用引物对TT～pICL1-F(SEQ ID NO:12)和BamH～TT-R(SEQ ID NO:11)，经PCR扩增可以得到P_ICL1驱动表达UTA的表达盒片段。将线性化的质粒pZ_P_AOX1R-BCGN与表达盒片段进行无缝克隆转化大肠杆菌，可得到表达质粒pZ_UTA_P_AOX1R-BCGN。

2.pK_UTA_P_AOX1R-sAR质粒的构建

使用XhoI和SalI双酶切质粒pZ_P_AOX1R；以引物PCR扩增得到lovA(SEQ ID NO:5)和cpr的基因片段(SEQ ID NO:6)，将各个基因片段分别与线性化质粒pZ_P_AOX1R进行无缝克隆，获得质粒pZ_P_AOX1R-LovA、pZ_P_AOX1R-CPR。

设计引物对TT～KanaHis-F(SEQ ID NO:13)和Amp～KanaHis-R(SEQ ID NO:14)、KanaHis～Amp-F(SEQ ID NO:15)和lacOcAOX～Amp-R(SEQ ID NO:16)，以质粒pPIC3.5K为模板进行PCR扩增。同时设计引物对Amp～lacOcAOX-F(SEQ ID NO:17)和KanaHis～TTSpe-R(SEQ ID NO:18)，以质粒pZ_P_AOX1R-LovA为模板进行PCR扩增，得到表达盒片段与线性化质粒进行多片段无缝克隆，得到质粒pK_P_AOX1R-LovA。

使用SpeI线性化质粒pK_P_AOX1R-LovA，使用引物对TT～lacOcAOX-F(SEQ ID NO:10)和KanaHis～TTSpe-R(SEQ ID NO:18)以质粒pZ_P_AOX1R-CPR为模板，经PCR扩增得到片段与线性化质粒进行无缝克隆，可以得到质粒pK_P_AOX1R-sAR。继续使用内切酶SpeI酶切线性化质粒pK_P_AOX1R-sA，使用引物TT～pGAP-F(SEQ ID NO:19)和BamH～TT-R(SEQ ID NO:11)以质粒pZ-P_GAP-UTA为模板，经PCR扩增可以得到表达盒片段，将线性化质粒与表达盒片段分别进行单片段无缝克隆，可以获得质粒pK_UTA_P_AOX1R-sAR。

实施例2、P_ICL1驱动表达UTA对于乙醇表达的促进

前述制备的质粒pZ_P_AOX1R，以Xho和Sal双酶切线性化质粒，设计引物扩增eGFP报告基因片段，以及获得P_ICL1-UTA，通过无缝组装试剂盒经克隆筛选即可得到质粒pZ_P_ICL1-UTA_P_AOX1R-eGFP。同时，以P_ICL1驱动表达eGFP、P_AOX1驱动表达eGFP为对照。线性化质粒，并电转化毕赤酵母野生株，筛选转化子。所得单克隆转化子进行基因型鉴定，进行乙醇或甲醇为碳源的发酵。

如图1所示，使用人工转录系统P_ICL1-UTA_P_AOX1R在乙醇条件下的GFP表达强度相比原始P_ICL1启动子强度大幅提升，且远高于原始P_AOX1在甲醇和乙醇条件下的GFP表达强度。证明本发明中的人工转录装置能够显著提升异源蛋白的表达水平。

实施例3、生产莫纳可林J共培养菌株的获得

1、生产二氢莫纳可林L菌株的构建

前述制备的质粒pZ_UTA_P_AOX1R-BCGN，使用SpeI单酶切，经纯化回收后电转化毕赤酵母野生株，使用博来霉素抗性的YPD固体平板进行转化子筛选。所得单克隆转化子进行基因型鉴定，经乙醇诱导发酵后，提取发酵液中的代谢产物进行高效液相色谱分析，合成二氢莫纳可林L的重组菌即为生产二氢莫纳可林L的毕赤酵母菌株，命名为P.p/DML。

2、代谢工程优化提升二氢莫纳可林L生产

为进一步增强乙酰辅酶A的供应及二氢莫纳可林L的合成，在二氢莫纳可林L生产菌株的基础上，进一步过表达乙醇脱氢酶ADH(SEQ ID NO:20)、乙酰辅酶A合成酶ACS(SEQID NO:21)以及乙酰辅酶A脱羧酶ACC(SEQ ID NO:22)。

以酿酒酵母基因组为模版，设计引物经PCR扩增可获得乙醇脱氢酶基因adh，及乙酰辅酶A合成酶基因acs。以毕赤酵母基因组为模版，设计引物经PCR扩增可以得到乙酰辅酶A脱羧酶acc。使用内切酶BspT104I和KpnI双酶切质粒pGAPZα，经DNA凝胶电泳去除信号肽片段得到线性化质粒，将线性化质粒分别与三基因片段分别进行无缝克隆，转化大肠杆菌，经菌落PCR验证和测序结果比对可以得到P_GAP表达各酶基因的质粒pZ-P_GAP-ADH、pZ-P_GAP-ACS和pZ-P_GAP-ACC。设计引物对以毕赤酵母商业化载体pPIC3.5K为模板经PCR扩增去除其中HIS4基因，即可得到去除HIS4筛选标记基因的质粒pKdH。同时分别以质粒pZ-P_GAP-ADH和pZ-P_GAP-ACS为模板，进行PCR扩增得到基因表达盒。将基因表达盒与线性化的质粒pKdH分别进行多片段无缝克隆，可得到质粒pKdH-P_GAP-ADH和pKdH-P_GAP-ACS。使用SpeI单酶切质粒pKdH-P_GAP-ADH将之线性化，将线性化质粒与表达盒片段进行无缝克隆和转化，经筛选可以得到质粒pKdH-P_GAP-ADH+P_GAP-ACS。使用BlnI线性化该质粒，电转化毕赤酵母P.p/DML的感受态细胞，使用添加遗传霉素的YPD培养基筛选转化子并进行基因型验证，可以得到过表达ADH和ACS的毕赤毕赤酵母菌株。

使用BamHI和BlnI双酶切质粒pPIC3.5K，设计引物并以pZ-P_GAP-ACC为模板，经PCR扩增得到P_GAP-ACC-TT片段，将两者进行无缝克隆，经菌落PCR筛选和验证可以得到质粒pK-P_GAP-ACC。线性化该质粒，电转化已过表达ADH和ACS的毕赤酵母感受态细胞，用MGY平板筛选转化子和基因型验证，同时筛选各个表达质粒单拷贝整合，可以得到ADH，ACS和ACC过表达的二氢莫纳可林L生产菌株菌株P.p/DML_OE，所得毕赤酵母转化子经乙醇诱导发酵后提取发酵产物，经高效液相色谱进行定量分析，如图2所示，相比优化前菌株的二氢莫纳可林L产量提升195％，该优化后的菌株命名为P.p/DML_OE(P.p/DML with overexpression)。

3、催化二氢莫纳可林L合成莫纳可林J菌株的构建

使用BlnI单酶切质粒pK_UTA_P_AOX1R-sAR，经纯化回收后电转化毕赤酵母野生株，使用遗传霉素抗性的YPD固体平板进行转化子筛选。所得单克隆转化子进行基因型鉴定。

将上述获得的转化了pK_UTA_P_AOX1R-sAR的菌株，与菌株P.p/DML_OE共培养发酵。之后，提取发酵液中的代谢产物进行高效液相色谱分析，如图3所示，确定发酵产物为莫纳可林J。

上述用以催化二氢莫纳可林L转化为莫纳可林J的毕赤酵母重组菌株，命名为P.p/sAR。

实施例4、共培养重组菌株生产莫纳可林J

1.生产莫纳可林J的共培养菌株最优初始接种比例的确定

本发明人在反复研究后发现，在P.p/DML和P.p/sAR双菌株共培养体系里，不同的初始接种比例使共培养体系处于不同的稳定状态。因此，本发明人认为，有必要对共培养体系中两菌株的初始接种比例进行优化。

本发明人将菌株P.p/DML与菌株P.p/sAR的初始接种比例依次设置为1:0.1，1:0.2，1:0.5，1；1，1:1.5，1:2，观察不同接种比例对于生产量的影响。

各组的莫纳可林J的生产量如图4所示，可见，菌株P.p/DML与菌株P.p/sAR在1:0.2～0.5的初始接种比例时，莫纳可林J的生产量显著理想；而在初始接种比例为1:0.2时，莫纳可林J的生产量达到最高，为156mg/L。

2.重组工程菌5L反应器高密度发酵工艺

本发明人将菌株P.p/DML与菌株P.p/sAR的初始接种比为1:0.2的共培养体系放大到5L反应器中，进行发酵小试。分别在摇瓶中培养菌株P.p/DML与菌株P.p/sAR至对数生长期，测定菌浓，进行1:0.2混合后接入5L反应器中，控制pH为4.5，溶解氧在30～70％之间。在发酵前期使用葡萄糖作为碳源进行补料流加，控制葡萄糖补料速率由低到高，从24g/h逐步提升至40g/h，同时检测培养基中的葡萄糖残留浓度，避免葡萄糖补料过快造成葡萄糖大量积累。维持细胞高速生长至菌体湿重达到300g/L后，切换碳源至乙醇补料，乙醇补料速率同样由慢到快，从0g/h逐步提升至24g/h，期间监测发酵液中的乙醇残留浓度，避免乙醇积累过高，待菌体适应乙醇后维持补料速率24g/h直至发酵至110h，期间维持pH在4.5、溶解氧在30～70％之间。测定发酵过程中的产量。如图5所示，在发酵96h时，共培养体系可以生产莫纳可林J的量达到2.2g/L。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 一种莫纳可林J异源生产的方法及应用

<130> 184446

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9117

<212> DNA

<213> 土曲霉(Aspergillus terreus)

<400> 1

atggctcaat ctatgtatcc taatgagcct attgtcgtgg tcggcagtgg ttgtcgcttc 60

cctggtgacg ccaacacacc ctccaagctc tgggagctac tccagcatcc tcgcgatgtg 120

cagagtcgaa tccccaaaga acgatttgac gtcgacacat tttatcaccc ggacgggaag 180

caccacgggc gaacaaatgc accctacgcc tatgttctcc aagacgatct gggcgccttc 240

gatgcggcct tcttcaatat ccaggctgga gaggccgaga gtatggaccc ccagcaccgg 300

ctgttgctgg agacggtgta cgaggccgta acgaatgctg gaatgcgtat ccaggatctg 360

cagggaactt cgactgctgt ttacgtcggg gtgatgacgc acgactatga gactgtctca 420

acccgcgacc tggagagcat ccccacctac tcggcgacgg gtgtcgcggt cagtgttgcg 480

tccaaccgca tctcgtattt ttttgactgg catggaccaa gtatgacgat cgatacggca 540

tgcagctcgt cgttggttgc cgttcatctg gcggtgcaac agctacggac gggtcaaagc 600

tccatggcaa ttgctgcggg tgcgaatctg attctggggc ccatgacatt cgtccttgaa 660

agcaaattga gcatgctatc cccctcgggt cgatcccgca tgtgggacgc cggagctgac 720

ggctatgcca gaggcgaagc tgtttgctct gtagtgttga agacattgag tcaagccttg 780

cgcgatgggg acacgattga atgtgtcatc cgagaaactg gggtgaatca agatggccga 840

acgaccggaa ttacgatgcc gaaccatagt gctcaggagg cactcatcaa ggctacctac 900

gcccaggctg gccttgacat caccaaggcc gaggacaggt gccaattctt cgaggctcat 960

gggactggta ctccggccgg agatccccag gaggcggagg ccattgcaac agccttcttc 1020

ggccacgagc aggtagcacg cagcgacgga aacgagaggg cccctctgtt cgtgggcagt 1080

gcgaaaactg ttgtcgggca caccgagggc acggccggtc tggctggtct catgaaggcg 1140

tcgttcgctg tccgccatgg ggtaatcccc cccaacctgc tgttcgacaa aatcagcccg 1200

cgagtcgccc cattctataa aaacctgagg attccgacag aagctaccca atggccagct 1260

ctcccacccg gacaaccgcg ccgcgccagt gtcaactcct ttggattcgg cggcacgaat 1320

gcgcatgcca ttattgagga atacatggag ccagagcaaa accagctgcg agtctcgaat 1380

aatgaggact gcccacccat gaccggtgtc ctgagtttac ccttagtcct ctcggcgaag 1440

tcccagcgct ccttaaagat aatgatggag gagatgctgc aattccttga gtctcacccc 1500

gagatacact tgcacgacct cacctggtcc ttactgcgca agcggtcagt tctacccttc 1560

cgccgggcta ttgtcggcca tagtcatgaa accatccgcc gggctttgga ggatgccatc 1620

gaggatggta ttgtgtcgag cgacttcact acggaggtca gaggccagcc atcggtgttg 1680

ggaatcttca ccgggcaggg ggcgcagtgg ccggggatgt taaagaatct gatagaggca 1740

tcgccatatg tgcggaacat agtgagggag ctggacgact ccctgcagag cttgccggaa 1800

aaataccggc cctcgtggac gctactggac cagttcatgc tagaaggaga ggcctccaac 1860

gtccaatatg ctactttctc ccagccatta tgctgcgcgg tgcaaattgt cctggtccgt 1920

ctccttgaag ccgcgagaat acgattcacg gctgttgttg gacatagctc cggcgaaatt 1980

gcttgcgcct ttgctgccgg gctcatcagt gcctcgttgg cgattcggat tgcttactta 2040

cgtggagtcg tctcggcagg gggcgccaga ggcacaccgg gagccatgtt ggccgccggg 2100

atgtcctttg aggaagcaca agagatctgc gagttggatg cctttgaggg ccgcatctgc 2160

gtggctgcca gcaattcccc agacagtgta actttctctg gcgacgcgaa cgcaattgat 2220

cacctgaagg gcatgttgga ggatgagtcc acttttgcga gactgctcaa ggtcgataca 2280

gcgtaccact cgcatcatat gcttccatgt gcagacccat atatgcaagc cctagaagag 2340

tgtggttgtg ctgttgccga tgcaggttcc ccagccggaa gtgtaccctg gtattcgtcc 2400

gtggacgccg agaacaggca aatggcagca agagacgtga ccgccaagta ctggaaagat 2460

aacttagtat ctccggtgct attctcccac gcagtgcagc gggcagtcgt cacgcacaag 2520

gcgctggata tcgggattga agtgggctgt cacccagctc tcaagagccc atgcgtcgcc 2580

accatcaagg atgtcctatc tggggttgac ctggcgtata caggttgctt ggagcgagga 2640

aagaatgatc tcgattcatt ctctcgagca ctggcatatc tctgggaaag gtttggtgcc 2700

tccagtttcg atgcggacga gttcatgcgt gcagtcgcgc ctgatcggcc ctgtatgagt 2760

gtgtcgaagc tcctaccggc ctatccatgg gaccgctctc gtcgctactg ggtggaatcc 2820

cgagcaactc gccaccatct tcgagggccc aagccccatc ttctattagg aaagctctcc 2880

gaatacagca ctccgctaag cttccagtgg ctgaattttg tgcgcccacg agacattgaa 2940

tggcttgatg gacatgcatt gcaaggccag actgtcttcc ctgcggccgg ctatatcgtc 3000

atggcaatgg aagcagcctt aatgattgct ggcacccacg caaagcaggt caagttactg 3060

gagatcttgg atatgagcat tgacaaggcg gtgatatttg acgacgaaga cagcttggtt 3120

gagctcaacc tgacagctga cgtgtctcgc aacgccggcg aagcaggttc aatgaccata 3180

agcttcaaga tcgattcctg tctatcgaag gagggtaacc tatccctatc agccaagggc 3240

caactggccc taacgataga agatgtcaat cccaggacga cttccgctag cgaccagcac 3300

catcttcccc cgccagaaga ggaacatcct catatgaacc gtgtcaacat caatgctttc 3360

taccacgagc tggggttgat ggggtacaac tacagtaagg acttccggcg tctccataac 3420

atgcaacgag cagatcttcg agccagcggc accttagact tcattcctct gatggacgag 3480

ggtaatggct gtcctctcct gctgcatcct gcatcattgg acgtcgcctt ccagactgtc 3540

atcggcgcat actcctcccc aggtgatcgg cgtctacgct gtctgtatgt acccactcac 3600

gttgatcgca tcacacttgt cccatccctt tgcctggcaa cggctgagtc cggatgcgag 3660

aaggttgcct tcaatactat caatacgtac gacaagggag actacttgag cggtgacatt 3720

gtggtgtttg acgcggagca gaccaccctg ttccaggttg aaaatattac ttttaagccc 3780

ttttcacccc cggatgcttc aactgaccat gcgatgtttg cccgatggag ctggggtccg 3840

ttgactccgg actcgctgct ggataacccg gagtattggg ccaccgcgca ggacaaggag 3900

gcgattccta ttatcgaacg catcgtctac ttctatatcc gatcgttcct cagtcagctt 3960

acgctggagg agcgccagca ggcagccttc catttgcaga agcagatcga gtggctcgaa 4020

caagtcctgg ccagcgccaa ggagggtcgt cacctatggt acgaccccgg gtgggagaat 4080

gatactgagg cccagattga gcacctttgt actgctaact cctaccaccc tcatgttcgc 4140

ctggttcagc gagtcggcca acacctgctc cccaccgtac gatcgaacgg caacccattc 4200

gaccttctgg accacgatgg gctcctgacg gagttctata ccaacacact cagcttcgga 4260

cccgcactac actacgcccg ggaattggtg gcgcagatcg cccatcgcta tcagtcaatg 4320

gatattctgg agattggagc agggaccggc ggcgctacca agtacgtgtt ggccacgccc 4380

cagctggggt tcaacagcta cacatacacc gatatctcca ccggattctt cgagcaagcg 4440

cgggagcaat ttgccccctt cgaggaccgg atggtgtttg aacccctcga tatccgccgc 4500

agtcccgccg agcagggctt cgagccgcat gcctatgatc tgatcattgc ctccaatgtg 4560

ctacatgcga cacccgacct agagaaaacc atggctcacg cccgctctct gctcaagcct 4620

ggaggccaga tggttattct ggagattacc cacaaagaac acacacggct cgggtttatc 4680

tttggtctgt tcgccgactg gtgggctggg gtggatgatg gtcgctgcac tgagccgttt 4740

gtctcgttcg accgctggga tgcgatccta aagcgtgtcg ggttttccgg tgtggacagt 4800

cgcaccacgg atcgggacgc aaatctattc ccgacctctg tgtttagtac ccatgcaatt 4860

gacgccaccg tggagtactt agacgcgccg cttgccagca gcggcaccgt caaggactct 4920

taccctccct tggtggtggt aggagggcag accccccaat ctcagcgtct cctgaacgat 4980

ataaaagcga tcatgcctcc tcgtccgctc cagacataca agcgcctcgt ggatttgcta 5040

gacgcggagg agctgccgat gaagtccacg tttgtcatgc tcacggagct ggacgaggaa 5100

ttattcgccg ggctcactga agagaccttc gaggcaacca agctgctgct cacgtacgcc 5160

agcaatacgg tctggctgac agaaaatgcc tgggtccaac atcctcacca ggcgagcacg 5220

atcggcatgc tacgctccat ccgccgggag catcctgact tgggagttca tgttctggac 5280

gtcgacgcgg ttgaaacctt cgatgcaacc ttcctggttg aacaggtgct tcggcttgag 5340

gagcatacgg atgagctggc cagttcaact acatggactc aagaacccga ggtctcctgg 5400

tgtaaaggcc gcccgtggat tcctcgtctg aagcgcgatc tggctcgcaa taaccgaatg 5460

aactcctcgc gccgtcccat atacgagatg atcgattcgt cgcgggctcc cgtggcatta 5520

cagacggctc gggattcatc atcctacttc ttggagtccg ctgaaacctg gtttgtgcct 5580

gagagtgttc agcagatgga aacaaagacg atctatgtcc actttagctg tccccatgcg 5640

cttagggtcg gacagctcgg gtttttctat cttgtgcagg gtcacgtcca ggagggcaat 5700

cgcgaagtgc ccgtcgtggc cttagcagag cgtaacgcat ccattgtgca cgttcgtccc 5760

gattatatat atactgaggc agataacaat ctgtctgagg gtggtggcag ccttatggta 5820

accgtcctcg ccgcggcggt gttggcggag acggtgatca gtaccgccaa gtgcctgggg 5880

gtaactgact caatcctcgt tctgaatccc cccagcatat gtgggcagat gttgctccat 5940

gctggtgaag agatcggtct tcaagttcat ctggccacca cttctggcaa caggagttcg 6000

gtttctgctg gagacgccaa gtcctggcta acattgcatg ctcgcgacac ggactggcac 6060

ctgcgacggg tactgccccg gggtgtccag gctttagtcg acttatcagc cgaccagagc 6120

tgtgaaggtt tgactcagag gatgatgaaa gttctgatgc ctggctgtgc ccattaccgt 6180

gcggcagacc tgttcacaga caccgtttcc actgaattgc atagcggatc gcggcatcaa 6240

gcttcactgc ccgccgcata ttgggagcat gtggtatcct tagcccgcca gggacttcct 6300

agtgtcagcg aggggtggga ggtgatgccg tgcactcaat ttgcagcgca tgccgacaag 6360

acgcgcccgg atctctcgac agttatttcc tggccccggg agtcggacga ggctacgctt 6420

cctaccaggg ttcgctccat tgacgctgag accctctttg cggccgacaa aacatatctc 6480

ctggtcggac tgactggaga tcttggacga tcactaggtc gttggatggt ccagcatggg 6540

gcctgccaca ttgtacttac gagcagaaat ccgcaggtga accccaagtg gctggcgcat 6600

gttgaagaac tgggtggtcg agtcactgtt ctttccatgg acgtgacaag ccaaaactca 6660

gtggaagctg gcctggctaa actcaaggat ctgcatctgc caccagtggg gggtattgcc 6720

tttggccctc tggttctgca ggatgtgatg ctaaataata tggaactgcc aatgatggag 6780

atggtgctca accccaaggt cgaaggcgtc cgcatcctgc acgagaagtt ctccgatccg 6840

accagtagca accctctcga cttcttcgtg atgttctcct cgattgtggc cgtcatgggc 6900

aacccgggtc aggctaacta cagtgcggct aactgctacc ttcaagcgct ggcgcagcag 6960

cgagttgcat ccggattagc agcgtccacc atcgacatcg gtgccgtgta cggcgttggg 7020

ttcgtcactc gggcggagct ggaggaggac tttaatgcaa ttcggttcat gttcgattcg 7080

gttgaggaac atgaactgca tacactgttt gctgaggcag tggtggccgg tcgacgagcc 7140

gtgcaccagc aagagcagca gcggaagttc gcgacagtgc tcgacatggc tgatctggaa 7200

ctgacaaccg gaattccgcc cctggatcca gccctcaaag atcggatcac cttcttcgac 7260

gacccccgca taggcaactt aaaaattccg gagtaccgag gggccaaagc aggcgaaggg 7320

gcagccggct ccaagggctc ggtcaaagaa cagctcttgc aggcgacgaa cctggaccag 7380

gtccgtcaga tcgtcatcga tggactctcc gcgaagctgc aggtgaccct gcagatcccc 7440

gatggggaaa gcgtgcatcc caccatccca ctaatcgatc agggggtgga ctctctgggc 7500

gcggtcaccg tgggaacctg gttctccaag cagctgtacc ttgatttgcc actcctgaaa 7560

gtgcttgggg gtgcttcgat caccgatctc gctaatgagg ctgctgcgcg attgccacct 7620

agctccattc ccctcgtcgc agccaccgac gggggtgcag agagcactga caatacttcc 7680

gagaatgaag tttcgggacg cgaggatact gaccttagtg ccgccgccac catcactgag 7740

ccctcgtctg ccgacgaaga cgatacggag ccgggcgacg aggacgtccc gcgttcccac 7800

catccactgt ctctcgggca agaatactcc tggagaatcc agcagggagc cgaagacccc 7860

accgtcttta acaacaccat tggtatgttc atgaagggct ctattgacct taaacggctg 7920

tacaaggcgt tgagagcggt cttgcgccgc cacgagatct tccgcacggg gtttgccaac 7980

gtggatgaga acgggatggc ccagctggtg tttggtcaaa ccaaaaacaa agtccagacc 8040

atccaagtgt ctgaccgagc cggcgccgaa gagggctacc gacaactggt gcagacacgg 8100

tataaccctg ccgcaggaga caccttgcgg ctggtggact tcttctgggg ccaggacgac 8160

catctgctgg ttgtggctta ccaccgactc gtcggggatg gatctactac agagaacatc 8220

ttcgtcgaag cgggccagct ctacgacggc acgtcgctaa gtccacatgt ccctcagttt 8280

gcggacctgg cggcacggca acgcgcaatg ctcgaggatg ggagaatgga ggaggatctc 8340

gcgtactgga agaaaatgca ttaccgaccg tcctcaattc cagtgctccc actgatgcgg 8400

cccctggtag gtaacagtag caggtccgat actccaaatt tccagcactg tggaccctgg 8460

cagcagcacg aagccgtggc gcgacttgat ccgatggtgg ccttccgcat caaggagcgc 8520

agtcgcaagc acaaggcgac gccgatgcag ttctatctgg cggcgtatca ggtgctgttg 8580

gcgcgcctca ccgacagcac cgatctcacc gtgggcctcg ccgacaccaa ccgtgcgact 8640

gtcgacgaga tggcggccat ggggttcttc gccaacctcc ttcccctgcg cttccgggat 8700

ttccgccccc atataacgtt tggcgagcac cttatcgcca cccgtgacct ggtgcgtgag 8760

gccttgcagc acgcccgcgt gccctacggc gtcctcctcg atcaactggg gctggaggtc 8820

ccggtcccga ccagcaatca acctgcgcct ttgttccagg ccgtcttcga ttacaagcag 8880

ggccaggcgg aaagtggaac gattgggggt gccaagataa ccgaggtgat tgccacgcgc 8940

gagcgcaccc cttacgatgt cgtgctggag atgtcggatg atcccaccaa ggatccgctg 9000

ctcacggcca agttacagag ttcccgctac gaggctcacc accctcaagc cttcttggag 9060

agctacatgt cccttctctc tatgttctcg atgaatcccg ccctgaagct ggcatga 9117

<210> 2

<211> 1092

<212> DNA

<213> 土曲霉(Aspergillus terreus)

<400> 2

atgggcgacc agccattcat tccaccaccg cagcaaacag cgctgacggt aaatgaccat 60

gatgaagtca ccgtctggaa tgccgcaccc tgccccatgc tgccccgcga ccaggtatac 120

gtccgcgtcg aggccgtggc gatcaatccc agtgacacga agatgcgcgg acagtttgcc 180

acgccctggg cgtttctcgg aacggactat gccggcacgg tcgtcgcagt gggttcggac 240

gtgactcata tccaagtggg tgaccgggtc tacggggcac agaacgagat gtgcccacgc 300

accccggatc agggggcatt ctcgcagtac acggtcacgc gaggccgtgt ttgggccaag 360

atccccaagg gcttgtcgtt cgagcaggct gccgcgctac ctgcgggcat cagtaccgct 420

ggattggcga tgaagttgct tgggctgcct ttgccatcgc cttcggcaga ccagccaccc 480

acccactcca agccggtgta tgtgttggtc tatgggggca gtacggccac tgccactgtc 540

actatgcaaa tgctccgcct gtccggatat attccaattg caacatgctc cccccacaat 600

ttcgacctgg ccaaatcgcg cggcgcagag gaggtctttg actatcgggc cccgaatctc 660

gcgcagacga tccgtaccta caccaagaac aatctccgct atgctctcga ctgtatcacc 720

aacgtcgagt ccaccacatt ctgcttcgca gccatcggcc gcgcgggggg gcactacgtc 780

tccctgaacc cgttccctga acacgcggcc acgcgcaaga tggtcacgac cgactggacc 840

ctggggccga ccatctttgg cgagggatca acctggcccg ccccctatgg gcgtcccggc 900

agtgaggaag agcggcagtt cggcgaggat ctgtggcgca tcgcggggca gctcgtcgaa 960

gatggacgcc tcgtccatca tccgttgcgc gtggtgcagg gcggcttcga tcacattaag 1020

caaggcatgg agctcgtccg gaagggagag ctgtcggggg agaaactcgt ggttcggctc 1080

gaggggccgt aa 1092

<210> 3

<211> 771

<212> DNA

<213> 土曲霉(Aspergillus terreus)

<400> 3

atgcgttacc aagcatctcc agcgctggtg aaggcgcctc gagcgcttct ttgcatccat 60

ggggctggct gctctcccgc catcttccgc gtgcaattgt ctaagctccg ggctgcgctg 120

cgcgaaaact ttgaattcgt ctacgtgaca gctccgttcc cttcctctgc agggcctggg 180

attctccccg tcttcgccga cctagggcca tattactcct ggtttgaaag cagcagcgac 240

aacaatcata atggaccctc cgtgagcgaa cgcctcgccg ccgtccacga ccccatccgc 300

cgcaccattg tcgactggca gactcaacac ccccacatcc ctatcgtggg tgctatcggt 360

ttctccgaag gtgccctggt gacgaccttg ctcctctggc agcagcagat gggtcacctg 420

ccctggttgc cccggatgag tgttgcgctg ttgatctgtc cctggtatca agacgaggca 480

agccagtata tgaggaacga agtgatgaag aaccatgacg acgacaacga cagcaaagat 540

accgagtggc aggaggaact ggtcattcgg ataccgacat tacatctgca gggtcgcgat 600

gattttgcgc tcgcaggatc gaagatgctg gtggcgcgcc atttctcccc ccgagaggcg 660

caggtattgg agtttgctgg gcagcatcag tttcccaatc gaccgcgcga cgtgttggag 720

gtcattaatc gttttcgtaa gctgtgtgtg acggcccaga cattggagta g 771

<210> 4

<211> 1035

<212> DNA

<213> 土曲霉(Aspergillus terreus)

<400> 4

atggtgcaag acacatcaag cgcaagcact tcgccaattt taacaagatg gtacatcgac 60

acccgccctc taaccgcctc aacagcagcc cttcctctcc ttgaaaccct ccagcccgct 120

gatcaaatct ccgtccaaaa atactaccat ctgaaggata aacacatgtc tctcgcctct 180

aatctgctca aatacctctt cgtccaccga aactgtcgca tcccctggtc ttcaatcgtg 240

atctctcgaa ccccagatcc gcacagacga ccatgctata ttccaccctc aggctcacag 300

gaagacagct tcaaagacgg atataccggc atcaacgttg agttcaacgt cagccaccaa 360

gcctcaatgg tcgcgatcgc gggaacagct tttactccca atagtggtgg ggacagcaaa 420

ctcaaacccg aagtcggaat tgatattacg tgcgtaaacg agcggcaggg acggaacggg 480

gaagagcgga gcctggaatc gctacgtcaa tatattgata tattctcgga agtgttttcc 540

actgcagaga tggccaatat aaggaggtta gatggagtct catcatcctc actgtctgct 600

gatcgtcttg tggactacgg gtacagactc ttctacactt actgggcgct caaagaggcg 660

tatataaaaa tgactgggga ggccctctta gcaccgtggt tacgggaact ggaattcagt 720

aatgtcgtcg ccccggccgc tgttgcggag agtggggatt cggctgggga tttcggggag 780

ccgtatacgg gtgtcaggac gactttatat aaaaatctcg ttgaggatgt gaggattgaa 840

gttgctgctc tgggcggtga ttacctattt gcaacggctg cgaggggtgg tgggattgga 900

gctagttcta gaccaggagg tggtccagac ggaagtggca tccgaagcca ggatccctgg 960

aggcctttca agaagttaga tatagagcga gatatccagc cctgtgcgac tggggtgtgt 1020

aattgcctat cctaa 1035

<210> 5

<211> 1587

<212> DNA

<213> 土曲霉(Aspergillus terreus)

<400> 5

atgactgtcg acgcgctcac acagccgcac caccttctgt cgctggcttg gaatgacacg 60

cagcaacatg gctcgtggtt tgcgcccttg gtcactacca gtgcggggct actatgcctt 120

cttctttacc tgtgctcgag tggccggaga tctgatctgc cggtgttcaa tccgaaaaca 180

tggtgggaac tgacgaccat gagggccaaa cgggattttg atgcgaatgc accgtcatgg 240

attgagagct ggttctcgca aaatgataag cccattcggt tcatagtcga ctctgggtac 300

tgcaccattc ttccctcctc tatggccgat gagtttcgca agatgaaaga gctctgtatg 360

tacaagttct tgggcacgga ctttcactct catcttcccg gattcgatgg attcaaggaa 420

gtcacgaggg atgcacatct catcaccaag gtggttatga accagttcca gacccaagct 480

cccaagtacg tcaagcctct tgccaatgaa gccagcggga ttatcacgga tatttttggc 540

gacagcaatg aatggcacac agtgcctgtc tataaccagt gtctggactt agtgacccga 600

acagtgactt ttattatggt cgggagcaag ttagcccata atgaggagtg gcttgacatc 660

gccaagcacc acgcggtgac gatggcaatt caagcgcgcc agctgcgcct ctggcccgtc 720

attctgcgcc cccttgtaca ttggctcgag ccccagggag ccaaactccg ggcgcaggtt 780

cgacgagccc ggcaacttct cgatcccatt atccaggagc gacgtgcgga aagagatgcc 840

tgccgggcaa agggcattga gccgcctcgc tacgtagact cgatccagtg gttcgaggat 900

actgccaagg ggaaatggta cgatgcagcc ggggcgcaac tggccatgga ctttgctggt 960

atctacggaa cctccgacct gctgatcggt gggttggtgg acatcgtccg acatccccat 1020

ctccttgagc ccctccgtga tgagatccgg acggtcatcg gccaaggggg ttggacacct 1080

gcctcgctgt acaagctcaa actgctggat agttgtctca aggagtcaca gcgcgtcaag 1140

cccgtcgaat gtgccaccat gcgcagctat gcattgcagg atgtgacttt ctccaatgga 1200

acctttatcc caaaaggaga gctggtggcg gtagctgccg accgcatgag caaccccgag 1260

gtctggccag agccggcaaa atacgatcct taccggtata tgcgcctgcg agaggacccg 1320

gctaaagcgt tcagtgccca actggagaac accaacgggg accacatcgg cttcggttgg 1380

catccacggg cttgccccgg ccggttcttt gcctctaagg agatcaagat gatgttagcc 1440

tacttgctca tacgatacga ctggaaggtg gtccccgacg aaccgttgca gtactaccgc 1500

cattctttca gcgtgcgcat tcatcccacc acgaagctca tgatgcgccg gcgcgacgag 1560

gatatccgcc ttcctggttc actatag 1587

<210> 6

<211> 2088

<212> DNA

<213> 土曲霉(Aspergillus terreus)

<400> 6

atggctcaac tcgacactct cgacctggtg gtcctggtgg tgcttttggt gggtagcgcc 60

gcctacttca ccaagggcac ctactgggcc gttcccaagg acccgtatgc cgcctccggt 120

cccgccatga atggtggcgc caaggcgggc aaatccaggg acatcattga gaaaatggaa 180

gagactggca agaactgtgt gattttctac ggctcgcaga ccggtaccgc cgaggattat 240

gcgtcgcgcc tggccaagga aggctcccag cgtttcggcc tcaagaccat ggtcgcagat 300

ctggaagact acgattatga gaacctggac aagttccccg aggacaaggt tgccttcttc 360

gtcatggcca cctatggtga gggtgaaccc accgacaacg ccgtcgagtt ctaccagttc 420

atctcgggtg aggacgtcgc gttcgagagc ggcgcctctg ccgacgacaa gcccctgtcc 480

tccctcaagt atgtcacttt cggtctcggt aacaacacct atgagcacta tcaggctatg 540

gttcgcaatc tggatgccgc tctcaccaag ctgggtgcgc agcgcattgg agatgctggt 600

gaaggtgatg acggcgctgg caccatggaa gaagatttcc tggcctggaa agagcccatg 660

tggactgccc tgtccgaggc catgaacctt caggagcgcg aagccgtcta tgagccggtg 720

ttctcggtca cggaagatga atccctgtcc cccgaagacg aagccgtcta cctcggtgag 780

ccgaccaagg gtcaccgtga cggcaccccc agtggcccgt attccgctca caaccccttc 840

atcgccccca tcgtcgagtc tcgtgaactg ttcaacgtca aggaccgtaa ttgtctgcac 900

atggagatca gcatcgctgg tagcaacctt tcttaccaga ctggtgatca catcgcgatt 960

tggcccacga acgctggtgc cgaggtggac cggttcctcc aggtgtttgg tcttgagaac 1020

aagcgtcatt ccgtcatcaa catcaagggt atcgatgtga ccgccaaggt tcccattccg 1080

actcccacca cgtatgatgc tgctgttcgc tactatatgg aaattgctgc gcccgtctcc 1140

cgtcagtttg tggctaccct ggctgcgttt gctcccgatg aggagactaa ggcggaaatc 1200

gtgcgtttgg gtagcgacaa ggactacttc cacgagaaaa tcagcaacca gtgcttcacc 1260

atcgctcagg ctcttcagag tgtcacctcc aagcccttct cggctgtccc gttctctctg 1320

cttatcgagg gtctcaataa gctccagccc cgttactact ccatctcttc ctcctccatg 1380

gtccagaagg ataagatcag cattactgcc gtcgtggaat ccactcgctt gcctggtgcc 1440

gcccaccttg tcaagggtgt cacgaccaac tatctccttg ccctgaagca aaagcagaat 1500

ggggatccgt ctcccgaccc tcacggctta acttatacta tcactgggcc ccgtaacaag 1560

tacgacggaa tccacgttcc cgttcacgtc cgccactcca atttcaagct cccctctgat 1620

ccctctcggc ccattatcat ggttggccct ggtaccggtg tggctccctt ccgtggattc 1680

atccaggagc gtgccgcctt ggccgccaag ggtgagaacg tcggtcccac cgtgttgttc 1740

tttggatgcc gcaggcgcga tgaggacttt atgtacgcag atgaattcaa gacctaccag 1800

gaacagcttg gggacaagct tcagatcatt actgcgtttt ctcgtgaaac ttcccagaag 1860

gtgtatgttc agcacagact gcgtgaacac tccgatctgg tgagcagcct cctgaagcag 1920

aaggctaact tttacgtctg cggtgacgcc gccaacatgg cgcgtgaagt caaccttgtg 1980

cttggccaga tcatcgcgca acagcggggt ctcccggctg aacgggccga ggaaatggtg 2040

aagcacatgc gcagcagcgg cagctaccag gaggacgtgt ggtcatga 2088

<210> 7

<211> 3456

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgggtgtta agccagttac tttgtatgac gttgctgaat acgctggagt ttcctaccaa 60

actgtctcta gagttgttaa tcaagcttct catgtctccg ctaagactag agagaaggtt 120

gaggctgcta tggctgaatt gaactatatt ccaaatagag ttgctcagca gttggctgga 180

aagcaatctt tgttgattgg agtcgctact tcttctttgg ctttgcatgc tccatctcag 240

attgttgctg ctattaagtc cagagctgac cagttgggag cttctgttgt tgtttctatg 300

gttgagagat ctggagttga ggcttgcaag gctgctgttc ataacttgtt ggctcagaga 360

gtttctggat tgattattaa ttacccattg gacgatcaag acgctattgc cgttgaggcc 420

gcttgtacca acgtcccagc tttgttcttg gacgtttccg atcaaactcc aattaattct 480

attatttttt ctcacgagga tggaactaga ttgggagttg aacacttggt tgctttggga 540

catcaacaga ttgctttgtt ggctggacca ttgtcttccg tttctgctag attgagattg 600

gccggatggc acaagtactt gaccagaaac cagattcaac caattgctga gagagaggga 660

gattggtctg ctatgtctgg attccagcag actatgcaga tgttgaacga aggaattgtc 720

ccaaccgcta tgttggtcgc taatgaccaa atggctttgg gagctatgag agctattact 780

gaatctggat tgagagtcgg agctgacatt tctgttgttg gatatgatga cactgaggat 840

tcttcttgct acattccacc attgactact attaagcaag acttcagatt gttgggacag 900

acttctgttg atagattgtt gcagttgtcc caaggacaag ctgttaaagg aaaccaattg 960

ttgccagttt ctttggttaa gagaaagact actttggctc caaacactca gactgcttcc 1020

ccaagagctt tggctgactc tttgatgcaa ttggctagac aagtctctag attggagtct 1080

ggacaaggtg gcggcggctc tgttaacaac tccatgaagg atttcttagg caagaaaacg 1140

gtggatggag ctgatagtct caatttggcc gtgaatctgc aacaacagca gagttcaaac 1200

acaattgcca atcaatcgct ttcctcaatt ggattggaaa gttttggtta cggctctggt 1260

atcaaaaacg agtttaactt ccaagacttg ataggttcaa actctggcag ttcagatccg 1320

acattttcag tagacgctga cgaggcccaa aaactcgaca tttccaacaa gaacagtcgt 1380

aagagacaga aactaggttt gctgccggtc agcaatgcaa cttcccattt gaacggtttc 1440

aatggaatgt ccaatggaaa gtcacactct ttctcttcac cgtctgggac taatgacgat 1500

gaactaagtg gcttgatgtt caactcacca agcttcaacc ccctcacagt taacgattct 1560

accaacaaca gcaaccacaa tataggtttg tctccgatgt catgcttatt ttctacagtt 1620

caagaagcat ctcaaaaaaa gcatggaaat tccagtagac acttttcata cccatctggg 1680

ccggaggacc tttggttcaa tgagttccaa aaacaggccc tcacagccaa tggagaaaat 1740

gctgtccaac agggagatga tgcttctaag aacaacacag ccattcctaa ggaccagtct 1800

tcgaactcat cgattttcag ttcacgttct agtgcagctt ctagcaactc aggagacgat 1860

attggaagga tgggcccatt ctccaaagga ccagagattg agttcaacta cgattctttt 1920

ttggaatcgt tgaaggcaga gtcaccctct tcttcaaagt acaatctgcc ggaaactttg 1980

aaagagtaca tgacccttag ttcgtctcat ctgaatagtc aacactccga cactttggca 2040

aatggcacta acggtaacta ttctagcacc gtttccaaca acttgagctt aagtttgaac 2100

tccttctctt tctctgacaa gttctcattg agtccaccaa caatcactga cgccgaaaag 2160

ttttcattga tgagaaactt cattgacaac atctcgccat ggtttgacac ttttgacaat 2220

accaaacagt ttggaacaaa aattccagtt ctggccaaaa aatgttcttc attgtactat 2280

gccattctgg ctatatcttc tcgtcaaaga gaaaggataa agaaagagca caatgaaaaa 2340

acattgcaat gctaccaata ctcactacaa cagctcatcc ctactgttca aagctcaaat 2400

aatattgagt acattatcac atgtattctc ctgagtgtgt tccacatcat gtctagtgaa 2460

ccttcaaccc agagggacat cattgtgtca ttggcaaaat acattcaagc atgcaacata 2520

aacggattta catctaatga caaactggaa aagagtattt tctggaacta tgtcaatttg 2580

gatttggcta cttgtgcaat cggtgaagag tcaatggtca ttccttttag ctactgggtt 2640

aaagagacaa ctgactacaa gaccattcaa gatgtgaagc catttttcac caagaagact 2700

agcacgacaa ctgacgatga cttggacgat atgtatgcca tctacatgct gtacattagt 2760

ggtagaatca ttaacctgtt gaactgcaga gatgcgaagc tcaattttga gcccaagtgg 2820

gagtttttgt ggaatgaact caatgaatgg gaattgaaca aacccttgac ctttcaaagt 2880

attgttcagt tcaaggccaa tgacgaatcg cagggcggat caacttttcc aactgttcta 2940

ttctccaact ctcgaagctg ttacagtaac cagctgtatc atatgagcta catcatctta 3000

gtgcagaata aaccacgatt atacaaaatc ccctttacta cagtttctgc ttcaatgtca 3060

tctccatcgg acaacaaagc tgggatgtct gcttccagca cacctgcttc agaccaccac 3120

gcttctggtg atcatttgtc tccaagaagt gtagagccct ctctttcgac aacgttgagc 3180

cctccgccta atgcaaacgg tgcaggtaac aagttccgct ctacgctctg gcatgccaag 3240

cagatctgtg ggatttctat caacaacaac cacaacagca atctagcagc caaagtgaac 3300

tcattgcaac cattgtggca cgctggaaag ctaattagtt ccaagtctga acatacacag 3360

ttgctgaaac tgttgaacaa ccttgagtgt gcaacaggct ggcctatgaa ctggaagggc 3420

aaggagttaa ttgactactg gaatgttgaa gaataa 3456

<210> 8

<211> 214

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacactaac ccctacttga cagcaatata 60

taaacagaag gaagctgccc tgtcttaaac cttttttttt atcatcatta ttagcttact 120

ttcataattg cgactggttc caattgacaa gcttttgatt ttaacgactt ttaacgacaa 180

cttgagaaga tcaaaaaaca actaattatt cgaa 214

<210> 9

<211> 1002

<212> DNA

<213> 毕赤酵母(Pichia pastoris)

<400> 9

tctaacactt tgtatagcac atcgtaccag tttatcaaaa tccaacaagt tttcctctgg 60

gtactgaaat tcgattagta ataaacgggc gcacttggtg atctcctcat cctgttcact 120

agccttcttt tcgcttaact tcatcaacga gatcaactcg agtctgcgag cagagaactg 180

tttccaaaga gtttcatcgc tgaaattcag cttctttcga ataaaatgtg tcactcccac 240

tttattactc gtggtgttat ttgttttcca cgaactagtt gaatcgccat ctttactacc 300

gtcctgggtg acatccggcg aattcgggac aaatgtgctg ttccggtagc ttgtaggaag 360

cggcatccgt agggcaatat acgactatag cttctaaagc gtagtacaat gaaatgttcg 420

aaggaacaac aaacggattt gtttttcgta ggctcaaccc gttgaggtgt aactctttag 480

cgaaagggta agattgattg ttcgaagtag ggcctcaaag ggaaagagaa aaaaaaaata 540

acaccaagag ttacgtaagc atatattttt tacgtaaagc atgattgaat ttcagcagta 600

ttgtttaaca aggctgatgt cgtgtgccaa tcaaaacaaa agagattcgc ataatgccat 660

aattggggtg tgtgggcgcc ccctaaaacg tctttctcat catcatctgc aacccccatc 720

gaacctcatt aaatcacatg acttgtgcga tcctcggtca actcgttccg tgcacccatt 780

ccaccccggg ctgaccaacg caaggttctc cgagagtccg ctaccccaga tttatatcag 840

caaccagtca cctttttccg ggcacgactc tatatgccct ggaaaaccgg agacgatgag 900

cctgactgta aaaggtgaca gaacccccaa ctctggttaa tctcttcaac aaatacttta 960

ttttctttca attcaaagaa cacagtatca agtatatcaa ga 1002

<210> 10

<211> 44

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

ttaagtgaga ccttcgtttg tgcagatctt gtgtggaatt gtga 44

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 11

aagctatggt gtgtggggga tccgcacaaa cgaaggtctc 40

<210> 12

<211> 46

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 12

agtgagacct tcgtttgtgc agatcttcat ctaacacttt gtatag 46

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 13

cagaagatta agtgagaact agtagttcgt ttgtgcaagc 40

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 14

tcagagaaat ttaccatgaa atctcc 26

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 15

ggagatttca tggtaaattt ctctga 26

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 16

ccacacagag ctccgaataa taactgttat ttttcagtgt 40

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 17

taacagttat tattcggagc tctgtgtgga attgtgagcg 40

<210> 18

<211> 46

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 18

gcttgcacaa acgaactact agttctcact taatcttctg tactct 46

<210> 19

<211> 45

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 19

agtgagacct tcgtttgtgc agatcttttt tgtagaaatg tcttg 45

<210> 20

<211> 1047

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 20

atgtctattc cagaaactca aaaagccatt atcttctacg aatccaacgg caagttggag 60

cataaggata tcccagttcc aaagccaaag cccaacgaat tgttaatcaa cgtcaagtac 120

tctggtgtct gccacaccga tttgcacgct tggcatggtg actggccatt gccaactaag 180

ttaccattag ttggtggtca cgaaggtgcc ggtgtcgttg tcggcatggg tgaaaacgtt 240

aagggctgga agatcggtga ctacgccggt atcaaatggt tgaacggttc ttgtatggcc 300

tgtgaatact gtgaattggg taacgaatcc aactgtcctc acgctgactt gtctggttac 360

acccacgacg gttctttcca agaatacgct accgctgacg ctgttcaagc cgctcacatt 420

cctcaaggta ctgacttggc tgaagtcgcg ccaatcttgt gtgctggtat caccgtatac 480

aaggctttga agtctgccaa cttgagagca ggccactggg cggccatttc tggtgctgct 540

ggtggtctag gttctttggc tgttcaatat gctaaggcga tgggttacag agtcttaggt 600

attgatggtg gtccaggaaa ggaagaattg tttacctcgc tcggtggtga agtattcatc 660

gacttcacca aagagaagga cattgttagc gcagtcgtta aggctaccaa cggcggtgcc 720

cacggtatca tcaatgtttc cgtttccgaa gccgctatcg aagcttctac cagatactgt 780

agggcgaacg gtactgttgt cttggttggt ttgccagccg gtgcaaagtg ctcctctgat 840

gtcttcaacc acgttgtcaa gtctatctcc attgtcggct cttacgtggg gaacagagct 900

gataccagag aagccttaga tttctttgcc agaggtctag tcaagtctcc aataaaggta 960

gttggcttat ccagtttacc agaaatttac gaaaagatgg agaagggcca aattgctggt 1020

agatacgttg ttgacacttc taaataa 1047

<210> 21

<211> 2139

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 21

atgtcgccct ctgccgtaca atcatcaaaa ctagaagaac agtcaagtga aattgacaag 60

ttgaaagcaa aaatgtccca gtctgccgcc actgcgcagc agaagaagga acatgagtat 120

gaacatttga cttcggtcaa gatcgtgcca caacggccca tctcagatag actgcagccc 180

gcaattgcta cccactattc tccacacttg gacgggttgc aggactatca gcgcttgcac 240

aaggagtcta ttgaagaccc tgctaagttc ttcggttcta aagctaccca atttttaaac 300

tggtctaagc cattcgataa ggtgttcatc ccagacccta aaacgggcag gccctccttc 360

cagaacaatg catggttcct caacggccaa ttaaacgcct gttacaactg tgttgacaga 420

catgccttga agactcctaa caagaaagcc attattttcg aaggtgacga gcctggccaa 480

ggctattcca ttacctacaa ggaactactt gaagaagttt gtcaagtggc acaagtgctg 540

acttactcta tgggcgttcg caagggcgat actgttgccg tgtacatgcc tatggtccca 600

gaagcaatca taaccttgtt ggccatttcc cgtatcggtg ccattcactc cgtagtcttt 660

gccgggtttt cttccaactc cttgagagat cgtatcaacg atggggactc taaagttgtc 720

atcactacag atgaatccaa cagaggtggt aaagtcattg agactaaaag aattgttgat 780

gacgcgctaa gagagacccc aggcgtgaga cacgtcttgg tttatagaaa gaccaacaat 840

ccatctgttg ctttccatgc ccccagagat ttggattggg caacagaaaa gaagaaatac 900

aagacctact atccatgcac acccgttgat tctgaggatc cattattctt gttgtatacg 960

tctggttcta ctggtgcccc caagggtgtt caacattcta ccgcaggtta cttgctggga 1020

gctttgttga ccatgcgcta cacttttgac actcaccaag aagacgtttt cttcacagct 1080

ggagacattg gctggattac aggccacact tatgtggttt atggtccctt actatatggt 1140

tgtgccactt tggtctttga agggactcct gcgtacccaa attactcccg ttattgggat 1200

attattgatg aacacaaagt cacccaattt tatgttgcgc caactgcttt gcgtttgttg 1260

aaaagagctg gtgattccta catcgaaaat cattccttaa aatctttgcg ttgcttgggt 1320

tcggtcggtg agccaattgc tgctgaagtt tgggagtggt actctgaaaa aataggtaaa 1380

aatgaaatcc ccattgtaga cacctactgg caaacagaat ctggttcgca tctggtcacc 1440

ccgctggctg gtggtgttac accaatgaaa ccgggttctg cctcattccc cttcttcggt 1500

attgatgcag ttgttcttga ccctaacact ggtgaagaac ttaacaccag ccacgcagag 1560

ggtgtccttg ccgtcaaagc tgcatggcca tcatttgcaa gaactatttg gaaaaatcat 1620

gataggtatc tagacactta tttgaaccct taccctggct actatttcac tggtgatggt 1680

gctgcaaagg ataaggatgg ttatatctgg attttgggtc gtgtagacga tgtggtgaac 1740

gtctctggtc accgtctgtc taccgctgaa attgaggctg ctattatcga agatccaatt 1800

gtggccgagt gtgctgttgt cggattcaac gatgacttga ctggtcaagc agttgctgca 1860

tttgtggtgt tgaaaaacaa atctagttgg tccaccgcaa cagatgatga attacaagat 1920

atcaagaagc atttggtctt tactgttaga aaagacatcg ggccatttgc cgcaccaaaa 1980

ttgatcattt tagtggatga cttgcccaag acaagatccg gcaaaattat gagacgtatt 2040

ttaagaaaaa tcctagcagg agaaagtgac caactaggcg acgtttctac attgtcaaac 2100

cctggcattg ttagacatcc aattgattcg gtcaagttg 2139

<210> 22

<211> 6648

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 22

atgagtagtg ttaaccactc tctccgtcat tcaaagctac cgccgcattt ccttggtctc 60

aactcggttg aagtcgctgc tccctccaag gtcagagact ttgtcaggga ccatggtggc 120

cactcggtca tcacgagagt gctgatcgca aacaacggta tagctgccgt gaaagaaatt 180

cgttccgtca ggaaatgggc gtatgaaacg tttggtaacg atagagccat tcaatttatt 240

gttatggcta ccccagagga tcttgaagct aatgctgaat atattcgaat ggctgaccag 300

tatgtcatgg tcccaggagg aactgcaaac aacaactatg cgaacgtcga cctcattgta 360

gaaatagcag aatctactga tgctcatgct gtttgggctg gttggggttt tgcctccgaa 420

aatccccatt tgcctgagca actggccgct tctcctaaga agattatctt cattggccct 480

ccgggctctg ccatgcgatc tcttggtgac aagatttcct ctactattgt cgcacaacat 540

gctaaagtcc catgtattcc ttggtcagga actggtgtcg atcaggttat aatcgacccc 600

gtaagcaatt tggtttccgt tgatgaagaa acgtacgcca aaggatgctg ttccgatcca 660

caggacggtt tggcaaaagc caaggctatt ggtttccctg tgatgattaa agcttccgaa 720

ggtggtggtg gtaaaggaat tagaaaagtt gacagggagg aagattttct ttctctttat 780

gatcaagctg ctaatgaaat tccaggttcc ccaattttta tcatgaagct tgctggagat 840

gccaggcatt tggaagttca attacttgct gatcaatatg gaaccaacat ctcccttttt 900

ggaagagatt gttccgttca aagaagacac caaaagatca tagaagaggc accagttacc 960

attgccaaac aagacacttt caggcaaatg gaacaagccg ctgtcagact gggtcaattg 1020

gttggatacg tttctgccgg taccgttgag tatctatatt cacacgctga ggacaagttc 1080

tacttcttgg aactgaaccc tcgtcttcaa gttgagcatc caaccacaga aatggccaca 1140

ggtgtcaatc ttccagttgc ccagttgcta attgcaatgg gtattccttt gaatagaatc 1200

agagatatca gggtacttta cggacttgaa ccaaatggcg ctacagaaat tgactttgaa 1260

ttcaaaactg aagaaagctt gaagagtcaa agaaaaccca ttccaaaggg tcacactatt 1320

gcatgtcgta tcacatctga agatcctggt gaaggtttta agccttctgg tggtgctcta 1380

tatgagctaa atttcagatc ttcttctagc gtttggggtt acttcagtgt aggaaacaaa 1440

tcctcaattc attctttcag tgactctcaa tttggtcata tattctcgtt tggcgaaaac 1500

cgtcaaatcg ccagaaaaaa tatggtcgtc gccttgaaag agctttctat tcgtggtgac 1560

tttagaacta caattgagta cttaataaaa ctgttggaaa cagctgattt cgagaacaac 1620

accatcacta ctggttggtt ggacgaactg atctcgaaga agctgactgc tgaaagacct 1680

gatgaaacca cagcaatttt atgtggtgct gaaaaaggtc aaatcccagg caaagaactt 1740

cttcgtacta ttttcccaat tgaatttatt tatgaaggaa agaagtacaa gtttactgtg 1800

gttcaggctg catttgacaa atacaacgtc tttgtcaacg gatgtatgat tactgtaagt 1860

gtaacccatt tgaaggatgg cagtttattg gtagcacttg atggtaaatc ccattctgtc 1920

tattacttgc aggaagaagt cggaaatact aggttgtcgg tggatggtaa atcttgcatt 1980

ttagaagttg agcatgagcc aactgaactt cgtactccat ctccaggtaa acttatcaaa 2040

tatcttgtgg aacacggtga tcacgtcaaa attggacaac cttacgctga agttgaagta 2100

atgaagatgt gtatgccttt ggtcagtcag gagaatggaa ctatcaggtt attgaagcag 2160

ccaggatctt cggttgccgc tggagacatc cttgctattc ttgcattgga tgatcccagc 2220

aaggtgaagc atgctttgcc attcgatggt acaatccctg atatgaaaca gccatttatc 2280

catagcaaca aaccagttta taagttcatt tctcttctct ccgtgctgaa aaacatttta 2340

gcagggtatg ataatcaagt tgtgatgaac gatactctgc agagtctatt ggatgtgttg 2400

aagaaccctg aacttcctta ttcggaatgg aatcattcga tatctgcact tcattcaagg 2460

ttaccaattc atttggacga acaattgacc agtttgattg agagatcgca tcaacgtggt 2520

gcagactttc cagctaagca cttgctcaag cttttggaca aggagcaggc tgttaatcct 2580

gatccacttt tctcccaggt cattgcgcct cttactgctg ttgccaaaag ctacgaacat 2640

ggacttgaag ttcatgaaca caatgtattc gccgatttga tcacccaata ctacgacata 2700

gagagcttgt ttgccgataa aagggaggaa gatgttattt tacagctacg tgatgagaac 2760

aaatcgtccc ttgacaaggt catcgatgtc gtcttgtcac attccagagt tggagctaag 2820

aaccatttaa tcagagctat tctggaaatt tatcaaacta tctgccaaaa tgatctccaa 2880

gctgcaacca ttttgaagaa acctttgaaa aagattgttg agctagattc tagatttaca 2940

gcaaaggttt cgttaaaagc tagagagatt ttgattcaat gttcccttcc ctctatcaaa 3000

gaacgttcag accagctcga gcatatcctt cgatcttcag ttgtacaaac tcagtacgga 3060

gagagcttca atggaaacta caaactgcct aacttggacg ttatacaaga cgtaattgat 3120

tccaagtaca ttgtattcga tgttttgaca caatttgttg ttagcccaaa caagtatata 3180

tttgcagcag cagccgaggt gtatctgcga agagcttaca gggcttactc ggtgagagaa 3240

gttaaacatc atttcgtagg tgattctgct ctcccaattg tggaatggaa gttccaattg 3300

ccgctgttat caacagctgc ttacaattcc gtgcctgaag ctatgagaaa ctcctccagt 3360

aaccgatcct ctatttcaat ggatagagca gttgctgtct ccgatttgac cttcatgatc 3420

aacaagaatg attctcaacc tttgagaaca ggtatcataa ttcccacaaa ccacttagat 3480

gacattgagg agtccttgtc atctgccatt gatgtcttcc ctaaacgtcc acgtaacaat 3540

ggaccagctc ctgacagaac taatgtggct cctgagcaac ctactaacgt atgcaatgtt 3600

ttcattgcca atgtttctgg ctacaacagt gaggctgaga tcgttgacaa gattagcagc 3660

gttctttctg agttgaaaga cgacctcagg gctagtggcg ttcgaagagt tacctttgtc 3720

ttgggagaca aggttggaac ttatccaaaa tactatacct tcaaatttcc agactatttt 3780

gaagacgaga caatccgtca catagagcct gctcttgcgt tccagctgga actaagaaga 3840

ttgtccaatt tcaatattaa acctgttcca actgagaata gaaatattca tgtgtatgag 3900

gcagttgcca aaaatacttc atgcattgac aggagatttt ttactagggg tatcatcaga 3960

acaagcagaa tcagagagga tgtgactatc tctgaatacc ttatcagcga agctaatcgt 4020

cttatgagtg acattttgga cgctcttgag attattgata cctccaacac tgatttgaac 4080

catatattca tcaatttctc tgctgttttc aatgtcacgc cagatgacgt tgaagcagcg 4140

ttcggtggtt tcttagaaag gtttggacgt aggctgtgga gactacgtgt ttctgctgct 4200

gaaatccgta ttatgtgcac ggaccctgag actggtatcc cattcccact tcgtgcttta 4260

attaacaacg tttcaggata cgttgtgaaa tctgaaatgt atcaagaggt gaaaaatgat 4320

catggggaat gggttttcaa aagtcttggt cctacaccag gttcaatgca ccttagacca 4380

atttcaacac catacccaac caaagaatgg cttcaaccaa aacgttacaa agctcatctt 4440

atgggtacta cttacgtgta tgatttccct gaattattcc gtcaagctac gctctcccaa 4500

tggaaaaaat actctcctac tgcgagagtt ccttctgatg tgtttgtggc caatgaattg 4560

atcgtcgatg attcaggtga actaactgaa gtaagcagag aacccggcgc caacgttgtg 4620

ggtatggtgg ccttcaaggt aaccgcaaaa actcctgagt atccacgcgg tcgccatttc 4680

atcataattg ctaatgatat caccttcaag atcggatcct ttggccctca agaagatgaa 4740

tatttcaaca aggccacaca acttgcaaga aaattgggca ttcctcgaat ttatctgtca 4800

gccaactcgg gtgctagaat tggagttgct gaagaacttc ttccattatt caaagtagcc 4860

tggaaggaag aaggtaaacc aagcaaggga tttgaatact tatacctcac atcggaagat 4920

cttactctat tggaaaagtc cggaaagtct aacagcgtta ccactcaaag aatagttgaa 4980

gaaggcgaag aacgccacgt tataactgcc atcattggag ctagtgatgg actgggtgtt 5040

gaatgtctaa gaggttccgg tttgatcgct ggtgctacat ctcgggcgta caaggacatc 5100

ttcactatca cattggtcac ctgtagatct gttggtattg gtgcttactt ggtcagattg 5160

ggtcaacgag ccattcaaat tgaaggacaa ccaataattt tgactggtgc ccctgctatt 5220

aataagttgt tgggtaggga agtgtactct tccaacctgc aacttggtgg tacccagatt 5280

atgtacaaga acggtgtttc acacttaacc gccaatgatg atctcgcagg tgtcgaaaag 5340

attatggatt ggttagctta tgtgcctgct aagagaaaca tgcctgttcc tattttagaa 5400

tcacttcatg acaaatggga cagagatgtg gactataagc ctacaagaaa tgagccgtac 5460

gacgtcagat ggatgatcag tggacgtgaa actcctgatg gtgagttcga atctggattg 5520

tttgactctg ggtccttcac tgaaactttg agtggatggg ctaaaggtgt agtcgtcgga 5580

agagcccgtt taggtggtat tcctatggga gtcattggtg ttgaaactag agtcacagaa 5640

aacctgattc cagctgatcc cgccaatcca gactcaaccg aaatgatgat tcaagaagct 5700

ggtcaagtct ggtaccctaa cagtgccttc aagactgcac aagctatcaa cgatttcaac 5760

aatggtgaac agctaccctt gatgattttg gccaactgga gaggtttctc tggtggtcaa 5820

agagacatgt acaatgaagt tttgaaatac ggttctttca ttgtggatgc tttagtcgac 5880

ttcaagcagc ctatcttcac ttacattcct cccactgctg agttgagagg tggatcttgg 5940

gttgttgtag accctaccat caatgaagac atgatggaaa tgtatgcaga cgtcgaatca 6000

agagcaggtg ttttggaacc agaaggtatg gtaggtatca aataccgtaa ggacaaactc 6060

cttgctacta tggaacgatt ggatgccaaa tatgctgagc ttaaatccaa ggttagcgat 6120

actagtcttt cagaaaagga tgtttccgag atcaagaaac aaattgagca gagagagaag 6180

caattgttgc caatttatgc acaaatctct attcaatttg ctgatcttca tgacagatct 6240

ggtcgtatgt tggccaaggg tgtcattaaa aaggaactgg aatgggttaa ttctcgtcgt 6300

ttcttcttct ggagagtccg tcgtcgtttg aacgaggaat acctcattaa gcgtattacc 6360

gaattcctat ctgcttctgc taccagattg gacaagatct cgaggatcaa ttcttggttg 6420

ccaacatcga ttgatttgga agatgaccag aaggttgcca tttggttgga agaaaaccgt 6480

aaagctcttg acgccaatat caaggagctc agggctgagc atgttagaag aactctggct 6540

actcttgtca gaactgatat ggatactact tccaagagtt tggctgaatt gatcaacctt 6600

cttcctgaaa ccgaaaagga atcaatttta tctaagatca agtcatga 6648

Claims

1.一种二氢莫纳可林L的异源生产方法，包括：

(1) 提供酵母工程菌，以启动子驱动表达外源的下组基因：lovB，lovC，lovG，npgA；并以乙醇诱导型启动子驱动表达转录激活因子uta，所述uta的核苷酸序列如SEQ ID NO: 7所示；以P_AOX1R作为驱动lovB，lovC，lovG，npgA表达的启动子，P_AOX1R的核苷酸序列如SEQ IDNO: 8所示；所述酵母为毕赤酵母；

(2) 以乙醇作为碳源、前体和/或诱导剂，培养(1)的酵母工程菌，从而生成产物二氢莫纳可林L。

2.一种莫纳可林J的异源生产方法，包括：

(a) 提供酵母工程菌，以启动子驱动表达外源的下组基因：lovB，lovC，lovG，npgA；并以乙醇诱导型启动子驱动表达转录激活因子uta，所述uta的核苷酸序列如SEQ ID NO: 7所示；所述酵母为毕赤酵母；以P_AOX1R作为驱动lovB，lovC，lovG，npgA表达的启动子，P_AOX1R的核苷酸序列如SEQ ID NO: 8所示；

(b) 提供酵母工程菌，以启动子驱动表达外源的下组基因：lovA，cpr；并以乙醇诱导型启动子驱动表达转录激活因子uta；

(c) 以乙醇作为碳源、前体和/或诱导剂，培养(a)和(b)的酵母工程菌的混合菌，从而生成产物莫纳可林J。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，(1)或(a)中，所述的酵母工程菌还表达外源的乙醇脱氢酶ADH、乙酰辅酶A合成酶ACS和乙酰辅酶A脱羧酶ACC。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，(1)或(a)或(b)中，以P_ICL1为乙醇诱导型启动子。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，(c)中，(a)和(b)的酵母工程菌的混合菌中，(a)菌:(b)菌的比例为1:0.1～1。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，(a)菌:(b)菌的比例为1:0.2～0.5。

7. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)或(c)中，以添加乙醇的酵母基础氮源培养基进行培养，在发酵前期使用葡萄糖作为碳源进行补料；在菌体湿重达到200～400 g/L后，之后切换碳源至乙醇补料。

8. 一种用于生产二氢莫纳可林L的酵母工程菌，其特征在于，所述酵母工程菌中包含以启动子驱动表达的外源的下组基因：lovB，lovC，lovG，npgA，以及以乙醇诱导型启动子驱动表达的转录激活因子uta，所述uta的核苷酸序列如SEQ ID NO: 7所示；以P_AOX1R作为驱动lovB，lovC，lovG，npgA表达的启动子，P_AOX1R的核苷酸序列如SEQ ID NO: 8所示；所述酵母为毕赤酵母。

9.如权利要求8所述的用于生产二氢莫纳可林L的酵母工程菌，其特征在于，其还包含外源的乙醇脱氢酶ADH、乙酰辅酶A合成酶ACS和乙酰辅酶A脱羧酶ACC的编码基因。

10. 一种用于生产莫纳可林J的酵母工程菌，其特征在于，所述酵母工程菌中包含以启动子表达的外源的下组基因：lovA，cpr；以及以乙醇诱导型启动子驱动表达的转录激活因子uta，所述uta的核苷酸序列如SEQ ID NO: 7所示；以P_AOX1R作为驱动lovA，cpr表达的启动子，P_AOX1R的核苷酸序列如SEQ ID NO: 8所示；所述酵母为毕赤酵母。

11.权利要求8～10任一所述的酵母工程菌的用途，用于以乙醇作为碳源、前体和/或诱导剂，生产二氢莫纳可林L或莫纳可林J。

12.一种用于生产莫纳可林J或其中间体的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含权利要求8～10任一所述的酵母工程菌。

13. 一种用于生产莫纳可林J或其中间体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含一构建物，其包括启动子以及下组基因：lovB、lovC、lovG、npgA，以乙醇诱导型启动子驱动表达的转录激活因子uta；和/或另一构建物，其包括启动子以及下组基因：lovA、cpr，以乙醇诱导型启动子驱动表达的转录激活因子uta；所述的uta的核苷酸序列如SEQ ID NO: 7所示；以P_AOX1R作为驱动lovB、lovC、lovG、npgA、lovA、cpr表达的启动子，P_AOX1R的核苷酸序列如SEQ ID NO: 8所示。

14.如权利要求12或13所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括含有乙醇作为碳源、前体和/或诱导剂的培养基。