[go: up one dir, main page]

CN108913662B - 一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法 - Google Patents

一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108913662B
CN108913662B CN201810901153.1A CN201810901153A CN108913662B CN 108913662 B CN108913662 B CN 108913662B CN 201810901153 A CN201810901153 A CN 201810901153A CN 108913662 B CN108913662 B CN 108913662B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
lung cancer
tumor
culture
screening
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810901153.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108913662A (zh
Inventor
马永贤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aike Jingyi (beijing) Biomedical Technology Co Ltd
Original Assignee
Aike Jingyi (beijing) Biomedical Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aike Jingyi (beijing) Biomedical Technology Co Ltd filed Critical Aike Jingyi (beijing) Biomedical Technology Co Ltd
Priority to CN201810901153.1A priority Critical patent/CN108913662B/zh
Publication of CN108913662A publication Critical patent/CN108913662A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108913662B publication Critical patent/CN108913662B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法，与以往方法不同，可为癌症患者提供精准个体化治疗选药。本发明通过控制肿瘤细胞培养液中庆大霉素和霍乱霉素的浓度，可以提高肿瘤细胞的成活率，有效维持细胞形态促进肿瘤细胞对营养物质的吸收。通过控制肿瘤细胞培养液中胰岛素与所述的EGF的浓度，可以提高肿瘤细胞的生长速率，并提高细胞活性，可以得到大量的高活性肿瘤细胞，同时使用该比例的胰岛素和生长因子可以降低胎牛血清的使用量，由于胎牛血清价格比较昂贵，使用量减少有利于节约资源，并且使用本发明培养的细胞用于药物筛选测定的用药的半数抑制浓度(IC50)误差小，可以减少检测次数。

Description

一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法。
背景技术
肺癌是中国人死亡率最高的肿瘤，严重威胁国人的健康。中国肺癌患者在诊断时大部分(约75％)属于晚期，不能手术。主要治疗包括放射治疗，化学治疗，靶向药物治疗和免疫治疗等综合性治疗。
肿瘤的精准个体化治疗是近几年提出的，即根据肿瘤个体生物信息数据，基因突变的情况，肿瘤原代细胞对各种肿瘤药物的作用效果等综合信息，为肿瘤患者选择最佳的治疗药物方案，区别于传统的经验性性治疗方案。因为传统的经验性治疗方案有多种，由于肿瘤是一种异质性疾病，同一种肿瘤的不同患者对同一种药物治疗方案的效果差异很大，每一种传统经验性肿瘤治疗方案有效率差异很大，有效率在20％至40％，无效的治疗药物方案，不能杀死肿瘤细胞，而且有很多副作用，尤其是抑制机体的免疫力，促进肿瘤细胞的扩散。基因检测在肺癌治疗选择靶向药物方面已经取得良好效果，但是只有40％左右的肺癌患者可找到靶向药物，有效率在45％-75％左右，并且在一年左右都会产生耐药。ROHS(Reprogramed organoid Based High-throughput screening，重编程类器官高通量药物筛选，是用特殊方法将患者自己的肿瘤细胞从肿瘤组织中分离出来，在实验室保真扩增，生成大量微小肿瘤进行药物筛选的一种高通量药效检测技术，实现肿瘤患者的精准个体化治疗，这一技术有别于基因检测的技术，应用范围更广泛。为改善肿瘤患者的治疗效果带来极的希望。
随着环境的恶化肺癌成为发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，近几十年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完全明确，大量资料表明，长期大量吸烟与肺癌的发生有密切的关系。已有的研究证明：长期大量吸烟者患肺癌的概率是不吸烟者的10-20倍，开始吸烟的年龄越小，患肺癌的几率越高。此外，吸烟不仅直接影响本人的身体健康，还对周围的人群的健康产生不良的影响，导致被动吸烟者肺癌患病率明显增加。城市居民肺癌的发病率比农村高，这可能与城市大气污染和烟尘中含有致癌物有关。由于组合化学的出现和和快速发展，使得合成大量有潜在临床治疗功能的化合物速度也大为提高了，然而评估这些药物化合物的稳定性，以及对各种药物对癌细胞的治疗情况，目前常使用一些体内的评价方法，但是由于手术难度大，费用昂贵，其在药物筛选方面的应用很受限制。
抗肿瘤药物的筛选是抗肿瘤药物研究工作中非常重要的环节，建立合理的筛选体系，发现新的抗肿瘤药物，是肿瘤药物研究的一项重要课题，抗肿瘤药物的筛选方法繁多，总体上分为体内和体外方法两类，每种方法各有其优点及局限性，目前尚缺少有效的技术手段用于筛选和鉴定抗肿瘤的药物。因此，建立新的快速、方便、准确、高通量和高效率的检测方法具有重要的意义。
随着对肿瘤细胞凋亡机制的深入研究，药物诱导肿瘤细胞凋亡已成为目前肿瘤治疗的重要途径之一。高通量药物筛选技术是将多种技术方法有机结合而形成的新的技术体系，它以分子水平或细胞水平的试验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏、快速的检测仪器采集实验数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处理，在同一时间内对数以千、万计的样品进行检测，并以相应的数据库支持整个技术体系的正常运转。
据有关报道，20世纪90年代初期，一个实验室采用传统的方法，借助20余种药物作用靶位，一年内仅能筛选7.5万个样品。而在1997年高通量筛选发展的初期，采用100余种靶位，每年可筛选100万个样品。到1999年，由于高通量筛选的进一步完善，每天的筛选量就高达10万种化合物。
高通量药物筛选可以分成四部分：药物筛选模型、高容量的样品库、自动化工作站和高效率的数据处理系统，其中药物筛选模型是关键，高容量的样品库是药物筛选的先决条件。
随着高通量药物筛选的发展，将其运用于癌症药物的筛选可以加快药物筛选时间，减少人力物力，进而减轻患者的病痛，在短时间内发现可以有效治疗的药物，例如中国专利申请201510829192.1公开了一种抗包虫药物的高通量筛选方法，其具体公开了一种利用小鼠继发性细粒棘球蚴生发层细胞进行抗包虫药物的高通量筛选方法。采用的方案是：用细粒棘球蚴原头节感染实验小鼠，建立包虫病继发感染模型8-10个月后，剖检病鼠取出其体内棘球蚴囊，分离生发层细胞并建立细胞系。调整该细胞浓度并于96孔培养板中进行铺板，利用药物作用后细胞活性变化及细胞内源物质释放情况对药物作用效果进行评价，本发明极大地降低了药物筛选周期，不仅待测药物的用量少，而且提高了筛选精确度，降低了筛选成本。
又如，中国专利申请201110245360.4中公开了肺癌药物筛选细胞株的建立，该申请公开了一种人肺癌细胞株，还公开了该细胞株的构建方法及用途，所述的人肺癌细胞株具有高染色体整合度、高荧光强度、遗传性状稳定且对肺癌药物敏感的特点，是一种理想的研究肺癌药物筛选的模型，但是该申请对于药物的选择以及治疗效果并没有具体描述。
综上，由于当今社会各种化学物质的使用以及环境污染导致癌症的的发病率越来越高，如何有效快速的选出治疗肺癌的药物提高治疗效果成为肿瘤药物研究的一项重要课题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明旨在提供一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法，包括如下步骤：
(1)肺癌细胞的获取：从新鲜手术或者穿刺标本获取肺癌肿瘤组织，消化肿瘤组织，分离得到分散的肺癌细胞。
(2)肺癌细胞的扩增培养：对步骤(1)中得到的肺癌细胞在实验室进行保真扩增培养，生成微小肿瘤，即得到肺癌重编程类器官；
(3)肺癌细胞的贴壁培养：将步骤(2)中得到的肺癌重编程类器官分散，接种384孔板，贴壁培养得到贴壁细胞；
(4)药物筛选：将步骤(3)中制备的贴壁细胞进行候选药物处理，并检测细胞生存率，进行药物筛选。
上述步骤(1)中所述的消化是：用消化酶消化。所述消化酶由225单位/mL的胶原酶或透明质酸酶和13单位/mL的分散酶组成，然后用为肺癌肿瘤组织4倍体积的含10％小牛血清的DMEM细胞培养液中止消化，收集消化液。
上述步骤(2)中所述的培养是：将步骤(1)中得到的分散肿瘤细胞置于肿瘤细胞培养液中在37℃的CO2孵箱中进行培养，培养2-3周得到肿瘤细胞株；
所述的肿瘤细胞培养液为每500mL含有以下成分：
上述成分中完全DMEM(含6-10％的胎牛血清)表示：胎牛血清与完全DMEM的体积百分比为6-10％。
在一个优选实施例中，所述的两性霉素B和氢化可的松的浓度比为9-12∶1；优选为，所述的两性霉素B和氢化可的松的浓度比为9-11∶1；再优选为，所述的两性霉素B和氢化可的松的浓度比为9-10∶1。
上述步骤(3)中所述的培养是：将步骤(2)中得到的肺癌重编程类器官用消化酶进行消化，然后用肿瘤选择性培养液稀释，贴壁过夜培养；所述消化酶为0.05％胰酶-EDTA。
所述的肿瘤选择性培养液为每500mL含有以下成分：
在另一个优选实施方案中，所述的选择性肿瘤细胞培养液中所述的胰岛素与转铁蛋白的浓度比为1∶10-30。
上述成分中RPMI 1640培养基(含2-5％胎牛血清)表示：胎牛血清与RPMI 1640培养基的体积百分比为2-5％。
具体来说，本发明的技术方案是：一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法，具体操作步骤为：
(1)肺癌细胞的获取：将获得的肺癌细胞在无菌条件下去掉其脂肪组织，用消化酶消化，所述消化酶由225单位/mL的胶原酶或透明质酸酶和13单位/mL的分散酶组成，然后用为肺癌肿瘤组织4倍体积的含10％(体积百分比)小牛血清的DMEM细胞培养液中止消化，收集消化液，离心后收集沉淀，得到分散的肺癌细胞；
(2)肺癌细胞的扩增培养：用肿瘤细胞培养液将步骤(1)中获得的分散的肺癌细胞重悬沉淀在实验室进行保真扩增培养，放置于培养瓶并放置于37℃的CO2孵箱中进行培养，培养2-3周得到微小肿瘤，即得到肺癌重编程类器官；(3)肺癌细胞的贴壁培养：将步骤(2)中培养得到的肺癌重编程类器官用0.05％胰酶-EDTA进行消化，并用自动细胞计数仪进行计数，接种384孔板，然后用肿瘤选择性培养液稀释后贴壁培养过夜，即得贴壁的肺癌细胞。
(4)药物筛选：将步骤(3)中得到的贴壁的肺癌细胞用各种传统化疗药物，靶向药物或几种药物组合等候选药物处理72小时后，用ATP化学发光法(Promeaga)检测细胞生存率，进行药物筛选。
所述的肿瘤细胞培养液为每500mL含有以下成分二
上述成分中完全DMEM(含6-10％的胎牛血清)表示：胎牛血清与完全DMEM的体积百分比为6-10％。
在一个优选实施例中，所述的两性霉素B和氢化可的松的浓度比为9-12∶1；优选为，所述的两性霉素B和氢化可的松的浓度比为9-11∶1；再优选为，所述的两性霉素B和氢化可的松的浓度比为9-10∶1。
上述步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液为每500mL含有以下成分：
在另一个优选实施方案中，所述的选择性肿瘤细胞培养液中所述的胰岛素与转铁蛋白的浓度比为1∶10-30。
上述成分中RPMI 1640培养基(含2-5％胎牛血清)表示：胎牛血清与RPMI 1640培养基的体积百分比为2-5％。
本发明的有益效果是：
1、本发明公开使用本发明提供的肿瘤细胞培养液对肿瘤细胞进行培养，通过控制庆大霉素和霍乱霉素的浓度，可以提高肿瘤细胞的成活率，有效维持细胞形态促进肿瘤细胞对营养物质的吸收。
2、本发明公开使用本发明提供的肿瘤细胞培养液对肿瘤细胞进行培养，通过控制胰岛素与所述的EGF的浓度，可以提高肿瘤细胞的生长速率，并提高细胞活性，可以得到大量的高活性肿瘤细胞，同时使用该比例的胰岛素和生长因子可以降低胎牛血清的使用量，由于胎牛血清价格比较昂贵，使用量减少有利于节约资源。
3、本发明在实施过程中使用肿瘤选择性培养液对肿瘤细胞株进行稀释处理，并控制肿瘤选择性培养液中所述的胰岛素与转铁蛋白的浓度比为1∶10-30，进行过夜培养得到生存状况良好的贴壁细胞，从而可以进一步提高药物筛选的准确性。
4、用本发明提供的药物筛选方法，可用于筛选对患者最为有效，副作用小的传统的化疗药物和靶向药物。
附图说明
图1为靶向药剂量反应曲线
图1：——4 Ponatinib(波帕替尼)；——5 Vandetanib(范德塔尼)；——8阿发替你；——9吉非替尼；——10克唑替尼；——11奥希替尼；——12厄洛替尼；——21埃克替尼；——37依维莫司；——39 Bortezomib(硼替佐米)；——40 Bosutinib(博苏替尼)；——41 Cabozantinib(卡巴赞替)；——42 Ceritinib(色瑞替尼)；——43 Cobimetinib(柯比提尼)；——44 Dasatinib(达沙替尼)；——45 Ibrutinib(伊布替尼)；——46 Idelalisib(艾代拉利司)；——47 Rapamycin(雷帕霉素)；——48 Vismodegib(维斯莫代吉)。
图2为非靶向药剂量反应曲线
图2：——6吉西他滨；——7依托泊苷；——13多西他赛；——14紫杉醇；——15表阿霉素；——17培美曲塞；——38长春瑞滨。
图3为联合用药药剂量反应曲线
图3：——1卡铂+紫杉醇；——2卡铂+吉西他滨；——3卡铂+培美曲塞；——16表阿霉素+紫杉醇；——18表阿霉素+环磷酰胺；——19顺铂+依托泊苷；——20卡铂+依托泊苷；——22顺铂+长春瑞滨；——23顺铂+紫杉醇；——24顺铂+吉西他滨；——25顺铂+伊立替康；——26顺铂+阿法替尼；——27顺铂+吉非替尼；——28顺铂+拉帕替尼；——29顺铂+奥希替尼；——30顺铂+培美曲塞；——31顺铂+依托泊苷；——32顺铂+依托泊苷+环磷酰胺；——33卡铂+伊立替康；——34卡铂+依托泊苷；——35卡铂+多西他赛；——36阿霉素+长春新碱+环磷酰胺。
图4为药物相对药效剂量反应曲线
图4：——4 Ponatinib(波帕替尼)；——5 Vandetanib(范德塔尼)；——8阿法替尼；——9吉非替尼；——10克唑替尼；——11奥希替尼；——15表阿霉素；——16表阿霉素+紫杉醇；——18表阿霉素+环磷酰胺；——39 Bortezomib(硼替佐米)。
图5为药物(编号1-24)剂量反应曲线
图5：——1卡铂+紫杉醇；——2卡铂+吉西他滨；——3卡铂+培美曲塞；——4Ponatinib(波帕替尼)；——5 Vandetanib(范德塔尼)；——6吉西他滨；——7依托泊苷；——8阿法替尼；——9吉非替尼；——10克唑替尼；——11奥希替尼；——12厄洛替尼；——13多西他赛；——14紫杉醇；——15表阿霉素；——16表阿霉素+紫杉醇；——17培美曲塞；——18表阿霉素+环磷酰胺；——19顺铂+依托泊苷；——20卡铂+依托泊苷；——21埃克替尼；——22顺铂+长春瑞滨；——23顺铂+紫杉醇；——24顺铂+吉西他滨。
图6为药物(编号25-48)剂量反应曲线
图6：——25顺铂+伊立替康；——26顺铂+阿法替尼；——27顺铂+吉非替尼；——28顺铂+拉帕替尼；——29顺铂+奥希替尼；——30顺铂+培美曲塞；——31顺铂+依托泊苷；——32顺铂+依托泊苷+环磷酰胺；——33卡铂+伊立替康；——34卡铂+依托泊苷；——35卡铂+多西他赛；——36阿霉素+长春新碱+环磷酰胺；——37依维莫司；——38长春瑞滨；——39 Bortezomib(硼替佐米)；——40 Bosutinib(博苏替尼)；——41 Cabozantinib(卡巴赞替)；——42 Ceritinib(色瑞替尼)；——43 Cobimetinib(柯比提尼)；——44Dasatinib(达沙替尼)；——45 Ibrutinib(伊布替尼)；——46 IdeIaIisib(艾代拉利司)；——47 Rapamycin(雷帕霉素)；——48 Vismodegib(维斯莫代吉)。
具体技术方案
以下实施例中提到的肺癌细胞取自宁夏银川、上海、张家口、北京、山西等地的肺癌患者体内，术中冰冻病理报告证实为肺癌。
第一组实施例
实施例1一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法
具体操作步骤为：
(1)肺癌细胞的获取：将获得的肺癌细胞在无菌条件下去掉其脂肪组织，切成1mm大小，然后用4mL的消化酶消化2小时，所述消化酶由225单位/mL的胶原酶或透明质酸酶和13单位/mL的分散酶组成，然后用为肺癌肿瘤组织4倍体积的含10％(体积百分比)小牛血清的DMEM细胞培养液中止消化，收集消化液，离心后收集沉淀，得到分散的肺癌细胞；
(2)肺癌细胞的扩增培养：用肿瘤细胞培养液将步骤(1)中获得的分散的肺癌细胞重悬沉淀在实验室进行保真扩增培养，放置于培养瓶并放置于37℃的CO2孵箱中进行培养，培养3周得到微小肿瘤，即得到肺癌重编程类器官；
(3)肺癌细胞的贴壁培养：将步骤(2)中培养得到的肺癌重编程类器官用0.05％胰酶-EDTA进行消化，并用自动细胞计数仪进行计数，接种384孔板，然后用肿瘤选择性培养液稀释，贴壁培养过夜，即得贴壁的肺癌细胞。
(4)药物筛选：将步骤(3)中得到的贴壁的肺癌细胞用各种传统化疗药物，靶向药物或几种药物组合等候选药物处理72小时后，用ATP化学发光法(Promeaga)检测细胞生存率，进行药物筛选。
所述的肿瘤细胞培养液为每500mL含有以下成分：
上述步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液为每500mL含有以下成分：
本实施例1中在实施过程中使用本发明提供的肿瘤培养液以及选择性肿瘤培养液，本实施例中肿瘤细胞培养液中两性霉素B与氢化可的松的浓度范围没有在本发明优选范围内，所以培养液中需要加入10％的胎牛血清，对肿瘤细胞进行了3周的培养可以得到了生长性能好的贴壁肺癌细胞，可以满足药物筛选的要求。
实施例2一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法
具体操作步骤为：
(1)肺癌细胞的获取：将获得的肺癌细胞在无菌条件下去掉其脂肪组织，切成3mm大小，然后用5mL的消化酶消化3小时，所述消化酶由225单位/mL的胶原酶或透明质酸酶和13单位/mL的分散酶组成，然后用4倍体积的含10％(体积百分比)小牛血清的DMEM细胞培养液中止消化，收集消化液，离心后收集沉淀，得到分散的肺癌细胞；
(2)肺癌细胞的扩增培养：用肿瘤细胞培养液将步骤(1)中获得的分散的肺癌细胞重悬沉淀在实验室进行保真扩增培养，放置于培养瓶并放置于37℃的CO2孵箱中进行培养，培养2周得到微小肿瘤，即得到肺癌重编程类器官；
(3)肺癌细胞的贴壁培养：将步骤(2)中培养得到的肺癌重编程类器官用0.05％胰酶-EDTA进行消化，并用自动细胞计数仪进行计数，然后用肿瘤选择性培养液稀释，贴壁培养过夜，即得贴壁的肺癌细胞。
(4)药物筛选：将步骤(3)中得到的贴壁的肺癌细胞用各种传统化疗药物，靶向药物或几种药物组合等候选药物处理72小时后，用ATP化学发光法(Promeaga)检测细胞生存率，进行药物筛选。
所述的肿瘤细胞培养液为每500mL含有以下成分：
上述步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液为每500mL含有以下成分：
实施例2中使用本发明优选的实施方案，控制肿瘤培养液中两性霉素B和氢化可的松的浓度比为10∶1，在本发明公开浓度范围内；并控制肿瘤选择性培养液中胰岛素和转铁蛋白的浓度比为1∶20在本发明公开范围内，意外的发现使用该培养液可以在减少培养液中的胎牛血清的含量(肿瘤培养液中加含6％的胎牛血清，肿瘤选择性培养液中加含2％的胎牛血清)的情况下依然可以在较短的时间内培养出符合要求的肿瘤细胞，并且肿瘤细胞的各种性能都比较好，可以适用于药物筛选。
实施例3一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法
具体操作步骤为：
(1)肺癌细胞的获取：将获得的肺癌细胞在无菌条件下去掉其脂肪组织，切成2mm大小，然后用5mL的消化酶消化2.5小时，所述消化酶由225单位/mL的胶原酶或透明质酸酶和13单位/mL的分散酶组成，然后用为肺癌肿瘤组织4倍体积的含10％(体积百分比)小牛血清的DMEM细胞培养液中止消化，收集消化液，离心后收集沉淀，得到分散的肺癌细胞；
(2)肺癌细胞的扩增培养：用肿瘤细胞培养液将步骤(1)中获得的分散的肺癌细胞重悬沉淀在实验室进行保真扩增培养，放置于培养瓶并放置于37℃的CO2孵箱中进行培养，培养2.5周得到微小肿瘤，即得到肺癌重编程类器官；(3)肺癌细胞的贴壁培养：将步骤(2)中培养得到的肺癌重编程类器官用0.05％胰酶-EDTA进行消化，并用自动细胞计数仪进行计数，接种384孔板，然后用肿瘤选择性培养液稀释，后贴壁培养过夜，即得贴壁的肺癌细胞。
(4)药物筛选：将步骤(3)中得到的贴壁的肺癌细胞用各种传统化疗药物，靶向药物或几种药物组合等候选药物处理72小时后，用ATP化学发光法(Promeaga)检测细胞生存率，进行药物筛选。
所述的肿瘤细胞培养液为每500mL含有以下成分：
上述步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液为每500mL含有以下成分：
实施例3中同样使用了本发明优选的实施方案，控制肿瘤培养液中两性霉素B和氢化可的松的浓度比为10∶1，在本发明公开浓度范围内；并控制肿瘤选择性培养液中胰岛素和转铁蛋白的浓度比为1∶15在本发明公开范围内，但是由于培养基中各成分含量的增加意外的发现使用该培养液可以在减少培养液中的胎牛血清的含量(肿瘤培养液中加含8％的胎牛血清，肿瘤选择性培养液中加含3％的胎牛血清)的情况下依然可以在较短的时间内培养出符合要求的肿瘤细胞，并且肿瘤细胞的各种性能都比较好，可以适用于药物筛选。
为了证明本申请提供的肿瘤细胞培养液具有好的培养效果，每个实施例取100份肺癌肿瘤细胞，分别使用上述实施例1-3的培养方法进行肿瘤细胞培养，监测细胞培养情况。
第二组实施例
实施例4一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法
与实施例1的区别在于：步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液和步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量不同。
步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液中胎牛血清的含量为8％；步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量4％。
实施例5一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法
与实施例1的区别在于：步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液和步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量不同。
步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液中胎牛血清的含量为6％；步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量3％。
实施例6一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法
与实施例1的区别在于：步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液和步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量不同。
步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液中胎牛血清的含量为4％；步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量2％。
实施例7一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法
与实施例2的区别在于：步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液和步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量不同。
步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液中胎牛血清的含量为7％；步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量3％。
实施例8一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法
与实施例2的区别在于：步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液和步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量不同。
步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液中胎牛血清的含量为8％；步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量2％。
实施例9一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法
与实施例3的区别在于：步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液和步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量不同。
步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液中胎牛血清的含量为6％；步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量3％。
实施例10一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法
与实施例3的区别在于：步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液和步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量不同。
步骤(2)中所述的肿瘤细胞培养液中胎牛血清的含量为7％；步骤(3)中所述的肿瘤选择性培养液中胎牛血清的含量2％。
为了进一步证明本申请提供的肿瘤细胞培养液具有好的培养效果，每个实施例取100份肺癌肿瘤细胞，分别使用上述实施例4-10的培养方法进行肿瘤细胞培养，监测细胞培养情况。
根据上述测试数据可以看出，当细胞培养液中营养成分即两性霉素B和氢化可的松以及胰岛素和转铁蛋白的浓度比在本发明优选范围内时，适当减少胎牛血清的含量培养细胞的成功率不会出现明显降低，细胞依然可以保持其原有的形态，但是当营养成分的浓度比不在本发明优选范围内时，细胞培养的成功率会降低，培养得到的细胞无法保持原有形态，从经济上考虑本发明提供的培养液经济环保，节约资源。
试验例药物筛选试验
用上述实施例1-3中培养的肿瘤细胞进行乳腺癌肿瘤药物筛选
1、筛选用药种类
2、筛选药物的半数抑制浓度(IC50)
半数抑制浓度是指抑制效果为50％时所对应的药物浓度，半数抑制是用来衡量药物灵敏度的指标，半数抑制浓度的值越低，说明药物的起效浓度越低，对肿瘤细胞的杀伤力越强。
本发明通过一系列的筛选实验通过图1的检测曲线可知：在靶向药物中39号Bortezomib(硼替佐米)、4号Ponatinib(波帕替尼)、5号Vandetanib(范德塔尼)、10号克挫替尼、11号药物奥希替尼依次对该样本的肿瘤细胞具有良好的抑制作用，其中39号药物ortezomib(硼替佐米)对癌细胞的抑制作用尤为显著。
通过图2的检测曲线可知：在非靶向药物中药物15号表阿霉素、38号长春瑞滨依次对该样本的肿瘤细胞具有良好的抑制作用，其中15号药物表阿霉素对癌细胞的抑制作用尤为显著。
通过图3的检测曲线可知：在联合用药中18号表阿霉素+环磷酰胺、16号表阿霉素+紫杉醇、36号阿霉素+长春新碱+C依次对该样本的肿瘤细胞具有良好的抑制作用，其中18号药物组合表阿霉素+环磷酰胺最为显效。
通过图5、6的检测曲线可知：在所有药物中39号Bortezomib(硼替佐米)、18号表阿霉素+环磷酰胺、15号表阿霉素依次对该样本肿瘤细胞有较强的杀伤作用，其中39号药物Bortezomib(硼替佐米)对该样品癌细胞的抑制作用最为显著。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (6)

1.一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）肺癌细胞的获取：从新鲜手术或者穿刺标本获取肺癌肿瘤组织，消化肿瘤组织，分离得到分散的肺癌细胞；
（2）肺癌细胞的扩增培养：对步骤（1）中得到的肺癌细胞在实验室进行保真扩增培养，生成微小肿瘤，即得到肺癌重编程类器官；
（3）肺癌细胞的贴壁培养：将步骤（2）中得到的肺癌重编程类器官分散，贴壁培养得到贴壁细胞；
（4）药物筛选：将步骤（3）中制备的贴壁细胞进行候选药物处理，并检测细胞生存率，进行药物筛选；
步骤（2）中所述的扩增培养是：将步骤（1）中得到的分散肿瘤细胞置于肿瘤细胞培养液中在37℃的CO2孵箱中进行培养，培养2-3周得到肿瘤细胞株；
所述的肿瘤细胞培养液为每500mL含有以下成分：
完全DMEM 含6-10%的胎牛血清 373mL；
F12培养基 125mL；
胰岛素 5-10μg/mL；
两性霉素B 250-300ng/mL；
庆大霉素 10-15μg/mL；
霍乱毒素 0.1-0.5nM；
EGF 0.125-0.25ng/mL；
氢化可的松 25-30ng/mL；
ROCK抑制剂Y-27632 10-15μmol/L；
步骤（3）中所述的贴壁培养是：将步骤（2）中得到的肺癌重编程类器官用消化酶进行消化，然后用肿瘤选择性培养液稀释后过夜培养；所述消化酶为0.05%胰酶-EDTA；
所述的肿瘤选择性培养液为每500mL含有以下成分：
RPMI 1640培养基 含2-5%胎牛血清 485mL；
庆大霉素 10-15μg/mL；
氢化可的松 10-15nM；
胰岛素 5-10μg/mL；
转铁蛋白 100-150μg/mL；
17 beta-雌二醇 10-15nM；
亚硒酸钠 30-40nM。
2.根据权利要求1所述的肺癌功能性高通量用药筛选的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的消化是：用消化酶消化，然后用为肺癌肿瘤组织4倍体积的含10%小牛血清的DMEM细胞培养液中止消化，收集消化液。
3.根据权利要求2所述的肺癌功能性高通量用药筛选的方法，其特征在于：所述消化酶由225单位/mL的胶原酶或透明质酸酶和13单位/mL的分散酶组成。
4.根据权利要求1所述的肺癌功能性高通量用药筛选的方法，其特征在于：所述的两性霉素B和氢化可的松的浓度比为9-12：1。
5.根据权利要求1所述的肺癌功能性高通量用药筛选的方法，其特征在于：所述的选择性肿瘤细胞培养液中所述的胰岛素与转铁蛋白的浓度比为1：10-30。
6.根据权利要求1-5任一项所述的肺癌功能性高通量用药筛选的方法，其特征在于：具体操作步骤为：
（1）肺癌细胞的获取：将获得的肺癌细胞在无菌条件下去掉其脂肪组织，用消化酶消化，所述消化酶由225单位/mL的胶原酶或透明质酸酶和13单位/mL的分散酶组成，然后用为肺癌肿瘤组织4倍体积的含10%小牛血清的DMEM细胞培养液中止消化，收集消化液，离心后收集沉淀，得到分散的肺癌细胞；
（2）肺癌细胞的扩增培养：用肿瘤细胞培养液将步骤（1）中获得的分散的肺癌细胞重悬沉淀在实验室进行保真扩增培养，放置于培养瓶并放置于37℃的CO2孵箱中进行培养，培养2-3周得到微小肿瘤，即得到肺癌重编程类器官；
（3）肺癌细胞的贴壁培养：将步骤（2）中培养得到的肺癌重编程类器官用0.05%胰酶-EDTA进行消化，并用自动细胞计数仪进行计数，接种384孔板，然后用肿瘤选择性培养液稀释，贴壁培养过夜，即得贴壁的肺癌细胞；
（4）药物筛选：将步骤（3）中得到的贴壁的肺癌细胞用各种传统化疗药物，靶向药物或几种药物组合等候选药物处理72小时后，用ATP化学发光法检测细胞生存率，进行药物筛选。
CN201810901153.1A 2018-08-09 2018-08-09 一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法 Active CN108913662B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810901153.1A CN108913662B (zh) 2018-08-09 2018-08-09 一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810901153.1A CN108913662B (zh) 2018-08-09 2018-08-09 一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108913662A CN108913662A (zh) 2018-11-30
CN108913662B true CN108913662B (zh) 2019-03-29

Family

ID=64394750

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810901153.1A Active CN108913662B (zh) 2018-08-09 2018-08-09 一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108913662B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110373388A (zh) * 2019-04-24 2019-10-25 博奥生物集团有限公司 一种用于类器官培养的培养基及类器官培养方法
EP4012021A4 (en) * 2019-08-05 2022-11-30 Genex Health Co.,Ltd METHOD FOR CULTIVATION OF PRIMARY CELLS OF SOLID TUMORS IN LUNG CANCER AND PRIMARY TUMOR CELLS OF PLEEURAL EFFORT IN LUNG CANCER AND SUPPORTING REAGENT
CN113481162B (zh) * 2021-07-01 2023-02-24 丹望医疗科技(上海)有限公司 用于快速培养肿瘤类器官的培养基、方法以及试剂盒
CN115960816A (zh) * 2021-10-13 2023-04-14 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 肺癌类器官的培养基、培养方法及其应用
CN115960815A (zh) * 2021-10-13 2023-04-14 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 肺癌胸水来源类器官的培养基、培养方法及其应用
CN118272312B (zh) * 2024-05-30 2024-09-17 山东大学 一种微重力环境培养癌细胞用培养基和相关试剂及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102321587A (zh) * 2011-08-25 2012-01-18 上海吉凯基因化学技术有限公司 肺癌药物筛选细胞株的建立
CN102424816A (zh) * 2011-12-31 2012-04-25 广州呼吸疾病研究所 一种来源于人小细胞肺癌放化疗后复发病灶的细胞株及其制备方法
CN102424817A (zh) * 2011-12-31 2012-04-25 广州呼吸疾病研究所 一种来源于人肺腺癌的细胞株及其制备方法
CN106893696A (zh) * 2017-03-21 2017-06-27 安徽安龙基因医学检验所有限公司 一种非小细胞肺癌全细胞抗原树突状细胞瘤苗的制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102321587A (zh) * 2011-08-25 2012-01-18 上海吉凯基因化学技术有限公司 肺癌药物筛选细胞株的建立
CN102424816A (zh) * 2011-12-31 2012-04-25 广州呼吸疾病研究所 一种来源于人小细胞肺癌放化疗后复发病灶的细胞株及其制备方法
CN102424817A (zh) * 2011-12-31 2012-04-25 广州呼吸疾病研究所 一种来源于人肺腺癌的细胞株及其制备方法
CN106893696A (zh) * 2017-03-21 2017-06-27 安徽安龙基因医学检验所有限公司 一种非小细胞肺癌全细胞抗原树突状细胞瘤苗的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN108913662A (zh) 2018-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108913662B (zh) 一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法
Xu et al. Berbamine: a novel inhibitor of bcr/abl fusion gene with potent anti-leukemia activity
Lin et al. Optimal conditions for cordycepin production in surface liquid-cultured Cordyceps militaris treated with porcine liver extracts for suppression of oral cancer
Chiu et al. The synthetic β-nitrostyrene derivative CYT-Rx20 inhibits esophageal tumor growth and metastasis via PI3K/AKT and STAT3 pathways
Xiao et al. Davanone terpenoid inhibits cisplatin-resistant acute myeloid leukemia cancer cell growth by inducing caspase-dependent apoptosis, loss of mitochondrial membrane potential, inhibition of cell migration and invasion and targeting PI3K/AKT/MAPK signalling pathway
CN105943522B (zh) 氯福克酚用于制备治疗人神经胶质瘤的药物的用途
CN108998495B (zh) 一种抗乳腺癌药物的高通量筛选方法
CN100522184C (zh) 具有抗肿瘤和抗毒活性的提取物
CN109880798A (zh) 一种体外培养nk细胞的方法
Collins et al. Preclinical validation of target engagement assays and investigation of mechanistic impacts of FHD-609, a clinical-stage BRD9 degrader being developed for the treatment of synovial sarcoma
Chlebek et al. Cytotoxicity of naturally occurring isoquinoline alkaloids of different structural types
CN109776477A (zh) 源于草酸青霉的iso-Penicillixanthone A及抗长春新碱耐药应用
Sheeja et al. Antimetastatic potential of garcinone E in human oral cancer cells
TWI820118B (zh) 人參皂苷m1用於治療口腔癌之用途
CN110295132B (zh) 一株具有强力抗癌活性的芽孢杆菌ccpm7645及其应用
CN109965036A (zh) 一种含bostrycin的发酵茶及其制备方法
US8546366B2 (en) Method for inhibition of tumor cell growth using (22R)-5α-lanosta-8,24-dien-3β,15α,21-triol
CN105368752A (zh) 一株从人体肠道中分离的能产生抗癌活性代谢产物的细菌ad05及其用途
Hu et al. Aloin promotes oral squamous cell carcinoma cell apoptosis and autophagy through Akt/mTOR pathway
US9675563B2 (en) Method for adjunctive treatment of cancer metastasis by using lycogen
CN109833321A (zh) 一种逆转肝癌细胞对sorafenib耐药性的药物组合物
CN116421640B (zh) 傣百解提取物在制备治疗前列腺癌骨转移的药物中的应用
CN110272855A (zh) 一株具有强力抗癌活性的芽孢杆菌ccpm7650及其应用
CN110433150A (zh) 乙酰紫草素在制备预防和治疗结肠癌药物中的应用
CN114366740B (zh) 化合物a-6在制备广谱抗癌药物中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant