CN108893522A - 一种杂交瘤细胞染色体的鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种杂交瘤细胞染色体的鉴定方法，将处于指数生长期的待测杂交瘤细胞中加入秋水仙素处理，收集细胞再加入低渗液处理，用甲醇:冰乙酸=3:1之比例配制的固定液进行一次预固定和两次固定，滴片及Giemsa染色后观察，放大、拍照、计数。本发明的优点在于通过各参数及制作染色体玻片关键步骤及条件的限定，得到的染色体玻片图片清晰，分散性好，可以清晰的观察到细胞染色体的数目及形态特征，通过对染色体数目及形态特征的分析，来判断杂交瘤细胞遗传的稳定性，利于通过染色体核型分析技术来进一步对杂交瘤细胞的遗传稳定性进行研究。

Description

一种杂交瘤细胞染色体的鉴定方法

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞的传代培养，尤其是涉及一种杂交瘤细胞传代培养中染色体的鉴定方法。

背景技术

自1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术以来，科学家们对杂交瘤细胞及单抗的研究就从未间断过。杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化得到的杂交瘤细胞系，所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓的单克隆抗体（monoclonalantibody），简称单抗。但杂交瘤细胞在传代培养过程中，编码抗体的染色体容易丢失，因此对杂交瘤细胞染色体的鉴定就显得尤为必要。

染色体是生物遗传物质基因的载体，是当前研究生物遗传的物质基础。染色体发生异常变化，如数目的增加或较少，甚至是结构的微小变化，如重复、缺失、易位等，均会造成基因的变化，并产生相应的临床表型。而对于杂交瘤细胞而言，染色体的变化可能导致细胞株分泌抗体能力不稳定，甚至丧失产生抗体的能力，尤其是初期建立的杂交瘤细胞，其染色体是很不稳定的。因此在杂交瘤及单抗研究中，细胞遗传分析技术在鉴定杂交瘤、观察细胞株突变、探索抗体特性等方面均具有重要价值。

目前对染色体进行鉴定的方法虽有报道，但缺乏统一的标准，鉴定方法及条件参差不齐，导致难以一次性制备出中期分裂相较多，染色体分散性较好的高清晰度染色体玻片。

发明内容

本发明的目的在于提供一种中期分裂相更多，染色体分散性更好，染色效果更佳的杂交瘤细胞染色体鉴定方法，以满足对杂交瘤细胞进行遗传稳定性研究。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的杂交瘤细胞染色体的鉴定方法包括下述步骤：

第一步，将处于指数生长期的待测杂交瘤细胞中加入秋水仙素，调整秋水仙素的最终浓度为0.05μg/ml，37℃、5% CO₂培养箱中培养4小时，使细胞分裂停止在中期相；

第二步，将第一步培养的细胞离心后，去上清液，留细胞沉淀物；

第三步，将第二步得到的细胞沉淀物中加入经37℃预温的0.075M/L KCl低渗液，使细胞悬浮于低渗液中，置37℃水浴中处理20min；

第四步，按甲醇:冰乙酸=3:1之比例配制固定液，将该固定液1mL加入第三步得到的细胞悬液中，打匀后离心，去上清液；

第五步，将第四步中的细胞沉淀物中加入5mL上述固定液，轻轻打匀，在室温下静置15min，离心后去上清液；重复该步骤两次；

第六步，将第五步固定处理后的细胞用固定液打匀成细胞悬浮液，按每片2~3滴滴加到已在75%酒精4℃预冷2小时的载玻片上，滴液高度30cm，火焰固定；

第七步，取1份Giemsa原液加入9份pH7.4磷酸缓冲液进行稀释，对第五步制备的载玻片染色20min，用水冲洗后自然干燥，得到标本片；

第八步，将第七步制备好的标本片放在物镜下，显微镜观察，找到细胞分裂中期相，选择分散良好的中期相，放大、拍照、计数。

所述第二步、第四~五步中的离心条件为1000r/min，离心时间10min。

本发明的优点在于通过各参数及制作染色体玻片关键步骤及条件的限定，得到的染色体玻片图片清晰，分散性好，可以清晰的观察到细胞染色体的数目及形态特征，通过对染色体数目及形态特征的分析，来判断杂交瘤细胞遗传的稳定性，利于通过染色体核型分析技术来进一步对杂交瘤细胞的遗传稳定性进行研究。

附图说明

图1是本发明制作的染色体玻片放大10×100倍的图片。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明方法做更加详细的说明。

本发明所述的杂交瘤细胞染色体的鉴定方法包括下述步骤：

第一步，将转入6孔板中，生长状态良好（铺满孔底70~80%）且处于指数生长期的待测杂交瘤细胞中加入秋水仙素，调整秋水仙素的最终浓度为0.05μg/ml，37℃、5% CO₂培养箱中培养4小时，使细胞分裂停止在中期相；由于秋水仙素可阻止中期细胞继续分裂，故处理时的浓度及时间十分关键，高浓度长时间处理虽然可获得更多中期相细胞，同时也会导致染色体的过分凝缩或着丝点裂解，最终会引起染色体形态不正常，甚至被破坏或溶解；秋水仙素低浓度处理时间过短又达不到阻止中期分裂的目的；只有合适的浓度（0.05μg /ml），恰当的处理时间（4小时）才能达到数量多且形态清晰的染色体；

第二步，用加样枪将细胞轻轻吹匀后移入10ml离心管内，1000r/min，离心10min，去上清液，留细胞沉淀物；

第三步，在细胞沉淀物中加入经37℃预温的0.075M/L KCl低渗液5ml，轻轻吹匀，使细胞悬浮于低渗液中，置37℃水浴中处理20min；低渗液的量和处理均与细胞的数量有关，低渗过度，细胞会破裂，低渗不足，则染色体在一起分散不开；

第四步，按甲醇:冰乙酸=3:1之比例配制固定液；用塑料吸管吸取固定液1ml，加入经低渗处理的细胞悬液中，轻轻打匀，1000r/min，离心10min，去上清液，完成预固定；

第五步，然后沿管壁加入固定液5 ml，用吸管塑料轻轻打匀，在室温下静置15min，1000r/min，离心10min，去上清液，完成第一次固定；再次加入固定液5 ml，固定15min，以1000r/min，离心10min，去上清液，完成第二次固定；

固定时，离心条件为1000r/min，离心时间10min，因为离心速度或离心时间也能影响染色体标本的制备，离心速度过大或离心时间过长，会引起细胞破裂；反之，离心速度过小或离心时间过短，则细胞沉降不下来，会引起大量细胞的丢失；同时，用吸管吹散细胞时用力必须尽量轻柔，用力过大则会造成细胞破裂，而染色体也会弥散在溶液中，在随后的离心中将会丢失；

第六步，在离心管内加固定液0.4ml，细心打匀成细胞悬浮液，在预先经冰冻冷却的载玻片上（载玻片在盛有75%酒精的容器中在4℃冰柜中预冷2小时，如果冷却不够，则会影响染色体的附着和铺展），每片滴加2~3滴细胞悬浮液，滴片高度30cm，火焰固定；滴片时的高度过低细胞不会破裂，高度过高则染色体过于分散甚至丢失，无法辨别出染色体的准确数量；

第七步，用pH7.4磷酸缓冲液10倍稀释Giemsa原液，取制备好的染色体标本载玻片染色20min，然后用小水流慢慢冲洗，自然干燥，制成标本片

第八步，将制备好的标本片放在物镜下，显微镜调好，先用低倍镜观察，再转换油镜观察，找到细胞分裂中期相，选择分散良好的中期相，放大、拍照、计数，图1为拍摄的染色体玻片放大10×100倍的照片；染色体数目统计时，可用一定数量（30~50）染色体分散良好的分裂细胞进行计数。

Claims (2)

1.一种杂交瘤细胞染色体的鉴定方法，其特征在于：包括下述步骤：

第一步，将处于指数生长期的待测杂交瘤细胞中加入秋水仙素，调整秋水仙素的最终浓度为0.05μg/ml，37℃、5% CO₂培养箱中培养4小时，使细胞分裂停止在中期相；

第二步，将第一步培养的细胞离心后，去上清液，留细胞沉淀物；

第三步，将第二步得到的细胞沉淀物中加入经37℃预温的0.075M/L KCl低渗液，使细胞悬浮于低渗液中，置37℃水浴中处理20min；

第四步，按甲醇:冰乙酸=3:1之比例配制固定液，将该固定液1mL加入第三步得到的细胞悬液中，打匀后离心，去上清液；

第五步，将第四步中的细胞沉淀物中加入5mL上述固定液，轻轻打匀，在室温下静置15min，离心后去上清液；重复该步骤两次；

第六步，将第五步固定处理后的细胞用固定液打匀成细胞悬浮液，按每片2~3滴滴加到已在75%酒精4℃预冷2小时的载玻片上，滴液高度30cm，火焰固定；

第七步，取1份Giemsa原液加入9份pH7.4磷酸缓冲液进行稀释，对第五步制备的载玻片染色20min，用水冲洗后自然干燥，得到标本片；

第八步，将第七步制备好的标本片放在物镜下，显微镜观察，找到细胞分裂中期相，选择分散良好的中期相，放大、拍照、计数。

2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞染色体的鉴定方法，其特征在于：所述第二步、第四~五步中的离心条件为1000r/min，离心时间10min。