CN108884461A - 在禽蛋中产生病毒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及可被用于产生增高的病毒水平的经修饰的禽蛋。本发明涉及在本发明的禽蛋中产生病毒的方法，以及所获得的病毒用于制备疫苗组合物的用途。

Description

在禽蛋中产生病毒

技术领域

本发明涉及可被用于产生增加的病毒水平的经修饰的禽蛋。本发明还涉及在本发明的禽蛋中产生病毒的方法，以及获得病毒用于制备疫苗组合物的用途。

背景技术

病毒感染仍然是在人类和在对经济重要的牲畜中都存在的一个重要的健康问题，产生不良的经济和社会后果。

预防动物病毒性疾病的主要方法之一是疫苗接种。足够量的病毒的可用性以及与病毒产生相关联的成本是疫苗生产的限制性因素。目前病毒产生的方法包括细胞培养和蛋内产生系统。但是，不是所有的病毒都在细胞培养和/或蛋内产生系统中良好的复制。例如，不是所有的流感病毒都在蛋内良好地复制(Horimoto et al.,2006；Horimoto et al.,2007)。

因此，需要开发用于病毒产生的改进的方法。正是针对这个背景，本发明人开发了增加蛋内病毒产生的方法。

发明内容

本发明人已经证明，可利用降低禽蛋中的抗病毒基因的表达和/或禽蛋中抗病毒蛋白质活性的水平增加病毒产生。

因此一方面，本发明提供了一种禽蛋，其包括：

1)遗传学修饰，与缺少所述遗传学修饰的同基因蛋相比，其降低所述蛋中抗病毒基因的表达，和/或

2)外源化合物，与缺少所述化合物的同基因蛋相比，其在所述蛋中降低抗病毒基因的表达和/或降低抗病毒蛋白质活性，

其中与所述同基因蛋相比，所述蛋能够产生更多的病毒。

在一个实施方案中，所述抗病毒基因和/或蛋白质位于I型、II型或III型干扰素路径中。在一个实施方案中，所述抗病毒基因和/或蛋白质位于I型干扰素路径中。

在一个实施方案中，所述抗病毒基因和/或蛋白质选自以下的一种、两种、四种或更多种：IFNAR1、IL-6、CNOT4、MDA5、IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNλ、IFNAR2、UBE1DC1、GNAZ、CDX2、LOC100859339、IL28RA、ZFPM2、TRIM50、DNASEIL2、PHF21A、GAPDH、BACE2、HSBP1、PCGF5、IL-1RA、DDI2、CAPN13、UBA5、NPR2、IFIH1、LAMP1、EFR3A、ARRDC3、ABI1、SCAF4、GADL1、ZKSCAN7、PLVAP、RPUSD1、CYYR1、UPF3A、ASAP1、NXF1、TOP1MT、RALGAPB、SUCLA2、GORASP2、NSUN6、CELF1、ANGPTL7、SLC26A6、WBSCR27、SIL1、HTT、MYOC、TM9SF2、CEP250、FAM188A、BCAR3、GOLPH3L、HN1、ADCY7、AKAP10、ALX1、CBLN4、CRK、CXORF56、DDX10、EIF2S3、ESF1、GBF1、GCOM1、GTPBP4、HOXB9、IFT43、IMP4、ISY1、KIAA0586、KPNA3、LRRIQ1、LUC7L、MECR、MRPL12、POLR3E、PWP2、RPL7A、SERPINH1、SLC47A2、SMYD2、STAB1、TTK、WNT3、IFNGR1、IFNGR2、IL-10R2、IFNκ、IFNΩ、IL-1RB和XPO1。

在一个实施方案中，所述抗病毒基因和/或蛋白质选自以下的一种、两种、三种、四种或更多种：IFNAR1、IL-6、CNOT4、MDA5、IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNλ、BACE2、UBA5、ZFPM2、TRIM50、DDI2、NPR2、CAPN13、DNASE1L2、PHF21A、PCGF5、IFIH1、IL-1RA、LAMP1、EFR3A、ABI1、GADL1、PLVAP、CYYR1、ASAP1、NXF1、NSUN6、ANGPTL7、SIL1、BCAR3、GOLPH3L、HN1、ADCY7、CBLN4、CXORF56、DDX10、EIF2S3、ESF1、GCOM1、GTPBP4、IFT43、KPNA3、LRRIQ1、LUC7L、MRPL12、POLR3E、PWP2、RPL7A、SMYD2、XPO1和ZKSCAN7。

在一个实施方案中，所述抗病毒基因和/或蛋白质选自以下的一种、两种、三种、四种或全部：IFNAR1、IL-6、CNOT4、MDA5、IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNλ和IL-1RA。

在一个实施方案中，所述抗病毒基因和/或蛋白质是IFNAR1。在一个实施方案中，所述抗病毒基因和/或蛋白质是IL-6。在一个实施方案中，所述抗病毒基因和/或蛋白质是MDA5。在一个实施方案中，所述抗病毒基因和/或蛋白质是CNOT4。在一个实施方案中，所述抗病毒基因和/或蛋白质是IFNα。在一个实施方案中，所述抗病毒基因和/或蛋白质是IFNβ。在一个实施方案中，所述抗病毒基因和/或蛋白质是IFNγ。在一个实施方案中，所述抗病毒基因和/或蛋白质是IFNλ。在一个实施方案中，所述抗病毒基因和/或蛋白质是IL-1RA。

在一个实施方案中，所述遗传学修饰位于基因组中。在一个实施方案中，所述基因组是纯合的。在一个实施方案中，所述遗传学修饰位于所述蛋中包含的胚胎的线粒体DNA(mtDNA)或核DNA。

在一个实施方案中，所述遗传学修饰可以是任何天然存在的禽蛋或其亲代的修改，其实现在禽蛋中降低抗病毒基因的表达和/或降低抗病毒蛋白质活性的效果。

在一个实施方案中，遗传学修饰是抗病毒基因或其调节区内的缺失、取代或插入。例如，可通过可编程核酸酶引入遗传学修饰。在另一个实施例中，可通过同源重组引入遗传学修饰(诸如通过缺失部分或全部抗病毒基因、将外源性多核苷酸插入抗病毒基因、或重排一些抗病毒基因(诸如外显子)的方向)，从而使其不再编码具有抗病毒活性的蛋白质。在另一个实施方案中，通过非同源性末端接合来引入遗传学修饰。在又一个实施方案中，通过化学诱变剂引入遗传学修饰。

在一个实施方案中，遗传学修饰是点突变。

在一个实施方案中，通过转基因引入遗传学修饰，该转基因编码降低禽蛋中的抗病毒基因的表达和/或抗病毒蛋白质活性的水平的多核苷酸。多核苷酸的实例包括但不限于反义多核苷酸、有义多核苷酸、微小RNA、编码与所述抗病毒基因编码的蛋白质结合的多肽的多核苷酸、转座子、适体、双链RNA分子或从其衍生的经加工的RNA分子。

在一个实施方案中，转基因包含编码与启动子可操作地连接的多核苷酸的开放阅读框，所述启动子指导禽蛋中的多核苷酸的表达。

在一个实施方案中，所述外源性化合物是小的基于碳的分子、蛋白质结合物、可编程核酸酶、多核苷酸或其两种或更多种的组合。

在一个实施方案中，蛋白质结合物或多核苷酸由施用于蛋的转基因来表达。

在一个实施方案中，转基因存在于将要在蛋中培养的病毒中。

在一个实施方案中，所述蛋白质结合物是抗体。

在一个实施方案中，病毒是动物病毒。在一个实施方案中，动物是人、鸡、猪、鱼、绵羊或牛。在一个实施方案中，动物是人。

在一个实施方案中，病毒选自以下的科中：正粘病毒科、疱疹病毒科、副粘病毒科、黄病毒科和冠状病毒科。

在一个实施方案中，病毒选自：流感病毒、犬瘟热病毒、麻疹病毒、呼肠孤病毒、东方马脑炎病毒、犬副流感病毒、狂犬病病毒、鸡痘病毒、西部马脑炎病毒、腮腺炎病毒、马脑脊髓炎病毒、风疹病毒、鸡产蛋下降综合症病毒、禽溶瘤病毒、禽传染性喉气管炎疱疹病毒、新城疫病毒、牛副流感病毒、天花病毒、传染性法氏囊病、牛茨城病毒、重组痘病毒、I型、II型或III型禽腺病毒、猪日本脑炎病毒、黄热病毒、疱疹病毒、辛德毕斯病毒、感染支气管炎病毒、塞姆利基森林病毒、脑脊髓炎病毒、委内瑞拉EEV病毒、鸡贫血病毒、马立克氏病病毒、细小病毒、口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、古典猪瘟病毒、蓝舌病毒、Kabane病毒、传染性鲑鱼贫血病毒、传染性造血组织坏死病毒、病毒性出血性败血症病毒和感染性胰腺坏死病毒。在一个实施例中，病毒是流感病毒。

在一个实施方案中，禽蛋是鸡蛋。在一个实施方案中，禽蛋是鸭蛋。

在另一方面，本发明提供了本发明的禽蛋，其包含病毒。在一个实施方案中，病毒是流感病毒。

在进一步的方面，本发明提供了一种复制病毒的方法，所述方法包括：

1)获得包含遗传学修饰的本发明的禽蛋，

2)用病毒接种所述蛋，并且

3)温育所述蛋一段预定的时间以复制所述病毒。

在一个替代的方面，本发明提供一种复制病毒的方法，所述方法包括：

1)获得禽蛋，

2)施用化合物，与缺少所述化合物的同基因蛋相比，所述化合物在所述蛋中降低抗病毒基因的表达和/或降低抗病毒蛋白质的活性水平，

3)用病毒接种所述蛋，并且

4)温育所述蛋一段预定的时间以复制所述病毒。

在一个实施方案中，如本文所描述的方法进一步包含从所述蛋中收获所述复制的病毒或其病毒颗粒的步骤。

在一个实施方案中，所述收获步骤包括从所述蛋获取尿囊液。

如本领域技术人员将会理解的，可使用本领域的标准技术来进行在本发明的蛋中复制病毒的方法。

在另一方面，本发明提供使用本发明的禽蛋产生的病毒，和/或使用本发明的方法产生的病毒。

在另一方面，本发明提供了产生疫苗组合物的方法，所述方法包括：

1)使用本发明的方法复制病毒，

2)从蛋中收获所述复制的病毒或其颗粒，并且

3)用所收获的病毒制备疫苗组合物。

在一个实施方案中，步骤2)或步骤3)包括灭活病毒。在一个实施方案中，灭活病毒的方法包括UV、热或化学灭活。

在一个实施方案中，步骤2)或步骤3)包括破坏病毒以产生裂解的病毒颗粒或亚单位病毒颗粒。

如本领域技术人员将会理解的，可使用本领域的标准技术来进行在本发明的蛋中产生疫苗组合物的方法。

在一个实施方案中，收获所复制的病毒或其颗粒包含以下一个或多个步骤：1)澄清、2)浓缩、3)失活、4)核酸酶处理、5)分离/纯化、6)精制；和/或7)无菌过滤。

还提供了一种使用本发明的方法产生的疫苗组合物。

在一个实施方案中，所述疫苗组合物是减毒的疫苗。在一个实施方案中，所述疫苗组合物是灭活的疫苗组合物。在一个实施方案中，所述疫苗组合物是流感疫苗组合物。

在又一方面，本发明提供了包含遗传学修饰的转基因禽，与缺少所述遗传学修饰的同基因禽产生的蛋相比，其中所述遗传学修饰降低了禽产生的蛋中的抗病毒基因的表达。

在一个实施方案中，所述禽是鸡。

在另一方面，本发明提供产生本发明的禽的方法，所述方法包括：

1)将遗传学修饰引入禽细胞中，

2)从所述细胞产生雌性禽，

3)从雌性禽获得一个或多个蛋，并根据与缺乏所述遗传学修饰的同基因蛋相比所述蛋产生更多的病毒的能力筛选所述蛋，

4)选择雌性禽，所述雌性禽产生与缺乏所述遗传学修饰的同基因蛋相比产生更多的病毒的所述蛋，并且

5)任选地使用所述雌性禽繁育更多禽。

在一个实施方案中，所述遗传学修饰位于所述细胞的基因组中。

在一个实施方案中，所述遗传学修饰通过可编程核酸酶引入。

在又一实施方案中，所述禽是鸡。

除非另外特别说明，否则本文的任何实施方案应被视为加以必要的变通而适用于任何其他实施方案。例如，如本领域技术人员将理解的，对于本发明的禽蛋概述的可编程核酸酶的实例同样适用于本发明的方法。

本发明在范围上不受在此描述的具体实施方式的限制，这仅仅是为了举例说明的目的。如本文所述，功能等效产品、组合物和方法显然在本发明的范围内。

在整个说明书中，除非特别说明或上下文另有要求，否则提及单个步骤、物质组成、步骤组或物质组合物组应当包括一个和多个(即，一个或多个)那些步骤、物质组成、步骤组或物质组合物组。

通过以下非限制性实例并参考附图来描述本发明。

附图说明

图1。重组鸡(rch)IFNα、IFNβ、IFNγ和IFNλ在病毒中和测定中的抗病毒活性。细胞活力的增加等同于OD的增加。吸光度值是来自两个独立实验的一式两份样品的平均值±SE。单独的细胞以及细胞+病毒对照被示出为24个孔的平均值。

图2。A.间接ELISA分析揭示，纯化的抗IFN(IFNα、IFNβ、IFNγ和IFNλ)血清识别同源蛋白。所述图显示，在ELISA中，硫酸铵沉淀的多克隆抗chIFN抗血清检测同源蛋白质。OD是抗体水平的量度。所示的吸光度值是来自两个独立实验的一式两份样品的平均值±SE。B.抗chIFN-α抗体似乎并不会增加卵内的病毒滴度。与流感疫苗病毒(PR8或NIBRG14)共同接种于卵内的抗chIFN-α抗体不增加通过血凝集(HA)测定法测量的血细胞凝集(HA)滴度。条形图表示四次实验的平均值±SE。C.抗chIFN-β抗体似乎并不会增加卵内的病毒滴度。纯化的抗chIFN-β抗体和流感疫苗病毒(PR8或NIBRG14)的共同施用不影响通过HA测定法确定的卵内病毒HA滴度。条形图表示多至三次实验的平均值±SE。

图3。A.抗chIFN-λ抗体增加卵内病毒滴度。纯化的抗chIFN-λ抗体和流感疫苗病毒(PR8或NIBRG14)的接种导致了通过HA测定法测量的卵内HA滴度的增加。条形图表示多至七次实验的平均值±SE。统计学显著性表示为一个星号(*)p<0.05，两个星号(**)p<0.005，以及三个星号(***)表示p＝0.0001。B.抗chIFN-γ抗体增加卵内病毒滴度。抗chIFN-γ抗体和流感疫苗病毒(PR8或NIBRG14)的联合施用导致了通过HA测定法测量的卵内病毒HA滴度的增加。条形图表示2次实验的平均值±SE。统计学显著性表示为一个星号(*)p<0.05。C.抗chIL-6抗体增加卵内病毒滴度。在卵内注射纯化的抗chIL-6抗体和流感疫苗病毒(PR8或NIBRG14)二者的效果导致了HA测定法测量的HA病毒滴度的增加。条形图表示多至五次实验的平均值±SE。统计学显著性表示为一个星号(*)p<0.05，两个星号(**)p<0.005。

图4。禽流感疫苗生产中的抗病毒基因的筛选和鉴定。A.用阴性对照siRNA(siNT1)或用靶向21个候选宿主基因的siRNA进行转染的DF-1细胞的活力。在病毒感染的时候，在转染后72小时测量活力。B.在永生化的鸡成纤维细胞系DF-1中、在对照细胞(siNT1)中、或在用siRNA转染以使21个宿主基因的表达沉默的细胞中产生的甲型流感病毒/WSN的滴度。观察到在使用siRNA的敲低(KD)之后以TCDI₅₀测量的病毒滴度显著增加，IFNRA1显示出病毒滴度的最高增加。C.DF1细胞上的病毒颗粒的免疫染色显示了通过siRNA抑制IFNAR1表达后病毒生长显著增加。

图5。siRNA下调宿主基因表达增加了体外病毒生长。用阴性对照siRNA(siNT1)或者靶向CNOT4、IFNAR或MDA5的siRNA(以4个siRNA双链体汇集(smartpool))或以单独的siRNA双链体)来转染DF-1细胞。与用siNT1转染的细胞中的mRNA水平相比，*p<0.05。通过定量实时PCR在转染后72小时使用Taqman探针对mRNA水平进行定量。单独评估每个siRNA复合物对靶基因敲低(KD)的能力(在左侧示出)并增加病毒滴度(在右侧示出)。用甲型流感/WSN病毒(MOI 0.1)感染细胞48h。通过TCID₅₀测定法定量测定细胞上清液中的病毒水平。与用siNT1转染的细胞中的病毒水平相比，*p<0.05。

图6。来自蛋的TCID₅₀WSN。A.使用ABA-21/117Q递送的siRNA下调后的来自蛋的TCID₅₀WSN，其数值作为单个重复值给出。B.使用ABA-21/117Q递送的siRNA下调后来自蛋的TCID₅₀WSN。以平均值±2SD给出数值。

图7。来自蛋的TCID₅₀WSN。A.使用ABA-21/117Q递送的siRNA下调后来自蛋的TCID₅₀PR8疫苗株。数值以平均值±2SD给出。B.TCID₅₀滴度与IFNAR1敲低之间的相关性。C.使用ABA-21/117Q递送的siRNA下调获得的HA和TCID₅₀最大值，其相当于与对照相比的3个对数增加。shIFNAR1增加了蛋中的流感病毒的生长。D.在第0天注射RCAS-shIFNA1并在胚胎发生第10天用流感病毒(PR8菌株)感染后，测量第12天胚胎的心脏中的shIFNAR1的表达和流感RNA的水平。来自实时PCR的原始CT值显示了shIFNAR1表达与流感RNA水平之间的相关性。shIFNAR1的表达越高，且流感RNA表示出越低的CT值(N＝6)。

图8。IFNAR1 DF-1 KO细胞系的生成。转染后，在约30％的等位基因中进行PCR筛选的过程中，来自亲本细胞系的细胞呈现出替代的扩增子。A.通过测序来确认缺失。当与野生型(WT)相比，对细胞进行分选以获得单克隆呈现出：双等位基因(A136和A142)单等位基因(A13)或无明显缺失(A143)。B.通过qPCR来评估IFNAR1A基因表达。结果表示为在KO细胞系上产生的针对管家WSN病毒颗粒的ΔΔct值+/-2个标准偏差(SD)的平均值。用在不同细胞系上生长的H1N1 A/WSN/1933感染MDCK细胞之后建立Pfu和TCID₅₀，作为总病毒产量的指示。C.在0h和48h的基因KO。D.在KO细胞系上产生的WSN病毒颗粒。用在不同细胞系上生长的H1N1 A/WSN/1933感染MDCK细胞之后建立Pfu和TCID₅₀，作为总病毒产量的指示。

图9。针对亨德拉病毒的抗病毒基因的筛选和鉴定。

列出了在永生化人类细胞系HeLa中、在对照细胞(siNT1)中或在用siRNA转染以使表达沉默的细胞中的亨德拉病毒复制。观察到使用siRNA的病毒复制的显著增加。LAMP1显示出最高的病毒滴度的增加。

具体实施方式

通用技术和选定的定义

除非另有明确定义，本文所使用的所有技术和科学术语应视为具有与本领域的普通技术人员通常理解的相同含义(例如，在细胞培养、分子遗传学、转基因禽、免疫学、免疫组织化学、精确基因组工程、蛋白质化学和生物化学方面)。

除非另外指明，在本发明中利用细胞培养和免疫技术都是本领域的普通技术人员所熟知的标准程序。此类技术在诸如以下的整个文献资料中有描述和解释，如J.Perbal，分子克隆使用指南(APractica Guide to Molecular Cloning)、John Wiley和Sons(1984)、J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbour Laboratory Press)(1989)，T.A.Brown(编辑)，基础分子生物学：实用方法(Essential Molecular Biology:A Practical Approach)，第1卷和第2卷，IRL出版社(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(编辑)，DNA克隆：实用方法(DNACloning:A Practical Approach)，第1-4卷，IRL出版社(IRL Press)(1995和1996)和F.M.Ausubel等人(编辑)，分子生物学当前技术(Current Protocols in MolecularBiology)，格林出版社联合威利出版社(Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience)(1988，包括直到现在的所有更新)，Ed Harlow和David Lane(编辑)抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)，冷泉港实验室(Cold Spring HarbourLaboratory)，(1988)，和J.E.Coligan等人(编辑)现行免疫学方案(Current Protocols inImmunology)，John Wiley&Sons(包括直到现在的所有更新)。

术语“和/或”，例如，“X和/或Y”应当被理解为意指“X和Y”或“X或Y”，并且应当被视为对两种含义或任一种含义提供明确支持。

在整个说明书中，词语“包括”或诸如“包含”或“含有”的变化将被理解为暗示包括所述的元素、技术特征或步骤，或者元素、技术特征或步骤的组，但不排除任何其他元素、技术特征或步骤，或者元素、技术特征或步骤的组。

如本文中使用的术语“禽”是指分类学鸟纲的生物的任何种、亚种或品种，例如但不限于那些生物，例如鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦以及平胸类鸟(包括鸵鸟、鸸鹋以及鹤鸵(cassowary))。该术语包括原鸡(鸡)的不同已知品系(例如，白来杭鸡、棕色来杭鸡、条纹岩鸡(Barred-Rock)、苏塞克斯鸡、新罕布什尔鸡、罗德岛鸡、澳洲黑鸡、考尼什鸡、米诺卡鸡、横斑芦花鸡(Amrox)、加利福尼亚灰鸡、意大利彩鹧鸪)，还有火鸡、雉、鹌鹑、鸭、狩猎母鸡(game hen)、珍珠鸡、乳鸽、鸵鸟以及通常以商业数量繁殖的其他家禽的品种。

如本文中使用的，术语“遗传学修饰”是对禽蛋中遗传物质的任何人为的改变。可对蛋、蛋的一个或两个亲代、或一个或两个亲代的祖先进行修饰。在一个实施例中，遗传学修饰是通过可编程核酸酶引入的对基因组中内源基因的突变。例如，突变可以是导致基因不再编码功能性蛋白质的移码和/或缺失。在另一个实施方案中，使用同源重组使部分或全部靶抗病毒基因被缺失，从而不产生抗病毒蛋白质。在替代的实施方案中，遗传学修饰是例如在核酸构建体中转基因的指令，所述核酸构建体在蛋中表达所需的多核苷酸。转基因可以是染色体外的或整合到蛋的基因组中的。

如本文中使用的，“外源性化合物”可以是施用于蛋以产生期望结果的任何物质，诸如小的基于碳的分子、蛋白质或多核苷酸。

如本文中使用的，术语“与同基因蛋相比产生更多的病毒”或类似术语是指将要使用的本发明的禽蛋具有比同基因蛋培养更多的病毒的能力。在一个实施方案中，同基因蛋与本发明的禽蛋来自相同的禽品种。在一个实施方案中，除了存在遗传学修饰和/或外源性化合物之外，所述同基因禽蛋与本发明的蛋在遗传上是相同的。在一个实施方案中，当与缺少遗传学修饰和/或外源性化合物的同基因蛋相比时，本发明的禽产生至少0.5倍、或至少1倍、或至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少15倍、或至少20倍、或至少50倍、或至少100倍的更多病毒的蛋。本领域技术人员可使用常规技术容易地确定这样的病毒产生的增加。例如，本发明的蛋和同基因蛋可用相同量的相同病毒进行接种并在相同条件下接种相同的时长，并且可使用标准技术(诸如在实施例中概述的那些技术)来确定存在于每个蛋中的病毒颗粒的量。

如本文中使用的，术语“病毒或其颗粒”是指可以或可以不被灭活的全病毒以及此类病毒的颗粒。病毒颗粒可以是适用于裂解病毒疫苗或亚单位病毒疫苗的任何大小的病毒颗粒。可从蛋的尿囊液中收获全病毒或病毒颗粒。收获的全病毒在制备疫苗组合物期间可被断裂，以形成用于裂解的病毒疫苗或亚单位病毒疫苗的合适大小的颗粒。

如本文中使用的，术语“降低抗病毒基因的表达”是指与缺乏遗传学修饰或外源性化合物的同基因蛋中的水平相比，遗传学修饰和/或外源性化合物下调RNA转录物的水平和/或蛋中的RNA转录物的翻译水平的能力。在一个实施方案中，同基因蛋与本发明的禽蛋来自相同的禽品种。在一个实施方案中，除了存在遗传学修饰和/或外源性化合物之外，同基因禽蛋与本发明的蛋在遗传上是相同的。在一个实施方案中，所述基因编码抗病毒蛋白质，并因此与同基因蛋中的水平相比，在蛋中降低抗病毒蛋白质的活性水平。在一个实施方案中，当与缺乏遗传学修饰和/或外源性化合物的同基因蛋相比时，所述遗传学修饰和/或外源性化合物将蛋中抗病毒基因的表达减少至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％或100％。可使用标准程序来鉴定这种减少。

如本文中使用的，术语“降低抗病毒蛋白质活性水平”是指当与同基因蛋中的水平相比时，遗传学修饰和/或外源性化合物下调蛋中抗病毒蛋白质活性水平的能力。在一个实施方案中，同基因蛋与本发明的禽蛋来自相同的禽品种。在一个实施方案中，除了存在遗传学修饰和/或外源性化合物之外，同基因禽蛋与本发明的蛋在遗传学上是相同的。可通过例如减少蛋中蛋白质的量和/或降低蛋白质在蛋中执行其天然功能的能力(诸如通过使外源性化合物(例如抗体)与其活性位点结合)来降低蛋白质的活性。在一个实施方案中，当与缺乏遗传学修饰和/或外源性化合物的同基因蛋相比时，所述遗传学修饰和/或外源性化合物将所述蛋中的抗病毒蛋白质活性的水平降低至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或者至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％。可使用标准程序来鉴定这种减少。

本文提到的“转基因”具有生物技术领域中的普通含义，并且包括已通过重组DNA或RNA技术产生或改变并且已经被引入到本发明的蛋、亲代的蛋或其祖先的蛋中的基因序列。转基因可包括来源于禽细胞的基因序列。典型地，通过人工操作例如通过转化，但是也可使用本领域技术人员认可的任何方法将转基因引入本发明的禽或其蛋中。转基因包括被引入染色体的基因序列以及染色体外的基因序列。转基因通常会包含编码感兴趣的多核苷酸的开放阅读框，所述感兴趣的多核苷酸可操作地连接于合适的启动子用于在本发明的禽蛋中表达多核苷酸。所述转基因可通过同源重组插入。

如本文中使用的，术语“小的基于碳的分子”是指分子量低于2000道尔顿、优选地低于1500道尔顿、更优选地低于1000道尔顿、仍更优选地低于750道尔顿、还更优选低于500道尔顿的化学化合物或分子。

抗病毒基因和/或蛋白质

如本文中使用的，“抗病毒基因”是任何内源的禽基因，其表达以任何方式限制病毒在蛋中的产生。抗病毒基因可编码抗病毒蛋白质。

如本文中使用的，“抗病毒蛋白质”是任何内源的禽蛋白质，其存在限制了病毒在蛋中的产生。

抗病毒基因和/或蛋白质可能参与成年禽对病毒感染产生应答的能力。在一个实施方案中，抗病毒基因和/或蛋白质形成干扰素(IFN)途径的一部分。在一个实施方案中，抗病毒基因和/或蛋白质在I型、II型或III型干扰素途径中。在一个实施方案中，抗病毒基因和/或蛋白质处于I型或III型干扰素途径中。在一个实施方案中，抗病毒基因和/或蛋白质是IFN-α/β受体1(IFNAR1)链。在另一个实施方案中，抗病毒基因和/或蛋白质是IL-6。

在替代的实施方案中，抗病毒基因和/或蛋白质可以或已知参与成年禽对病毒感染产生免疫应答的能力。这类基因/蛋白质的一些以前已知的功能的实例包括参与细胞代谢、胚胎发育、细胞信号传导或核酸合成。

在替代的实施方案中，减少抗病毒基因和/或蛋白质的表达减少了被病毒感染的禽蛋的细胞的凋亡。

在一个实施方案中，抗病毒基因和/或蛋白质选自以下的一种、两种、三种、四种或更多种：IFNAR1、IL-6、CNOT4、MDA5、IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNλ、IFNAR2、UBE1DC1、GNAZ、CDX2、LOC100859339、IL28RA、ZFPM2、TRIM50、DNASEIL2、PHF21A、GAPDH、BACE2、HSBP1、PCGF5、IL-1RA、DDI2、CAPN13、UBA5、NPR2、IFIH1、LAMP1、EFR3A、ARRDC3、ABI1、SCAF4、GADL1、ZKSCAN7、PLVAP、RPUSD1、CYYR1、UPF3A、ASAP1、NXF1、TOP1MT、RALGAPB、SUCLA2、GORASP2、NSUN6、CELF1、ANGPTL7、SLC26A6、WBSCR27、SIL1、HTT、MYOC、TM9SF2、CEP250、FAM188A、BCAR3、GOLPH3L、HN1、ADCY7、AKAP10、ALX1、CBLN4、CRK、CXORF56、DDX10、EIF2S3、ESF1、GBF1、GCOM1、GTPBP4、HOXB9、IFT43、IMP4、ISY1、KIAA0586、KPNA3、LRRIQ1、LUC7L、MECR、MRPL12、POLR3E、PWP2、RPL7A、SERPINH1、SLC47A2、SMYD2、STAB1、TTK、WNT3、IFNGR1、IFNGR2、IL-10R2、IFNκ、IFNΩ、IL-1RB和XPO1或其对应的受体或激动剂。在一个实施方案中，IFNα是以下同种异型体的一种或多种：IFNα1、IFNα2、IFNα4、IFNα5、IFNα6、IFNα7、IFNA8、IFNα10、IFNα13、IFNα14、IFNα16、IFNα17和IFNα21。在一个实施方案中，IFNλ是以下同种异型体的一种或多种：IFNλ1、IFNλ2、IFNλ3、IFNλ4。

在一个实施方案中，抗病毒基因和/或蛋白质选自以下的一种、两种、三种、四种或更多种：IFNAR1、IL-6、CNOT4、MDA5、IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNλ、BACE2、UBA5、ZFPM2、TRIM50、DDI2、NPR2、CAPN13、DNASE1L2、PHF21A、PCGF5、IFIH1、IL-1RA、LAMP1、EFR3A、ABI1、GADL1、PLVAP、CYYR1、ASAP1、NXF1、NSUN6、ANGPTL7、SIL1、BCAR3、GOLPH3L、HN1、ADCY7、CBLN4、CXORF56、DDX10、EIF2S3、ESF1、GCOM1、GTPBP4、IFT43、KPNA3、LRRIQ1、LUC7L、MRPL12、POLR3E、PWP2、RPL7A、SMYD2、XPO1和ZKSCAN7或其相应的受体或激动剂。

在一个实施方案中，抗病毒基因和/或蛋白质选自以下的一种、两种、三种、四种或更多种：IL-6、CNOT4、MDA5、IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNAR2、UBE1DC1、GNAZ、CDX2、LOC100859339、IL28RA、ZFPM2、TRIM50、DNASEIL2、PHF21A、GAPDH、BACE2、HSBP1、PCGF5、IL-1RA、DDI2、CAPN13、UBA5、NPR2、IFIH1、LAMP1、EFR3A、ARRDC3、ABI1、SCAF4、GADL1、ZKSCAN7、PLVAP、RPUSD1、CYYR1、UPF3A、ASAP1、NXF1、TOP1MT、RALGAPB、SUCLA2、GORASP2、NSUN6、CELF1、ANGPTL7、SLC26A6、WBSCR27、SIL1、HTT、MYOC、TM9SF2、CEP250、FAM188A、BCAR3、GOLPH3L、HN1、ADCY7、AKAP10、ALX1、CBLN4、CRK、CXORF56、DDX10、EIF2S3、ESF1、GBF1、GCOM1、GTPBP4、HOXB9、IFT43、IMP4、ISY1、KIAA0586、KPNA3、LRRIQ1、LUC7L、MECR、MRPL12、POLR3E、PWP2、RPL7A、SERPINH1、SLC47A2、SMYD2、STAB1、TTK、WNT3、IFNGR1、IFNGR2、IL-10R2、IFNκ、IFNΩ、IL-1RB和XPO1或其相应的受体或激动剂。

在一个实施方案中，抗病毒基因和/或蛋白质选自以下的一种、两种、三种、四种或更多种：IL-6、CNOT4、MDA5、IFNAR2、UBE1DC1、GNAZ、CDX2、LOC100859339、IL28RA、ZFPM2、TRIM50、DNASEIL2、PHF21A、GAPDH、BACE2、HSBP1、PCGF5、IL-1RA、DDI2、CAPN13、UBA5、NPR2、IFIH1、LAMP1、EFR3A、ARRDC3、ABI1、SCAF4、GADL1、ZKSCAN7、PLVAP、RPUSD1、CYYR1、UPF3A、ASAP1、NXF1、TOP1MT、RALGAPB、SUCLA2、GORASP2、NSUN6、CELF1、ANGPTL7、SLC26A6、WBSCR27、SIL1、HTT、MYOC、TM9SF2、CEP250、FAM188A、BCAR3、GOLPH3L、HN1、ADCY7、AKAP10、ALX1、CBLN4、CRK、CXORF56、DDX10、EIF2S3、ESF1、GBF1、GCOM1、GTPBP4、HOXB9、IFT43、IMP4、ISY1、KIAA0586、KPNA3、LRRIQ1、LUC7L、MECR、MRPL12、POLR3E、PWP2、RPL7A、SERPINH1、SLC47A2、SMYD2、STAB1、TTK、WNT3、IFNGR1、IFNGR2、IL-10R2、IFNκ、IFNΩ、IL-1RB和XPO1或其相应的受体或激动剂。

在一个实施方案中，抗病毒基因和/或蛋白质是IFNAR1。在一个实施方案中，抗病毒基因和/或蛋白质是IL-6。在一个实施方案中，抗病毒基因和/或蛋白质是MDA5。在一个实施方案中，抗病毒基因和/或蛋白质是CNOT4。在一个实施方案中，抗病毒基因和/或蛋白质是IFNα。在一个实施方案中，抗病毒基因和/或蛋白质是IFNβ。在另一实施方案中，抗病毒基因和/或蛋白质是IFNγ。在另一实施方案中，抗病毒基因和/或蛋白质是IFNλ。在另一实施方案中，抗病毒基因和/或蛋白质是IL-1RA。在另一实施方案中，抗病毒基因和/或蛋白质是IL-1RB。

以下在表1中提供了关于可被靶向的抗病毒基因和/或蛋白质的进一步的细节。

减少禽蛋中抗病毒基因的表达和/或抗病毒蛋白质活性的水平

通过使用遗传学修饰的禽蛋和/或用本文定义的外源性化合物处理的禽蛋可实现病毒产生的增加。

在一些实施方案中，通过引入遗传学修饰来减少禽蛋中的抗病毒基因的表达。在一个实施例中，将遗传学修饰直接引入禽的蛋中。在一个替代的实施例中，遗传学修饰引入到蛋的亲代的母系和/或父系生殖系中。遗传学修饰引入到蛋的亲代的母系和/或父系生殖系中导致转基因禽的产生。在这样的情况下，蛋会继承母系和/或父系亲代的遗传学修饰。

在一些实施方案中，通过外源性化合物降低了禽蛋中的抗病毒基因的表达和/或蛋白质活性。外源性化合物的实例包括但不限于小的基于碳的分子、蛋白质结合物、可编程核酸酶、多核苷酸或其两种或更多种的组合。

遗传学修饰

遗传学修饰可以是任何对天然存在的禽蛋或其亲代进行的人为改变，其实现了降低禽蛋中的抗病毒基因的表达和/或抗病毒蛋白质活性的水平的期望效果。遗传学修饰细胞的方法在本领域中是公知的。在一个实施方案中，遗传学修饰是使基因部分或完全失活的内源基因的突变，诸如点突变、插入或缺失(或其一种或多种的组合)。点突变可以是降低基因或编码多肽的活性的提前终止密码子(无义突变)、剪接位点突变、缺失、移码突变或氨基酸取代突变。

在一个实施方案中，通过可编程核酸酶引入遗传学修饰。在一个实施方案中，通过同源重组引入遗传学修饰。在一个实施方案中，通过非同源性末端接合来引入遗传学修饰。在一个实施方案中，通过化学诱变剂引入遗传学修饰。在替代的实施方案中，通过由外源性多核苷酸编码的转基因来引入遗传学修饰。在一个实施方案中，外源性多核苷酸由DNA分子、RNA分子或DNA/RNA杂合分子编码。减少内源基因表达的外源性多核苷酸的实例选自：反义多核苷酸、有义多核苷酸、微小RNA、编码与内源酶结合的多肽的多核苷酸、转座子、适体、双链RNA分子以及由其衍生的经加工的RNA分子。在一个实施方案中，转基因包含可操作地连接于启动子的编码所述多核苷酸的开放阅读框，所述启动子指导所述多核苷酸在禽蛋中的表达。

可编程核酸酶

在一些实施方案中，与缺乏遗传学修饰的同基因蛋相比减少蛋中抗病毒基因表达的遗传学修饰通过可编程核酸酶引入禽蛋或蛋的亲代母系和/或父系生殖系。在一些实施方案中，与缺乏外源性化合物的同基因蛋相比减少抗病毒基因表达和/或降低蛋中抗病毒蛋白质活性水平的外源性化合物是可编程核酸酶。

如本文中使用的，术语“可编程核酸酶”涉及被“靶向”(“编程”)以识别和编辑禽蛋基因组中或禽蛋的亲代母系和/或父系生殖系的基因组中的预定位点的核酸酶。

在一个实施方案中，可编程核酸酶可在基因组中的预定位点处诱导位点特异性DNA裂解。在一个实施方案中，可编程核酸酶可被编程以识别具有DNA结合蛋白结构域或DNA结合蛋白结构域的组合的基因组位置。在一个实施方案中，核酸酶将缺失、取代或插入引入抗病毒基因或其调节区。

在一个实施方案中，可编程核酸酶可被编程以通过DNA结合锌指蛋白(ZFP)结构域的组合来识别基因组位置。ZFP识别DNA序列中的特定的3-bp，ZFP的组合可用于识别特定的基因组位置。

在一个实施方案中，可编程核酸酶可被编程以通过转录激活因子样效应因子(TALE)DNA结合结构域来识别基因组位置。

在替代的实施方案中，可编程核酸酶可被编程以通过一个或多个RNA序列来识别基因组位置。在替代的实施方案中，可编程核酸酶可通过一个或多个DNA序列来进行编程。在替代的实施方案中，可编程核酸酶可通过一个或多个杂合DNA/RNA序列来进行编程。在替代的实施方案中，可编程核酸酶可通过RNA序列、DNA序列和杂合DNA/RNA序列中的一种或多种来进行编程。

在替代的实施方案中，可编程核酸酶可用于多重沉默，即：使用多于一种“靶向”或“编程序列”(即两种、三种、四种、五种或更多种编程序列)来递送可编程核酸酶，使得两种、三种、四种、五种或更多种抗病毒基因可同时被靶向(Kim等人，2014)。

根据本公开可使用的可编程核酸酶包括但不限于：源自细菌性簇规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)-cas(CRISPR相关)系统的RNA指导的工程化核酸酶(RGEN)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样核酸酶(TALEN)和argonaute。

(CRISPR)-cas(CRISPR相关)系统是一种涉及抵御侵入的噬菌体和质粒的微生物核酸酶系统。微生物宿主中的CRISPR基因座含有CRISPR相关(Cas)基因以及能够编程CRISPR介导的核酸裂解特异性的非编码RNA元件的组合。已经在具有II型RGEN类的广泛范围的细菌宿主中鉴定了三种类型(I-III)的CRISPR系统(Makarova等人，2015)。每个CRISPR基因座的一个关键特征是存在被非重复序列的短区段(间隔子)间隔开的重复序列(同向重复序列)的阵列。同向重复序列内的非编码CRISPR阵列被转录并裂解成含有单独间隔子序列的短的crRNA，所述crRNA将Cas核酸酶导向至靶位点(原型间隔子)。

II型CRISPR在四个连续步骤中执行靶向DNA双链断裂(例如，参见Cong等人，2013)。首先，从CRISPR基因座转录两种非编码RNA，即pre-crRNA阵列和tracrRNA。第二步，tracrRNA与pre-crRNA的重复区杂合并介导将pre-crRNA加工成含有单独间隔子序列的成熟crRNA。第三步，成熟crRNA:tracrRNA复合物经由crRNA上的间隔子与和原型间隔子邻近基序(PAM)相邻的靶DNA上的原型间隔子之间的Watson-Crick碱基配对而将Cas9导向至靶DNA，这是靶识别的附加要求。最后，Cas9介导了靶DNA的裂解，从而产生在原型间隔序列之内的双链断裂。CRISPR系统也可用于在基因组中产生单链断裂。因此，CRISPR系统可用于RNA导向的(或RNA编程的)位点特异性基因组编辑。

在一个实施方案中，所述核酸酶是RNA指导的工程化的核酸酶(RGEN)。在一个实施方案中，RGEN来自古细菌基因组或是其重组形式。在一个实施方案中，RGEN来自细菌基因组或是其重组形式。在一个实施方案中，RGEN来自I型(CRISPR)-cas(CRISPR相关)系统。在一个实施方案中，RGEN来自II型(CRISPR)-cas(CRISPR相关)系统。在一个实施方案中，RGEN来自III型(CRISPR)-cas(CRISPR相关)系统。在一个实施方案中，所述核酸酶是I类RGEN。在一个实施方案中，所述核酸酶是II类RGEN。在一个实施方案中，RGEN是多组分酶。在一个实施方案中，RGEN是单组分酶。在一个实施方案中，RGEN是CAS3。在一个实施方案中，RGEN是CAS10。在一个实施方案中，RGEN是CAS9。在一个实施方案中，RGEN是Cpf1(Zetsche等人，2015)。在一个实施方案中，RGEN被单个RNA或DNA靶向。在一个实施方案中，RGEN被多于一种RNA和/或DNA靶向。在一个实施方案中，CAS9来自化脓性链球菌(Steptococcus pyogenes)。

在一个实施方案中，可编程核酸酶可以是转录激活因子样效应因子(TALE)核酸酶(参见例如Zhang等人，2011)。TALE是来自植物病原体黄单胞菌的转录因子，其可很容易地被工程化以与新的DNA靶标结合。TALE或其截短形式可与内切核酸酶(诸如FokI)的催化结构域连接以产生被称为TALE核酸酶或TALEN的靶向内切核酸酶。

在一个实施方案中，可编程核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)。在一个实施方案中，ZFN的每个单体都包含3个或更多个基于锌指的DNA结合结构域，其中每个基于锌指的DNA结合结构域都与3bp亚位点结合。在其他实施方案中，ZFN是包含可操作地连接至独立核酸酶的基于锌指的DNA结合结构域的嵌合蛋白。在一个实施方案中，独立的内切核酸酶是FokI内切核酸酶。在一个实施方案中，所述核酸酶剂包含第一ZFN和第二ZFN，其中第一ZFN和第二ZFN中的每一个都可操作地连接至FokI核酸酶，其中第一和第二ZFN识别由约6bp至约40bp裂解位点或约5bp至约6bp裂解位点分开的靶DNA序列的每条链中的两个连续靶DNA序列，并且其中FokI核酸酶二聚化并形成双链断裂(参见例如US20060246567、US20080182332、US20020081614、US20030021776、WO/2002/057308、US20130123484、US20100291048以及WO11/017293)。

在一个实施方案中，可编程核酸酶可以是DNA编程的argonaute(WO14/189628)。原核和真核生物的argonaute是参与RNA干扰途径的酶。Argonaute可通过与设计的核酸靶向酸形成复合物来结合和裂解靶核酸。裂解可在靶核酸中引入双链断裂，其可通过非同源性末端接合机制进行修复。DNA“引导”或“编程”的argonaute可被导向以在DNA中的预定位置引入双链DNA断裂。在一个实施方案中，argonaute来自格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacteriumgregoryi)。

同源重组

在一个实施方案中，遗传学修饰是通过同源重组引入的。同源重组是核苷酸序列在两个相似的或相同的DNA分子之间进行交换的基因重组类型，其可涉及使用双链断裂修复(SBR)途径和合成依赖性链退火(SDSA途径)(Lodish等人，2000；Weaver，2002)。同源重组可用于使基因或其部分缺失，或者用于将取代或插入引入抗病毒基因或其调节区。另外，可使用同源重组来插入转基因。通过本领域技术人员已知的任何方法，可使用同源重组将遗传学修饰引入宿主细胞的DNA中。在一个实施方案中，同源重组可由可编程核酸酶来触发。

双链RNA

在一个实施方案中，遗传学修饰是编码针对RNAi的dsRNA分子的转基因，优选地整合到禽的基因组中。在另一个实施方案中，外源性化合物是针对RNAi的dsRNA分子、或编码dsRNA的转基因(例如在诸如病毒的合适的表达载体中提供的)。

术语“RNA干扰”、“RNAi”或“基因沉默”通常是指dsRNA分子降低与双链RNA分子共有基本上全部或全部同源性的核酸序列的表达的过程。然而，已经显示使用非RNA双链分子可实现RNA干扰(参见例如US20070004667)。

本发明包括用于本发明的包含和/或编码用于RNA干扰的双链区的核酸分子。所述核酸分子通常是RNA，但是可包含化学修饰的核苷酸和非核苷酸。

双链区应该是至少19个连续核苷酸，例如约19个至23个核苷酸，或者可更长，例如30个或50个核苷酸，或100个核苷酸或更多。可使用与整个基因转录物相对应的全长序列。优选地，它们长约19至约23个核苷酸。

核酸分子的双链区域与靶转录物的同一性程度应至少为90％，且更优选地为95-100％。核酸分子当然可包含无关序列，这些无关序列可起到使分子稳定的作用。

如本文中使用的术语“短干扰RNA”或“siRNA”是指包含能够例如通过以序列特异性方式介导RNAi来抑制或下调基因表达的核糖核苷酸的核酸分子，其中双链部分的长度少于50个核苷酸，优选地长度为约19个至23个核苷酸。例如，siRNA可以是包含自身互补的有义和反义区域的核酸分子，其中反义区域包含与靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且有义区域具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。siRNA可由两个单独的寡核苷酸组装而成，其中一条链是有义链，并且另一条链是反义链，其中反义链和有义链是自身互补的。

如本文中使用的，术语siRNA意在等同于用于描述能够介导序列特异性RNAi的核酸分子的其他术语，例如微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡核苷酸、短干扰核酸(siNA)、短干扰性修饰的寡核苷酸、化学修饰的siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)等。另外，如本文中使用的，术语RNAi意指等同于用于描述序列特异性RNA干扰的其他术语，例如转录后基因沉默、翻译抑制或表观遗传学(epigenetic)的沉默或抑制。例如，本发明的siRNA分子可用于在转录后水平或转录前水平两者都使基因在表观遗传学上沉默。在非限制性实例中，由本发明的siRNA分子对基因表达的表观遗传学调节可起因于siRNA介导的染色质结构修饰以改变基因表达。

通过“shRNA”或“短发夹RNA”意为一种RNA分子，在所述RNA分子中少于约50个核苷酸、优选地约19个至约23个核苷酸与位于相同RNA分子上的互补序列进行碱基配对，并且在所述RNA分子中所述序列和互补序列由至少约4个至约15个核苷酸的非配对区域分开，所述非配对区域在由两个碱基互补区域形成的茎结构的上方形成单链环。单链环的序列的实例包括：5′UUCAAGAGA3′。

包括的shRNA是两指或双指和多指发夹dsRNA，其中RNA分子包含两个或更多个由单链间隔子区域分开的这种茎环结构。

一旦被设计，包含双链区域的核酸分子可通过本领域已知的任何方法产生，例如通过体外转录、重组或通过合成手段。

可引入核苷酸的修饰或类似物以改善本发明的核酸分子的性质。改进的性质包括增加核酸酶抗性和/或增加渗透细胞膜的能力。因此，术语“核酸分子”和“双链RNA分子”包括经合成修饰的碱基，例如但不限于：肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基-、2-丙基-和其他烷基腺嘌呤、5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、6-氮杂胞嘧啶和6-氮杂胸腺嘧啶、假尿嘧啶、4-硫脲嘧啶、8-卤代腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-硫醇腺嘌呤、8-硫代烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤及其他8位取代的腺嘌呤、8-卤代鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-硫醇鸟嘌呤、8-硫代烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤及其他取代的鸟嘌呤、其他氮杂和脱氮腺嘌呤、其他氮杂和脱氮鸟嘌呤、5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶。

小分子

在一些实施方案中，外源性化合物是小分子。在一个实施方案中，小分子与抗病毒蛋白质结合，从而降低了蛋白质在病毒感染的禽蛋中发挥其正常功能的能力。

在一个实施方案中，施用的化合物可以是前体化合物，该前体化合物无活性或活性相对较差，但在施用后被转化(例如，被代谢)成化合物，与缺乏该化合物的同基因细胞相比所述化合物降低了蛋中抗病毒基因的表达和/或蛋白质活性。在那些实施例中，所施用的化合物可被称为前药。可替代地或另外地，所施用的化合物可被代谢以产生活性代谢物，与缺乏该化合物的同基因蛋相比所述活性代谢物具有降低蛋中的抗病毒基因的表达和/或蛋白质活性的活性。这种活性代谢物的使用也在本公开的范围内。

根据外源性化合物中存在的取代基，化合物可任选地以盐的形式存在。在本发明中适用的化合物的盐是其中的反离子是药学上可接受的反离子的那些盐。合适的盐包括与有机或无机酸或碱形成的盐。特别地，与酸形成的合适的盐包括：与无机酸、强有机羧酸(诸如未取代的或例如被卤素取代的1至4个碳原子的链烷羧酸，诸如饱和的或不饱和的二羧酸，诸如羟基羧酸，诸如氨基酸类)或有机磺酸(诸如被例如卤素取代的或未取代的(C_1-4)-烷基-或芳基-磺酸)形成的盐。药学上可接受的酸加成盐包括：由盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、柠檬酸、酒石酸、乙酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、琥珀酸、高氯酸、富马酸、马来酸、羟基乙酸、乳酸、水杨酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羟乙磺酸、抗坏血酸、苹果酸、邻苯二甲酸、天冬氨酸和谷氨酸、赖氨酸和精氨酸形成的盐。药学上可接受的碱盐包括：铵盐、碱金属盐(例如钾盐和钠盐)、碱土金属盐(例如那些钙盐和镁盐)和与有机碱形成的盐，该有机碱例如二环己胺、N-甲基-D-谷氨酸、吗啉、硫代吗啉、哌啶、吡咯烷、单-、二-或三-低级烷基胺，例如乙基-、叔丁基-、二乙基-、二异丙基-、三乙基-、三丁基-或二甲基-丙胺或单-、二-或三羟基低级烷基胺，例如单-、二-或三乙醇胺。也可形成相应的内盐。

有机和/或药物化学领域的技术人员将会认识到，许多有机化合物可与溶剂形成复合物，有机化合物在该溶剂中反应，或有机化合物从该溶剂中沉淀或结晶。这些复合物被称为“溶剂化物”。例如，与水的复合物被称为“水合物”。当药物以化学计量或非化学计量的量在晶格中掺入溶剂(诸如水)时，存在溶剂化物，如水合物。对药物进行常规筛选以筛选其是否存在溶剂化物，诸如水合物，因为可能会在任何阶段遇到这些物质。因此可理解，用于本发明的化合物可以以溶剂化物(诸如水合物)的形式存在。适用于本发明的化合物的溶剂化形式是其中相关溶剂是药学上可接受的那些溶剂化形式。例如，水合物是药学上可接受的溶剂化物的实例。

用于本发明的化合物可以以无定形形式或结晶形式存在。许多化合物以多种多晶形式存在，并且所有这些形式的化合物的使用都包含在本公开内容中。

用于本发明的小分子可使用标准程序来鉴定，诸如筛选与本发明的抗病毒靶蛋白结合的候选化合物的文库，并然后确定任何所结合的化合物是否降低蛋白质活性。例如，用于降低鸡IFN-α/β受体1的活性的小分子会与受体结合并抑制所述受体的配体(诸如IFNα)诱导细胞信号的能力。

结合物

在一个实施方案中，外源性化合物是结合并降低抗病毒蛋白质活性的蛋白质。在一个实施方案中，结合物是抗体或其片段。在一些实施方案中,所述抗体针对和/或降低了以下的表达或活性：IFNAR1、IL-6、CNOT4、MDA5、IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNλ、IFNAR2、UBE1DC1、GNAZ、CDX2、LOC100859339、IL28RA、ZFPM2、TRIM50、DNASEIL2、PHF21A、GAPDH、BACE2、HSBP1、PCGF5、IL-1RA、DDI2、CAPN13、UBA5、NPR2、IFIH1、LAMP1、EFR3A、ARRDC3、ABI1、SCAF4、GADL1、ZKSCAN7、PLVAP、RPUSD1、CYYR1、UPF3A、ASAP1、NXF1、TOP1MT、RALGAPB、SUCLA2、GORASP2、NSUN6、CELF1、ANGPTL7、SLC26A6、WBSCR27、SIL1、HTT、MYOC、TM9SF2、CEP250、FAM188A、BCAR3、GOLPH3L、HN1、ADCY7、AKAP10、ALX1、CBLN4、CRK、CXORF56、DDX10、EIF2S3、ESF1、GBF1、GCOM1、GTPBP4、HOXB9、IFT43、IMP4、ISY1、KIAA0586、KPNA3、LRRIQ1、LUC7L、MECR、MRPL12、POLR3E、PWP2、RPL7A、SERPINH1、SLC47A2、SMYD2、STAB1、TTK、WNT3、IFNGR1、IFNGR2、IL-10R2、IFNκ、IFNΩ、IL-1RB和XPO1基因和/或蛋白质或其相应的受体或激动剂。在一些实施方案中，结合物是针对以下两种或更多种的任意组合的双特异性抗体：IFNAR1、IL-6、CNOT4、MDA5、IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNλ、IFNAR2、UBE1DC1、GNAZ、CDX2、LOC100859339、IL28RA、ZFPM2、TRIM50、DNASEIL2、PHF21A、GAPDH、BACE2、HSBP1、PCGF5、IL-1RA、DDI2、CAPN13、UBA5、NPR2、IFIH1、LAMP1、EFR3A、ARRDC3、ABI1、SCAF4、GADL1、ZKSCAN7、PLVAP、RPUSD1、CYYR1、UPF3A、ASAP1、NXF1、TOP1MT、RALGAPB、SUCLA2、GORASP2、NSUN6、CELF1、ANGPTL7、SLC26A6、WBSCR27、SIL1、HTT、MYOC、TM9SF2、CEP250、FAM188A、BCAR3、GOLPH3L、HN1、ADCY7、AKAP10、ALX1、CBLN4、CRK、CXORF56、DDX10、EIF2S3、ESF1、GBF1、GCOM1、GTPBP4、HOXB9、IFT43、IMP4、ISY1、KIAA0586、KPNA3、LRRIQ1、LUC7L、MECR、MRPL12、POLR3E、PWP2、RPL7A、SERPINH1、SLC47A2、SMYD2、STAB1、TTK、WNT3、IFNGR1、IFNGR2、IL-10R2、IFNκ、IFNΩ、IL-1RB和XPO1或其受体或激动剂。在一个实施方案中，抗体是经修饰以穿透禽蛋的细胞或被禽蛋的细胞摄取(被动地或主动地)的抗体。在一个实施方案中，结合物不是B18R。

如本文中使用的术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、融合双抗体、三抗体、异源偶联抗体、包括完整分子的嵌合抗体及其片段和其他抗体样分子。抗体包括多种形式的修饰，包括例如但不限于：包括VH或VL结构域的结构域抗体、重链可变区的二聚体(VHH，如针对骆驼抗体所述的)、轻链可变区的二聚体(VLL)、包含可直接或通过接头连接的仅轻链(VL)和重链(VH)可变区的Fv片段、或含有重链可变区和CH1结构域的Fd片段。

由连接在一起形成单链抗体的重链和轻链的可变区组成的scFv(Bird等人，1988；Huston等人，1988)以及scFv的寡聚体(诸如双抗体和三抗体)也包括在术语“抗体”中。还包括含有可变区和部分恒定区的抗体片段，诸如Fab、(Fab′)2和FabFc2片段。还包括互补性决定区(CDR)移植的抗体片段以及抗体片段的寡聚物。Fv的重链和轻链组分可源自相同的抗体或不同的抗体，从而产生嵌合Fv区。抗体可以是动物(例如小鼠、兔或大鼠)，或者可以是嵌合体(Morrison等人，1984)。可通过本领域已知的任何方法产生抗体。

使用本文提供的指导方针以及在以上引用的参考文献中和在例如出版物Harlow&Lane《抗体：实验室手册》(Antibodies:a Laboratory Manual)(冷泉港实验室，1988)中描述的本领域技术人员熟知的方法，可容易地制备用于本发明的方法的抗体。

抗体可以是包含可变轻链(VL)和可变重链(VH)的Fv区，其中轻链和重链可直接或通过接头连接。如本文中使用的，接头是指与轻链和重链共价连接、并且在两条链之间提供足够的间隔和柔性而使得它们能够实现构象的分子，所述两条链在所述构象中能够与它们所针对的表位特异性结合。蛋白质接头是特别优选的，因为它们可被表达为融合多肽的Ig部分的内在组分。

在一个实施方案中，抗体具有细胞内传播的能力。具有细胞内传播能力的抗体包括诸如骆驼抗体和美洲驼羊抗体、鲨鱼抗体(IgNAR)、scFv抗体、胞内抗体或纳米抗体(例如scFv胞内抗体和VHH胞内抗体)等抗体。这样的抗原结合物可按照Harmsen和De Haard(2007)、Tibary等人(2007)和Muyldermans等人(2001)所述的进行制备。酵母SPLINT抗体文库可用于测试能够破坏蛋白质-蛋白质相互作用的胞内抗体(参见例如Visintin等人(2008)，关于其产生的方法)。这样的试剂可包含细胞穿透肽序列或核定位肽序列，诸如Constantini等人(2008)所公开的。还有用于体内递送的是Vectocell或Diato肽载体，诸如在De Coupade等人(2005)和Meyer-Losic等人(2006)所公开的。

另外，抗体可与细胞穿透剂(例如细胞穿透肽)融合。细胞穿透肽包括Tat肽、Penetratin、短的两亲性肽(诸如来自Pep家族和MPG家族的两亲性肽)、寡聚精氨酸和寡聚赖氨酸。在一个实施例中，细胞穿透肽还缀合至脂质(C6-C18脂肪酸)结构域以改善细胞内递送(Koppelhus等人，2008)。细胞穿透肽的实例可见于Howl等人(2007)和Deshayes等人(2008)。因此，本发明还提供了抗体经由共价键(例如肽键)任选地在N端或C端与细胞穿透肽序列融合的用途。

核酸构建体

将遗传学修饰引入本发明的禽和/或禽蛋可能涉及使用核酸构建体。在一个实施方案中，核酸构建体可包含转基因。如本文中使用的，“核酸构建体”是指载体中的编码例如本文定义的双链RNA分子、RNA、DNA或RNA/DNA杂合序列的任何核酸分子(其“导向”或“靶向”可编程核酸酶)、或感兴趣的多核苷酸。通常，核酸构建体将会是双链DNA或双链RNA或其组合。此外，核酸构建体通常将会包含与编码多核苷酸的开放阅读框可操作地连接的合适的启动子。核酸构建体可包含例如编码双链RNA分子的第一单链的第一开放阅读框，互补(第二)链由第二开放阅读框通过不同的或优选地相同的核酸构建体来编码。核酸构建体可以是线性片段或环状分子，并且其可能具有或可能不具有复制能力。本领域技术人员将会理解，本发明的核酸构建体可包括在合适的载体内。将核酸构建体转染或转化到受体细胞中允许细胞表达由核酸构建体编码的RNA或DNA分子。

在另一个实施例中，核酸构建体可表达相同的多个拷贝，和/或一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个或更多个，包括多个不同的)包含双链区的RNA分子，例如短发夹RNA。在一个实施例中，核酸构建体可为如在Schusser等人(2013)中描述的基因打靶盒。

核酸构建体还可含有附加的遗传因子。可包括在构建体中的因子的类型不受任何形式的限制，并且可由本领域技术人员选择。在一些实施方案中，核酸构建体作为转基因插入到宿主细胞中。在这种情况下，可能需要在构建体中包括“填充”片段，所述片段被设计成保护编码RNA分子的序列免受转基因插入过程的损害并降低外部转录通读的风险。填充片段也可被包括在构建体中以增加例如启动子与编码序列和/或终止子元件之间的距离。填充片段可以是5-5000个或更多个核苷酸的任何长度。启动子之间可有一个或更多个填充片段。在多个填充片段的情况下，它们可具有相同或不同的长度。填充DNA片段优选地是不同的序列。优选地，填充序列包含与在其插入的细胞或其子代中发现的序列相同的序列。在另一个实施例中，核酸构建体包含侧接于编码(多个)双链RNA的(多个)开放阅读框的填充区域。

替代性地，核酸构建体可包括转座因子，例如特征在于侧接于编码(多个)双链RNA的开放阅读框的末端反向重复序列的转座子。合适的转座子的实例包括Tol2、mini-To、睡美人转座子(Sleeping Beauty)、Mariner和Galluhop。

可包括在核酸构建体中的附加的遗传因子的其他实例包括：报道基因，诸如用于荧光标记蛋白(诸如GFP或RFP)的一种或多种基因；容易测定的酶，诸如β-半乳糖苷酶、萤光素酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶或分泌的胚胎碱性磷酸酶；或免疫测定容易获得的蛋白质(诸如激素或细胞因子)。可在本发明实施方案中使用的其他遗传因子包括编码赋予细胞选择性生长优势(诸如腺苷脱氨酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素B磷酸转移酶或药物抗性)的蛋白质的遗传因子。

在将核酸构建体转染到禽中的情况下，期望启动子和任何附加遗传因子是由天然存在于禽基因组中的核苷酸序列组成的。

在一些情况下，可能期望将核酸构建体插入到载体中。载体可例如是质粒、病毒或来源于例如噬菌体、腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、痘病毒或疱疹病毒的人工染色体。这样的载体包括染色体载体、附加型载体和源自病毒的载体，例如源自细菌质粒、噬菌体和病毒的载体、源自其组合的载体，诸如源自质粒和噬菌体遗传因子、粘粒和噬菌粒的载体。

在一个实施方案中，所述核酸构建体包含启动子。本领域技术人员将会理解，诸如组成型启动子、组织特异性或发育阶段特异性启动子、或诱导型启动子等启动子可用于本发明。在一个实施方案中，所述启动子是禽启动子。在一个实施方案中，所述启动子是PolI、Pol II或Pol II启动子。禽启动子的实例包括7sK RNA聚合酶III启动子、U6RNA聚合酶II启动子(Bannister等人,2007；Massine等人,2005)。

转基因禽

术语“转基因禽”是指其中一个或多个或所有细胞含有包含遗传学修饰的禽。“遗传学修饰”的实例包括但不限于基因和/或其调控区的缺失、取代或插入。所述的“插入”方法可包括但不限于，单个核苷酸的插入或核酸构建体的插入(“转基因”)。在一个实施方案中，遗传学修饰是在转基因禽的种系中。在一个实施方案中，使用可编程核酸酶产生的遗传学修饰改变禽内源抗病毒基因的编码区，以使得其不产生功能性蛋白质，或者编码的蛋白质具有降低的活性。遗传学修饰可以是染色体外的或整合到蛋的核或线粒体基因组中的。

在种系中包含遗传学修饰的转基因禽可用于产生包含种系遗传学修饰的禽和/或蛋。本发明的转基因禽可用于产生包含遗传学修饰的蛋，其中与缺乏遗传学修饰的同基因蛋相比，遗传学修饰降低了蛋中抗病毒基因和/或蛋白质的表达。在一个实施方案中，遗传学修饰导致动物和/或其后代和/或禽和/或其后代产生的蛋的一个或多个基因和/或蛋白质的表达降低。在一个实施方案中，可产生基因敲除动物。在一个实施方案中，靶向的种系遗传学修饰处于性染色体中。在替代的实施方案中，靶向的种系遗传学修饰处于体细胞染色体。在另一个实施方案中，遗传学修饰至少被引入到受精的卵子的DNA中(在单细胞阶段)。如本领域技术人员将理解的，在该实施方案中，遗传学修饰可被引入源自母系或父系的DNA，或两者。

用于产生转基因动物的技术是本领域已知的。针对该主题的有用的一般教科书是Houdebine的转基因动物——产生和使用(Harwood Academic,1997)。

异源DNA可例如被引入受精卵中。例如，可通过显微注射、磷酸钙介导的沉淀、脂质体融合、逆转录病毒感染或其它方式转化全能或多能干细胞，然后将转化的细胞引入胚胎，并然后将胚胎发育成转基因动物。在一种方法中，用含有所需DNA的逆转录病毒感染发育中的胚胎，且由被感染的胚胎产生转基因动物。然而，在替代的方法中，合适的DNA被共同注射到胚胎的原核或细胞质中(优选在单细胞阶段)，并且允许胚胎发育成成熟的转基因动物。

用于产生转基因禽的另一种方法包括通过标准方法将核酸显微注射到前核阶段的蛋中。然后将注射的蛋在转移到假孕接受者的输卵管中之前进行培养。

还可通过核转移技术产生转基因禽。使用该方法，用整合有结合结构域或调控序列控制的感兴趣的结合伴侣的编码序列的质粒稳定转染来自供体动物的成纤维细胞。然后将稳定的转染子融合到无核的卵母细胞中，培养并转移到雌性接受体中。

精子介导的基因转移(SMGT)是可用于产生转基因动物的另一种方法。该方法首先由Litrano等人(1989)描述。

产生转基因动物的另一种方法是基于连接子的精子介导的基因转移技术(LB-SMGT)。该过程在US7067308中描述。简言之，洗涤新鲜收获的精液，并用鼠单克隆抗体mAbC(由分配的ATCC登录号为PTA-6723的杂交瘤分泌)温育并然后构建DNA。单克隆抗体有助于DNA与精液的结合。然后将精子/DNA复合物人工授精到雌性中。

用于产生转基因禽的另一种方法是同源重组。该过程的一个实例在Schusser等人(2013)中提供。Schusser等人描述了通过在培养的原始生殖细胞中同源重组以产生基因特异性敲除鸟类的基因打靶。在一个实施例中，使用Schusser等人(2013)中描述的基因沉默盒产生转基因禽。

可通过将复制缺陷的逆转录病毒注射到新产的蛋的鸡胚盘的胚下腔中来产生种系转基因鸡(US 5,162,215；Bosselman等人，1989；Thovaval等人，1995)。携带外来基因的逆转录病毒核酸随机插入到胚胎细胞的染色体中，产生转基因动物，其中的一些在它们的种系中携带转基因。已描述了使用绝缘子元件插入融合基因构建体的5’或3’区以克服插入位点的位置效应(Chim等，1993)。

产生种系转基因动物的另一种方法是使用转座子，例如Tol2转座子，以将本发明的核酸构建体整合到动物的基因组中。在Koga等人(1996)和Kawakami等人(2000)中描述了首先从青鳉鱼Oryzias latipes分离并属于转座子的hAT家族的Tol2转座子。微型Tol2是Tol2的变体，并且在Balciunas等人(2006)中描述。当与Tol2转座酶共作用时，Tol2转座子和微型Tol2转座子帮助转基因整合入生物体的基因组中。通过在单独的非复制质粒上递送Tol2转座酶，仅将Tol2转座子或微型Tol2转座子和转基因整合到基因组中，并且含有Tol2转座酶的质粒在有限次的细胞分裂中丢失。因此，整合的Tol2转座子或微型Tol2转座子将不再具有经历随后的转位事件(transposition event)的能力。另外，由于Tol2已知是天然存在的禽转座子，在禽细胞(例如鸡细胞)中没有内源转座酶活性以引起进一步的转位事件。

任何其它合适的转座子系统可用于本发明的方法中。例如，转座子系统可以是睡美人转座子、青蛙王子转座子或Mos1转座子系统，或者可使用属于tc1/mariner或hAT转座子家族的任何转座子。

将禽胚胎干细胞注射入受体胚胎以产生嵌合鸟类，描述于US 7,145,057中。繁殖得到的嵌合体产生转基因鸟类，其基因组包含外源DNA。

在US 20060206952中描述了从禽原始生殖细胞(PGC)的长期培养物中获得转基因鸡的方法。当通过已知方法与宿主禽胚胎结合时，这些经修饰的PGC通过种系传输以产生转基因后代。

基于任何合适病毒的病毒递送系统可用于将本发明的核酸构建体递送至细胞。此外，可使用杂种病毒系统。病毒递送系统的选择将取决于各种参数，诸如递送到感兴趣的细胞、组织或器官中的效率、系统的转导效率、致病性、免疫学和毒性问题等。显然，不存在适用于所有应用的单一病毒系统。当选择在本发明中使用的病毒递送系统时，重要的是选择一种系统，其中含有核酸构建体的病毒颗粒优选：1)可重复地且稳定地繁殖；2)能够纯化至高滴度；和3)能够介导靶向递送(将核酸表达构建体递送至感兴趣的细胞、组织或器官，而没有广泛的传播)。

在一个实施方案中，转染试剂可与本文所述的分离的核酸分子、多核苷酸或核酸构建体混合，并如WO 2013/155572中所述直接注射到发育中的禽胚胎的血液中。该方法在本文中称为“直接注射”。使用这种方法，将转基因导入胚胎中的原始生殖细胞(PGC)中，并插入禽基因组中。直接注射可另外用于施用可编程核酸酶。

因此，多核苷酸，如本文描述的转基因和/或核酸构建体，可与合适的转染试剂复合或混合。如本文所用，术语“转染试剂”是指用于增强多核苷酸进入真核细胞的添加至所述多核苷酸的组合物，所述真核细胞包括但不限于禽细胞，如原始生殖细胞。虽然可使用本领域已知的适于转染真核细胞的任何转染试剂，但包含阳离子脂质的转染试剂是特别有用的。包含阳离子脂质的合适的市售转染试剂的非限制性实例包括Lipofectamine(LifeTechnologies)和Lipofectamine 2000(LifeTechnologies)。

可根据制造商的说明书或已知的方案将多核苷酸与转染试剂混合(或与之复合)。例如，当用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen，Life Technologies)转染质粒DNA时，可将DNA稀释在50μL Opit-MEM培养基中并轻轻混合。将Lipofectamine 2000试剂轻轻混合，并适量稀释于50μL Opit-MEM培养基中。温育5分钟后，将稀释的DNA和转染试剂合并，并在室温下轻轻混合20分钟。

然后可根据本发明的方法将合适体积的转染混合物直接注射入禽胚胎。尽管合适的体积可由诸如被注射的禽的胚胎的阶段和物种的因素决定，典型地用于注射入禽胚胎的合适体积为约1μL至约3μL。本领域技术人员将理解，可根据本说明书的教导优化用于混合转染试剂和DNA以及待注射到禽胚胎中的体积的方案。

注射前，将蛋在合适的温度下(例如约37.5-38℃)培养以发育胚胎，蛋的尖端朝上约2.5天(阶段12-17)，或直到胚胎中的血管的大小足以允许注射的时候。注射转染混合物的最佳时间是PGC迁移的时间，其通常发生在约阶段12-17，但更优选在阶段13-14。如本领域技术人员将理解的，肉鸡品系的鸡通常具有更快生长的胚胎，并因此注射应优选在阶段13-14的早期发生，以便在PGC迁移时将转染混合物引入血流中。

为了获得禽胚胎的血管，在蛋壳上穿孔。例如，可使用诸如镊子的合适工具在蛋的尖端形成大约10mm的孔。小心地除去壳部分和相关膜，同时避免损伤胚胎和它的膜。

在将转染混合物注射到禽胚胎的血管中之后，使用本领域已知的足量的石蜡膜或其它合适的密封剂膜密封蛋。例如，在壳中形成10mm孔的情况下，可使用大约20mm方形的石蜡膜片覆盖孔。然后可使用温的手术刀刀片将石蜡膜固定到蛋外表面。然后将蛋翻转至尖端朝下的位置，并在足以使胚胎发育的温度下孵育，例如直至随后的分析或孵化。直接注射技术进一步描述于WO 2013/155572中，其要求来自美国61/636,331的优先权。

使用本发明的方法生产的动物和/或蛋可针对遗传学修饰的存在进行筛选。此步骤可使用本领域中已知的任何合适方法来进行。例如，可使用标准DNA扩增和测序程序分析核酸样品(例如基因组DNA样品)以确定遗传学修饰是否存在于基因组中的靶位点(基因座)。在一个实施方案中，筛选还确定动物和/或蛋对于遗传学修饰是纯合的还是杂合的。在另一个实施方案中，筛选禽以鉴定是否可在种系细胞中发现遗传学修饰，以使得所述遗传学修饰可被传递到其后代中。

病毒

可在本发明的禽蛋中产生的病毒包括能够在可在禽蛋中复制和产生新的病毒颗粒的任何病毒。这类病毒包括DNA和RNA病毒。在一个实施方案中，病毒是动物病毒。在一个实施方案中，动物病毒是人类病毒。在一个实施方案中，病毒是非人类病毒。在一个实施方案中，病毒是禽病毒。

在本发明中使用的病毒的实例包括但不限于选自以下各科的病毒：正粘病毒科、疱疹病毒科、副粘病毒科、黄病毒科和冠状病毒科。在一个实施方案中，病毒是正粘病毒科的成员。

正粘病毒科病毒可以是例如甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、传染性鲑鱼贫血病毒(Isavirus)、索哥托病毒和/或Quaranja病毒。所述流感病毒可以是甲型流感病毒。所述甲型流感病毒可选自分离自动物的甲型流感病毒。在一个实施方案中，动物是人类或禽类。特别是，所述甲型流感病毒可选自H1N1、H1N2、H1N3、H1N4、H1N5、H1N6、H1N7、H1N9、H2N1、H2N2、H2N3、H2N4、H2N5、H2N7、H2N8、H2N9、H3N1、H3N2、H3N3、H3N4、H3N5、H3N6、H3N8、H4N1、H4N2、H4N3、H4N4、H4N5、H4N6、H4N8、H4N9、H5N1、H5N2、H5N3、H5N6、H5N7、H5N8、H5N9、H6N1、H6N2、H6N3、H6N4、H6N5、H6N6、H6N7、H6N8、H6N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N5、H7N7、H7N8、H7N9、H9N1、H9N2、H9N3、H9N5、H9N6、H9N7、H9N8、H10N1、H10N3、H10N4、H10N6、H10N7、H10N8、H10N9、H11N2、H11N3、H11N6、H11N9、H12N1、H12N4、H12N5、H12N9、H13N2、H13N6、H13N8、H13N9、H14N5、H15N2、H15N8、H15N9和H16N3。在一个实施方案中，所述甲型流感病毒选自H1N1、H3N2、H7N7和/或H5N1。

所述疱疹病毒科病毒可以是例如HSV-1、HSV-2、水痘带状疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒或巨细胞病毒。

所述副粘病毒科病毒可以是例如副粘病毒亚科或肺病毒亚科。在一个实施方案中，副粘病毒科病毒是新城疫病毒。

所述黄病毒科病毒可以是例如黄病毒属、丙型肝炎病毒属、Pegivirus、瘟病毒属病毒。在实施方案中，黄病毒科可以是阿波依病毒、阿罗阿病毒、巴格扎病毒、班齐病毒、博博衣病毒、布卡拉沙蝙蝠病毒、卡西帕科利病毒、凯里岛病毒、牛骨山脊病毒、达喀尔蝙蝠病毒、登革热病毒、埃杰山病毒、恩德培蝙蝠病毒、加德格兹谷病毒(Gadget Gully virus)、伊列乌斯病毒、以色列土耳其脑膜脑脊髓炎病毒、日本脑炎病毒、朱格拉病毒、胡蒂亚帕病毒、卡达姆病毒、凯多各病毒(Kedougou virus)、Kokobera病毒、库坦戈病毒、科萨努尔森林病病毒、兰加特病毒、跳跃病病毒、米班病毒、摩多克病毒、蒙大拿鼠耳蝙蝠脑白质炎病毒、墨累山谷脑炎病毒、恩塔亚病毒、鄂木斯克出血热病毒、粉判蝙蝠病毒、玻瓦桑病毒、里约布拉沃病毒、皇家农场病毒、萨博亚病毒、萨尔别霍病毒(Sal Vieja virus)、圣帕利塔病毒(SanPerlita virus)、索马勒兹礁病毒(Saumarez Reef virus)、塞皮克病毒、圣路易脑炎病毒、坦布苏病毒、蜱传脑炎病毒、秋列尼病毒、乌干达S病毒、乌苏土病毒、韦塞尔斯布朗病毒、西尼罗河病毒、雅温德病毒、黄热病病毒、横须贺病毒、寨卡病毒。

冠状病毒科病毒可以是例如冠状病毒亚科(Coronavirinae)或Corovirinae。冠状病毒亚科可能是α-冠状病毒、β-冠状病毒、δ-冠状病毒或γ-冠状病毒。环曲病毒亚科(Torovirinae)可能是α-冠状病毒或β-冠状病毒。在一个实施方案中，冠状病毒可能是SARS(严重急性呼吸综合征)冠状病毒。

在一个实施方案中，病毒选自：流感病毒、犬瘟热病毒、麻疹病毒、呼肠孤病毒、东方马脑炎病毒、犬副流感病毒、狂犬病病毒、鸡痘病毒、西方马脑炎病毒、腮腺炎病毒、马脑脊髓炎、风疹病毒、鸡产蛋下降综合征病毒、禽溶瘤病毒、禽传染性喉气管炎疱疹病毒、新城疫病毒、牛副流感病毒、天花病毒、传染性法氏囊病、牛茨城病毒、重组痘病毒、I型、II型或III型禽腺病毒、猪日本脑炎病毒、黄热病毒、疱疹病毒、辛德毕斯病毒、感染性支气管炎病毒、塞姆利基森林病毒、脑脊髓炎病毒、委内瑞拉EEV病毒、鸡贫血病毒、马立克氏病病毒、细小病毒、口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、古典猪瘟病毒、蓝舌病毒、Kabane病毒、传染性鲑鱼贫血病毒、传染性造血组织坏死病毒、病毒性出血性败血症病毒和感染性胰腺坏死病毒。

在蛋中产生疫苗

在禽蛋中复制病毒并从这些蛋中产生疫苗的方法已经存在了超过约70年，且因此是本领域公知的。例如，用于产生流感疫苗组合物的常规方法通常涉及在含胚的鸡蛋中生长病毒。通过该方法生长的病毒然后用于产生例如减毒活病毒、灭活(killed)的全病毒或亚基疫苗组合物。制备流感疫苗组合物的一种方法是通过将活流感病毒接种到10-11天大的含胚鸡蛋中。将该经接种的疫苗病毒孵育预定的一段时间，例如2或更多天以允许病毒复制，然后收获富集病毒的尿囊液(Hoffmann等人，2002)。在一个实施例中，预定时间为至少12小时，或至少24小时，或至少18小时，或至少24小时，或至少48小时，或至少72小时，或至少4天，或至少5天，或至少6天，或至少7天，或至少8天，或至少9天，或至少10天。

在通常操作中，蛋必须对着光检查，必须对外壳进行消毒，并且必须通过将少量病毒注射到尿囊腔中来接种每个蛋。然后将注射的蛋在33-37℃温育48-72小时，再次对着光检查，冷藏过夜并打开以允许收集尿囊液。然后可在进一步纯化之前通过过滤和/或离心澄清收集的流体。对灭活流感疫苗的要求，世界卫生组织技术报告系列384(1966)。美国许多商业上可获得的流感疫苗已在含胚的雌性蛋中繁殖。在一个实施方案中，蛋是鸡蛋，并且在第8天到第11天收获病毒。在一个实施方案中，蛋是鸡蛋并且在约第10天收获病毒。

从蛋中收获复制的病毒或其颗粒

可通过对于技术人员已知的任何方法从蛋、优选蛋的尿囊液中收集所复制的病毒或其颗粒(诸如分裂病毒颗粒或亚单位病毒颗粒)。例如，收获复制的病毒或其颗粒可涉及以下一个或多个步骤：澄清、浓缩、灭活、核酸酶处理、分离/纯化、精制和无菌过滤(Wolf等人,2008；Wolf等人,2011；Kalbfuss等人,2006；Josefsberg等人,2012)。在一个实施例中，通过离心、微滤和/或深度过滤来进行澄清。在一个实施例中，通过离心、超滤、沉淀、Monolith和/或膜吸附器来进行浓缩。在一个实施例中，通过UV、热或化学处理来进行灭活。灭活的化学形式包括福尔马林、二元乙撑亚胺和β-丙内酯或本领域技术人员已知的任何其他方法。在一个实施方案中，核酸酶处理是用全能核酸酶进行处理。在一个实施例中，通过超速离心(例如密度梯度)、珠粒层析(例如尺寸排阻层析、离子交换层析或亲和层析)和/或膜吸附剂(例如离子交换层析或亲和层析)来进行分离/纯化。在一个实施例中，通过超滤和/或渗滤进行精制。在一个实施例中，病毒或病毒颗粒可通过醇或聚乙二醇沉淀来进行浓缩。在一个实施例中，收获所复制的病毒或其颗粒包括使用如Grein等人(2013)所描述的膜。

在另一个实施例中，收获所复制的病毒可包括病毒破裂步骤，以产生用于裂解疫苗组合物或亚单位疫苗组合物的合适大小的病毒颗粒(Wolf等人,2008；Josefsberg等人,2012)。这样的步骤可以是产生用于裂解疫苗组合物或亚单位疫苗组合物的合适大小的病毒颗粒的任何方法。在一个实施例中，破坏步骤是洗涤剂增溶。

本领域技术人员会理解，可将所收获的病毒(减毒或灭活的全病毒)或所收获的病毒颗粒(裂解病毒颗粒或亚单位病毒颗粒)配制成疫苗组合物。这类组合物可包含以下的一种或多种：佐剂、赋形剂、粘合剂、防腐剂、载体偶联剂、缓冲剂、稳定剂、乳化剂、润湿剂、非病毒载体和转染促进化合物(Josefsberg等人,2011；Jones,2008)。本领域技术人员将进一步理解，可将这类疫苗组合物冻干。在一个实施例中，所生产的疫苗组合物适合于人类使用。在一个实施例中，所生产的疫苗组合物适合于兽医使用。

实施例

实施例1-通过中和抗体而破坏干扰素应答增加了卵内的病毒产量

ChIFNα、ChIFNβ、ChIFNγ和ChIFNλ的ORF在Top F′10大肠杆菌(E.coli)感受态细胞中表达，其采用pQE50表达系统并在IPTG诱导之后表达。使用Ni-NTA-琼脂糖将重组蛋白溶解并纯化。使用病毒中和测定法来测量rchIFN的生物学活性(Lowenthal等人,1995)。rchIFN在一定浓度范围内保护细胞，并且因此具有生物活性(图1)。

rchIFN被用作免疫原以产生针对同源重组蛋白质的兔抗血清。使用皂树(Qui A)混合佐剂中的rchIFN蛋白对新西兰雌性白兔进行皮下免疫多达7次。使用硫酸铵来富集兔抗chIFN抗血清中的球状血清蛋白。在对用于卵内注射的抗体进行0.2μm过滤灭菌(赛多利斯，德国)之前，使用分光光度计(NanoND-1000，NanoDrop Technologies，USA)对富集的抗血清进行定量。使用间接ELISA分析测试血清的反应性和多克隆抗体识别。简言之，在Titertek Multiscan Plus平板阅读器上在450nm处读取96孔ELISA平板中的在包被缓冲液中稀释至5μg/mL的纯化的rchIFN。所述分析显示了血清对于相应蛋白质的剂量效应反应性(图2A)。

接下来，用抗体和/或病毒经由尿囊液接种处于胚胎期第10-11天的海兰(Hyline)褐壳蛋(海兰(Hy-Line)，澳大利亚)。将流感病毒原液(由CSL Pty Ltd提供)在含有1％新霉素/多粘菌素的病毒稀释液中稀释至10-5。分别对蛋进行PR8(H1N1)或H5N1疫苗病毒(NIBRG-14)(CSL，澳大利亚)接种。还将纯化的抗chIFN和抗chIL-6抗体在病毒稀释液中稀释，以每只蛋1000μg、200μg或20μg的量接种到蛋中。接种后，将蛋在35℃下孵育48小时。

在将蛋冷藏在4℃下过夜以备收获之前，在孵育之后将蛋对着光检查以检查活力。从每只蛋中取出尿囊液(5mL)用于进一步分析。在收获的同一天进行HA测定。简言之，将尿囊液样品在PBS中连续稀释1/25，并一式两份地加到最后一排圆底96孔板(ICNBiochemicals，USA)中。向所有孔中加入50μL的0.5％经洗涤的鸡RBC，轻轻敲击以混合并在室温(RT)下放置至少40分钟，并且测定HA终点。卵内实验表明，所有浓度的抗chIFN-α抗体(图2B)和抗chIFN-β抗体(图2C)均未显著影响PR8或NIBRG-14病毒在蛋中的HA滴度。然而，当以200μg/蛋施用时(p＝0.04)，抗chIFN-λ抗体(图3A)显示出在统计学上提高了的PR8病毒的滴度。当以1000μg/蛋(p＝0.0045)和20μg/蛋(p＝0.0001)两者注射抗体时，H5N1疫苗病毒滴度在统计学上提高达1.5倍。类似地，当以1000μg/蛋(p＝0.015)接种时，抗chIFN-γ抗体(图3B)能够提高H5N1疫苗病毒的HA滴度。此外，抗chIL-6抗体(图3C)也在统计学上增强了蛋中的H5N1疫苗病毒滴度。

实施例2-在体外通过siRNA对大量基因的破坏增加了病毒滴度

为了鉴定具有抗病毒功能的候选基因，通过小干扰RNA(siRNA)测定来评估一组基因。在用禽流感(AI)病毒进行感染之前，用针对每种基因的多重(smartpool)siRNA来转染DF-1细胞。结果显示，KD后病毒滴度增加，对细胞没有任何明显的毒性作用(图4)。至少在某些情况下没有观察到明显的影响，但这可能是由于siRNA未被尽早施用以产生有效的KD(例如，考虑到抗-IL6抗体数据，这很可能解释了图4中的IL-6siRNA数据)。对于CNOT4、IFNAR或MDA5，评估了各个smartpool siRNA对细胞活力和基因沉默的影响(图5)。

实施例3-在体内通过shRNA对大量基因的下调增加了病毒滴度

对于卵内分析，siRNA以与ABA-21/117Q/PF聚合物(ABA-21/117Q；不含PolyFluor570染料标记的聚合物)形成的复合物进行递送，聚合物与2nmol siRNA的摩尔比为4:1，总体积为200μl。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)存在下在水溶液中形成复合物。将重新悬浮于水中的所需量的聚合物(316μg)加入到试管中并通过涡旋进行混合。然后将总共2nmol、相当于30μg的siControl或24.5μg的siAntiIFNAR1加入到试管中并对样品进行涡旋。在室温下允许复合持续1小时。将复合物直接注入到绒毛膜尿囊液中。48小时后，如前所述地注射病毒，并且在病毒感染后24小时收集样品。结果显示，IFNAR1的KD后的病毒生长增加(图6和图7)。

实施例4-鸡体内IFNAR1基因的缺失增加了体外病毒滴度

为了探究鸡干扰素(α、β和ω)受体1，即IFNAR1(基因ID：395665)的永久缺失对病毒产量有影响，生成了来自鸡胚成纤维细胞(DF-1)的连续细胞系的KO细胞系。使用来自微生物成簇的、规律间隔的、短回文重复序列(CRISPR/Cas9)系统的RNA指导的Cas9核酸酶，设计了两种不同的单指导RNA(sgRNA)以便通过双联法来产生双重双链断裂。根据(Ran等人,2013)对sgRNA进行克隆，并且使用编码完全去除IFNAR1前体的转录起始位点(TSS)和外显子一的约200bp的缺失而将相应的构建体转染到DF-1细胞中。使用BD FACS Aria II^TM细胞分选仪进行分选后，分离单细胞。基因组PCR筛选后鉴定每个克隆中的缺失，以区分野生型与单等位基因和双等位基因靶细胞系。

转染后，大约30％的等位基因呈现出多于200bp的缺失，这是通过对扩增子进行克隆和测序来证实的。在细胞分选成单克隆之后，通过gDNA PCR筛选细胞，并且分离单等位基因和双等位基因细胞系。此外，诱导的缺失证明，以基因剂量依赖的方式在转录水平上中断基因的表达，其中单等位基因细胞系显示出一半的表达水平，相比于野生型和双等位基因细胞系显示出接近于零的水平。即使是在受到病毒或聚(I:C)攻击后，这种效应也能持续下去，聚(I:C)是先天反应的强大诱导剂(图8A、B和C)。

为了评估缺失对于疫苗生产的影响，H1N1菌株A/WSN/1933在高感染复数和低感染复数(分别为1MOI和0.1MOI)下使用。使用这种方法，感染十小时后双等位基因细胞系中的病毒产量显著增加，当在噬斑形成单位(PFU)测定法中测量时为野生型细胞系中发现的水平的约三倍。与亲本细胞系相比，分离的病毒还显示出比来自双等位基因细胞系的TCID₅₀高五倍(图8D)。

实施例5-筛选和鉴定针对亨德拉病毒(Hendra Virus)的抗病毒基因

在调查亨德拉病毒(HeV)感染在人类海拉细胞中所需的蛋白质的siRNA筛选中，鉴定了许多与病毒产生相关的基因。将海拉细胞(ATCC CCL-2)保持在生长培养基(伊格尔氏改良伊格尔氏培养基；EMEM)中，所述生长培养基添加有10％v/v胎牛血清(FBS)、10mMHEPES、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/mL链霉素(P/S；Life technologies)。在Opti-MEM(Life technologies)中使用Dharmafect-1(GE Life Sciences)用siRNA池(GELife Sciences)对海拉细胞(7×10⁴)进行反向转染过夜，之后除去培养基并用转染培养基(生长培养基减去抗生素)进行置换，并且将细胞再接种24小时。转染后约6小时(h.p.t)更换培养基并再孵育18小时。然后用亨德拉病毒(HeV)(Hendra virus/Australia/Horse/1994/Hendra)感染细胞。对于50％组织培养感染剂量(TCID₅₀)，在96孔组织培养的培养基中制备组织培养上清液的10倍稀释液。将平板在37℃和5％CO₂下孵育3天(HeV)并对细胞病变效应进行评分。通过Reed和Muench(1938)的方法来计算感染滴度。将沉默基因的病毒复制与非靶向siRNA对照组(siNT)进行比较。观察到病毒复制显著增加，伴有大量基因的沉默(见图9和表2)。ADCY7的沉默展示出最高的病毒滴度的增加(见表2)。

本领域技术人员应理解，在不偏离广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对如具体实施例所示的发明做出众多的变化和/或修改。因此，本实施例在所有方面都被认为是说明性的而非限制性的。

本申请要求于2015年11月24日提交的标题为“禽蛋中的病毒的产生(Productionof viruses in avian eggs)”的澳大利亚临时申请号2015904854的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

将所有在本文中讨论的和/或提及的出版物通过引用以其全文并入本文。

已经被包括在本说明书中的文献、作用、材料、装置、物品或类似物的任何讨论唯一用于提供本发明的背景的目的。这并不被看作是承认任何或所有这些事项形成现有技术基础的一部分或任何或所有这些事项是与本发明相关的领域中的公共常识，虽然它在本申请的每个权利要求的优先权日之前存在。

表2：选择基因的沉默增加了海拉细胞中的亨德拉病毒复制

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Claims (34)

1.禽蛋，其包含：

1)遗传学修饰，与缺少所述遗传学修饰的同基因蛋相比，所述遗传学修饰降低所述蛋中抗病毒基因的表达，和/或

2)外源化合物，与缺少所述化合物的同基因蛋相比，所述外源化合物降低所述蛋中抗病毒基因的表达和/或降低所述蛋中抗病毒蛋白质活性的水平，

其中与所述同基因蛋相比，所述蛋能够产生更多的病毒。

2.如权利要求1所述的禽蛋，其中所述抗病毒基因和/或蛋白质选自以下的一种、两种、三种、四种或更多种：IFNAR1、IL-6、CNOT4、MDA5、IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNλ、BACE2、UBA5、ZFPM2、TRIM50、DDI2、NPR2、CAPN13、DNASE1L2、PHF21A、PCGF5、IL28RA、IFIH1、IL-1RA、LAMP1、EFR3A、ABI1、GADL1、PLVAP、CYYR1、ASAP1、NXF1、NSUN6、ANGPTL7、SIL1、BCAR3、GOLPH3L、HN1、ADCY7、CBLN4、CXORF56、DDX10、EIF2S3、ESF1、GCOM1、GTPBP4、IFT43、KPNA3、LRRIQ1、LUC7L、MRPL12、POLR3E、PWP2、RPL7A、SMYD2、XPO1和ZKSCAN7。

3.如权利要求1或权利要求2所述的禽蛋，其中所述抗病毒基因和/或蛋白质选自以下中的一种、两种、三种、四种或全部：IFNAR1、IL-6、CNOT4、MDA5、IFNα、IFNβ、IFNγ和IFNλ。

4.如权利要求1至3中任一项所述的禽蛋，其中所述遗传学修饰位于所述蛋的基因组中。

5.如权利要求1至4中任一项所述的禽蛋，其中所述遗传学修饰通过可编程核酸酶引入。

6.权利要求5所述的禽蛋，其中所述核酸酶选自：RNA指导的工程化核酸酶(RGEN)、转录激活因子样核酸酶(TALEN)和锌指核酸酶(ZFN)。

7.权利要求6所述的禽蛋，其中所述核酸酶是一种RNA指导的工程化核酸酶(RGEN)。

8.如权利要求4至7中任一项所述的禽蛋，其中所述核酸酶将缺失、取代或插入引入所述抗病毒基因或其调节区中。

9.如权利要求1至4中任一项所述的禽蛋，其中所述遗传学修饰是编码多核苷酸的转基因，所述多核苷酸降低所述蛋中的抗病毒基因的表达。

10.如权利要求9所述的禽蛋，其中所述多核苷酸是反义多核苷酸、有义多核苷酸、微小RNA、编码与所述抗病毒基因编码的蛋白质结合的多肽的多核苷酸、双链RNA分子、或由其衍生的经加工的RNA分子。

11.如权利要求1至3中任一项所述的禽蛋，其中所述外源化合物是小的基于碳的分子、蛋白质结合物、可编程核酸酶、多核苷酸或其二者或更多的组合。

12.如权利要求11所述的禽蛋，其中所述蛋白质结合物或所述多核苷酸表达自施用于所述蛋的转基因。

13.权利要求12所述的禽蛋，其中所述转基因存在于用于在所述蛋中培养的病毒中。

14.根据权利要求11至13中任一项所述的禽蛋，其中所述蛋白质结合物是抗体。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的禽蛋，其中所述病毒是动物病毒。

16.如权利要求15所述的禽蛋，其中所述动物是人类。

17.如权利要求15或权利要求16所述的禽蛋，其中所述病毒是选自以下病毒科的病毒：正粘病毒科、疱疹病毒科、副粘液病毒科、黄病毒科和冠状病毒科。

18.如权利要求17所述的禽蛋，其中所述病毒选自：流感病毒、犬瘟热病毒、麻疹病毒、呼肠病毒、东方马脑炎病毒、犬副流感病毒、狂犬病毒、鸡痘病毒、西方马脑炎病毒、腮腺炎病毒、马脑炎病毒、风疹病毒、产蛋下降综合征病毒、禽溶瘤病毒、禽传染性喉气管炎疱疹病毒、新城疫病毒、牛副流感病毒、天花病毒、鸡传染性法氏囊病、牛茨城病毒、重组痘病毒、I、II、III型禽腺病毒、猪日本脑炎病毒、黄热病毒、疱疹病毒、辛德比斯病毒、传染性支气管炎病毒、塞姆利基河森林脑炎、脑脊髓炎病毒、委内瑞拉EEV病毒、鸡贫血病毒、马立克氏病病毒、细小病毒、口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、蓝舌病毒、Kabane病毒、传染性鲑鱼贫血病毒、传染性造血组织坏死病毒、病毒出血性败血症病毒和传染性胰腺坏死病毒。

19.如权利要求18所述的禽蛋，其中所述病毒是流感病毒。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的禽蛋，其是鸡蛋。

21.根据权利要求1至20终任一项所述的禽蛋，其包含所述病毒。

22.复制病毒的方法，所述方法包括：

1)获取根据权利要求1至20中任一项所述的禽蛋，所述禽蛋包含遗传学修饰，

2)用所述病毒接种所述蛋，并且

3)将所述蛋孵育预定时间长度以复制所述病毒。

23.复制病毒的方法，所述方法包括：

1)获得禽蛋，

2)施用化合物，与缺少所述化合物的同基因蛋相比，所述化合物降低所述蛋中抗病毒基因的表达和/或降低所述蛋中抗病毒蛋白质活性的水平，

3)用所述病毒接种所述蛋，并且

4)将所述蛋孵育预定时间长度以复制所述病毒。

24.如权利要求22或权利要求23所述的方法，其进一步包括从所述蛋收获所述复制的病毒或其病毒颗粒。

25.权利要求24所述的方法，其中所述收获包含从所述蛋获得尿囊液。

26.使用根据权利要求1至21中任一项所述的禽蛋和/或使用根据权利要求22至25中任一项所述的方法产生的病毒。

27.产生疫苗组合物的方法，所述方法包括：

1)使用根据权利要求22至25中任一项所述的方法复制病毒，

2)收获来自所述蛋的所述复制的病毒或其病毒颗粒，并且

3)制备来自所述收获的病毒的疫苗组合物。

28.权利要求27所述的方法，其中步骤2)或步骤3)包含灭活病毒。

29.使用权利要求27或权利要求28所述的方法产生的疫苗组合物。

30.转基因禽，其包含遗传学修饰，其中与缺少所述遗传学修饰的同基因的禽产生的蛋相比，所述遗传学修饰降低所述禽产生的蛋中抗病毒基因的表达。

31.产生权利要求30的禽的方法，所述方法包括：

1)向禽细胞中引入所述遗传学修饰，

2)产生来自所述细胞的雌性禽，

3)获得来自所述雌性禽的一个或多个蛋，并针对与缺少所述遗传学修饰的同基因蛋相比产生更多病毒的能力对所述蛋进行筛选，

4)选择雌性禽，其产生具有遗传学修饰的蛋，与缺少所述遗传学修饰的同基因蛋相比，所述遗传学修饰产生更多病毒，

5)任选地，使用所述雌性禽繁殖更多禽。

32.权利要求31的方法，其中所述遗传学修饰位于所述细胞的基因组中。

33.权利要求31或权利要求32的方法，其中所述遗传学修饰通过可编程核酸酶引入。

34.根据权利要求31至33中任一项所述的方法，其中所述禽是鸡。