CN108872412B

CN108872412B - 基于石墨烯的QuEChERS法建立脂溶性贝类毒素的UPLC-MS/MS检测方法

Info

Publication number: CN108872412B
Application number: CN201810304789.8A
Authority: CN
Inventors: 赵巧灵; 王萍亚; 黄朱梁; 戴意飞; 陈翔; 蒋玲波
Original assignee: Zhoushan Institute For Food And Drug Control
Current assignee: Zhoushan Institute For Food And Drug Control
Priority date: 2018-04-04
Filing date: 2018-04-04
Publication date: 2022-01-04
Anticipated expiration: 2038-04-04
Also published as: CN108872412A

Abstract

本发明涉及基于石墨烯的QuEChERS法建立脂溶性贝类毒素的UPLC‑MS/MS检测方法。本发明建立了贝类水产品中9种脂溶性贝类毒素的UPLC‑MS/MS定量检测方法：该方法具有快速、简便、高效、回收率高、有机溶剂接触少、省时等优点；建立的QuEChERS样品前处理技术，结合冷冻除脂技术以及氧化石墨烯的高吸附特性，可以有效去除复杂基质(如游离脂肪酸和色素)，获得较好的脂溶性贝类毒素的检测回收率效果，净化效果良好，引入低温冷冻技术辅助QuEChERS法对样品的净化效果，可显著减少基质效益，提高方法的灵敏度；结合超高液相色谱串联质谱技术，成功应用贝类样品中脂溶性贝类毒素的检测，可同时检测9种脂溶性贝类毒素，比现有标准方法显著增加5种，具有较好的适用性。

Description

基于石墨烯的QuEChERS法建立脂溶性贝类毒素的UPLC-MS/MS 检测方法

技术领域

本发明涉及脂溶性贝类毒素的检测方法，尤其涉及一种减少基质效益，提高方法的灵敏度的基于氧化石墨烯的QuEChERS法建立脂溶性贝类毒素的UPLC-MS/MS多组分定量检测方法。

背景技术

海洋生物毒素(贝类毒素)特指主要由海洋有毒微藻或微生物产生、能够在海洋生物尤其是双壳贝类中富集的、对其他生物包括人类产生危害的一大类小分子有毒化学物质。针对这些生物毒素，研究者初期主要根据所引起的中毒症状将其分为六大类：麻痹性贝类毒素(Paralytic Shellfish Poisoning，PSP)、腹泻性贝类毒素(Diarrhetic ShellfishPoisoning，DSP)、神经性贝类毒素(Neurotoxic Shellfish Poisoning，NSP)、记忆缺失性贝类毒素(Amnesic Shellfish Poisoning，ASP)、西加鱼毒素(Ciguatera FishPoisoning，CFP)、蓝绿藻毒素。不过随着研究的深入，新的生物毒素种类不断被发现，且多种毒素如OA往往与毒素AZA和PTX伴生而成，但具有不同的致毒机理，原有分类方法已不能满足管理和科研的需求。因此，2004年，由联合国粮农组织、世界卫生组织和政府间海洋委员会共同组建的双壳类软体生物毒素工作组将贝类毒素分为八大类，分别为石房蛤毒素组(Saxitoxin，STX)、软骨藻酸组(Domoic acid，DA)、大田软海绵酸毒素组(Okadaic acid，OA)、原多甲酸毒素组(Azaspiracid，AZA)、短裸甲藻毒素组(Brevetoxin，BTX)、蛤毒素组(Pecenotoxins，PTX)、虾夷扇贝毒素组(Yessotoxin，YTX)和环亚胺类毒素(Cyclicimines，CIs)。除此之外，水螅毒素(Palytoxins，P1TX)和西加鱼毒素(Ciguatoxins，CTX)也正在被考虑是否划作贝类毒素中。

现有8大类贝类毒素中，STX和DA毒素组较易溶解于水，比较而言OA、AZA、BTX、PTX、YTX、CIs均为聚醚类物质，具热稳定性，易溶解于甲醇、乙醚等非极性有机试剂中，因此被统一称作为脂溶性贝类毒素(lipophilic phycotoxins，LPs)。贝类毒素的严重危害性已引起多个国家的密切关注，以欧美加等为首的发达国家相继制定了贝类毒素监控国家计划。传统的监控方法主要是定期对相关海域中的双壳贝类进行贝类毒素的含量及产毒藻种类和数量进行监测，以评估贝类毒素的风险性，对保护消费者安全，确保贝类产业健康发展做出了积极贡献。然而，传统手段需要采集大量的贝类和藻类样品才能对贝类毒素做出有效预警，不仅耗费大量的人力物力，而且时效性不强。2004年，MacKenzie等人首次报道了一种固相吸附毒素追踪技术(Solid phase adsorption toxin tracking，SPATT)，主要是利用特异性吸附材料对目标毒素进行吸附，然后实验室内洗脱、浓缩和净化后经LC-MS检测。SPATT技术与传统方法相比，不仅大量减少采样分析工作量，而且还可以监控目标海域不同水层贝类毒素的变化，同时结合贝类中毒素和有毒藻的变化情况，对贝类毒素有早期预警作用，具有很大的发展前景。现有的检测技术主要还是小鼠生物法，存在动物福利以及检出限高且不能明确辨析贝毒成分等问题，虽然质谱检测技术也已开始用于贝类毒素的检测，但检测种类比较单一，或前处理方法尚需进一步完善。

发明内容

本发明的目的在于为了解决现有用于贝类毒素的质谱检测方法，检测种类比较单一的缺陷而提供一种减少基质效益，提高方法的灵敏度的基于氧化石墨烯的QuEChERS法建立脂溶性贝类毒素的UPLC-MS/MS多组分定量检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

基于石墨烯的QuEChERS法建立脂溶性贝类毒素的UPLC-MS/MS检测方法，所述检测方法为通过QuEChERS法提取贝类样品，通过低温冷冻技术辅助QuEChERS法对样品的净化效果，然后通过进UPLC-MS/MS分析；其中净化吸附剂使用石墨烯。

在本技术方案中，(1)首次使用氧化石墨烯作为QuEChERS法的净化吸附剂，可获得较好的脂溶性贝类毒素的检测回收率效果。(2)引入低温冷冻技术辅助QuEChERS法对样品的净化效果，可显著减少基质效益，提高方法的灵敏度。(3)方法建立的UPLC-MS/MS可同时检测9种脂溶性贝类毒素，比现有标准方法显著增加5种。

作为优选，所述检测方法的具体步骤为：

1)QuEChERS法前处理步骤：准确称取1g±0.01g均质好的贝类样品于15mL离心管中，加入2mL提取液，涡旋震荡30s；加入0.50g无水硫酸镁，涡旋震荡1min，2.3×10³g离心5min，转移上清液于另一15mL离心管中；按照上述步骤重复提取一次；合并两次上清液置于冰箱中-20℃冷冻2h；取出后迅速过装有脱脂棉的漏斗，将得到的滤液40℃下氮吹至近干，加入1mL提取液复溶；然后加入50.0mg氧化石墨烯和100.0mg无水硫酸镁，涡旋震荡5min，1.0×10⁴g离心5min，上清液经0.22μm尼龙滤膜过滤后，进UPLC-MS/MS分析；

2)标准溶液的配制：根据每个毒素标准品的溶解度和性质，用移液器吸取适量的毒素标准品单标，用甲醇定容，使得h-YTX、YTX的浓度为400ng/mL，OA、DTX1、DTX2、SPX的浓度为200ng/mL；AZA1、AZA2、AZA3的浓度为50ng/mL的标准工作溶液，-20℃条件下冷冻保存。

作为优选，流动相选择流动相A：0.15％氨水和流动相B：甲醇，9种毒素优化后的质谱参数为：离子源：ESI电喷雾离子源，正负离子同时扫描；检测方式：MRM多反应监测；毛细管电压：ESI⁺：3.5kv；ESI^-：3.0kv；离子源温度：145℃；脱溶剂温度：450℃；喷雾电压：4000V；锥孔气流量：50L/h；脱溶剂气流量：750L/h。

作为优选，UPLC-MS/MS色谱条件为：色谱柱：Waters XBridge C18色谱柱100mm×2.1mm，5.0μm；柱温：40℃；进样量：10μL；流动相：A：0.15％氨水；B：甲醇；流速：0.3mL/min；洗脱方式：梯度洗脱。

作为优选，步骤1)提取液为体积比为7∶2∶1甲醇/乙醇/异丙醇。

作为优选，净化吸附剂为氧化石墨烯、还原石墨烯、氨基化石墨烯或羧基化石墨烯。

本发明的有益效果是：

本发明建立了贝类水产品中9种脂溶性贝类毒素的UPLC-MS/MS定量检测方法：该方法具有快速、简便、高效、回收率高、有机溶剂接触少、省时等优点；

(1)建立的QuEChERS样品前处理技术，结合冷冻除脂技术以及氧化石墨烯的高吸附特性，可以有效去除复杂基质(如游离脂肪酸和色素)，获得较好的脂溶性贝类毒素的检测回收率效果，净化效果良好，引入低温冷冻技术辅助QuEChERS法对样品的净化效果，可显著减少基质效益，提高方法的灵敏度；

(2)优化后的的QuEChERS方法，结合超高液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)技术，成功应用贝类样品中脂溶性贝类毒素的检测，可同时检测9种脂溶性贝类毒素，比现有标准方法显著增加5种，具有较好的适用性。

附图说明

图1是本发明C18，PSA，GCB和GO作为吸附剂时脂溶性贝类毒素的回收率。

图2是本发明氧化石墨烯、还原石墨烯、氨基化石墨烯和羧基化石墨烯作为吸附剂时脂溶性贝类毒素的回收率。

具体实施方式

以下结合具体实施例与附图对本发明作进一步的解释：

实验仪器

Waters超高液相系统(ACQUITYUPLC)和三重四级杆串联质谱仪(XEVO-TQ)，含电喷雾离子源(ESI)和大气压化学电离源(APCI)(Waters，USA)；

色谱柱：Waters XBridge C18 column(5μm，100mmX2.1mm i.d.)Acquity HSS-T₃column(1.8μm，，100mm×2.1mm i.d.，)Atlantics HILIC Silica column(Waters，150mm×2.1mm i.d.，5μm)(Waters，MA，USA)；

纯水仪：ELGA PURELAB Ultra+HitechRoDI plus纯水制备仪(ELGA，UK)；

均质仪：PoMron(PT2000，Switzerland)；

冷冻离心机：Type 3K-18(Sigma，Germany)；

涡旋振荡器：SCILOGXE MX-S(SCILOGEX，USA)；

组织捣碎器：IKA T-18(IKA，Germany)；

分析天平：ELECTRONIC BALANCE(SHIMADZU，Japan)；

氮吹仪：N-EVAP-24(Oragnic Association，USA)；

超声波清洗仪：上海科导超声仪器有限公司；

实验试剂

乙腈：HPLC级，纯度＞99.9％，购自Thermo Fisher Scientific，USA；

甲醇：HPLC级，纯度＞99.9％，购自TEDIA COMPANY.IN USA；

异丙醇：HPLC级，纯度＞99.8％，购自TEDIA COMPANY.IN USA；

丙酮：HPLC级，纯度＞99.5％，购自TEDIA COMPANY.IN USA；

正己烷：HPLC级，纯度＞99.5％，购自Honeywell，USA；

乙醇：分析纯，纯度＞99.7％，购自中国医药集团总公司；

氨水：分析纯，纯度25％～28％，购中国医药集团总公司；

超纯水：ELGA纯水仪制得，电导率≥18.2MΩ；

固相萃取柱：OASIS HLB购自Waters，USA；

Cleanert C₁₈，PSA，GCB购自Agela Technologies，USA；

石墨烯吸附材料：购自Nanoinnova technologies company(Madrid，Spain)；

无水硫酸镁(MgSO₄)，购自中国医药集团总公司；

9种标准毒素(OA、DTX1、DTX2、YTX、h-YTX、SPX、AZA1、AZA2、AZA3)均购自加拿大国家研究院海洋生物研究所(National Research Council，Halifax，NS，Canada)。

所述检测方法的具体步骤为：

1)QuEChERS法前处理步骤：准确称取1g±0.01g均质好的贝类样品于15mL离心管中，加入2mL提取液，体积比为7∶2∶1的甲醇/乙醇/异丙醇，涡旋震荡30s；加入0.50g无水硫酸镁，涡旋震荡1min，2.3×10³g离心5min，转移上清液于另一15mL离心管中；按照上述步骤重复提取一次；合并两次上清液置于冰箱中-20℃冷冻2h；取出后迅速过装有脱脂棉的漏斗，将得到的滤液40℃下氮吹至近干，加入1mL提取液复溶；然后加入50.0mg氧化石墨烯和100.0mg无水硫酸镁，涡旋震荡5min，1.0×10⁴g离心5min，上清液经0.22μm尼龙滤膜过滤后，进UPLC-MS/MS分析；

净化吸附剂为氧化石墨烯、还原石墨烯、氨基化石墨烯或羧基化石墨烯。

贝类样品均采集于浙江省宁波市港口海域。将采集来的贝类样品用清水洗净，取出完整新鲜的软组织，放入组织捣碎机中捣碎，将得到的样品放入-80℃条件下保存。

合适的液相色谱条件对于提高色谱选择性和降低质谱检测时的信号干扰是非常必要的。基于前人的报道，碱性的流动相通常会为脂溶性贝类毒素的检测提供一个更加完美的选择性、准确性和更低的定量限(LOQ)。在本发明中，基本的流动相选择0.15％氨水(流动相A)和甲醇(流动相B)，9种毒素优化后的部分质谱参数如下：

离子源：电喷雾离子源(ESI)，正负离子同时扫描；

检测方式：多反应监测(MRM)；

毛细管电压：ESI⁺：3.5kv；ESI^-：3.0kv；

离子源温度：145℃；

脱溶剂温度：450℃；

喷雾电压：4000V；

锥孔气流量：50L/h；

脱溶剂气流量：750L/h

锥孔电压和碰撞能量等质谱多反应监测条件见表1。

表1脂溶性贝类毒素的质谱多反应监测(MRM)条件

脂溶性贝类毒素UPLC-MS/MS色谱条件的建立

色谱柱：Waters XBridge C18色谱柱(100mm×2.1mm，5.0μm)；

柱温：40℃；

进样量：10μL；

流动相：A：0.15％氨水；B：甲醇；

流速：0.3mL/min；

洗脱方式：梯度洗脱；

梯度洗脱程序见表2。

表2目标贝类毒素的梯度洗脱

时间(min)	流速(mL/min)	％A	％B	Curve
					initial	0.3	95	5	0
0.1	0.3	95	5	6
					6	0.3	0	100	6
10	0.3	0	100	6
					10.1	0.3	95	5	1
12	0.3	95	5	1

方法学验证

优化的QuEChERS结合超高液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法检测贝类毒素的定量检测方法学验证包括以下参数：线性、基质效应、准确性、精密度、检出限(LOD)和定量限(LOQ)。由于贝类毒素没有合适的内标，因此选用外标法配以基质匹配曲线定量。基质匹配曲线通过空白基质添加已知浓度的贝类毒素混合标准品，按照梯度浓度添加，空白基质液是贝类样品粗提液经过优化后的QuEChERS净化而来。所有实验均重复三次进行。标准曲线的线性是通过相关系数(r²)体现，日内重复性(Intra-day)和日间重现性(Inter-day)以及精密度的判定通过使用基质加标实验测定回收率和相对标准偏差(RSD)来判断。检出限(LOD)和定量限(LOQ)通过基质加标液上样检测，信噪比(S/N)为10∶1时，作为定量限(LOQ)；继续稀释至信噪比(S/N)为3∶1时，作为方法检出限(LOD)。

提取溶剂的优化研究

贝类提取物中的复杂基质成分与UPLC-ESI-MS/MS系统是不相容的。因此，为了获得更高的质谱信号、较好的回收率和更高程度的样品制备效率，通过对现有的QuEChERS方法进行改进，使其具有更高的提取效率和相对简单的操作流程。通常，采用适当的溶剂中提取样品中的目标分析物，这是QuECHERS方法的初始步骤。因此，分别选择甲醇、乙醇、异丙醇、甲醇∶乙醇∶异丙醇(7∶2∶1，v/v/v)、甲醇∶乙醇∶异丙醇(2∶7∶1，v/v/v)、甲醇∶乙醇∶异丙醇(4.5∶4.5∶1，v/v/v)作为提取溶剂，通过提取的贝类毒素的回收率来获得最优提取试剂。结果表明，对于大多数的脂溶性海洋贝类毒素来看，当选择甲醇∶乙醇∶异丙醇(7∶2∶1，v/v/v)作为提取剂时，9种贝类毒素的回收率都在100％上下，波动平稳，得到最优回收率。

吸附剂的选择研究

基质效应通常会导致LC-MS/MS分析时，脂溶性贝类毒素质谱信号的增强或抑制。因此，贝类样品经过初步提取后，立即进行冷冻处理，于-20℃以下放置于铅盒中2h，注意贴壁，使贝类样品冷冻完全，而后迅速过滤，除去贝类样品中的大部分脂质。但是，粗提取物的颜色并没有发生明显变化，表明贝类样品粗提液中的色素没有被冷冻步骤除去。通常，PSA、C18和GCB可用于游离脂肪酸和色素去除。因此，通过比较不同类型的吸附剂，包括C18、PSA、GCB和GO，评估其对干扰成分的去除能力。结果表明，相对于PSA和C18的净化效果，使用GCB和GO进行净化后的提取液更趋于透明。此外还发现，用C18和PSA进行净化后的粗提液，基质增强效应明显，这与文献报道出的在LC-MS/MS分析中，YTXs和AZAs通过基质增强效应趋向于信号增强一致。此外，虽然使用分散固相萃取(d-SPE)净化时，用GCB和GO时的色素去除效果难以区分，但是GO吸附剂显示出更好的色素去除能力，因为在线性范围内，GO提供了令人满意的回收率，回收率在82.3％-111.7％之间，相对标准偏差(RSD)低于10.0％，结果如表3所示。

表3 C18、PSA、GCB和GO作为吸附剂时脂溶性贝类毒素的回收率和RSD

然而，在净化过程中由于GCB吸附剂对YTX和h-YTX的高保留，导致其回收率较低，h-YTX和YTX的回收率分别为50.4％和58.6％。上述结果表明，使用GO作为QuECHERS方法的吸附剂，具有最好的除去提取液中杂质的能力，获得较好的回收率，回收率范围为88.6％-108.3％。如图1所示。

不同形态的石墨烯比较研究

考察了四种石墨烯——氧化石墨烯、还原石墨烯、氨基化石墨烯和羧基化石墨烯作为QuECHERS方法吸附剂时去除杂质的能力，采用回收率和相对标准偏差(RSD)作为评价指标进行比较。结果如表4、图2所示。四种石墨烯中，氧化石墨烯对于目标毒素的吸附最为稳定；还原石墨烯和氨基化石墨烯对于h-YTX和YTX贝类毒素保留较高，造成回收率过低；羧基化石墨烯相对于氧化石墨来说，整体回收率均低于氧化石墨烯。因此，选择氧化石墨烯作为净化吸附剂。

表4利用氧化石墨烯，还原石墨烯，氨基化石墨烯和羧基化石墨烯作为吸附剂时脂溶性贝类毒素的回收率

质谱条件的优化

为了在质谱定量时提供更好的信号响应，每种脂溶性贝类毒素标准品先单独直接进样，通过多反应监测模式(MRM)正负离子同时扫描发现，AZAs和SPX贝类毒素适于正离子模式，YTXs、DTXs和OA贝类毒素适于负离子模式。因此，在检测9种贝类毒素时，需要在母离子和响应最高的子离子之间不断转换扫描，离子对中响应值较高离子被用做定量离子。对每种分析物，优化串联质谱(MS/MS)的参数，包括锥孔电压、碰撞电压、定量离子和定性离子，如表1所示。

色谱条件的优化

合适的色谱分离条件对于提高分辨率和降低质谱检测时信号干扰有着至关重要的作用。通常，碱性流动相可以提供更好的灵敏度、准确性和更低的定量限和检测限。在本发明中，流动相为0.15％氨水(流动相A)和甲醇(流动相B)，通过梯度洗脱的优化为脂溶性贝类毒素的分离提供足够的分辨率。

虽然QuEChERS方法可以有效除去基质成分，从而获得较高精确度，但是在日常的LC-MS/MS分析中，无法完全避免样品中的基质效应所带来的影响。基质中存在的干扰成分对目标分析物会产生基质增强或基质抑制效应，由于离子源ESI在追踪目标物质时的高灵敏度，会引起目标物质定量重复或定量缺失。因此，在本发明中，为有效避免基质效应带来的定量不准确，使用外标法和基质匹配曲线来对基质效应进行评价。同时，基质效应会因基质和贝类毒素的不同而出现差异，因此，为了评估QuEChERS方法的稳定性，使用文蛤和紫贻贝样品两种不同的基质匹配曲线，根据基质匹配曲线的斜率表明(表5)，基于GO和冷冻除脂步骤的QuEChERS方法可以显著消除主要基质成分，极大提高该方法的线性和信号的稳定性。同时，结果表明，使用特定贝类提取物的基质匹配曲线可用于其它贝类样品的测定。

表5文蛤和紫贻贝中的基质效应评价表

线性、LOD(检出限)及LOQ(定量限)

按照优化后的样品前方法处理得到目标物含量分别为5个系列空白添加式样，然后进行UPLC-MS/MS检测。以目标分析物的响应面积y为纵坐标，以目标分析物添加浓度X(μg/kg)为横坐标，绘制标准曲线。从表6可知，在构建的基质匹配曲线中，9种脂溶性贝类毒素：h-YTX和YTX为6.0-80.0μg/kg；DTX1，DTX2，OA和SPX为3.0-40.0μg/kg；AZA1，AZA2，AZA3为0.75-10.0μg/kg呈线性关系。结果表明，相关系数(r²)范围为0.9827～0.9997，这表明实验获得了令人满意的线性，优化后的方法具有足够的适用性，能够满足脂溶性贝类毒素定量检测的分析要求。表6表明，方法检测限(LOD)为0.10-1.47μg/kg，定量限(LOQ)为0.32-4.92μg/kg，远低于欧盟最大残留限量(MRL)。这些数据表明，该方法具有极好的灵敏度。

表6脂溶性贝类毒素的线性范围、相关系数(r²)、检测限(LOD)和定量限(LOQ)

贝类毒素	线性范围/(μg/kg)	相关系数r<sup>2</sup>	检测限(μg/kg)	定量限(μg/kg)
					h-YTX	6-80	0.9936	1.47	4.92
YTX	6-80	0.9943	0.74	2.41
					DTX1	3-40	0.9930	0.66	2.19
DTX2	3-40	0.9940	0.81	2.77
					OA	3-40	0.9997	0.75	2.53
AZA1	0.75-10	0.9827	0.17	0.55
					AZA2	0.75-10	0.9905	0.18	0.65
AZA3	0.75-10	0.9990	0.13	0.43
					SPX1	3-40	0.9966	0.10	0.32

回收率和精密度

以贝类为样品，做3个水平的基质加标实验，分别重复3次，按2.2.2节所述样品前处理方法进行回收率和精密度试验。结果见表7可知，9种脂溶性贝类毒素平均回收率为85.0-117.4％，并且日内重现性和的日间重现性(RSD)均低于13.2％。这表明，优化后的QuEChERS方法具有良好的的准确性和精密度。

表7三种不同浓度贝类毒素的加标回收率及相对标准偏差(RSDs)(n＝3)

运用所建立的方法来检测近海区域中贝类样品中脂溶性贝类毒素的浓度，结果如表8所示。SPX1、AZA3和h-YTX在贝类样品中有所检出，几乎所有的贝类样品中都含有SPX1，浓度范围为0.14μg/kg-19.92μg/kg，YTX、DTX1、DTX2、OA、AZA1和AZA2均低于检测限和欧盟最大残留限量。

表8近海区域中贝类样品中脂溶性贝类毒素的浓度

本发明建立了贝类水产品中9种脂溶性贝类毒素的UPLC-MS/MS定量检测方法：该方法具有快速、简便、高效、回收率高、有机溶剂接触少、省时等优点。建立的QuEChERS样品前处理技术，结合冷冻除脂技术以及氧化石墨烯的高吸附特性，可以有效去除复杂基质(如游离脂肪酸和色素)，净化效果良好。优化后的的QuEChERS方法，结合超高液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)技术，成功应用贝类样品中脂溶性贝类毒素的检测，具有较好的适用性。

Claims

1.基于石墨烯的QuEChERS法建立脂溶性贝类毒素的UPLC-MS/MS检测方法，其特征在于，所述检测方法为通过QuEChERS法提取贝类样品，通过低温冷冻技术辅助QuEChERS法对样品进行净化，然后通过进UPLC-MS/MS分析；

所述检测方法的具体步骤为：

1)QuEChERS法前处理步骤：准确称取1g±0.01g均质好的贝类样品于15mL离心管中，加入2mL提取液，提取液为体积比为7：2：1的甲醇、乙醇与异丙醇；涡旋震荡30s；加入0.50g无水硫酸镁，涡旋震荡1min，2.3×10³g离心5min，转移上清液于另一15mL离心管中；按照上述步骤重复提取一次；合并两次上清液置于冰箱中-20℃冷冻2h；取出后迅速过装有脱脂棉的漏斗，将得到的滤液40℃下氮吹至近干，加入1mL提取液复溶；然后加入50.0mg氧化石墨烯和100.0mg无水硫酸镁，涡旋震荡5min，1.0×10⁴g离心5min，上清液经0.22μm尼龙滤膜过滤后，进UPLC-MS/MS分析；

UPLC-MS/MS色谱条件为：色谱柱：Waters XBridge C18色谱柱100mm×2.1mm，5.0μm；柱温：40℃；进样量：10μL；流动相：A：0.15％氨水；B：甲醇；流速：0.3mL/min；洗脱方式：梯度洗脱；梯度洗脱程序为：

质谱条件为：流动相选择流动相A：0.15％氨水和流动相B：甲醇，9种毒素优化后的质谱参数为：离子源：ESI电喷雾离子源，正负离子同时扫描；检测方式：MRM多反应监测；毛细管电压：ESI⁺：3.5kv；ESI^-：3.0kv；离子源温度：145℃；脱溶剂温度：450℃；喷雾电压：4000V；锥孔气流量：50L/h；脱溶剂气流量：750L/h；9种脂溶性贝类毒素的质谱多反应监测条件为：