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CN108866198A - 标志物loc105376380在直肠腺癌诊断和治疗中的应用 - Google Patents

标志物loc105376380在直肠腺癌诊断和治疗中的应用 Download PDF

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CN108866198A CN201811010361.9A CN201811010361A CN108866198A CN 108866198 A CN108866198 A CN 108866198A CN 201811010361 A CN201811010361 A CN 201811010361A CN 108866198 A CN108866198 A CN 108866198A
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Abstract

本发明公开了标志物LOC105376380在直肠腺癌诊断和治疗中的应用。本发明首次发现了LOC105376380在直肠腺癌中表达水平显著上调，同时通过设计该lncRNA的siRNA，降低LOC105376380的表达水平可以改变直肠腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

Description

标志物LOC105376380在直肠腺癌诊断和治疗中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及标志物LOC105376380在直肠腺癌诊断和治疗中的应用。
背景技术
直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，其在全球的发病率与死亡率均位于第三位，每年约有130万新发病例。虽然直肠癌的发病原因仍不明确，但已确定与下列因素密切相关:饮食因素、遗传易感性、寄生虫、癌前疾病。直肠癌的发生发展过程包含一系列转录水平、转录后水平及表观遗传学的改变，但是至今尚未充分阐明直肠癌发生发展的机制，直肠癌的治疗也没有达到预期的效果，所以深入研究直肠癌的发病机制，探究新的诊断方法与治疗手段是攻克直肠癌的关键问题。
随着生物学的发展，人们发现，之前被认为“噪音”的lncRNA在疾病的发生发展中起着重要的作用。lncRNA，通常是指一类分子量大于200nt的非编码RNA，根据其功能，将其定义为在起始转录或是剪接转录中可能发挥功能的RNA分子。多数lncRNA分子是由RNA聚合酶II转录而来，并被聚腺甘酸化。
随着对lncRNA研究的深入，人们发现lncRNA在生物生长发育的特定阶段产生，具有组织和时间特异性。近年来的研究也表明，lncRNA参与了基因组印迹、X染色体失活、染色体修饰以及端粒生物学等多种生命活动过程。lncRNA还可在转录水平、转录后水平以及表观遗传水平调节基因的表达，参与人类多种疾病的发生和发展，如恶性肿瘤、冠心病、脊髓小脑共济失调8型、阿尔茨海默病及糖尿病等。近年来，有关lncRNA与肿瘤相关性的文献报道越来越多，表明了lncRNA是肿瘤发生发展过程中的一个重要环节，因此研究lncRNA在直肠腺癌中的作用，对于直肠腺癌发病机制的揭示，以及临床的诊断和治疗具有重要的意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与直肠腺癌相关的lncRNA标志物，将其应用到临床中，从而实现直肠腺癌的诊断和治疗，进行有效干预，提高患者的生存率和生存质量。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了LOC105376380的应用，用于制备诊断直肠腺癌的产品。
进一步，所述产品包括检测样本中LOC105376380表达水平的试剂。
进一步，所述试剂包括通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片技术检测LOC105376380表达水平的试剂。
本发明提供了一种诊断直肠腺癌的产品，包括芯片或试剂盒，其中，所述制剂、芯片或试剂盒包括检测LOC105376380表达水平的试剂。
进一步，所述芯片中检测LOC105376380表达水平的试剂包括特异性识别LOC105376380基因的探针；所述试剂盒中检测LOC105376380表达水平的试剂包括特异性扩增LOC105376380基因的引物或特异性识别LOC105376380基因的探针。
进一步，特异性扩增LOC105376380基因的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。
本发明提供了LOC105376380的另一种应用，用于制备治疗原发性直肠腺癌、直肠腺癌转移或直肠腺癌侵袭的药物组合物。
进一步，所述药物组合物包括LOC105376380的抑制剂。所述抑制剂选自：以LOC105376380或其转录本为靶序列、且能够抑制LOC105376380基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。
进一步，所述抑制剂为siRNA。如本文所用，所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。
在筛选有效的siRNA序列时，本发明人通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种siRNA序列，并将它们分别通过转染试剂转染直肠腺癌细胞系进行验证，选出干扰效果最佳的siRNA，进一步地在细胞水平实验，验证lncRNA与直肠腺癌发生发展的相关性。
优选的，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7～14所示；
更为优选的，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7～8所示。
作为本发明的一种可选方式，所述的LOC105376380的抑制剂也可以是一种“小发夹RNA(Small hairpin RNA，shRNA)”，其是能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，小发夹RNA能够通过RNA干扰途径来抑制基因的表达。如上述，shRNA可以由双链DNA模板来表达。双链DNA模板被插进一个载体，例如质粒或病毒载体，然后在体外或体内连接到一个启动子进行表达。shRNA在真核细胞内DICER酶的作用下，可被切割成小干扰RNA分子，从而进入RNAi途径。“shRNA表达载体”是指一些本领域常规用于构建shRNA结构的质粒，通常该质粒上存在“间隔序列”以及位于“间隔序列”两边的多克隆位点或供替换序列，从而人们可以将shRNA(或类似物)相应的DNA序列通过正向和反向的方式插入多克隆位点或替换其上的供替换序列，该DNA序列转录后的RNA可形成shRNA(Short Hairpin)结构。所述的“shRNA表达载体”目前已经完全可以通过商购的途径购买获得，例如一些病毒载体。
本发明提供了一种治疗直肠腺癌的药物组合物，所述药物组合物包括LOC105376380的抑制剂。所述抑制剂选自：以LOC105376380或其转录本为靶序列、且能够抑制LOC105376380基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。
进一步，所述抑制剂为siRNA。
优选的，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7～14所示；
更为优选的，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7～8所示。
进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体，药学上可接受的载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末等。
在本发明中，药物组合物可以使用不同的添加剂进行制备，例如缓冲剂、稳定剂、抑菌剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂。
本发明的药物组合物还可与其他治疗直肠腺癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。
本发明同时提供了一种筛选治疗直肠腺癌的候选药物的方法，所述方法包括：
用待筛选物质处理表达或含有LOC105376380基因的体系；和
检测所述体系中LOC105376380基因的表达；
其中，若所述待筛选的物质可以抑制LOC105376380基因的水平，则表明该待筛选物质是治疗直肠腺癌的候选药物。
所述体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
所述候选物质包括(但不限于)：针对LOC105376380基因或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物等。
当将通过本发明的筛选方法分离的化合物作为药物施用于人或其它哺乳动物，其包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、犬、羊、猪、牛、猴子、狒狒、黑猩猩时，分离的化合物可以直接施用，或者可以利用已知的药物制备方法配制成各种剂型。例如，根据需要，所述药物可以作为糖衣片剂、胶囊剂、酏剂和微胶囊口服施用；或者用水或任何其它药物可接受的液体配制成无菌溶液或悬浮液，以注射剂的形式非口服施用。例如，可以将化合物以一般接受的药物施用方式所需的单位剂型(unit dose)、与药学可接受的载体或介质混合在一起，所述载体或介质包括但不限于无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、赋形剂(excipient)、媒介物(vehicle)、防腐剂、粘合剂等。根据这些制剂中有效成分的含量，可以获得在指定范围内的合适的给药量。
在本发明中，“标志物”、“生物标志物”“基因标志物”可以通用，指代具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。
在本发明中，转录LOC105376380的基因是位于人10号染短臂1区5带上，本发明中的LOC105376380包括野生型、突变型或其片段。在本发明的实施例中，一种代表性的转录LOC105376380基因的核苷酸序列如目前国际公共核酸数据库GeneBank中LOC105376380基因(XR_930610.2)所示。
本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因的表达水平。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。
lncRNA水平的一些检测或定量方法是本领域已知的并且都适合用于本文提供的方法以测量生物标志物的水平。示例性的方法包括但不限于RNA印迹(northern blots)、核糖核酸酶保护试验和基于PCR的方法。当生物标志物是lncRNA分子时，lncRNA序列或其片段可以用于制备至少有部分互补的探针。然后采用例如基于PCR的方法、RNA印迹法(Northernblotting)或试纸条检测(dipstick assay)等任何合适的测定法，可以用探针检测样品中的lncRNA序列。
所述测定方法可以根据所需lncRNA信息的类型而变化。示例性的方法包括但不限于RNA印迹(Northern blots)和基于PCR的方法(例如，qRT-PCR)。qRT-PCR等方法也可以对样品中lncRNA的量进行准确定量。
在本发明中，试剂盒还包括容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂，以及附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肿瘤发展进行判断、对治疗方案进行选择。
试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。
在本发明中，术语芯片还包括固相载体，所述固相载体包括塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合，最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米，由于带有能与蛋白质结合的功能团，易与抗体(抗原)形成化学偶联，结合容量大；所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。
本发明中，正如熟练技术人员知道的，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合标志物和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。
优选地，在标志物组合中应用的数学算法是一种对数函数。优选地，应用此类数学算法或此类对数函数的结果是单一值。根据根本的诊断问题，能容易地将此类值与例如个体关于直肠腺癌的风险或与有助于评估直肠腺癌患者的其它有意诊断用途关联起来。以一种优选的方式，此类对数函数是如下获得的：a)将个体分类入组，例如正常人、有直肠腺癌风险的个体、具有直肠腺癌的患者等等，b)通过单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物，c)对数回归分析以评估标志物的可用于评估这些不同组的独立差别值，并d)构建对数函数来组合独立差别值。在这种类型的分析中，标志物不再是独立的，而是代表一个标志物组合。
用于将标志物组合与疾病关联起来的对数函数优选采用通过应用统计方法开发和获得的算法。例如，适宜的统计方法是判别分析(DA)(即线性、二次、规则DA)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推/装袋方法)、广义线性模型(即对数回归)、基于主分量的方法(即SIMCA)、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练技术人员在选择适宜的统计方法来评估本发明的标志物组合并由此获得适宜的数学算法方面不会有问题。在一个实施方案中，用于获得评估直肠腺癌中使用的数学算法的统计方法选自DA(即线性、二次、规则判别分析)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推方法)、或广义线性模型(即对数回归)。
在本发明的具体实施例中，实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
本发明的优点与有益效果：
本发明首次发现了LOC105376380的差异表达与直肠腺癌的发生发展相关，通过检测LOC105376380的表达水平可以判断患者是否患有直肠腺癌。
本发明首次发现了LOC105376380表达水平的变化可以引起直肠腺癌细胞增殖、侵袭和转移的变化，据此可以将其应用于直肠腺癌的治疗。
本发明公开了一种筛选治疗直肠腺癌的候选药物的方法，通过检测待选物质是否可以下调LOC105376380的表达水平来判断待筛选物质是否是候选药物。
附图说明
图1是利用QPCR检测LOC105376380基因在直肠腺癌组织中的表达情况图；
图2是检测siRNA对LOC105376380的沉默效果图；
图3是CCK8法检测LOC105376380对直肠腺癌细胞增殖的影响图；
图4是利用划痕实验检测LOC105376380对直肠腺癌迁移的影响图；
图5是利用Transwell小室检测LOC105376380对直肠腺癌细胞侵袭的影响图。
具体的实施方式
下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1筛选与直肠腺癌相关的基因标志物
1、样品收集
分别收集3例直肠腺癌癌旁正常上皮组织和直肠腺癌组织样本，全部病例在手术前均未接收化疗和放疗，无其他肿瘤性疾病、自身免疫疾病和严重的慢性疾病，癌旁正常上皮组织取自距肿瘤上缘5cm处，所有的患者均已知情同意，并通过组织伦理委员会的同意。
2、RNA样品的制备
利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行组织RNA的提取，具体操作按说明书进行。
3、总RNA定量与纯度分析
将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5μg，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。
4、构建cDNA文库
1)去除rRNA
使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA；
2)片段化RNA
对完整的RNA序列，利用金属离子进行随机打断，将RNA随机断裂成200bp左右的小片段。
3)反转合成cDNA
利用Illumina TruseqTM RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以lncRNA为模板反转合成一链cDNA，进行二链合成时，dNTPs试剂中用dUTP代替dTTP，使cDNA第二链中碱基包含A/U/C/G。
4)连接adaptor
加入End Repair Mix将双链cDNA的粘性末端补成平末端，随后在3’末端加上一个A碱基，用于连接Y字形的接头。
5)UNG酶消化cDNA二链
用UNG酶将cDNA第二链消化，从而使文库中仅包含cDNA第一链。
5、测序
使用Illumina X-Ten测序平台，进行2*150bp测序。
6、高通量转录组测序数据分析
1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉N大于10％的reads；
2)tophat比对到参考基因组上。所用的参考基因组版本为GRCh38.p7，fasta和gff文件下载自NCBI；
3)cuffquant定量lncRNA的表达量并标准化输出；cuffquant定量lncRNA的表达量并标准化输出；
4)cuffdiff比较对照组跟疾病组lncRNA的表达差异，差异表达lncRNA的筛选标准：p_value<0.05，|log2FC|>1。
7、结果
结果显示，相比癌旁正常上皮组织，在直肠腺癌组织中LOC105376380的表达水平显著增加，提示LOC105376380可能作为分子靶标应用于直肠腺癌的诊断。
实施例2QPCR测序验证LOC105376380基因的差异表达
1、对LOC105376380基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择直肠腺癌癌旁正常组织和直肠腺癌组织各45例。
2、RNA提取
利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取RNA样品，具体操作详见说明书。
3、QPCR
1)逆转录反应
采用FastQμant cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR106)进行lncRNA反转录，首先去除基因组DNA反应，在试管中加入5×gDNA Bμffer 2.0μl，总RNA 1μg，加Rnase Free ddH2O使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min，再将10×Fast RT Bμffer 2.0μl，RT EnzymeMix 1.0μl，FQ-RT Primer Mix 2.0μl，RNase Free ddH2O5.0μl，混合后加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min。
2)引物设计
根据Genebank中LOC105376380基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：
LOC105376380基因：
正向引物为5’-TTAGCCACCAGGTTAGTA-3’(SEQ ID NO.1)；
反向引物为5’-GGTTCAGACAGAAGACAA-3’(SEQ ID NO.2)。
GAPDH基因：
正向引物为5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.3)；
反向引物为5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.4)。
3)QPCR扩增检验
用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号：FP205)，进行扩增，实验操作按产品说明书进行。
采用20μl反应体系：
2×SuperReal PreMix Plus 10μl，正反向引物(10μM)各0.6μl，5×ROXReference Dye△2μl，DNA模板2μl，灭菌蒸馏水4.8μl。每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。
扩增程序为：
95°15min，(95℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 32s)×40个循环，95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s)。
4)cDNA模板浓度的筛选
将各样本cDNA混合后，以此为模板进行10倍梯度(10、100、1000、10000、100000倍)稀释，稀释后样品各取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行模板浓度的筛选。
根据溶解曲线，可以看出，当cDNA的进行10倍稀释时，PCR的扩增效率较高，溶解曲线单峰比较好。
5)样品RealTime PCR检测
将各样品cDNA 10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2-ΔΔCT法进行相对定量。
4、结果
QPCR结果如图1所示，与直肠腺癌癌旁正常组织相比，LOC105376380在直肠腺癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)；提示可将LOC105376380可作为直肠腺癌分子诊断的靶标。
实施例3LOC105376380基因的沉默
1、细胞培养
人直肠腺癌细胞株HRC-99，以含10％小牛血清和1％P/S的RPMI1640培养基在37℃、5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用含EDTA的0.25％胰蛋白酶常规消化传代，取处于对数生长期的细胞用于实验。
2、siRNA的设计
针对LOC105376380基因的序列设计siRNA，设计的siRNA序列如下所示：
阴性对照siRNA-NC的序列：
正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.5)，
反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.6)；
siRNA1：
正义链：5’-UGGAAAAGGAGGAAAGAGGUG-3’(SEQ ID NO.7)，
反义链：5’-CCUCUUUCCUCCUUUUCCAAG-3’(SEQ ID NO.8)；
siRNA2：
正义链：5’-AAUUACCUCGGCAAAGACCCU-3’(SEQ ID NO.9)，
反义链：5’-GGUCUUUGCCGAGGUAAUUAA-3’(SEQ ID NO.10)；
siRNA3：
正义链为5’-UAUAGACAGAAAAUGGAAGUG-3’(SEQ ID NO.11)，
反义链为5’-CUUCCAUUUUCUGUCUAUAAA-3’(SEQ ID NO.12)
siRNA4：
正义链为5’-UCAUUUGAAAUGAAUUGAGUU-3’(SEQ ID NO.13)，
反义链为5’-CUCAAUUCAUUUCAAAUGAAA-3’(SEQ ID NO.14)
3、转染
将细胞按1×104/孔接种到24孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养24h，在无双抗、含10％FBS的RPMI1640培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染。
实验分为空白对照组(HRC-99)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4)，其中阴性对照组siRNA与LOC105376380基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别进行转染。
4、QPCR检测LOC105376380基因的转录水平
1)细胞总RNA的提取
使用QIAGEN细胞RNA提取试剂盒提取细胞中的总RNA，具体步骤详见说明书。
2)逆转录步骤同实施例2。
3)QPCR扩增步骤同实施例2。
5、结果
结果如图2显示，与HRC-99和转染空载siRNA-NC组相比，实验组(siRNA1～4)能降低LOC105376380的水平，其中siRNA1的效果最为显著，选择siRNA1进行后续的实验。
实施例4LOC105376380对直肠腺癌细胞增殖的影响
1、直肠腺癌细胞HRC-99接种于6孔板中培养，待细胞密度达到85％-90％，使用脂质体2000转染siRNA1。无血清培养基培养4-6h后更换新培养基。
2、转染siRNA1后培养24h，将干扰组细胞和对照组细胞消化，在96孔板中接种转染后的HRC-99细胞悬液以及各对照组(100μl/孔)，接种密度为5×104/L。将培养板放在培养箱中预培养(37℃，5％CO2)。
3、向每孔加入10μl CCK8溶液。
4、将培养板放在培养箱内培养1-4h。
5、使用酶标仪测定在490nm处的吸光度。
6、结果
结果如图3所示，相比对照组，实验组中的细胞增殖受到显著抑制，提示LOC105376380可作为直肠腺癌的分子靶标。
实施例5划痕实验检测转染siRNA后直肠腺癌细胞增殖、迁移能力
1、将HRC-99细胞平铺于六孔板中，待细胞密度达到85％-90％，使用Lipo2000转染siRNA1，无血清培养4-6h后更换培养基。
2、直肠腺癌细胞将培养板底部均匀盖满后，用1ml枪头对准孔板保持垂直角度进行细胞划痕，尽可能使每个划痕的宽度相同。
3、去除细胞原培养液，用磷酸盐缓冲液对孔板进行冲洗，将由于细胞划痕形成的碎片洗去，加入无血清培养基，进行拍照，留取数据。
4、培养板置于细胞培养箱进行培养，培养4-6h后将培养板取出，再次拍照、记录数据，计算划痕愈合率。
5、结果
结果如图4所示，siRNA1组的划痕愈合率明显低于siRNA-NC组和空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，说明LOC105376380影响直肠腺癌细胞的迁移，提示LOC105376380可作为治疗直肠腺癌的分子靶标。
实施例6Matrigel侵袭实验
1、结直肠癌HRC-99细胞接种于6孔板中培养，待细胞密度达到85％-90％，使用Lipo 2000转染siRNA1。无血清培养基培养4-6h后更换培养基。
2、干扰组和对照组培养24h后，胰酶消化离心，使用无血清培养基进行重悬，调整细胞密度为5×l05个/ml，将200μl不含胎牛血清的基础培养基细胞悬液加入已铺好Matrigel基质胶的Transwell小室，24孔板的下室加入500μl含10％胎牛血清的培养基，细胞培养24h。
3、细胞在培养结束后使用DAPI染色。把小室细胞先用PBS漂洗2遍，放入DAPI工作液中室温染色5-20min。用PBS漂洗2遍，放入荧光显微镜下观察并计数。
4、结果
结果如图5所示，与对照组相比，实验组的穿膜细胞数减少，说明降低LOC105376380的表达水平之后细胞的侵袭能力明显下降(P<0.05)，提示LOC105376380可作为治疗直肠腺癌侵袭的潜在的分子靶标。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> 标志物LOC105376380在直肠腺癌诊断和治疗中的应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttagccacca ggttagta 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggttcagaca gaagacaa 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatcccatca ccatcttcca g 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagccccagc cttctccat 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
uucuccgaac gugucacgu 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgugacacg uucggagaa 19
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
uggaaaagga ggaaagaggu g 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccucuuuccu ccuuuuccaa g 21
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aauuaccucg gcaaagaccc u 21
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggucuuugcc gagguaauua a 21
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
uauagacaga aaauggaagu g 21
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cuuccauuuu cugucuauaa a 21
<210> 13
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ucauuugaaa ugaauugagu u 21
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cucaauucau uucaaaugaa a 21

Claims (10)

1.LOC105376380的应用，其特征在于，用于制备诊断直肠腺癌的产品。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括检测样本中LOC105376380表达水平的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片技术检测LOC105376380表达水平的试剂。
4.一种诊断直肠腺癌的产品，其特征在于，包括芯片或试剂盒，其中，所述制剂、芯片或试剂盒包括检测LOC105376380表达水平的试剂。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述芯片中检测LOC105376380表达水平的试剂包括特异性识别LOC105376380基因的探针；所述试剂盒中检测LOC105376380表达水平的试剂包括特异性扩增LOC105376380基因的引物或特异性识别LOC105376380基因的探针。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，特异性扩增LOC105376380基因的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。
7.LOC105376380的应用，其特征在于，用于制备治疗原发性直肠腺癌、直肠腺癌转移或直肠腺癌侵袭的药物组合物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包括LOC105376380的抑制剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为siRNA，优选的，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7～14所示；更为优选的，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7～8所示。
10.一种治疗直肠腺癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括LOC105376380的抑制剂；优选的，所述抑制剂为siRNA，更为优选的，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7～14所示；更为优选的，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7～8所示。
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