CN108866090B - 一种共发酵葡萄糖和木糖生产d-乳酸的乳酸片球菌构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种共发酵葡萄糖和木糖生产D‑乳酸的乳酸片球菌构建方法，属于基因工程领域。构建步骤包括，利用热敏型敲除系统在乳酸片球菌Pediococcus acidilactici ZP26（保藏号为CGMCC NO.8665）基因组上整合了异源木糖异构酶、木酮糖激酶、转酮醇酶以及转醛醇酶编码基因；敲除磷酸转酮酶编码基因以阻断副产物乙酸生成；并通过适应性驯化策略显著提高了工程菌株共发酵葡萄糖和木糖的能力。本发明首次成功实现了乳酸片球菌中木糖代谢路径的构建，得到一株高效共发酵葡萄糖和木糖生产光学纯D‑乳酸的工程菌株，并命名为P.acidilactici ZY15，其保藏号为CGMCC NO.13612。

Description

一种共发酵葡萄糖和木糖生产D-乳酸的乳酸片球菌构建方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别涉及一种利用热敏型敲除系统，基于同源重组原理的共发酵葡萄糖和木糖生产D-乳酸的乳酸片球菌构建方法。

背景技术

D-乳酸是一种重要的工业化学品，它广泛运用于食品、医药、皮革以及纺织业。近年来，以D-乳酸为前体生产生物可降解性塑料聚乳酸，使得光学纯D-乳酸的需求大大提升。但是，目前世界D-乳酸产量的90%都是由淀粉类原料进行发酵得到的，这就存在“与人争粮”问题。寻找更加便宜的原料进行D-乳酸生产将有助于减少粮食危机。木质纤维素原料是一种价格低廉、来源广泛的可再生生物质能源，利用含量丰富的木质纤维素原料生产D-乳酸是一种非常有前途的选择，并且已经有大量研究开始利用木材、农业废弃物等木质纤维素原料进行D-乳酸生产。

木质纤维素的主要组成部分是纤维素（30-60%干重）、半纤维素（20-40%）和木质素（15-25%）。其中纤维素来源的葡萄糖可以被微生物利用进行生物基化学品的生产。半纤维来源的木糖约占木质纤维素来源总糖含量的约30%，然而绝大部分生物炼制菌株都不能利用木糖，这限制了木质纤维素原料进行高浓度生物基化学品生产。本实验室先前工作中，筛选得到一株乳酸片球菌P. acidilatici DQ2，该菌可以很好的适应木质纤维素体系，并可以利用玉米秸秆原料产生103g/L的乳酸。之后通过基因工程改造敲除了乳酸片球菌P.acidilatici DQ2基因组上L-乳酸脱氢酶编码基因ldh，得到的工程菌株P. acidilaticiZP26可以利用25%（w/w）固含量的玉米秸秆原料产生77.76 g/L的D-乳酸，但其不能利用木糖。如果将木糖代谢路径构建至P. acidilatici ZP26，利用玉米秸秆生产D-乳酸的产量必将大大提高。

乳酸菌利用木糖进行乳酸生产一般是通过以下两种路径进行的。（1）磷酸转酮酶路径（PK路径）：木糖在木糖异构酶作用下被异构化为木酮糖，木酮糖在木酮糖激酶作用下磷酸化成5-磷酸木酮糖，然后5-磷酸木酮糖在磷酸转酮酶作用下裂解为三磷酸甘油醛（GAP）和乙酰磷酸，最后前者进入糖酵解路径生成乳酸，而后者进一步转化为副产物乙酸；（2）戊糖磷酸路径（PP路径）：木糖同样在木糖异构酶和木酮糖激酶作用下被转化为5-磷酸木酮糖，5-磷酸木酮糖在转酮醇酶和转醛醇酶的作用下最终转化为GAP进入糖酵解路径生成乳酸。其中PP路径代谢木糖时只产生乳酸，而无副产物乙酸等生成，因此PP路径是进行木糖代谢生成乳酸的最佳路径。

目前木糖代谢路径构建以生产D-乳酸只在Lactobacillus plantarum中实现过。Okano等（Okano K, Yoshida S, Yamada R, Tanaka T, Ogino C, Fukuda H, Kondo A.Improved production of homo-D-lactic acid via xylose fermentation byintroduction of xylose assimilation genes and redirection of thePhosphoketolase Pathway to the Pentose Phosphate Pathway in L-lactatedehydrogenase gene-deficient Lactobacillus plantarum. Applied andenvironmental microbiology, 2009, 75(24):7858-7861.）敲除了菌株中L-乳酸脱氢酶编码基因（ldhL1），和两个磷酸转酮酶编码基因（xpk1和xpk2），并将异源的转酮醇酶编码基因（tkt）整合至xpk1基因位点处。接着Yoshida等（Yoshida S, Okano K, Tanaka T, OginoC, Kondo A. Homo-D-lactic acid production from mixed sugars using xylose-assimilating operon-integrated Lactobacillus plantarum. Applied Microbiologyand Biotechnology, 2011, 92:67-76.）将两个拷贝的异源PxylAB分别整合至ldhL1和xpk2基因位点处，最终得到的工程菌株L. plantarum NCIMB 8826 ΔldhL1::PxylAB-Δxpk1::tkt-Δxpk2::PxylAB可以代谢木糖进行同型D-乳酸生产。

目前还没有对乳酸片球菌进行木糖代谢路径构建以生产D-乳酸的报道，因此建立一种乳酸片球菌木糖代谢路径构建方法，对于共发酵木质纤维素原料中的葡萄糖和木糖进行D-乳酸生产是非常有必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种P. acidilactici中木糖代谢路径构建方法。

本发明的另一个目的在于构建一株能够高效共发酵葡萄糖和木糖进行D-乳酸生产的P. acidilactici工程菌株。

本发明实现P. acidilactici中木糖代谢路径构建所采用的技术方案是：首先，选择不同来源的xylAB操纵子以及不同启动子，得到最优的xylAB表达框后，并将xylAB表达框整合至P. acidilactici ZP26已缺失的ldh基因位点处。接着，敲除磷酸转酮酶编码基因pkt以阻断副产物乙酸生成。接着，将磷酸转酮酶（tkt）和转酮醇酶（tal）表达框整合至已敲除的pkt基因位点处。最后，得到的重组菌在木糖为唯一碳源的合成培养基中进行适应性驯化，直至得到一株高效利用木糖的稳定菌株为止。

上述基因敲除以及基因整合具体方法是：将构建得到的敲除质粒或整合质粒电转化至P. acidilactici中，然后将重组菌在42℃，添加红霉素的MRS培养基中培养12h后，取菌液稀释10⁶倍涂布于含有红霉素的MRS平板上，42℃静置24h后，取单菌落转接至无红霉素的MRS培养液中，并在28℃下培养20h后，取菌液稀释10⁶倍涂布于无红霉素的MRS平板上，42℃静置24h后，将长出的单菌落分别点板至不含红霉素的MRS平板上和含有红霉素的MRS平板上，42℃静置24h，将在不含红霉素平板上生长的菌落，而在含红霉素平板上不生长的菌落进行进一步的PCR验证，以确定靶基因是否被敲除或者靶基因是否被整合到相应的基因位点处。

上述敲除质粒构建方法是：以P. acidilactici ZP26基因组为模板，PCR得到待敲除靶基因的上下游同源臂，然后通过酶切连接分别连接至热敏型敲除质粒pSET4E上。

上述整合质粒构建方法是：以P. acidilatici DSM20284基因组为模板，PCR得到待整合的靶基因，以P. acidilactici ZP26基因组为模板，PCR得到待整合位点处基因的上下游同源臂，首先将上下游同源臂分别连接至pSET4E上，得到敲除质粒，然后将待整合的靶基因连接至敲除质粒的上下游同源臂之间，得到整合质粒。

上述适应性驯化具体方法是：将整合了木糖代谢路径的工程菌株接种至MRS液体培养基中，培养12h后，以10%的接种量接种至含木糖为唯一碳源的MRS液体培养基中(添加CaCO₃调节pH)，培养36h，以10%接种量转接至新鲜含木糖为唯一碳源的MRS液体培养基中继续培养36h，期间不断进行转接，直至发酵液中残留的木糖以及D-乳酸生成稳定为止，对得到的木糖发酵性能稳定的驯化菌株进行保种。

本发明结合代谢工程以及适应性驯化，在国际上首次实现了P. acidilactici的木糖代谢路径构建。

本发明所采用的木糖代谢路径构建方法，不局限于P.acidilactici的木糖代谢路径构建，也可以运用于其他微生物的木糖代谢路径构建。

本发明结合代谢工程和适应性驯化，得到了一株高效共发酵葡萄糖和木糖进行D-乳酸生产的工程菌株，并命名为P. acidilactici ZY15，该菌株已于2017年01月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏登记号为CGMCC NO.13612，其分类命名为乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。

附图说明

图1：木糖代谢路径构建示意图。

图2：P. acidilatici ZP26::xylAB-Δpkt::(tkt_tal)的基因组PCR验证图

图中：M，DL5,000 DNA Marker；1，利用引物xylAB_2911-F和xylAB_2911-R扩增整合至基因组上的异源基因xylAB_2911；2，利用引物pkt-F和pkt-R扩增基因组中被敲除的基因pkt；3，利用引物tkt_tal-F和tkt_tal-R扩增整合至基因组上的异源基因tkt_tal。

图3：适应性驯化过程中发酵液中木糖残留以及D-乳酸生成。

图4：驯化前后木糖发酵性能比较。

图5：驯化前后葡萄糖和木糖共发酵性能比较。

图6：木糖利用工程菌株与母本菌株共发酵性能比较。

具体实施方案

一、本发明所使用的菌株与质粒

乳酸片球菌P. acidilactici ZP26由本实验室改造得到，已于2013年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏登记号为CGMCC NO.8665。所用大肠杆菌Escherichia coli XLI-blue保存于本实验室。所用的乳酸片球菌P. acidilacticiDSM20284购自DSM (Scheiwg,Germany)，戊糖片球菌P. pentosaceus ATCC25745购自ATCC(Manassas,VA,USA)。所用表达质粒pMG36e来源见Van de Guchte M, Van der Vossen JM,Kok J, Venema G. Construction of a lactococcal expression vector: expressionof hen egg white lysozyme in Lactococcus lactis subsp. lactis. AppliedEnvironment and Microbiology, 1989, 55(1):224-228。所用热敏型敲除质粒pSET4E来源见Yi X, Zhang P, Sun J, Tu Y, Gao Q, Zhang J, Bao J. Engineering wild-typerobust Pediococcus acidilactici strain for high titer l- and d-lactic acidproduction from corn stover feedstock. Journal of Biotechnology, 2016, 217:112-121。

二、试剂与培养基

Prime STAR HS DNA 聚合酶购自Takara生物工程公司；限制性内切酶和T4 DNAligase购自Fermentas公司；基因组抽提试剂盒购自Tiangen公司；质粒小抽试剂盒、PCR产物回收试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；Megazyme D-/L-Lactic acid Kit试剂盒购自Megazyme公司；红霉素购自Biosharp生物科技有限公司；其它药品、试剂如无特殊说明均购自上海凌峰化学试剂公司或上海国药化学试剂集团；引物合成在上海捷瑞生物工程有限公司完成。

MRS培养基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母粉4，牛肉膏8，乙酸钠3，柠檬酸氢二铵2，磷酸氢二钾2，七水硫酸镁0.2，一水硫酸锰0.05，吐温80 l mL/L；

含红霉素的MRS培养基：在MRS培养基基础上加入终浓度5μg/mL的红霉素；

简化MRS液体培养基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母粉10，乙酸钠5，柠檬酸氢二铵2，磷酸氢二钾2，七水硫酸镁0.58，一水硫酸锰0.25，115℃高压蒸汽灭菌20min；

适应性驯化所用培养基（g/L）：木糖20，蛋白胨10，酵母粉10，乙酸钠5，柠檬酸氢二铵2，磷酸氢二钾2，七水硫酸镁0.58，一水硫酸锰0.25，CaCO₃ 12，115℃高压蒸汽灭菌20min；

LB培养基（g/L)：

液体：酵母浸粉5，蛋白胨10，氯化钠10；固体：在液体培养基中额外添加15 g/L的琼脂，115 ℃高压蒸汽灭菌20 min；

含红霉素的LB培养基：在LB培养基基础上加入终浓度150μg/mL的红霉素。

三、所用主要仪器

Mastercycler型PCR仪（Eppendorf公司）；Gene Pulser Xcell试型电穿孔仪（Bio-Rad公司）；EPS-100型DNA电泳系统（上海天能公司）；Tanon 1600凝胶成像系统（上海天能公司）；DU-800型核酸蛋白质分析仪（Beckman公司）；HZ-2111KB型落地恒温振荡摇床（太仓华利达有限公司）；5415R型台式冷冻离心机（Eppendorf公司）；LC-20AD型高效液相色谱（岛津公司）；SDC-6型低温水槽（宁波新芝生物科技有限公司）；DK-8D型三孔电热恒温水槽（上海一恒科学仪器有限公司）；GHP-9160型隔水式恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；Forma-86C型超低温冰箱（Thermo公司）。

实施案例1：携带不同xylAB表达框的P. acidilactici ZP26的木糖发酵性能比较。

（1）不同启动子与不同xylAB操纵子的PCR扩增

根据Tiangen基因组抽提试剂盒的所述方法提取P. acidilactici ZP26，P.acidilactici DSM20284和P. pentosaceus ATCC25745的基因组。以P. acidilacticiZP26基因组为模板，设计引物Pldh-F（SEQ ID NO:1）和Pldh-R（SEQ ID NO:2）扩增得到ldh的启动子Pldh（SEQ ID NO:3），设计引物PldhD-F（SEQ ID NO:4）和PldhD-R（SEQ ID NO:5）扩增得到ldhD的启动子PldhD（SEQ ID NO:6）；以P. acidilactici DSM20284基因组为模板，设计引物xylAB_2911-F(SEQ ID NO:7)和xylAB_2911-R(SEQ ID NO:8)扩增得到xylAB_2911(SEQ ID NO:9)；以P. acidilactici DSM20284基因组为模板，扩增得到xylAB_3089，以P. pentosaceus ATCC25745基因组为模板，扩增得到xylAB_pp。

（2）携带不同xylAB表达框的表达质粒构建

将两种启动子Pldh和PldhD与三种操纵子xylAB_2911，xylAB_3089和xylAB_pp分别进行融合PCR，得到六个表达框Pldh_xylAB_2911，Pldh_xylAB_3089，Pldh_xylAB_pp，PldhD_xylAB_2911(SEQ ID NO:10)，PldhD_xylAB_3089和PldhD_xylAB_pp。然后通过EcoRI和Xba I两个酶切位点将表达质粒pMG36e的P32启动子替换成以上六种表达框，得到六种表达质粒pMG36e-PldhD_xylAB_2911，pMG36e-Pldh_xylAB_2911，pMG36e-PldhD_xylAB_3089，pMG36e-Pldh_xylAB_3089，pMG36e-PldhD_xylAB_pp和pMG36e-Pldh_xylAB_pp。

（3）携带不同表达质粒的重组菌木糖发酵比较

将上述得到的六种表达质粒分别电转化至P. acidilactici ZP26,得到六株重组菌P. acidilactici ZP26(pMG36e-PldhD_xylAB_2911)， P. acidilactici ZP26(pMG36e-Pldh_xylAB_2911)， P. acidilactici ZP26(pMG36e-PldhD_xylAB_3089)， P.acidilactici ZP26(pMG36e-Pldh_xylAB_3089)， P. acidilactici ZP26(pMG36e-PldhD_xylAB_pp)和P. acidilactici ZP26(pMG36e-Pldh_xylAB_pp)。

将以上六株重组菌培养在含20g/L木糖的MRS培养基中进行发酵性能比较（发酵数据见表1），其中重组菌P. acidilactici ZP26 (pMG36e-PldhD_xylAB_2911)木糖代谢速率最快，后期选择表达框PldhD_xylAB_2911进行基因组整合。

表1：携带不同表达质粒的P. acidilactici ZP26重组菌的木糖发酵比较

实施案例2：xylAB表达框整合至P. acidilactici ZP26的ldh基因位点处

（1）整合质粒pSET4E-Δldh::xylAB的构建

首先以P. acidilactici ZP26基因组为模板，扩增得到ldh上游约1,000bp的基因序列up-ldh，扩增得到ldh下游约1,000bp的基因序列down-ldh。以实施案例1中得到的表达质粒pMG36e-PldhD_xylAB_2911为模板，扩增得到PldhD_xylAB_2911。然后通过酶切连接，将up-ldh片段插入至pSET4E的Pst I和BamH I位点之间，将down-ldh片段插入至BamH I和EcoR I位点之间，得到用于ldh基因敲除的质粒pSET4E-Δldh，然后将表达框PldhD_xylAB_2911插入至pSET4E-Δldh的Xho I和BamH I之间，得到整合质粒pSET4E-Δldh::xylAB。

（2）xylAB的基因组整合

将整合质粒pSET4E-Δldh::xylAB电转化至P. acidilactici ZP26中，得到重组菌P. acidilactici ZP26(pSET4E-Δldh::xylAB)，然后将重组菌在42℃，添加红霉素的MRS培养基中培养12h后，取菌液稀释10⁶倍涂布于含有红霉素的MRS平板上，42℃静置24h后，取单菌落转接至无红霉素的MRS培养液中，并在28℃下培养20h后，取菌液稀释10⁶倍涂布于无红霉素的MRS平板上，42℃静置24h后，将长出的单菌落分别点板至不含红霉素的MRS平板上和含有红霉素的MRS平板上，42℃静置24h，将在不含红霉素平板上生长的菌落，而在含红霉素平板上不生长的菌落进行进一步的PCR验证。选择的单菌落为模板，若能够扩增出xylAB_2911，而扩增不出红霉素抗性基因Em，则xylAB整合成功，得到的整合菌株命名为P.acidilactici ZP26::xylAB。

（3）工程菌P. acidilactici ZP26::xylAB的木糖发酵

将工程菌株P. acidilactici ZP26::xylAB接种于简化MRS液体培养基中，培养12h后，以10%接种量转接至含35g/L木糖的MRS液体培养基中进行木糖发酵。工程菌株P.acidilactici ZP26::xylAB可以代谢木糖生产D-乳酸，但同时生成了大量副产物乙酸（见表2）。

实施案例3：磷酸转酮酶基因pkt的敲除

（1）敲除质粒pSET4E-Δpkt的构建

以P. acidilactici ZP26基因组为模板，扩增得到pkt基因的上游约1,000bp片段（up-pkt）和下游约1,000bp片段序列（down-pkt）。将down-pkt片段插入至pSET4E的BamH I和Sac I位点之间，然后将up-pkt片段插入至Pst I和Sal I位点之间，得到用于pkt基因敲除的质粒pSET4E-用于得到。

（2）pkt的敲除

将敲除质粒pSET4E-用于得到电转化至案例2得到的菌株P. acidilacticiZP26::xylAB中，得到重组菌P. acidilactici ZP26::xylAB(pSET4E-Δpkt)，然后将重组菌在42℃，添加红霉素的MRS培养基中培养12h后，取菌液稀释10⁶倍涂布于含有红霉素的MRS平板上，42℃静置24h后，取单菌落转接至无红霉素的MRS培养液中，并在28℃下培养20h后，取菌液稀释10⁶倍涂布于无红霉素的MRS平板上，42℃静置24h后，将长出的单菌落分别点板至不含红霉素的MRS平板上和含有红霉素的MRS平板上，42℃静置24h，将在不含红霉素平板上生长的菌落，而在含红霉素平板上不生长的菌落进行进一步的PCR验证。选择的单菌落为模板，以pkt-F(SEQ ID NO:11)和pkt-R(SEQ ID NO:12)为引物扩增pkt（SEQ ID NO:13），若扩增不出磷酸转酮酶基因pkt，则基因pkt被敲除，得到的工程菌株命名为P.acidilactici ZP26::xylAB-Δpkt。

（3）工程菌P. acidilactici ZP26::xylAB-Δpkt的木糖发酵

将工程菌株P. acidilactici ZP26::xylAB-Δpkt接种于简化MRS液体培养基中，培养12h后，以10%接种量转接至含35g/L木糖的MRS液体培养基中进行木糖发酵。工程菌株P. acidilactici ZP26::xylAB-Δpkt代谢木糖能力显著下降（见表2）。

实施案例4：转酮醇酶tkt和转醛醇酶tal基因的整合

（1）整合质粒pSET4E-Δpkt::(tkt_tal)的构建

以P. acidilactici ZP26基因组为模板，扩增得到启动子PldhD；以P.acidilactici DSM20284为模板，设计引物tkt_tal-F(SEQ ID NO:14)和tkt_tal-R(SEQ IDNO:15)扩增得到tkt_tal(SEQ ID NO:16)。接着将克隆得到的PldhD与tkt_tal通过融合PCR得到表达框PldhD_tkt_tal(SEQ ID NO:17)，并插入至案例3得到的敲除质粒pSET4E-Δpkt的Sal I和BamH I之间，得到整合质粒pSET4E-Δpkt::(tkt_tal)。

（2）tkt_tal的基因组整合

将整合质粒pSET4E-Δpkt::(tkt_tal)电转化至案例3得到的工程菌株P.acidilactici ZP26::xylAB-Δpkt中，得到重组菌P. acidilactici ZP26::xylAB-Δpkt(pSET4E-Δpkt::(tkt_tal))，然后将重组菌在42℃，添加红霉素的MRS培养基中培养12h后，取菌液稀释10⁶倍涂布于含有红霉素的MRS平板上，42 ℃静置24h后，取单菌落转接至无红霉素的MRS培养液中，并在28℃下培养20h后，取菌液稀释10⁶倍涂布于无红霉素的MRS平板上，42℃静置24h后，将长出的单菌落分别点板至不含红霉素的MRS平板上和含有红霉素的MRS平板上，42℃静置24h，将在不含红霉素平板上生长的菌落，而在含红霉素平板上不生长的菌落进行进一步的PCR验证。选择的单菌落为模板，若能扩增出tkt_tal，而扩增不出红霉素抗性基因Em，则基因tkt_tal基因组整合成功，得到的工程菌株命名为P. acidilaticiZP26::xylAB-Δpkt::(tkt_tal)。并提取该菌株的基因组，进行PCR验证（见图2）。

（3）工程菌P. acidilatici ZP26::xylAB-Δpkt::(tkt_tal)的木糖发酵

将工程菌株P. acidilatici ZP26::xylAB-Δpkt::(tkt_tal)接种于简化MRS液体培养基中，培养12h后，以10%接种量转接至含35g/L木糖的MRS液体培养基中进行木糖发酵。工程菌株P. acidilatici ZP26::xylAB-Δpkt::(tkt_tal)可以代谢木糖，然而木糖代谢速率很慢（见表2）。

表2：P. acidilatici ZP26相关工程菌株的木糖发酵性能比较

实施案例5：工程菌株P. acidilatici ZP26::xylAB-Δpkt::(tkt_tal)的适应性驯化

案例4中得到的工程菌株P. acidilatici ZP26::xylAB-Δpkt::(tkt_tal)木糖代谢速率很慢，并不能满足实际发酵应用。因此采取适应性驯化提高其木糖发酵能力。首先，将工程菌株P. acidilatici ZP26::xylAB-Δpkt::(tkt_tal)接种至MRS液体培养基中，培养12h后，以10%的接种量接种至含木糖为唯一碳源的MRS液体培养基中(添加CaCO₃调节pH)，培养36h后，以10%接种量转接至新鲜含木糖为唯一碳源的MRS液体培养基中继续培养36h，期间不断进行转接，直至发酵液中残留的木糖以及D-乳酸生成稳定为止（见图3）。当连续转接18代（27天）后，驯化菌株的木糖发酵性能有了显著提高，且保持稳定，对得到的木糖发酵性能稳定的驯化菌株进行保种，并命名为P. acidilactici ZY15。

实施案例6：驯化前后木糖发酵性能比较

（1）木糖为唯一碳源的发酵性能比较

将驯化菌株P. acidilactici ZY15与未驯化菌株P. acidilatici ZP26::xylAB-Δpkt::(tkt_tal)进行木糖为唯一碳源的发酵性能比较。将-80℃冰箱保存的两株菌株分别接种至简化MRS液体培养基中活化12h后，以10%接种量分别接种至含35g/L木糖为唯一碳源的MRS培养基中进行发酵性能比较（添加CaCO₃进行pH调节），用于检测细胞生长的摇瓶中不添加CaCO₃。

就生长而言，在培养16h后，驯化菌株P. acidilactici ZY15的OD600达到了4.50，远高于未驯化菌株的1.30。就木糖发酵能力而言，驯化菌株的木糖消耗速率，D-乳酸生产速率均高于未驯化菌株（见图4）。长期驯化大大提升了工程菌株利用木糖的能力。

（2）葡萄糖、木糖混合碳源时的发酵性能比较

接着又比较了驯化菌株和未驯化菌株的葡萄糖木糖共发酵能力。使用的培养基是含有35g/L葡萄糖和20g/L木糖的MRS培养基。两株菌株的细胞生长没有什么差别，但驯化菌株P. acidilactici ZY15在48h已耗完所有的糖，而未驯化菌株在发酵72h后，仍有18%的葡萄糖和52%的木糖残留（见图5）。这说明，适应性驯化也提升了工程菌株的共发酵能力。依据Megazyme D-/L-Lactic acid Kit试剂盒方法，测得D-乳酸光学纯度为99.23%。

实施案例7：木糖利用工程菌株与母本菌株的共发酵性能比较

将本发明构建的木糖利用工程菌株P. acidilactici ZY15和不能利用木糖的母本菌株P. acidilactici ZP26分别接种至简化MRS液体培养基中活化12h后，以10%接种量分别接种至含35g/L葡萄糖和20g/L木糖的MRS培养基中进行共发酵性能比较（添加CaCO₃进行pH调节）。工程菌株P. acidilactici ZY15在48h已耗完所有葡萄糖和木糖；而母本菌株只消耗了葡萄糖，木糖并没有消耗（见图6）。以上结果说明本发明通过代谢工程和适应性驯化成功构建了一株具备共发酵葡萄糖和木糖能力生产D-乳酸的工程菌株。

以上具体描述了本发明技术方案的操作实例，不视为对本发明的应用限制。凡操作条件的等同替换，均在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 一种共发酵葡萄糖和木糖生产D-乳酸的乳酸片球菌构建方法

<130> 2017-04-05

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> Pldh-F

<400> 1

ccgctcgagg tgcgtctacc accataaagc 30

<210> 2

<211> 49

<212> DNA

<213> Pldh-R

<400> 2

tttttgcgat caaataatga catttattag attatatatt tggtccacc 49

<210> 3

<211> 309

<212> DNA

<213> Pldh

<400> 3

gtgcgtctac caccataaag ccggtgttgt gccgcgtttg atcatattct tttccaatgt 60

ttcctaaacc aacaatcatt ttcattattt atcatcctca tacgcaaaaa tagctgaaag 120

gaatccgccc cttcagcttg agctcgtttt aaataatctt atcatatatc gccacaaaag 180

cttagatatt acttctgttc gctcggtaat tatttttggc aaacttattt gttttctgaa 240

aattaggtct caactttccc ctgttaaaat gctataatac tttggtggac caaatatata 300

atctaataa 309

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> PldhD-F

<400> 4

ccggaattct gctctggtgt gcagaccaga c 31

<210> 5

<211> 49

<212> DNA

<213> PldhD-R

<400> 5

ttttttgcga tcaaataatg acattgtaat attacccctt tctttttta 49

<210> 6

<211> 303

<212> DNA

<213> PldhD

<400> 6

tgctctggtg tgcagaccag acgttgtaca caggctacac ggttaattta aaacaacggg 60

ttgcccggca taattctggc caaggcgcta aatatacccg ggttcctaaa cgtcgtccgg 120

ttcagctgct ttattatgaa agttttgaaa accagcatga tgcaatgagt gcagaatatt 180

tttttaaaaa acaaagccgc aaagagaaac ttaaatattt aaaaaataat ggggtaatag 240

taactacttt ctcacattag tggtacattt atattgatta aaaaagaaag gggtaatatt 300

aca 303

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> xylAB_2911-F

<400> 7

aaaagaaagg ggtaatatta caatgtcatt atttgatcgc aaaaaaatgg 50

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> xylAB_2911-R

<400> 8

ctagtctaga ttacaacatt tcacgccggt aattc 35

<210> 9

<211> 2911

<212> DNA

<213> xylAB_2911

<400> 9

atgtcattat ttgatcgcaa aaaaatggaa tatgtgggta accaagcagg tttaaaagca 60

ggaaatggat ttcactacta taatcctgac gaagtaattc acggaaagaa aatgagcgag 120

tggttgaagt tctccgtagc atattggcac acaatggatc aacgtttagt tgacccattt 180

ggagacggaa cggctcaacg cccatgggac aacattaaag atccaatgga acaggccttg 240

gctaaggttg attacatgtt tgacttctta gataagatga acatcgaata ctttgcgttt 300

catgatcggg atttggctcc ggaaggtgaa acccttcggg aaactaacgc caatttggac 360

aaggtagtgg ataagattgt tgaaaaaatg aaagaaacgg gtaagaaagt tctttggaat 420

acgtccagct tatttaccaa cccgcgtttc gtggctggtg gcgcaaccgc accatttgct 480

gacattttgg catattccgc ggcccagatt aaacactcgt tggaaattgc taaacgggta 540

aactcacgca actacgtctt ctggggcggt cgtgaaggtt acgaatcatt attaaatact 600

gatatgaagt tggaacaaga tcacattgcg aaattcttcc ggatggctaa agattacgct 660

aatgaaattg gctacactgg tcaattttta ttggaaccta aaccaaagga accaacttca 720

catcaatacg atacggacgc cgcaaccacg attgccttct tgaagacgta cggtttagat 780

aaagacttta agctaaacct tgaaggtaac cacgcttatc tagcaggcca tacctatgaa 840

catgaagttc gagtagctcg tgacgcagga ttgttaggtt ccttagatgc caatatgggt 900

gataaattga ttggctggga tattgatgaa tttcctaacg atgtaatgga agctacctta 960

gttatgtatg aaatgcttaa gaatggtggt ttaccaactg gtgggttgaa ctttgatgct 1020

aaaccaagac ggcaatcatt tactatggag gatttattct tagcacacac tgcagggatg 1080

gatacctatg ccgcaggttt gcgggtagct gctaagttac ttgaagatca cgttttggat 1140

tccgtaattg aagatcgtta tagctccttc aagtccggga ttggtgcaga ctttgaaaat 1200

ggcaaagtcg actttactga ttttgaaaac tatatcatcg acaaaccaca atcagaatta 1260

attgccgcaa ccaagtctgg ccatctagaa cagttgaaag caaccatcaa taactacatg 1320

ttcactgtgt taggaaaata aacattaatt aaacactaag agggtggcgt gggccgccct 1380

tttattatca ggagaggtgg atatcatgca agtagtttta ggggttgatt taggaaccag 1440

tgcggttaag gtttcggcag ttgaccaagc gggcaaaatt gtcgcccaac aaagtaagga 1500

atatcccttg agccagcccg agccgggata tagtgaacaa aatccggaag actgggtaat 1560

ggggacgacc gttgcaatta aacggttgat tgaggtagac aaaattaagc caacggatat 1620

caaggggatc agttattcag gacagatgca cggattggtc ctcctggatg atcatcacca 1680

ggttttacgt ccggcaattt tatggaacga tacgcggact actcaacaat gcaaagaaat 1740

tttggatgta atgggaaaag actttattaa gatcactcgt aacgtgccac tcgaaggatt 1800

tactttgccg aaattactgt gggtcaaaga acacgaacct cagatttttg aggaagcagc 1860

tacgttcctt ttacccaaag attacgttcg ttatcgcatg accggcaaga ttgcgatgga 1920

atattctgac gcagccggca cggtaatgtt ggacgaagaa aatcgaaaat ggagctccca 1980

aattgcggaa gcattccaac taccgatgga aattttccct ccattaatcg aatcgatcgg 2040

gtttgcagga aaaattagcg aaacctacgc atcgttttca ggattaagta cggacactca 2100

ggtttttggt ggagcagctg ataatgcggc tggcgcgatt ggtgcgggaa tccttaatac 2160

tagccaagtg ctatcctcaa tcggaacctc tggggtagtt ttaaagtacg aagataatgc 2220

gaaagttgat taccaaggag cgttgcattt ctttaatcac gcaattccta ataagtatta 2280

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caacgacaat agttttactg attttgttaa tgcggctaaa aaatccaccg tgggcgcgaa 2400

cggcttacta tttacgccgt acatcgttgg agaacggact ccatacccgg acggcgacat 2460

ccgggggagt tttatcggaa tcgacggcac ccatcgcaaa gaggacttca caagagcagt 2520

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taatttcgat acggttgttt ccatcggcgg gggtgctaaa agtgctctat ggctacaaat 2640

tcaggcagat atctttaata aaaaggtggt taccttgaaa aatgaacaag gccccgggct 2700

cggtgcagca atgattgcag ctgtaggtgt gggatggttt ggttctttaa atgaatgtgc 2760

cgaaagattt gttgcgtacg accagacgta catacctaac gcccaaaacg ttaaaaagta 2820

cgatgagctg tataacctgt ataaaaaagt ttacggacaa acggcggaaa ttagtcacgg 2880

attaatgaat taccggcgtg aaatgttgta a 2911

<210> 10

<211> 3214

<212> DNA

<213> PldhD_xylAB_2911

<400> 10

tgctctggtg tgcagaccag acgttgtaca caggctacac ggttaattta aaacaacggg 60

ttgcccggca taattctggc caaggcgcta aatatacccg ggttcctaaa cgtcgtccgg 120

ttcagctgct ttattatgaa agttttgaaa accagcatga tgcaatgagt gcagaatatt 180

tttttaaaaa acaaagccgc aaagagaaac ttaaatattt aaaaaataat ggggtaatag 240

taactacttt ctcacattag tggtacattt atattgatta aaaaagaaag gggtaatatt 300

acaatgtcat tatttgatcg caaaaaaatg gaatatgtgg gtaaccaagc aggtttaaaa 360

gcaggaaatg gatttcacta ctataatcct gacgaagtaa ttcacggaaa gaaaatgagc 420

gagtggttga agttctccgt agcatattgg cacacaatgg atcaacgttt agttgaccca 480

tttggagacg gaacggctca acgcccatgg gacaacatta aagatccaat ggaacaggcc 540

ttggctaagg ttgattacat gtttgacttc ttagataaga tgaacatcga atactttgcg 600

tttcatgatc gggatttggc tccggaaggt gaaacccttc gggaaactaa cgccaatttg 660

gacaaggtag tggataagat tgttgaaaaa atgaaagaaa cgggtaagaa agttctttgg 720

aatacgtcca gcttatttac caacccgcgt ttcgtggctg gtggcgcaac cgcaccattt 780

gctgacattt tggcatattc cgcggcccag attaaacact cgttggaaat tgctaaacgg 840

gtaaactcac gcaactacgt cttctggggc ggtcgtgaag gttacgaatc attattaaat 900

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gctaatgaaa ttggctacac tggtcaattt ttattggaac ctaaaccaaa ggaaccaact 1020

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gaacatgaag ttcgagtagc tcgtgacgca ggattgttag gttccttaga tgccaatatg 1200

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ttagttatgt atgaaatgct taagaatggt ggtttaccaa ctggtgggtt gaactttgat 1320

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gattccgtaa ttgaagatcg ttatagctcc ttcaagtccg ggattggtgc agactttgaa 1500

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aattttggat gtaatgggaa aagactttat taagatcact cgtaacgtgc cactcgaagg 2100

atttactttg ccgaaattac tgtgggtcaa agaacacgaa cctcagattt ttgaggaagc 2160

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ccaaattgcg gaagcattcc aactaccgat ggaaattttc cctccattaa tcgaatcgat 2340

cgggtttgca ggaaaaatta gcgaaaccta cgcatcgttt tcaggattaa gtacggacac 2400

tcaggttttt ggtggagcag ctgataatgc ggctggcgcg attggtgcgg gaatccttaa 2460

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cggattaatg aattaccggc gtgaaatgtt gtaa 3214

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> pkt-F

<400> 11

atgacagact attcatctaa agctt 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> pkt-R

<400> 12

ttatttaacg tctttccata cccag 25

<210> 13

<211> 2364

<212> DNA

<213> pkt

<400> 13

atgacagact attcatctaa agcttacttt gacaaacttg aaaagttttg gcgcgcagct 60

aactacctct cagttggtca attgtattta aaagacaacc cattattgaa gcgtgacgtt 120

aaggcctccg acgttaaggt tcacccaatc ggacactggg gaacgattcc tggtcaaaac 180

tacatttacg ctcacttgaa ccgggttatt aacaagtacg gcgttaacat gttctatatc 240

gaaggaccag gtcatggtgg acaagtaatg gtttctactt cataccttga cggttcatac 300

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gacatcaacg gttacaagtt gagtaaccca acccttactt cccggatgac ggatgaagaa 660

ttagctgaat tcttccacag tcaacattgg gacccatact ttgttgaagg cgacgattct 720

gaagcaatgg atcctaagat ggctgaagta atggacaagg caatcgaaaa gatccaagaa 780

attcaaaaga atgctcgtga aaaccatgac gaatcattgc catactggcc agtaatcgtc 840

ttccgttcac caaagggctg gactggtcca aagacttggg acggtaaggt tatcgaaggt 900

actttccgtg ctcaccaaat tccaattcct gttgaccaaa acaacatgga acacgttgat 960

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gaacactctg cagaaggctg gcttgaagca tacaccttaa ctggtcgtca cggaatcttc 1440

actagttatg aagcattcct tcgggtagtt gactcaatgc ttacccaaca cttcaagtgg 1500

ttacggaagg cttctgaatt agactggcgt cgtgattacc catcattgaa tattgtttca 1560

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gcatctaagc aaccacgtcc acaattctac tcaatggctg aagcagaaat gcttgctaac 1800

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agtccaaagg ttaaccctaa cggcttgagt gacgaagaat tcgatcgcta cttcactaag 2040

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ccgtttgata tgcgagttct taacgaactt gaccgcttcc acttggctca agacgtaatc 2220

aactcaattt cagaatttaa cgaaaagggt gcagactttg cccaagaaat ggacaatatc 2280

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<210> 14

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<212> DNA

<213> tkt_tal-F

<400> 14

aaagaaaggg gtaatattac agtgtttact aaaaaagata ttgacg 46

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> tkt_tal-R

<400> 15

aactgcagct ataaaattga caatcccgat tc 32

<210> 16

<211> 2693

<212> DNA

<213> tkt_tal

<400> 16

gtgtttacta aaaaagatat tgacgcggtt aacgcaattc gttttctaag cgcagacatg 60

attgaaaagg cgcaaagcgg acacccaggt ttgccgattg acgcggcgcc catggcttac 120

acattatggg agaagttctt acaatttaac ccacaagatc cgaaatggat taatcgagat 180

cgctttgttc taagcgcggg ccatggatcg gcaatgcttt atagtttatt acatttgaat 240

ggctttgatt taccgctaac tgaattgaaa aagttccgaa agcttggctc tagaactcca 300

ggacatccag aatatgggat gacggccggt gtagatgcaa ccaccggccc gttagggcaa 360

ggcttaggga tggcagttgg gatggcaatg gcagaacgcc acttagcagc gttggttaat 420

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atggaagggg tcagtcagga agctattaac attgcaggcc aaaaacagct caataaatta 540

attgttttgt acgattctaa tgacgtttcg cttgatggac ctttgagttt aagtactaac 600

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aatgatctgg ctgggctgca acaagcgtta cagcaagccc aaactagcga ccgaccaacc 720

ttgattgaag ttaaaacgat aatcggatat ggtaccccgg aaagcgggac gaataaggta 780

catggaaatg ccttaggaaa ggctaatttg gcagcgatgc gccaatttta tcattggcaa 840

gcggcgccgt ttgagattgc cccagaaatt taccaacatt atcaagaaca ggtagctaaa 900

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gaagtttacc gccaatttca agatgcgcgc ttagatacga ccaagcttaa tttagatgac 1020

ccggcatggc aggagcccat ggcaactcga acgagtaatt ctaaaatcat gcaacaggtt 1080

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caccttgatg attcgaaggc gtttgatgcg ttacaccctg aacaacgcaa tgtttatttc 1200

ggggtgcgcg aatttggcat ggcaactgcg gttaacggga ttaacttaca tggcaacacc 1260

cgggcgtttg ggagcacgtt ctttgtcttt agtgattatc tcaaagcggc gattcgctta 1320

gcggcaatcc agcagattcc agcagtatac attttcacgc acgactcgat tgcggtcggc 1380

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ataggacttg aaatgggcag tcgcaatggt ttagccacag tggcgagcgc ggtaatcgga 1860

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atgcaaatga tttaactatt aagatttatg aagacggcgc ggaaattgag aaaatgcgag 2040

ctgctagtca acaggcgttc gttaagggct ttactacgaa cccttcgcta ttaaaacaag 2100

cgggagtgac tgattattta gcttttgccc gccaagcagt ggcagaattt ccagagcagg 2160

agttttcttt tgaagttttt agtaacgaac cgcaagaaat gttgcgggaa gctcaaatct 2220

tacatgattt aggcccccga gtgtatgtaa aagtaccgat tatcactacg accggagaat 2280

caacggcgga cgtgattaaa gagctatcgg cagcgcatat taacttaaac attacggcaa 2340

tcaccacggt agaacaggtt gaagttgccg agcgtaattt agcaccaggc acccacaact 2400

taatttccat ttttgtggga cgggtagctg acgctgggat tgatccgcat catttgattg 2460

aaagcagtgt agaaattacg aaatctcacc cagaagcatc cttgttatgg gcaagtacgc 2520

gagaagtgta caacgtcttt gaagcacaac aaatgggggt ggatattatt acggtaccac 2580

cggctttaat tacgaagtta agtaaaacgg gtaaagcggc tttagaaatt tcggtggata 2640

cggttaaggg gttccaacgg gatattgagg aatcgggatt gtcaatttta tag 2693

<210> 17

<211> 2996

<212> DNA

<213> PldhD_tkt_tal

<400> 17

tgctctggtg tgcagaccag acgttgtaca caggctacac ggttaattta aaacaacggg 60

ttgcccggca taattctggc caaggcgcta aatatacccg ggttcctaaa cgtcgtccgg 120

ttcagctgct ttattatgaa agttttgaaa accagcatga tgcaatgagt gcagaatatt 180

tttttaaaaa acaaagccgc aaagagaaac ttaaatattt aaaaaataat ggggtaatag 240

taactacttt ctcacattag tggtacattt atattgatta aaaaagaaag gggtaatatt 300

acagtgttta ctaaaaaaga tattgacgcg gttaacgcaa ttcgttttct aagcgcagac 360

atgattgaaa aggcgcaaag cggacaccca ggtttgccga ttgacgcggc gcccatggct 420

tacacattat gggagaagtt cttacaattt aacccacaag atccgaaatg gattaatcga 480

gatcgctttg ttctaagcgc gggccatgga tcggcaatgc tttatagttt attacatttg 540

aatggctttg atttaccgct aactgaattg aaaaagttcc gaaagcttgg ctctagaact 600

ccaggacatc cagaatatgg gatgacggcc ggtgtagatg caaccaccgg cccgttaggg 660

caaggcttag ggatggcagt tgggatggca atggcagaac gccacttagc agcgttggtt 720

aatcgcccag gttacccagt tttcaaccac ttcacgtacg ctttagttgg tgatggggat 780

ctaatggaag gggtcagtca ggaagctatt aacattgcag gccaaaaaca gctcaataaa 840

ttaattgttt tgtacgattc taatgacgtt tcgcttgatg gacctttgag tttaagtact 900

aacgaaaacg tcgcgcagcg ttttaaagct gctaactgga attaccaaaa agttaccgac 960

ggcaatgatc tggctgggct gcaacaagcg ttacagcaag cccaaactag cgaccgacca 1020

accttgattg aagttaaaac gataatcgga tatggtaccc cggaaagcgg gacgaataag 1080

gtacatggaa atgccttagg aaaggctaat ttggcagcga tgcgccaatt ttatcattgg 1140

caagcggcgc cgtttgagat tgccccagaa atttaccaac attatcaaga acaggtagct 1200

aaaaagcaaa cggcctacca agcctggcaa acgatgttcc aagaatatca aacagagttt 1260

ccagaagttt accgccaatt tcaagatgcg cgcttagata cgaccaagct taatttagat 1320

gacccggcat ggcaggagcc catggcaact cgaacgagta attctaaaat catgcaacag 1380

gttgccgacc agaatgtgca attatggggc ggctcagcag atttgtattc ttcaaataat 1440

actcaccttg atgattcgaa ggcgtttgat gcgttacacc ctgaacaacg caatgtttat 1500

ttcggggtgc gcgaatttgg catggcaact gcggttaacg ggattaactt acatggcaac 1560

acccgggcgt ttgggagcac gttctttgtc tttagtgatt atctcaaagc ggcgattcgc 1620

ttagcggcaa tccagcagat tccagcagta tacattttca cgcacgactc gattgcggtc 1680

ggcgaagacg gaccaactca tgagccgatt gaacagctag ccggattacg atccattcct 1740

aatgtgacgg tgattcgccc agccgatgcg cacgaagtac tgggcgcttg gcaaaagatt 1800

ggccaaatta ctgatcagcc aacggtatta gtgttgaccc gccaaaaagt gccgttatta 1860

gcgcaaacgc agactgataa agtggccttc ggcggctaca cactctcgcc agctgccact 1920

gccaatccgg acggaatctt ggttgcaacg ggttcggaag tcgccttagc cctacaggcg 1980

caacaaaaac tcgcccaaga aaaattgaac gtggcagtag tttccatgcc gagcgtcgag 2040

cttttccaag ctcaaagttc ggattatcaa gctcaagttc ttccaccaaa cgtgaaggta 2100

aagataggac ttgaaatggg cagtcgcaat ggtttagcca cagtggcgag cgcggtaatc 2160

ggaattgatc actttggggc aagcgggaac ggcacggaag tagttcaaca agcaggcttc 2220

acggtagata acattgcgga acaatttaaa gcaaaattag cagaggcgga agtgaaatga 2280

tggatgcaaa tgatttaact attaagattt atgaagacgg cgcggaaatt gagaaaatgc 2340

gagctgctag tcaacaggcg ttcgttaagg gctttactac gaacccttcg ctattaaaac 2400

aagcgggagt gactgattat ttagcttttg cccgccaagc agtggcagaa tttccagagc 2460

aggagttttc ttttgaagtt tttagtaacg aaccgcaaga aatgttgcgg gaagctcaaa 2520

tcttacatga tttaggcccc cgagtgtatg taaaagtacc gattatcact acgaccggag 2580

aatcaacggc ggacgtgatt aaagagctat cggcagcgca tattaactta aacattacgg 2640

caatcaccac ggtagaacag gttgaagttg ccgagcgtaa tttagcacca ggcacccaca 2700

acttaatttc catttttgtg ggacgggtag ctgacgctgg gattgatccg catcatttga 2760

ttgaaagcag tgtagaaatt acgaaatctc acccagaagc atccttgtta tgggcaagta 2820

cgcgagaagt gtacaacgtc tttgaagcac aacaaatggg ggtggatatt attacggtac 2880

caccggcttt aattacgaag ttaagtaaaa cgggtaaagc ggctttagaa atttcggtgg 2940

atacggttaa ggggttccaa cgggatattg aggaatcggg attgtcaatt ttatag 2996

Claims (9)

1.一种共发酵葡萄糖和木糖生产D-乳酸的乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）的构建方法，其特征在于，步骤包括：

（1）启动子与xylAB基因簇的优化：木糖异构酶xylA和木酮糖激酶xylB是木糖代谢的两个最主要基因，xylA和xylB的表达水平直接决定了木糖的代谢速率，因此通过优化不同启动子和不同来源的xylAB从而提高xylAB基因的表达水平；优化得到的表达框为PldhD_xylAB_2911，其中，启动子PldhD的编码序列为SEQ ID NO:6，基因簇xylAB_2911的序列为SEQ ID NO:9；

（2）xylAB基因组整合表达：将步骤（1）中得到的PldhD_xylAB_2911表达框，通过同源重组整合至P. acidilactici ZP26基因组上，所述P. acidilactici ZP26的保藏号为CGMCCNO.8665；

（3）磷酸转酮酶编码基因pkt的敲除：在步骤（2）得到的菌株基础上，通过同源重组敲除了磷酸转酮酶路径的关键基因pkt，以减少副产物乙酸生成；

（4）转酮醇酶和转醛醇酶编码基因的整合：在步骤（3）得到的菌株基础上，通过同源重组将异源的转酮醇酶和转醛醇酶编码基因tkt-tal整合至其基因组上，所述基因tkt-tal的序列为SEQ ID NO:16；

（5）适应性驯化：将步骤（4）得到的菌株，在木糖为唯一碳源的培养基中进行适应性驯化。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中使用的表达质粒为pMG36e。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）、（3）和（4）中使用的敲除和整合质粒均为热敏型敲除质粒pSET4E。

4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中将表达框PldhD_xylAB_2911整合至P. acidilactici ZP26基因组上已经缺失的ldh基因位点处，得到的重组菌株为P. acidilactici ZP26::xylAB，其能利用木糖进行D-乳酸生产，但同时有大量副产物乙酸生成。

5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（3）中得到的工程菌株为P. acidilactici ZP26::xylAB-Δpkt，其利用木糖进行代谢的PK路径被阻断，利用木糖能力显著下降。

6.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（4）中使用的tkt_tal基因来源于P. acidilactici DSM 20284，所用的启动子为PldhD，通过融合PCR将PldhD和tkt_tal进行融合，得到表达框PldhD_tkt_tal。

7.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（4）中将表达框PldhD_tkt_tal整合至步骤（3）得到的工程菌株P. acidilactici ZP26::xylAB-Δpkt已缺失的pkt基因位点处，获得的工程菌为P. acidilactici ZP26::xylAB-Δpkt::tkt_tal，其利用木糖进行同型乳酸代谢的PP路径被成功构建，但该工程菌木糖代谢速率很慢。

8.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（5）中所使用的适应性驯化方法是：将步骤（4）得到的工程菌株P. acidilactici ZP26::xylAB-Δpkt::tkt_tal于简化MRS培养基中活化12 h后，以体积比为10％的接种量接种至含20 g/L木糖为唯一碳源的MRS培养基中，添加CaCO₃调节pH，每36 h以10％接种量转接至新鲜的木糖MRS培养基中，直至发酵液中残留的木糖和生成的D-乳酸稳定时停止驯化。

9.如权利要求8所述的构建方法，其特征在于，经过18次的不断转接，共驯化27天，最终得到发酵性能稳定的驯化菌株P. acidilactici ZY15，其菌种保藏编号为CGMCCNO.13612。

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