CN108841833A - 一种dpbf1重组片段及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种DPBF1重组片段及其应用。将DPBF1基因保守区Ⅱ(AD1)和碱性亮氨酸拉链区(bZIP)进行重组并构建于改造后的遗传转化载体pCAMBIA1301‑GUSless上，遗传转化拟南芥哥伦比亚生态型，经筛选鉴定获得转基因拟南芥rDPBF1，并以过表达DPBF1编码区全序列的转基因拟南芥(DPBF1)为对照。转录水平分析表明重组基因在转基因拟南芥中可以进行转录表达。获得的转基因株系与野生型相比，表现出了花期提前、成熟种子的形态大小变大、种子千粒重显著增加、抗旱性明显增强的优良表型。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，具体地说是一种拟南芥DPBF1重组片段及其应用。
背景技术
植物激素脱落酸(ABA)在植物种子和芽休眠的起始和维持、植物对逆境尤其是水分逆境的响应中起主要作用。此外，ABA通过与其它植物激素相互作用影响着植物生长发育的诸多方面，比如成花期和叶片衰老。
拟南芥转录因子DPBF1是一个响应ABA信号的碱性亮氨酸拉链类转录因子，其表达受ABA和多种非生物胁迫的诱导。DPBF1可与顺式元件ABRE相结合，进而增强下游抗旱、抗盐碱、抗低温等相关功能基因的表达，提高植物抵抗这些非生物逆境的能力。转录因子DPBF1在胚胎发育晚期和ABA信号转导过程中发挥着关键调控作用，影响着植物种子的成熟和萌发等生长发育过程。最近已有的研究还表明，过表达转录因子DPBF1基因的拟南芥成花期改变，表现出延迟开花性状。
然而，早先对DPBF1基因是否增强植物抗旱性意见不一，有报道可以增强也有报道不能增强。由于转录因子DPBF1中存在着转录激活的调控区域，而这些调控区域发挥作用的模式目前并不十分清晰，以致全长DPBF1基因构建的转基因植株表型或者难以呈现、或者难以重复。基于此，我们构建了转录因子DPBF1的不同突变体——保留其转录激活区域和DNA结合区域、删除转录激活调控区域，以此了解DPBF1在植物生长发育过程中的作用。我们以DPBF1突变体基因构建的转基因拟南芥不仅表现出了可重复的抗旱性，而且表现出了提早开花和种子千粒重增加等十分有意义的新性状。
现有技术存在的问题：
(1)DPBF1对于抗旱性的功能并不确定，并且未见DPBF1重组片段影响拟南芥抗旱性的报道。
(2)未见DPBF1重组片段影响拟南芥开花期的报道。
(3)鉴于转录因子DPBF1的转录调控区涉及植物生长发育过程的复杂调控机制，以此试图阐明DPBF1在植物体内的功能涉及的过程多、机制复杂、常常导致结论的矛盾性。
(4)现有技术未见DPBF1增加产量的报道。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明提供了一种DPBF1重组片段及其应用，利用重组DPBF1基因保守区Ⅱ(AD1)和DPBF1基因碱性亮氨酸拉链区域，最终实现了过表达转基因拟南芥植株的花期提前、抗旱性显著增强、种子千粒重增加。
为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
一种DPBF1蛋白重组片段，其序列包括：pMX-1，含有DPBF1基因编码的保守区Ⅱ(AD1，第59至第79位氨基酸残基)和碱性亮氨酸拉链区(bZIP，第342至第442位氨基酸残基)2个片段，重组片段构建于改造后的植物遗传转化载体pCAMBIA1301-GUSless上。pMX-1携带的重组片段AD1-bZIP的核苷酸序列长372bp，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
pMX-4,含DPBF1基因编码区全长序列，构建于改造后的植物遗传转化载体pCAMBIA1301-GUSless上。pMX-4携带的全长DPBF1基因编码区长1323bp，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。
一种DPBF1蛋白重组片段的克隆和重组方法，包括如下步骤：
1.pCAMBIA1301载体的改造
pCAMBIA1301载体中多克隆位点(MCS)位于植物启动子(35S promoter)上游，且35S启动子下游缺少供目的基因插入的酶切位点。为消除原载体中多克隆位点对实验操作的影响，需去除pCAMBIA1301载体中的多克隆位点，同时将35S启动子下游的GUS基因序列替换为人工合成含有多克隆位点的Linker。
(1)pCAMBIA1301载体中多克隆位点的去除
将pCAMBIA1301载体中的多克隆位点用限制性内切酶EcoRI和HindIII双酶切后进行平端化连接。HindIII酶切体系如下(80μL):10×M缓冲液8.0μL，DNA 12μL，Hind III内切酶4.0μL，无菌水补足至80.0μL。混匀反应液，离心大约30sec后，于37℃水浴锅中酶切反应2h。
酶切产物用生物工程PCR产物纯化试剂盒纯化，纯化方法参照PCR产物纯化试剂盒操作说明。纯化产物之后用EcoRI酶切，EcoRI酶切体系如下(100μL)：10×quick cut缓冲液10μL，DNA 40μL，Quickcut EcoRI 2.0μL，无菌水补足至100.0μL。
混匀反应液，离心大约30sec后，于37℃反应15min。酶切产物用PCR产物纯化试剂盒纯化。为进行平端化连接，需要对纯化的DNA片段进行平端化处理，其平端化反应体系如下(10μL)：HindIII和EcoRI双酶切后的pCAMBIA1301
>0.1pmol，1.7mmol/L dNTP Mixture 1μl，0.1％BSA 1μL，10×T4 DNApolymerase缓冲液1μL，T4 DNA polymerase 1μL，无菌水补足至10μL。上述反应体系于37℃保温1h以完成粘性末端的平端化。
平端化后的线性载体经连接酶连接后重新环化。连接反应体系如下：平端化后的线性载体3.5μL，10×Ligase缓冲液1.5μL，T4 DNA Ligase(350U/μL)1.5μL，无菌水补足至15μL。产物16℃过夜连接后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化产物涂布于含有Kan抗性的LB固体培养基，37℃培养过夜。挑取抗性平板上生长的单菌落并提取质粒，用SacI和SacII双酶切进行鉴定，鉴定正确的质粒命名为pCAMBIA1301-ΔMCS。
将pCAMBIA1301的多克隆位点用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切后进行平端化连接，得到质粒pCAMBIA1301-ΔMCS，并对pCAMBIA1301-ΔMCS进行SacI和SacII双酶切鉴定。pCAMBIA1301-ΔMCS载体经SacI和SacII双酶切后，形成了11837bp的片段；pCAMBIA1301经SacI和SacII双酶切后产生了两个片段，一个片段大小为9185bp，另一个片段为2652bp(图1)。由此推测pCAMBIA1301载体的多克隆位点已被切除。
(2)pCAMBIA1301-ΔMCS载体中GUS基因序列的去除
将初步改造后的载体pCAMBIA1301-ΔMCS分别用NcoI和BstEII进行双酶切以去除GUS基因序列。NcoI酶切体系如下(100μL)：10×K缓冲液
10.0μL，pCAMBIA1301-ΔMCS质粒10μL，BSA 10μL，NcoI 6μL，无菌水补足至100.0μL。混匀反应液，离心30s后，于37℃酶切反应2h。
用PCR产物纯化试剂盒纯化回收酶切反应液，回收产物之后用BstEII进行酶切，BstEII酶切体系如下(20μL)：10×K缓冲液2.0μL，NcoI酶切pCAMBIA1301-ΔMCS质粒后的回收产物≤1μg，BSA 10μL，BstEII 1μL，无菌水补足至20.0μL。混匀反应液，离心后于60℃反应2h，酶切产物用PCR产物纯化试剂盒纯化。
针对以下酶切位点(NcoI EcoRI SalI KpnI BamHI SacI BstEII)合成一对完全互补引物：
1301LinkerF：CATGGAATTCGTCGACGGTACCGGATCCGAGCTCG
1301LinkerR:GTCACCGAGCTCGGATCCGGTACCGTCGACGAATTC
将引物1301LinkerF1和1301LinkerR于60℃退火10min后与上述纯化后的线性化载体进行16℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α。转化产物涂布于卡那霉素(Kan 50μg/ml)抗性的LB平板上，37℃培养过夜。挑取生长在抗性平板的单菌落，摇菌过夜，抽提质粒。将质粒送至上海生工有限责任公司测序。将测序正确的改造后的pCAMBIA1301载体质粒命名为pCAMBIA1301-GUSless。
pCAMBIA1301-ΔMCS载体质粒用NcoI和BstEII进行酶切以去除GUS序列，并对去除GUS序列的质粒进行双酶切鉴定。对照载体pCAMBIA1301-ΔMCS经NcoI和BstEII酶切后，酶切产物为9736bp的大片段和一个2050bp的小片段；pCAMBIA1301-GUSless载体经SacI和SacII酶切后产生了6700bp的大片段和大约3018bp的小片段(图2)。酶切鉴定结果表明pCAMBIA1301-GUSless载体中的GUS序列已经去除。pCAMBIA1301-GUSless载体图谱如图3所示。
2.DPBF1基因编码的保守区Ⅱ(AD1)、碱性亮氨酸拉链区(bZIP)以及DPBF1基因全序列的克隆
(1)DPBF1基因保守区Ⅱ(AD1)的PCR扩增
根据pCAMBIA1301-GUSless质粒的序列和NCBI数据库中收录的DPBF1基因序列，设计特异性引物AD1F：CGGAATTCGGCAAGAACTTTGGGTCCAT，和AD1R：GGGGTACCCTCCTCTGCGTTCCAAATAG，引物两端添加酶切位点EcoRI，KpnI和保护碱基，由生物工程(上海)有限公司合成。
以pET32a-DPBF1为模板用特异性引物扩增DPBF1基因的保守区Ⅱ。50μL的PCR反应体系如下：10×PCR buffer(含Mg2+)5.0μL，dNTP(2.5mM)4.0μL，TaKaRa rTaq DNApolymerase(5U/μL)0.3μL，AD1-F(10μM)1.0μL，AD1-R(10μM)1.0μL，模板1.0μL，无菌水补足至50.0μL。
反应条件：94℃预变性2min，然后进入3step法循环：94℃变性30sec，40℃退火30sec，72℃延伸5sec，反应30个循环后，72℃延伸10min；4℃99min。PCR扩增完成后，取AD1的PCR扩增产物和DNA DL2000Marker于1％的琼脂糖凝胶中进行电泳。100V电泳30min，紫外灯下观察，初步检测扩增产物大小。
(2)DPBF1碱性亮氨酸拉链区(bZIP)的PCR扩增
根据pCAMBIA1301-GUSless质粒的序列和NCBI数据库中收录的DPBF1基因序列，设计特异性引物DBDF：GGGGTACCAGGAAAAGAGTAGTGGATGGT和DBDR：TCGAGCTCTTAGAGTGGACAACTCGGGT，引物两端添加酶切位点KpnI，SacI和保护碱基，由生物工程(上海)有限公司合成。
以pET32a-DPBF1为模板进行DPBF1基因的碱性亮氨酸拉链区(bZIP)的PCR扩增。50μL的PCR反应体系如下：10×PCR buffer(含Mg2+)5.0μL，dNTP(2.5mM)4.0μL，模板0.5μL，TaKaRa rTaq DNA polymerase(5U/μL)0.3μL，DBD-F(10μM)1.0μL，DBD-R(10μM)1.0μL，无菌水补足至50.0μL。
反应条件：94℃预变性2min，然后进入3step法循环：94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸16sec，反应30个循环后，72℃延伸10min；4℃99min。PCR扩增完成后，取PCR扩增产物和DNA DL2000 Marker于1％的琼脂糖凝胶中进行电泳。100V电泳30min，紫外灯下观察，初步检测扩增产物大小。
(3)DPBF1基因完整编码区的扩增
根据pCAMBIA1301-GUSless质粒的序列和NCBI数据库中收录的DPBF1基因序列，设计特异性引物DPBF1F：5’-CCGGAATTCACTAGAGAAACGAAGTTGACGT-3和DPBF1R：TCGAGCTCTTAGAGTGGACAACTCGGGT，引物两端添加酶切位点EcoRI/SacI和保护碱基，由生物工程(上海)有限公司合成。
以pET32a-DPBF1为模板进行DPBF1基因完整编码区的PCR扩增。50μL的PCR反应体系如下：10×PCR buffer(含Mg2+)5.0μL，dNTP(2.5mM)4.0μL，模板0.5μL，rTaq DNApolymerase(5U/μL)0.3μL，DPBF1-F(10μM)1.0μL，DPBF1-R(10μM)1.0μL，无菌水补足至50.0μL。
反应条件：94℃预变性2min，然后进入3step法循环：94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min18sec，反应30个循环后，72℃延伸10min；4℃99min。PCR扩增完成后，取PCR扩增产物和DNA DL2000 Marker于1％的琼脂糖凝胶中进行电泳。100V电泳30min，紫外灯下观察，初步检测扩增产物大小。
取各序列的PCR扩增产物和DNA DL2000 Marker于1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，100V电泳30min，紫外灯下观察。AD1的片段长度为63bp，bZIP的片段长度为303bp，DPBF1编码区全长的片段长度为1323bp(图4)。PCR扩增产物的分子量大小与预期理论值一致，初步判定扩增出的PCR产物为所需要的目的片段。
3.植物遗传转化载体pMX-1的构建
对AD1的PCR纯化产物及pCAMBIA1301-GUSless载体进行EcoRI/KpnI双酶切，并根据上海生工凝胶回收试剂盒对相应的电泳条带进行胶回收。之后用T4 DNA连接酶将扩增产物连接至载体pCAMBIA1301-GUSless上。连接反应体系如下(15μL)：胶回收酶切后的AD1片段4.5μL，胶回收的酶切后的线性化载体pCAMBIA1301-GUSless 3.5μL，10×Ligase缓冲液1.5μL，T4 DNA Ligase(350U/μL)1.5μL，无菌水补足至15μL。
混匀反应液，16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α。转化产物涂布于卡那霉素(Kan 50μg/ml)抗性的LB平板上，37℃培养过夜。挑取生长在抗性平板的单菌落，摇菌过夜，抽提质粒得到第一次连接产物。
对bZIP的PCR纯化产物及上述的第一次连接产物进行KpnI/SacI双酶切，并根据上海生工凝胶回收试剂盒对相应的电泳条带进行胶回收。将bZIP和第一次连接产物的胶回收产物在16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α。转化产物涂布于卡那霉素(Kan 50μg/ml)抗性的LB平板上，37℃培养过夜。挑取生长在抗性平板的单菌落，摇菌过夜，抽提质粒。抽提的重组质粒命名为pMX-1。将pMX-1质粒送于上海生物工程有限公司进行测序，测序结果用DNAMAN软件进行分析、比对。保存测序结果正确的质粒。
4.植物遗传转化载体pMX-4的构建
对DPBF1基因编码区全序列的PCR纯化产物及pCAMBIA1301-GUSless质粒进行EcoRI/SacI双酶切，并根据上海生工凝胶回收试剂盒对相应的电泳条带进行胶回收。将DPBF1全序列和pCAMBIA1301-GUSless质粒的胶回收产物于16℃过夜连接。连接反应体系如下表所示：凝胶回收的DPBF1基因片段4.5μL，凝胶回收的经酶切后的线性化载体pCAMBIA1301-GUSless 3.5μL，10×Ligase缓冲液1.5μL，T4 DNA Ligase(350U/μL)1.5μL，无菌水补足至15μL。
连接产物转化大肠杆菌DH5α。转化产物涂布于卡那霉素(Kan 50μg/ml)抗性的LB平板上，37℃培养过夜。挑取生长在抗性平板的单菌落，摇菌过夜，抽提质粒。将抽提的重组质粒命名为pMX-4。将pMX-4质粒送于上海生物工程有限公司进行测序，测序结果用DNAMAN软件进行分析、比对。保存测序结果正确的质粒。
5.pMX-1、pMX-4质粒转化农杆菌
pMX-1、pMX-4质粒分别转化农杆菌GV3101，转化产物涂布于含有庆大霉素(40μg/ml)、利福平(25μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB固体培养基上，30℃培养两天。分别挑取在抗性平板上生长的单菌落至4ml含有庆大霉素(40μg/ml)、利福平(25μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的液体LB培养基中，30℃慢摇孵育12小时后，取1μL作为PCR模板，进行菌落PCR鉴定阳性克隆。菌落PCR鉴定阳性克隆方法如下：在灭菌的1.5mL EP管中加入10μL的无菌水，用白色小枪头挑取单克隆菌落至10μL的无菌水中轻轻吹打混合均匀，可观察到无菌水变为淡淡的乳白色，取1μL作为PCR反应的模板，利用Taq DNA聚合酶进行PCR鉴定。
以AD1 F和DBD R为特异性引物，含有pMX-1质粒的农杆菌液为模板；以DPBF1 F和DBD R为特异性引物，含有pMX-4质粒的农杆菌液为模板分别进行PCR扩增，验证插入序列。PCR产物于琼脂糖凝胶中进行电泳检测。pMX-1质粒在农杆菌中的PCR鉴定产物片段长度为372bp，pMX-4质粒在农杆菌中的PCR鉴定产物片段长度为1323bp(图5)。重组质粒pMX-1、pMX-4已经转入农杆菌中。
6.农杆菌浸染拟南芥哥伦比亚生态型(农杆菌浸花法转化拟南芥)
(1)拟南芥生长至抽苔之后，将拟南芥主花序的顶端剪掉同时注意避免伤及叶生花序，以诱导侧花序的生成，待侧枝伸出2-10cm时准备浸染。以有较多未开的花蕾为准，并给需要浸染的植株提前一天浇水；
(2)将含有遗传转化载体的农杆菌接种于5ml LB液体培养基(庆大霉素(40μg/ml)、利福平(25μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml))中，28℃，200r/min摇床震荡培养15小时左右；
(3)将上步中的培养物以1：50的比例转接到200ml含有相应抗生素的LB液体培养基中，28℃、200r/min摇床培养15小时左右至OD600＝0.8-1.0；
(4)4000r/min离心15min收集菌体，用渗透缓冲液(1/2MS培养基+5％的蔗糖)重悬菌体，加入Silwett L-77使其终浓度为0.03％；
(5)用5ml注射器吸取分别含有待转化质粒的农杆菌悬浮液，对准备好的拟南芥植株每一朵花进行浸染。用保鲜袋将浸染过的植物(T0代植物)罩起来以保持湿度；
(6)将浸染过后的拟南芥植株于黑暗条件下培养12h后，去掉保鲜袋，正常培养到果荚成熟，期间可重复浸染2-3次以提高转化效率；
(7)果荚变黄后、开裂前，按照标号收取若干果荚至1.5ml离心管中，收集拟南芥种子(T1代)，待充分干燥后储存，以筛选转化子。
(8)转化pMX-1质粒筛选获得的转基因植株命名为Arabidopsis thalianarDPBF1，转化pMX-4质粒筛选获得的转基因植株命名为Arabidopsis thaliana DPBF1。
7.转基因株系种子的筛选及鉴定
将收获转化后的T1代种子消毒后，铺在含25μg/ml潮霉素的1/2MS固体培养基上。4℃春化2-3后移至植物光照培养箱中正常见光培养。生长两周后的绿色植株(深绿色的子叶，根较长)可能是转基因阳性植株，而非转基因植物子叶发黄，根短，不能长期存活。将绿色植株移栽于土壤中，培养至种子成熟，分单株收获种子(T2代种子)。将T2代种子在含有潮霉素抗性的MS培养基上继续筛选至T3代。
根据pMX-1和pMX-4质粒的序列设计特异性引物以鉴定重组基因在转基因拟南芥中的表达。提取于1/2MS培养基上生长7天的野生型和转基因拟南芥幼苗全植株的RNA，反转为cDNA，用特异性引物通过Reverse-Transcript PCR(RT-PCR)鉴定重组基因在转录水平的表达。
RT F1：cgggggactcttgaccatgga
RT R1：ctgcgcattctcttctttcaactggt
通过RT-PCR分析重组基因在转基因拟南芥中的表达。转基因拟南芥的RT-PCR电泳结果呈现出具有相应分子量大小的专一性条带，对照组野生型没有条带(图6)。表明重组基因在转基因拟南芥中可以进行转录表达。
一种DPBF1蛋白重组片段在促进拟南芥提前开花中的应用。
(1)选用相同的花盆，在每个花盆中放入一定的营养土(丹麦品氏基质5号，pH5.5)，将盛有营养土的花盆放在平底的托盘中，托盘加水使盘中花盆里的土壤自主吸水。
(2)将上述转基因拟南芥株系和哥伦比亚野生型种子于4℃春化两天，点种于土壤表面，共点5处，温室培养(温度24±2℃，湿度20％，光照条件为16h光照/8h黑暗，光照强度5100lux)。一周后去除生长状况不良的幼苗，使每个花盆保留5株生长状况相近的幼苗。
(3)温室继续培养至开花，统计开花时间和生长状况。
植物抽薹开始进入开花期，野生型拟南芥生长30天开始抽薹，转基因拟南芥rDPBF1和DPBF1分别在生长25天和27天后进入抽薹期(图7)。转基因拟南芥rDPBF1和DPBF1的植株抽薹时间要早于野生型，表现出提早开花的表型。
一种DPBF1蛋白重组片段在提高拟南芥种子千粒重中的应用。
(1)选用相同的花盆，在每个花盆中放入一定的的营养土(丹麦品氏基质5号，pH5.5)，将盛有营养土的花盆放在平底的托盘中，托盘加水使盘中花盆里的土壤自主吸水。
(2)将上述转基因拟南芥株系和哥伦比亚野生型的种子于4℃春化两天，点种于土壤表面，共点5处，温室培养(温度24±2℃，湿度20％，光照条件为16h光照/8h黑暗，光照强度5100lux)。一周后去除生长状况不良的幼苗，使每个花盆保留5株生长状况相近的幼苗。
(3)继续培养至种子成熟，选取形态大小相近的果荚收取种子。
(4)取野生型及转基因株系的种子各一千粒，称重。重复三次取平均值。
植物生长后期种子成熟，转基因株系的种子在吸水后形态明显比野生型大(图8)。称取各株系1000粒成熟种子进行称重：野生型种子千粒重18mg，转基因拟南芥rDPBF1种子千粒重24mg，转基因拟南芥DPBF1种子千粒重20mg(图9)。统计学分析表明转基因株系与野生型的种子千粒重具有极其显著的差异。
一种DPBF1蛋白重组片段在提高拟南芥抗旱性中的应用。
(1)选用相同的花盆，在每个花盆中放入重量相等的的营养土(丹麦品氏基质5号，pH5.5)，将盛有同等重量营养土的花盆放在平底的托盘中，托盘加水使盘中花盆里的营养土自主吸水。
(2)将上述转基因拟南芥株系和哥伦比亚野生型种子于4℃春化两天，点种在土壤表面，共点8处，温室培养(温度24±2℃，湿度20％，光照条件为16h光照/8h黑暗，光照强度5100lux)。一周后去除生长状况不良的幼苗，使每个花盆保留8株生长状况相近的幼苗。
(3)继续培养2周后，停止浇水，干旱胁迫处理10天。
(4)干旱10天后复水，1周后观察、统计幼苗存活状况。
对生长三周且培养条件一致的野生型及转基因株系的拟南芥幼苗停止浇水，干旱10天后复水1周，观察转基因拟南芥对干旱的耐受性。野生型拟南芥共八株幼苗，八株幼苗的叶片全部失水、干枯死亡，即野生型拟南芥在干旱胁迫下的存活率为0；转基因株系rDPBF1的幼苗存活率是87.5％，转基因株系DPBF1的幼苗存活率为100％。转基因株系叶片在复水后恢复为健康有活性的绿色，并且可以进入生殖生长期(图10)。
附图说明
图1为本发明pCAMBIA1301-ΔMCS酶切鉴定电泳结果；
其中，1：pCAMBIA1301-ΔMCS经SacI和SacII酶切产物；2：pCAMBIA1301经SacI和SacII酶切产物；M：DL15000Marker。
图2为本发明pCAMBIA1301-GUSless酶切鉴定电泳结果；
其中，1：pCAMBIA1301-ΔMCS经NcoI和BstEII酶切产物；2：pCAMBIA1301-GUSless经SacI和SacII酶切产物；M：DL15000Marker。
图3为本发明改造后的植物遗传转化载体pCAMBIA1301-GUSless的物理图谱。
图4为本发明AD1、bZIP及DPBF1全长的PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图；
其中，1：AD1的PCR扩增产物，片段长度63bp；2：bZIP的PCR扩增产物，片段长度303bp；3：DPBF1完整编码区的PCR扩增产物，片段长度1323bp；M：DL2000分子量Marker。
图5为本发明重组载体pMX-1、pMX-4在农杆菌中的PCR鉴定；
其中，1：pMX-1的PCR鉴定产物，片段长度372bp；2：pMX-4的PCR鉴定产物，片段长度1323bp；3：是以空载的pCAMBIA1301-GUSless为模板，进行的阴性对照。M：DL2000分子量Marker。
图6为本发明过表达转基因拟南芥RT-PCR鉴定；
其中，提取1/2MS培养基上生长7天的转基因株系与野生型植株的总RNA，反转为cDNA后用特异性引物进行RT-PCR分析。野生型(WT)作为对照，Actin2为内参。培养条件：温度24±2℃，湿度20％，光照条件为16小时光照/8小时黑暗，光照强度5100lux。
图7为本发明过表达转基因拟南芥植株开花提前；
其中，过表达转基因拟南芥植株和野生型植株在生长5周后的抽薹状况。培养条件：温度24±2℃，湿度20％，光照条件为16小时光照/8小时黑暗，光照强度5100lux。
图8为本发明过表达转基因拟南芥植株的种子大小；
其中，野生型和转基因株系的成熟种子于水中浸泡一天后的大小比较；
图9为本发明过表达转基因拟南芥植株的千粒重；
其中，野生型和转基因株系每1000颗种子的重量。Student's t test检验野生型与转基因株系之间的差异性，**表示P＜0.01(差异极其显著)。
图10为本发明过表达转基因植株的抗旱性增强；
其中，干旱胁迫处理前后拟南芥幼苗的生长状况。野生型及过表达转基因拟南芥植株在相同培养条件下生长三周后，停止浇水并干旱处理10天，复水1周后植物的生长存活状况。每个花盆共有8株幼苗。
具体实施方式
为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。
实施例1
本实施例提供了一种DPBF1蛋白重组片段，其序列包括：pMX-1，含有DPBF1基因编码的保守区Ⅱ(AD1，第59至第79位氨基酸残基)和碱性亮氨酸拉链区(bZIP，第342至第442位氨基酸残基)2个片段，重组片段构建于改造后的植物遗传转化载体pCAMBIA1301-GUSless上。pMX-1携带的重组片段AD1-bZIP的核苷酸序列长372bp，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
pMX-4,含DPBF1基因编码区全长序列，构建于改造后的植物遗传转化载体pCAMBIA1301-GUSless上。pMX-4携带的全长DPBF1基因编码区长1323bp，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。
实施例2
本实施例提供了一种DPBF1蛋白重组片段的克隆和重组方法，包括如下步骤：
1.pCAMBIA1301载体的改造
pCAMBIA1301载体中多克隆位点(MCS)位于植物启动子(35S promoter)上游，且35S启动子下游缺少供目的基因插入的酶切位点。为消除原载体中多克隆位点对实验操作的影响，需去除pCAMBIA1301载体中的多克隆位点，同时将35S启动子下游的GUS基因序列替换为人工合成含有多克隆位点的Linker。
(1)pCAMBIA1301载体中多克隆位点的去除
将pCAMBIA1301载体中的多克隆位点用限制性内切酶EcoRI和HindIII双酶切后进行平端化连接。HindIII酶切体系如下(80μL):10×M缓冲液8.0μL，DNA 12μL，Hind III内切酶4.0μL，无菌水补足至80.0μL。混匀反应液，离心大约30sec后，于37℃水浴锅中酶切反应2h。
酶切产物用生物工程PCR产物纯化试剂盒纯化，纯化方法参照PCR产物纯化试剂盒操作说明。纯化产物之后用EcoRI酶切，EcoRI酶切体系如下(100μL)：10×quick cut缓冲液10μL，DNA 40μL，Quickcut EcoRI 2.0μL，无菌水补足至100.0μL。
混匀反应液，离心大约30sec后，于37℃反应15min。酶切产物用PCR产物纯化试剂盒纯化。为进行平端化连接，需要对纯化的DNA片段进行平端化处理，其平端化反应体系如下(10μL)：HindIII和EcoRI双酶切后的pCAMBIA1301
>0.1pmol，1.7mmol/L dNTP Mixture 1μl，0.1％BSA 1μL，10×T4 DNApolymerase缓冲液1μL，T4 DNA polymerase 1μL，无菌水补足至10μL。上述反应体系于37℃保温1h以完成粘性末端的平端化。
平端化后的线性载体经连接酶连接后重新环化。连接反应体系如下：平端化后的线性载体3.5μL，10×Ligase缓冲液1.5μL，T4 DNA Ligase(350U/μL)1.5μL，无菌水补足至15μL。产物16℃过夜连接后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化产物涂布于含有Kan抗性的LB固体培养基，37℃培养过夜。挑取抗性平板上生长的单菌落并提取质粒，用SacI和SacII双酶切进行鉴定，鉴定正确的质粒命名为pCAMBIA1301-ΔMCS。
将pCAMBIA1301的多克隆位点用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切后进行平端化连接，得到质粒pCAMBIA1301-ΔMCS，并对pCAMBIA1301-ΔMCS进行SacI和SacII双酶切鉴定。pCAMBIA1301-ΔMCS载体经SacI和SacII双酶切后，形成了11837bp的片段；pCAMBIA1301经SacI和SacII双酶切后产生了两个片段，一个片段大小为9185bp，另一个片段为2652bp(图1)。由此推测pCAMBIA1301载体的多克隆位点已被切除。
(2)pCAMBIA1301-ΔMCS载体中GUS基因序列的去除
将初步改造后的载体pCAMBIA1301-ΔMCS分别用NcoI和BstEII进行双酶切以去除GUS基因序列。NcoI酶切体系如下(100μL)：10×K缓冲液
10.0μL，pCAMBIA1301-ΔMCS质粒10μL，BSA 10μL，NcoI 6μL，无菌水补足至100.0μL。混匀反应液，离心30s后，于37℃酶切反应2h。
用PCR产物纯化试剂盒纯化回收酶切反应液，回收产物之后用BstEII进行酶切，BstEII酶切体系如下(20μL)：10×K缓冲液2.0μL，NcoI酶切pCAMBIA1301-ΔMCS质粒后的回收产物≤1μg，BSA 10μL，BstEII 1μL，无菌水补足至20.0μL。混匀反应液，离心后于60℃反应2h，酶切产物用PCR产物纯化试剂盒纯化。
针对以下酶切位点(NcoI EcoRI SalI KpnI BamHI SacI BstEII)合成一对完全互补引物：
1301LinkerF：CATGGAATTCGTCGACGGTACCGGATCCGAGCTCG
1301LinkerR:GTCACCGAGCTCGGATCCGGTACCGTCGACGAATTC
将引物1301LinkerF1和1301LinkerR于60℃退火10min后与上述纯化后的线性化载体进行16℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α。转化产物涂布于卡那霉素(Kan 50μg/ml)抗性的LB平板上，37℃培养过夜。挑取生长在抗性平板的单菌落，摇菌过夜，抽提质粒。将质粒送至上海生工有限责任公司测序。将测序正确的改造后的pCAMBIA1301载体质粒命名为pCAMBIA1301-GUSless。
pCAMBIA1301-ΔMCS载体质粒用NcoI和BstEII进行酶切以去除GUS序列，并对去除GUS序列的质粒进行双酶切鉴定。对照载体pCAMBIA1301-ΔMCS经NcoI和BstEII酶切后，酶切产物为9736bp的大片段和一个2050bp的小片段；pCAMBIA1301-GUSless载体经SacI和SacII酶切后产生了6700bp的大片段和大约3018bp的小片段(图2)。酶切鉴定结果表明pCAMBIA1301-GUSless载体中的GUS序列已经去除。pCAMBIA1301-GUSless载体图谱如图3所示。
2.DPBF1基因编码的保守区Ⅱ(AD1)、碱性亮氨酸拉链区(bZIP)以及DPBF1基因全序列的克隆
(1)DPBF1基因保守区Ⅱ(AD1)的PCR扩增
根据pCAMBIA1301-GUSless质粒的序列和NCBI数据库中收录的DPBF1基因序列，设计特异性引物AD1F：CGGAATTCGGCAAGAACTTTGGGTCCAT，和AD1R：GGGGTACCCTCCTCTGCGTTCCAAATAG，引物两端添加酶切位点EcoRI，KpnI和保护碱基，由生物工程(上海)有限公司合成。
以pET32a-DPBF1为模板用特异性引物扩增DPBF1基因的保守区Ⅱ。50μL的PCR反应体系如下：10×PCR buffer(含Mg2+)5.0μL，dNTP(2.5mM)4.0μL，TaKaRa rTaq DNApolymerase(5U/μL)0.3μL，AD1-F(10μM)1.0μL，AD1-R(10μM)1.0μL，模板1.0μL，无菌水补足至50.0μL。
反应条件：94℃预变性2min，然后进入3step法循环：94℃变性30sec，40℃退火30sec，72℃延伸5sec，反应30个循环后，72℃延伸10min；4℃99min。PCR扩增完成后，取AD1的PCR扩增产物和DNA DL2000Marker于1％的琼脂糖凝胶中进行电泳。100V电泳30min，紫外灯下观察，初步检测扩增产物大小。
(2)DPBF1碱性亮氨酸拉链区(bZIP)的PCR扩增
根据pCAMBIA1301-GUSless质粒的序列和NCBI数据库中收录的DPBF1基因序列，设计特异性引物DBDF：GGGGTACCAGGAAAAGAGTAGTGGATGGT和DBDR：TCGAGCTCTTAGAGTGGACAACTCGGGT，引物两端添加酶切位点KpnI，SacI和保护碱基，由生物工程(上海)有限公司合成。
以pET32a-DPBF1为模板进行DPBF1基因的碱性亮氨酸拉链区(bZIP)的PCR扩增。50μL的PCR反应体系如下：10×PCR buffer(含Mg2+)5.0μL，dNTP(2.5mM)4.0μL，模板0.5μL，TaKaRa rTaq DNA polymerase(5U/μL)0.3μL，DBD-F(10μM)1.0μL，DBD-R(10μM)1.0μL，无菌水补足至50.0μL。
反应条件：94℃预变性2min，然后进入3step法循环：94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸16sec，反应30个循环后，72℃延伸10min；4℃99min。PCR扩增完成后，取PCR扩增产物和DNA DL2000 Marker于1％的琼脂糖凝胶中进行电泳。100V电泳30min，紫外灯下观察，初步检测扩增产物大小。
(3)DPBF1基因完整编码区的扩增
根据pCAMBIA1301-GUSless质粒的序列和NCBI数据库中收录的DPBF1基因序列，设计特异性引物DPBF1F：5’-CCGGAATTCACTAGAGAAACGAAGTTGACGT-3和DPBF1R：TCGAGCTCTTAGAGTGGACAACTCGGGT，引物两端添加酶切位点EcoRI/SacI和保护碱基，由生物工程(上海)有限公司合成。
以pET32a-DPBF1为模板进行DPBF1基因完整编码区的PCR扩增。50μL的PCR反应体系如下：10×PCR buffer(含Mg2+)5.0μL，dNTP(2.5mM)4.0μL，模板0.5μL，rTaq DNApolymerase(5U/μL)0.3μL，DPBF1-F(10μM)1.0μL，DPBF1-R(10μM)1.0μL，无菌水补足至50.0μL。
反应条件：94℃预变性2min，然后进入3step法循环：94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min18sec，反应30个循环后，72℃延伸10min；4℃99min。PCR扩增完成后，取PCR扩增产物和DNA DL2000 Marker于1％的琼脂糖凝胶中进行电泳。100V电泳30min，紫外灯下观察，初步检测扩增产物大小。
取各序列的PCR扩增产物和DNA DL2000 Marker于1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，100V电泳30min，紫外灯下观察。AD1的片段长度为63bp，bZIP的片段长度为303bp，DPBF1编码区全长的片段长度为1323bp(图4)。PCR扩增产物的分子量大小与预期理论值一致，初步判定扩增出的PCR产物为所需要的目的片段。
3.植物遗传转化载体pMX-1的构建
对AD1的PCR纯化产物及pCAMBIA1301-GUSless载体进行EcoRI/KpnI双酶切，并根据上海生工凝胶回收试剂盒对相应的电泳条带进行胶回收。之后用T4 DNA连接酶将扩增产物连接至载体pCAMBIA1301-GUSless上。连接反应体系如下(15μL)：胶回收酶切后的AD1片段4.5μL，胶回收的酶切后的线性化载体pCAMBIA1301-GUSless 3.5μL，10×Ligase缓冲液1.5μL，T4 DNA Ligase(350U/μL)1.5μL，无菌水补足至15μL。
混匀反应液，16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α。转化产物涂布于卡那霉素(Kan 50μg/ml)抗性的LB平板上，37℃培养过夜。挑取生长在抗性平板的单菌落，摇菌过夜，抽提质粒得到第一次连接产物。
对bZIP的PCR纯化产物及上述的第一次连接产物同时进行KpnI/SacI双酶切，并根据上海生工凝胶回收试剂盒对相应的电泳条带进行胶回收。将bZIP和第一次连接产物的胶回收产物在16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α。转化产物涂布于卡那霉素(Kan 50μg/ml)抗性的LB平板上，37℃培养过夜。挑取生长在抗性平板的单菌落，摇菌过夜，抽提质粒。抽提的重组质粒命名为pMX-1。将pMX-1质粒送于上海生物工程有限公司进行测序，测序结果用DNAMAN软件进行分析、比对。保存测序结果正确的质粒。
4.植物遗传转化载体pMX-4的构建
对DPBF1基因编码区全序列的PCR纯化产物及pCAMBIA1301-GUSless质粒进行EcoRI/SacI双酶切，并根据上海生工凝胶回收试剂盒对相应的电泳条带进行胶回收。将DPBF1全序列和pCAMBIA1301-GUSless质粒的胶回收产物于16℃过夜连接。连接反应体系如下表所示：凝胶回收的DPBF1基因片段4.5μL，凝胶回收的经酶切后的线性化载体pCAMBIA1301-GUSless 3.5μL，10×Ligase缓冲液1.5μL，T4 DNA Ligase(350U/μL)1.5μL，无菌水补足至15μL。
连接产物转化大肠杆菌DH5α。转化产物涂布于卡那霉素(Kan 50μg/ml)抗性的LB平板上，37℃培养过夜。挑取生长在抗性平板的单菌落，摇菌过夜，抽提质粒。将抽提的重组质粒命名为pMX-4。将pMX-4质粒送于上海生物工程有限公司进行测序，测序结果用DNAMAN软件进行分析、比对。保存测序结果正确的质粒。
5.pMX-1、pMX-4质粒转化农杆菌
pMX-1、pMX-4质粒分别转化农杆菌GV3101，转化产物涂布于含有庆大霉素(40μg/ml)、利福平(25μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB固体培养基上，30℃培养两天。分别挑取在抗性平板上生长的单菌落至4ml含有庆大霉素(40μg/ml)、利福平(25μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的液体LB培养基中，30℃慢摇孵育12小时后，取1μL作为PCR模板，进行菌落PCR鉴定阳性克隆。菌落PCR鉴定阳性克隆方法如下：在灭菌的1.5mL EP管中加入10μL的无菌水，用白色小枪头挑取单克隆菌落至10μL的无菌水中轻轻吹打混合均匀，可观察到无菌水变为淡淡的乳白色，取1μL作为PCR反应的模板，利用Taq DNA聚合酶进行PCR鉴定。
以AD1 F和DBD R为特异性引物，含有pMX-1质粒的农杆菌液为模板；以DPBF1 F和DBD R为特异性引物，含有pMX-4质粒的农杆菌液为模板分别进行PCR扩增，验证插入序列。PCR产物于琼脂糖凝胶中进行电泳检测。pMX-1质粒在农杆菌中的PCR鉴定产物片段长度为372bp，pMX-4质粒在农杆菌中的PCR鉴定产物片段长度为1323bp(图5)。重组质粒pMX-1、pMX-4已经转入农杆菌中。
6.农杆菌浸染拟南芥野生型(农杆菌浸花法转化拟南芥)，步骤如下：
(1)拟南芥生长至抽苔之后，将拟南芥主花序的顶端剪掉同时注意避免伤及叶生花序，以诱导侧花序的生成，待侧枝伸出2-10cm时准备浸染。以有较多未开的花蕾为准，并给需要浸染的植株提前一天浇水；
(2)将含有遗传转化载体的农杆菌接种于5ml LB液体培养基(庆大霉素(40μg/ml)、利福平(25μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml))中，28℃，200r/min摇床震荡培养15小时左右；
(3)将上步中的培养物以1：50的比例转接到200ml含有相应抗生素的LB液体培养基中，28℃、200r/min摇床培养15小时左右至OD600＝0.8-1.0；
(4)4000r/min离心15min收集菌体，用渗透缓冲液(1/2MS培养基+5％的蔗糖)重悬菌体，加入Silwett L-77使其终浓度为0.03％；
(5)用5ml注射器吸取分别含有待转化质粒的农杆菌悬浮液，对准备好的拟南芥植株每一朵花进行浸染。用保鲜袋将浸染过的植物(T0代植物)罩起来以保持湿度；
(6)将浸染过后的拟南芥植株于黑暗条件下培养12h后，去掉保鲜袋，正常培养到果荚成熟，期间可重复浸染2-3次以提高转化效率；
(7)果荚变黄后、开裂前，按照标号收取若干果荚至1.5ml离心管中，收集拟南芥种子(T1代)，待充分干燥后储存，以筛选转化子。
(8)转化pMX-1质粒筛选获得的转基因植株命名为Arabidopsis thalianarDPBF1，转化pMX-4质粒筛选获得的转基因植株命名为Arabidopsis thaliana DPBF1。
7.种子的筛选及鉴定
将收获转化后的T1代种子消毒后，铺在含25μg/ml潮霉素的1/2MS固体培养基上。4℃春化2-3后移至植物光照培养箱中正常见光培养。生长两周后的绿色植株(深绿色的子叶，根较长)可能是转基因阳性植株，而非转基因植物子叶发黄，根短，不能长期存活。将绿色植株移栽于土壤中，培养至种子成熟，分单株收获种子(T2代种子)。将T2代种子在含有潮霉素抗性的MS培养基上继续筛选至T3代。
根据pMX-1和pMX-4质粒的序列设计特异性引物以鉴定重组基因在转基因拟南芥中的表达。提取于1/2MS培养基上生长7天的野生型和转基因拟南芥幼苗全植株的RNA，反转为cDNA，用特异性引物通过Reverse-Transcript PCR(RT-PCR)鉴定重组基因在转录水平的表达。
RT F1：cgggggactcttgaccatgga
RT R1：ctgcgcattctcttctttcaactggt
通过RT-PCR分析重组基因在转基因拟南芥中的表达。转基因拟南芥的RT-PCR电泳结果呈现出具有相应分子量大小的专一性条带，对照组野生型没有条带(图6)。表明重组基因在转基因拟南芥中可以进行转录表达。
实施例3
本实施例提供了一种DPBF1蛋白重组片段在促进拟南芥提前开花中的应用。
(1)选用相同的花盆，在每个花盆中放入一定的营养土(丹麦品氏基质5号，pH5.5)，将盛有营养土的花盆放在平底的托盘中，托盘加水使盘中花盆里的土壤自主吸水。
(2)将上述转基因拟南芥株系和哥伦比亚野生型种子于4℃春化两天，点种于土壤表面，共点5处，温室培养(温度24±2℃，湿度20％，光照条件为16h光照/8h黑暗，光照强度5100lux)。一周后去除生长状况不良的幼苗，使每个花盆保留5株生长状况相近的幼苗。
(3)温室继续培养至开花，统计开花时间和生长状况。
植物抽薹开始进入开花期，野生型拟南芥生长30天开始抽薹，转基因拟南芥rDPBF1和DPBF1分别在生长25天和27天后进入抽薹期(图7)。转基因拟南芥rDPBF1和DPBF1的植株抽薹时间要早于野生型，表现出提早开花的表型。
实施例4
本实施例提供了一种DPBF1蛋白重组片段在提高拟南芥种子千粒重中的应用。
(1)选用相同的花盆，在每个花盆中放入一定的的营养土(丹麦品氏基质5号，pH5.5)，将盛有营养土的花盆放在平底的托盘中，托盘加水使盘中花盆里的土壤自主吸水。
(2)将上述转基因拟南芥株系和哥伦比亚野生型的种子于4℃春化两天，点种于土壤表面，共点5处，温室培养(温度24±2℃，湿度20％，光照条件为16h光照/8h黑暗，光照强度5100lux)。一周后去除生长状况不良的幼苗，使每个花盆保留5株生长状况相近的幼苗。
(3)继续培养至种子成熟，选取形态大小相近的果荚收取种子。
(4)取野生型及转基因株系的种子各一千粒，称重。重复三次取平均值。
植物生长后期种子成熟，转基因株系的种子在吸水后形态明显比野生型大(图8)。称取各株系1000粒成熟种子进行称重：野生型种子千粒重18mg，转基因拟南芥rDPBF1种子千粒重24mg，转基因拟南芥DPBF1种子千粒重20mg(图9)。统计学分析表明转基因株系与野生型的种子千粒重具有极其显著的差异。
实施例5
本实施例提供了一种DPBF1蛋白重组片段在提高拟南芥抗旱性中的应用。
(1)选用相同的花盆，在每个花盆中放入重量相等的的营养土(丹麦品氏基质5号，pH5.5)，将盛有同等重量营养土的花盆放在平底的托盘中，托盘加水使盘中花盆里的营养土自主吸水。
(2)将上述转基因拟南芥株系和哥伦比亚野生型种子于4℃春化两天，点种在土壤表面，共点8处，温室培养(温度24±2℃，湿度20％，光照条件为16h光照/8h黑暗，光照强度5100lux)。一周后去除生长状况不良的幼苗，使每个花盆保留8株生长状况相近的幼苗。
(3)继续培养2周后，停止浇水，干旱胁迫处理10天。
(4)干旱10天后复水，1周后观察、统计幼苗存活状况。
对生长三周且培养条件一致的野生型及转基因株系的拟南芥幼苗停止浇水，干旱10天后复水1周，观察转基因拟南芥对干旱的耐受性。野生型拟南芥共八株幼苗，八株幼苗的叶片全部失水、干枯死亡，即野生型拟南芥在干旱胁迫下的存活率为0；转基因株系rDPBF1的幼苗存活率是87.5％，转基因株系DPBF1的幼苗存活率为100％。转基因株系叶片在复水后恢复为健康有活性的绿色，并且可以进入生殖生长期(图10)。
有益效果：
(1)首次验证了过表达DPBF1编码区全序列和重组片段的转基因植株具有抗旱性。
(2)过表达重组片段的转基因植株花期提前，缩短了植物生育期，以用于农业生产中早熟品种培育。
(3)相比DPBF1编码区全序列，重组片段序列较短。
(4)首次发现DPBF1编码区的重组片段可以促进种子形态增大、增加种子的千粒重，侧面反应出该重组片段可以提高产量
(5)相比DPBF1编码区全序列，过表达重组片段的转基因株系表型突出的更为明显(种子千粒重、花期提前)。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
<110>兰州理工大学
<120> 一种DPBF1重组片段及其应用
<160> 2
<210> 1
<211> 372
<212> DNA
<213> 拟南芥 （Arabidopsis thaliana）
<400> 1
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<210> 1
<211> 1323
<212> DNA
<213> 拟南芥 （Arabidopsis thaliana）
<400> 2
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Claims (6)
1.一种DPBF1重组片段，其特征在于，所述DPBF1重组片段核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：1所示。
2.一种DPBF1重组片段的获取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)pCAMBIA1301载体的改造；(2)DPBF1基因编码的保守区Ⅱ(AD1)、碱性亮氨酸拉链区(bZIP)以及DPBF1基因编码区全序列的克隆；(3)植物遗传转化载体pMX-1的构建；(4)植物遗传转化载体pMX-4的构建；(5)pMX-1、pMX-4质粒转化农杆菌；(6)农杆菌浸染拟南芥哥伦比亚生态型；(7)转基因株系种子的筛选及鉴定。
3.根据权利要求2所述的一种DPBF1重组片段的获取方法，其特征在于所述步骤(1)包括：(1)pCAMBIA1301载体中多克隆位点的去除；(2)pCAMBIA1301-ΔMCS载体中GUS基因序列的去除。
4.如序列表SEQ ID NO：1所述的DPBF1重组片段在促进拟南芥提前开花中的应用。
5.如序列表SEQ ID NO：1所述的DPBF1重组片段在提高拟南芥种子千粒重中的应用。
6.如序列表SEQ ID NO：1所述的DPBF1重组片段在提高拟南芥抗旱性中的应用。
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