CN108840929A - 抗人乳头瘤病毒小分子抗体及其组合物以及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗人乳头瘤病毒小分子抗体及其组合物以及制备方法和应用。本发明的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab可透过细胞膜进入受感染细胞，攻击HPV‑E6/E7致癌基因蛋白，使其瘫痪失活而丧失细胞转化和致癌作用。本发明可以根据当地HPV流行情况，生产不同组合的可覆盖当地流行的所有型号HPV的抗人乳头瘤病毒E6、E7、E6/E7小分子抗体Fab，有的放矢、精准防治；本发明同时还提供一种抗人乳头瘤病毒小分子抗体及其组合物制成的液晶微囊、凝胶、栓剂、乳膏剂、洗液、片剂、泡腾片、胶囊剂、软胶囊、喷雾剂、及注射剂，用于防治人乳头瘤病毒(HPV)感染和/或用于预防和治疗宫颈癌的药物、消毒产品、保健品和医疗器械中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物药品技术领域，具体涉及一种抗人乳头瘤病毒小分子抗体及其组合物以及制备方法和应用。
背景技术
宫颈癌是严重危害妇女健康和生命的疾病，全球每2分钟有一人死于宫颈癌死亡。现代医学已证明子宫颈癌源自一种人乳头瘤病毒(HPV)，80％妇女50岁之前都会受人乳头瘤病毒感染，全球被感染女性达30亿。最新研究表明，30岁至50岁的中国妇女，高危型HPV总感染率为15％至20.8％，即每5-6位中年女性就有一人感染致癌力最强的高危HPV，并且存在发病日益年轻化趋势。根据统计，我国宫颈癌发病率是发达国家6倍，约占全球患者总数的1/3。
迄今为止，医药界还没有开发出用于治疗人乳头瘤病毒(HPV)感染的有效药物，抗生素和其它杀菌药、消毒药对人乳头瘤病毒(HPV)完全没有作用。目前上市的HPV疫苗只有预防一次过感染的作用。由于人乳头瘤病毒(HPV)是一种特殊的“无包膜病毒”，一侵入人体细胞就会脱去包膜外衣(衣壳蛋白L1/L2)；受感染细胞表面没有了疫苗所针对的衣壳蛋白L1靶抗原，造成疫苗失效；因此，HPV疫苗对HPV已侵入细胞、被检查出HPV感染阳性的患者既没有预防作用，更没有治疗作用。
我国对3381例女性生殖道人乳头瘤病毒检测结果分析的一份研究报告显示，女性中人乳头瘤病毒(HPV)阳性率高达18.75％，据此测算，我国人乳头瘤病毒(HPV)阳性患者高达0.9亿人。
对于这些人乳头瘤病毒(HPV)已进入细胞的阳性患者，除了注射疫苗无效外，传统抗体和许多中草药由于属于大分子，无法进入受感染细胞起作用；小分子化学药和部分小分子中药则由于没有特异性必然会对正常细胞产生强烈毒副作用。因此，目前既无药可治，也没有任何根除方法。最令人惊悚的是，其中受高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染者如不提前进行干预，五年后有20％可能发展成为癌症。
因此，研究开发一种可使人乳头瘤病毒(HPV)阳性患者“阳转阴”以及可预防和治疗宫颈癌的新药，是关系到全球亿万女性健康和生命的大事，也是摆在国际医学科学界面前的一项重要课题。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗人乳头瘤病毒小分子抗体及其组合物以及制备方法和应用，解决现有技术中尚未有可以有效治疗宫颈癌的药物的问题。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：一种抗人乳头瘤病毒小分子抗体，所述抗人乳头瘤病毒小分子抗体由如下方法制备得到：
A、制备抗原：在人乳头瘤病毒多肽中加入弗氏佐剂，并置于高速匀浆器中高速匀化，得到免疫用的人乳头瘤病毒多肽抗原；
B、制备免疫蛋：每隔两周对产蛋鸡注射一次免疫用的人乳头瘤病毒多肽抗原，注射2-5次，最后一次注射后的至少第12天后取产蛋鸡所产免疫蛋，并进行编码标记，得到抗人乳头瘤病毒-IgY免疫蛋；
C、制备抗人乳头瘤病毒-IgY粗提物；
D、制备抗人乳头瘤病毒-IgY纯品溶液；
E、制备抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab：将抗人乳头瘤病毒-IgY纯品溶液调节pH至3.0-5.0，加入催化蛋白质酶；充分搅拌溶解，产生酶促反应，然后低温高速旋转离心，弃去沉淀得上清液，对上清液进行超滤，得到浓 缩液；再将超滤后所获浓缩液进行凝胶层析，将层析收集物透析浓缩，得到抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab。
在本发明的抗人乳头瘤病毒小分子抗体中，步骤E制备得到的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab还利用聚乙二醇、右旋糖苷或聚氨基酸长效化修饰得到长效化的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab。
在本发明的抗人乳头瘤病毒小分子抗体中，步骤E制备得到的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab利用聚乙二醇进行长效化修饰，且利用聚乙二醇长效化修饰的工艺条件如下：
调节硼酸缓冲液pH值至6.5-10.0，在抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab中加入调节pH后的硼酸缓冲液，使抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab的浓度为0.1-0.5mg/mL，加入聚乙二醇进行反应，且抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab与聚乙二醇的摩尔比的比值为1/10～1/30，反应温度为15℃～30℃，反应时间控制在1h～3h。
在本发明的抗人乳头瘤病毒小分子抗体中，步骤E得到的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab还通过被干燥得到粉末状的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab；
粉末状的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab还被天然来源的CPPs或人工合成的CPPs偶联得到渗透细胞膜能力强的偶联的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab，其中偶联的方法包括：
取如下质量份数的粉末状的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab干粉1-3份、CPPs-EGFP1-3份、BSA-NS蛋白微球5-10份，分别溶于各自的pH7.5、0.01mol/L的PBS，得到浓度为0.5-1.5g/L的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab溶液、浓度为0.5-1.5g/L的CPPs-EGFP溶液、浓度为2.5-5g/L的蛋白微球溶液，再分别以体积比1:10～1:30的比例缓慢加入10-25mol/L的乙醇溶液，室温搅拌反应10-30分钟，将抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab的反应混合物和CPPs-EGFP的反应混合物分别加入超滤离心管，分别以pH4.5、0.01mol/L的醋酸盐缓冲液和pH7.5、0.01mol/L的PBS为洗涤液在4℃条件下离心洗涤；将BSA-NS蛋白微球反应混合物加入超滤离心管，并以pH7.5、0.01mol/L的PBS在4℃条件下离心洗涤，以去除剩余SPDP，分别得到抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab-PDP、CPPs-EGFP-PDP、BSA-NS-PDP的SPDP衍生物，4℃保存备用；在得到的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab-PDP醋酸盐溶液中加入适量DTT使反应体系中DTT终浓度为50mmol/L，室温下轻搅30分钟，加入超滤离心管中，以pH7.5、0.01mol/L的PBS为洗涤液在4℃条件下离心洗涤，去除剩余DTT，得到抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab-PDP-SH溶液，并立即与CPPs-EG-FP-PDP、BSA-NS-PDP溶液混合，4℃搅拌15-20h，用PBS离心洗涤，沉淀，最终得到CPPs-EG-FP-BSA-NS-抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab蛋白偶联物。
在本发明的抗人乳头瘤病毒小分子抗体中，步骤C中采用纯水提取法、氯仿萃取法、冷乙醇沉淀法或硫酸铵沉淀法制备抗人乳头瘤病毒-IgY粗提物。
在本发明的抗人乳头瘤病毒小分子抗体中，步骤C中采用纯水提取法制备抗人乳头瘤病毒-IgY粗提物，具体包括：把所制备的抗人乳头瘤病毒-IgY免疫蛋用流动水洗净，酒精擦洗消毒，再用打蛋机打碎抗人乳头瘤病毒-IgY免疫蛋，采用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；再按蛋黄液体积的3-8倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用1.0N HCI溶液调pH至5.5-6.5；将调好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将稀释液于高速离心；取分离所得的上清液置超滤器中进行超滤浓缩10-20倍；继而加入浓度为1.0-3.0％的海藻酸钠液，缓慢添加海藻酸钠液至终浓度为0.1-0.2％，搅拌至出现浑浊；再加入1.0-3.0％CaCl2液，至终浓度为0.1-0.2％，搅拌均匀，3-4℃静置8-12小时；高速离心并取上清液，得到抗人乳头瘤病毒-IgY粗提物；
步骤D具体包括：将制得抗人乳头瘤病毒-IgY粗提物溶解于pH7.0、0.01mol/L的MPB磷酸盐缓冲液中，再先后分别过离子交换柱和凝胶层析柱层析，得到抗人乳头瘤病毒-IgY纯品溶液；
步骤A中的人乳头瘤病毒多肽为HPV-E6、HPV-E7或HPV-E6-E7；人乳头瘤病毒多肽与弗氏佐剂的质量比的比值为(1-10):(10-1)；
步骤E中的催化蛋白酶加入质量比的比例为0.01％-0.1％；然后，低温高速离心。
本发明还提供了一种抗人乳头瘤病毒小分子抗体的制备方法，包括：
A、制备抗原：在人乳头瘤病毒多肽中加入弗氏佐剂，并置于高速匀浆器中高速匀化，得到免疫用的人乳头瘤病毒多肽抗原；
B、制备免疫蛋：每隔两周对产蛋鸡注射一次免疫用的人乳头瘤病毒多肽抗原，注射2-5次，最后一次注射后的至少第12天后取产蛋鸡所产免疫蛋，并进行编码标记，得到抗人乳头瘤病毒-IgY免疫蛋；
C、制备抗人乳头瘤病毒-IgY粗提物；
D、制备抗人乳头瘤病毒-IgY纯品溶液；
E、制备抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab：将抗人乳头瘤病毒-IgY纯品溶液调节pH至3.0-5.0，加入催化蛋白质酶；充分搅拌溶解，产生酶促反应，然后低温高速旋转离心，弃去沉淀得上清液，对上清液进行超滤，得到浓缩液；再将超滤后所获浓缩液进行凝胶层析，将层析收集物透析浓缩，得到抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab。
本发明还提供了上述的抗人乳头瘤病毒小分子抗体作为制备用于防治人乳头瘤病毒(HPV)感染、和/或用于预防和治疗宫颈癌的药物、消毒产品、保健品或医疗器械中的应用。
本发明还提供了一种组合物，包括了上述的抗人乳头瘤病毒小分子抗体以及至少一种其它药学上可接受的组分。
在本发明的组合物中，所述抗人乳头瘤病毒小分子抗体添加辅料或基料或者化学药、中药，制成液晶微囊、凝胶、栓剂、乳膏剂、洗液、片剂、泡腾片、胶囊剂、软胶囊、喷雾剂中的至少一种，或者制成抗人乳头瘤病毒(HPV)E6、E7、E6/E7小分子抗体Fab注射用水针剂和粉针剂中的至少一种。
本发明还提供了上述的组合物作为制备用于防治人乳头瘤病毒(HPV)感染、和/或用于预防和治疗宫颈癌的药物、消毒产品、保健品或医疗器械中的应用。
实施本发明的抗人乳头瘤病毒小分子抗体及其组合物以及制备方法和应用，具有以下有益效果：本发明的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab可透过细胞膜进入受感染细胞，攻击HPV-E6/E7致癌基因蛋白，使其瘫痪失活而丧失细胞转化和致癌作用；且可以根据当地HPV流行情况，生产不同组合的可覆盖当地流行的所有型号HPV的抗人乳头瘤病毒E6、E7、E6/E7小分子抗体Fab，有的放失精准防治。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的抗人乳头瘤病毒小分子抗体及其组合物以及制备方法和应用作进一步说明：
本发明涉及一种抗人乳头瘤病毒小分子抗体，该抗人乳头瘤病毒小分子抗体由如下方法制备得到。
抗人乳头瘤病毒小分子抗体的制备方法具体如下：
具体地，A、制备抗原：在人乳头瘤病毒多肽中加入弗氏佐剂，并置于高速匀浆器中高速匀化，得到免疫用的人乳头瘤病毒多肽抗原；其中，人乳头瘤病毒多肽为HPV-E6、HPV-E7或HPV-E6-E7；人乳头瘤病毒多肽与弗氏佐剂的质量比的比值为(1-10):(10-1)。
B、制备免疫蛋：每隔两周对产蛋鸡注射一次免疫用的人乳头瘤病毒多肽抗原，共注射2-5次，最后一次注射后的至少第12天后取产蛋鸡所产免疫蛋，并进行编码标记，得到抗人乳头瘤病毒-IgY免疫蛋；优选地，注射3次，第三次注射后的第15天后取产蛋鸡所产的免疫蛋。
C、制备抗人乳头瘤病毒-IgY粗提物，可以采用纯水提取法、氯仿萃取法、冷乙醇沉淀法或硫酸铵沉淀法等等方法制备抗人乳头瘤病毒-IgY粗提物；下述以纯水提取法为例进行详细说明，但对于本领域技术人员来说采用其它方法进行简单的变换实现提取均在本发明的保护范围之内。采用纯水提取法制备抗人乳头瘤病毒-IgY粗提物，具体包括：把所制备的抗人乳 头瘤病毒-IgY免疫蛋用流动水洗净，酒精擦洗消毒，再用打蛋机打碎抗人乳头瘤病毒-IgY免疫蛋，采用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；再按蛋黄液体积的3-8倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用1.0N HCI溶液调pH至5.5-6.5；将调好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将稀释液于高速离心；取分离所得的上清液置超滤器中进行超滤浓缩10-20倍；继而加入浓度为1.0-3.0％的海藻酸钠液，缓慢添加海藻酸钠液至终浓度为0.1-0.2％，搅拌至出现浑浊；再加入1.0-3.0％CaCl2液，至终浓度为0.1-0.2％，搅拌均匀，3-4℃静置8-12小时；高速离心并取上清液，得到抗人乳头瘤病毒-IgY粗提物。
D、制备抗人乳头瘤病毒-IgY纯品溶液，具体包括：将制得抗人乳头瘤病毒-IgY粗提物溶解于pH7.0、0.01mol/L的MPB磷酸盐缓冲液中，再先后分别过离子交换柱和凝胶层析柱层析，得到抗人乳头瘤病毒-IgY纯品溶液。抗人乳头瘤病毒-IgY纯品溶液还可以经过冷冻干燥或中低温喷雾干燥或者流化床干燥以及其他不影响抗体活性的干燥方式制得抗人乳头瘤病毒-IgY纯品干粉。
E、制备抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab：将抗人乳头瘤病毒-IgY纯品溶液调节pH至3.0-5.0，再按质量比的比例为0.01％-0.1％加入催化蛋白质酶；充分搅拌溶解，产生酶促反应，然后低温高速旋转离心，弃去沉淀得上清液，对上清液进行超滤，得到浓缩液；再将超滤后所获浓缩液进行凝胶层析，将层析收集物透析浓缩，得到抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab。其中，催化蛋白酶可以是木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等等。所得到的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab也可以进一步经过冷冻干燥或中低温喷雾干燥或者流化床干燥以及其他不影响抗体活性的干燥方式制得抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab干粉。需要说明的是，生物技术切割改造大分子抗体有多种方法，本发明以其中一种方法和实施步骤说明，但不限于这种方法和实施步骤，本领域技术人员可以上述说明的方法和实施步骤作各种改动或修改，这些等价形式均在本发明的保护范围之内。
F、抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab还利用聚乙二醇、右旋糖苷或聚氨基酸长效化修饰得到长效化的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab，以延长半衰期实现长效性、降低毒副作用、增加稳定性、降低免疫原性和抗原性。下面以PEG修饰方法和实施步骤为例说明，但不限于这种方法和实施步骤，本领域技术人员可以上述说明的方法和实施步骤作各种改动或修改，这些等价形式均在本发明的保护范围之内。本领域技术人员根据本方法也容易变换采取右旋糖苷或聚氨基酸等等其它长效化方法进行长效化修饰，均在本发明的保护范围之内。利用聚乙二醇长效化修饰的工艺条件如下：调节硼酸缓冲液pH值至6.5-10.0，在抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab中加入调节pH后的硼酸缓冲液，使抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab的浓度为0.1-0.5mg/mL，加入聚乙二醇进行反应，且抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab与聚乙二醇的摩尔比的比值为1/10～1/30，反应温度为15℃～30℃，反应时间控制在1h～3h。其中聚乙二醇为大分子量的PEG，优选为PEG5000，也可以为PEG4000或PEG2000等等。
G、本发明采用多种天然来源CPPs或多种人工合成CPPs偶联抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab。如ANTP(Antennapedia)、VP22(viral protein 22)和各种合成的短肽以及多聚精氨酸、transportan(序列为gWTLN-SAgYLLgKINLKALAALAKKIL)等。下面以穿膜肽-小分子抗体Fab-微球偶联物的制备方法和实施步骤为例说明，但不限于这种方法和实施步骤。其中偶联的方法包括：取如下质量份数的粉末状的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab干粉1-3份、CPPs-EGFP1-3份、BSA-NS蛋白微球5-10份，分别溶于各自的pH7.5、0.01mol/L的PBS，得到浓度为0.5-1.5g/L的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab溶液、浓度为0.5-1.5g/L的CPPs-EGFP溶液、浓度为2.5-5g/L的蛋白微球溶液，再分别以体积比1:10～1:30的比例缓慢加入10-25mol/L的乙醇溶液，室温搅拌反应10-30分钟，将抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab的反应混合物和CPPs-EGFP的反应混合物分别加入超滤离心管，分别以pH4.5、0.01mol/L的醋酸盐缓冲液和pH7.5、0.01mol/L 的PBS为洗涤液在4℃条件下离心洗涤；将BSA-NS蛋白微球反应混合物加入超滤离心管，并以pH7.5、0.01mol/L的PBS在4℃条件下离心洗涤，以去除剩余SPDP，分别得到抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab-PDP、CPPs-EGFP-PDP、BSA-NS-PDP的SPDP衍生物，4℃保存备用；在得到的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab-PDP醋酸盐溶液中加入适量DTT使反应体系中DTT终浓度为50mmol/L，室温下轻搅30分钟，加入超滤离心管中，以pH7.5、0.01mol/L的PBS为洗涤液在4℃条件下离心洗涤，去除剩余DTT，得到抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab-PDP-SH溶液，并立即与CPPs-EG-FP-PDP、BSA-NS-PDP溶液混合，4℃搅拌15-20h，用PBS离心洗涤，沉淀，最终得到CPPs-EG-FP-BSA-NS-抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab蛋白偶联物。
下面通过具体实施例进行详细说明。
人乳头瘤病毒(HPV)有100多种型号，本发明选择常见的18种型号采用生物技术切割的方法制备抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab，其中包括HPV16型、HPV18型、HPV26型、HPV31型、HPV33型、HPV35型、HPV39型、HPV45型、HPV51型、HPV52型、HPV53型、HPV56型、HPV58型、HPV59型、HPV66型、HPV68型、HPV73型、HPV82型；也可另外选择这18种型号以外的人乳头瘤病毒(HPV)采用生物技术切割的方法制备抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab。下面以其中采用生物技术切割法制备抗HPV16型E6小分子抗体Fab为例进行说明，采用生物技术切割法制备抗HPV16型E7、E6/E7小分子抗体Fab以及采用生物技术切割法制备抗HPV其它型号的E6、E7、E6/E7小分子抗体Fab的操作步骤，可参照以下制备抗HPV16型E6小分子抗体Fab的方法同样进行，只是免疫产蛋鸡的抗原要换成HPV16型E7多肽抗原或E6/E7复合多肽抗原以及不同HPV型号相应的E6、E7多肽抗原或E6/E7复合多肽抗原。实际实施时，还可将2-18种或更多种不同HPV型号相应的E6、E7多肽抗原或E6/E7复合多肽抗原进行优化组合制成复合多肽抗原；然后，采用这种组合的复合多肽抗原免疫产蛋鸡，制得抗多价人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7-IgY。也可将制得的多种抗 人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7-IgY或抗多价人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7-IgY根据当地HPV流行情况进行优化组合，制成不同组合的可覆盖当地流行的所有型号HPV的多种抗人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7复合IgY或者抗多价人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7复合IgY。再将所制成的抗人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7-IgY或抗多价人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7-IgY或者多种抗多价人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7复合IgY通过生物技术切割的方法制备可覆盖当地流行的所有型号HPV的多种抗人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7小分子抗体Fab或者抗多价人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7小分子抗体Fab，具体过程，这里就不赘述。
一、制备抗HPV-E6-IgY
1.HPV16型-E6抗原多肽设计
根据HPV16E6氨基酸序列(GenBank：AKN79013.1)： 采用MOE软件，通过Modeller同源建模，构建HPV16型-E6抗原多肽。其它的抗多价人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7氨基酸序列，比如，HPV16E7的氨基酸序列为 HPV18E6的氨基酸序列为 HPV18E6的氨基酸序列为 等等，这里仅仅是示意性的，就不再对所有的抗多价人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7氨基酸序列一一列举。
2.HPV16型-E6多肽抗原制备
在HPV16型-E6抗原多肽中按质量比(1-10:10-1)的比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器中，以8,000rpm高速匀化，即制得免疫用的HPV16型-E6多肽抗原。
3.制备抗HPV16型-E6-IgY免疫蛋
采用上述方法制备的HPV16型-E6多肽抗原对产蛋鸡进行免疫；每隔二周再强化注射一次，计免疫三次；第三次免疫15天后，分别检取产蛋鸡所产免疫蛋，并进行编码标记。即制得抗HPV16型-E6-IgY免疫蛋。
4.制备抗HPV16型-E6-IgY
本发明以纯水提取法为例说明，实际应用时不限于这一方法，可采用氯仿萃取法与冷乙醇沉淀法以及硫酸铵沉淀法等方法。
(1)制备抗HPV16型-E6-IgY免疫蛋粗提物
首先把所制备的抗HPV16型-E6-IgY免疫蛋用流动水洗净，酒精擦洗消毒，再用打蛋机打碎免疫蛋，采用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；再按蛋黄液体积的3-8倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用1.0N HCI溶液调pH至5.5-6.5。
将调整好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将稀释液于10,000rpm离心20分钟；取分离所得的上清置超滤器中进行超滤浓缩10-20倍，得浓缩液；继而往浓缩液中缓慢加入1.0-3.0％海藻酸钠液，直至终浓度为0.1-0.2％，搅拌至出现浑浊；再加入1.0-3.0％CaCl2液，至终浓度为0.1-0.2％，搅拌均匀，3-4℃静置8-12小时；8,000rpm离心20分钟，取上清；0.45μm膜串连0.22μm膜过滤除菌；UltiporVFTM DV50除病毒过滤器除去病毒，即制得抗HPV16型-E6-IgY粗提物。
(2)制备抗HPV16型-E6-IgY纯品
将制得抗HPV16型-E6-IgY粗提物溶解于pH7.0、0.01M PB(磷酸盐缓冲液)液中，再先后分别过离子交换柱和凝胶层析柱层析，即制得抗HPV16 型-E6-IgY纯品；经过冷冻干燥或中低温喷雾干燥或者流化床干燥以及其他不影响抗体活性的干燥方式即制得抗HPV16型-E6-IgY纯品干粉。
二、生物技术切割改造制备抗多价人乳头瘤病毒小分子抗体Fab
生物技术切割改造大分子抗体有多种方法，本发明以其中一种方法和实施步骤说明，但不限于这种方法和实施步骤。如前所指出的，本领域技术人员可以对以下说明的方法和实施步骤作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明权利要求书所限定的范围。
1.以酶解为代表性的生物技术分解改造
调节所制得的抗HPV16型-E6-IgY溶液或其他抗多价人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7-IgY溶液的PH值至3.0-5.0，再按质量比的比例为0.01％-0.1％加入木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等催化蛋白质酶；充分搅拌溶解，产生酶促反应，得到粗制的抗HPV16型-E6小分子抗体Fab溶液或其他抗多价人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7小分子抗体Fab溶液。
2.凝胶层析纯化
将上面粗制的抗HPV16型-E6小分子抗体Fab溶液或其他抗多价人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7小分子抗体Fab溶液经任何常规方法高速离心和超滤，然后凝胶层析，将层析收集物透析浓缩，再经过细菌病毒滤除设备处理，滤除细菌病毒，即制成纯化的抗HPV16型-E6小分子抗体Fab溶液或其他抗多价人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7小分子抗体Fab溶液。将纯化的抗HPV16型-E6小分子抗体Fab溶液或其他抗多价人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7小分子抗体Fab溶液经过冷冻干燥或中低温喷雾干燥或者流化床干燥以及其他不影响抗体活性的干燥方式即制成纯化的抗HPV16型-E6小分子抗体Fab干粉或其他抗多价人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7小分子抗体Fab干粉。细菌病毒滤除设备可采用美国PallUltrafine FiltrationCompany制造的或其他公司制造的细菌病毒滤除装置，其第一道细菌滤除装置是用0.22μm膜除菌过滤器除去沙门菌(Salmonella)等细菌，第二道支原体滤除装置是用0.1μm膜除支原体过滤器除去支原体，第三道病毒滤除装置是用Ultipor VFTMDV50除病毒过滤器除去病毒。
三、长效化修饰抗多价人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7小分子抗体Fab
本发明采用蛋白质修饰所制备的抗多价人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7小分子抗体Fab，以延长半衰期实现长效性、降低毒副作用、增加稳定性、降低免疫原性和抗原性。
可采用聚乙二醇、右旋糖苷、聚氨基酸等大分子修饰剂进行修饰改造，本实施例以蛋白质PEG修饰方法和实施步骤为例说明，但不限于这种方法和实施步骤。
采用PEG修饰抗多价人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7小分子抗体Fab工艺条件为：
1.调节硼酸缓冲液的pH值至6.5-10.0；
2.按0.1-0.5mg/mL浓度将抗多价人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7小分子抗体Fab加入硼酸缓冲液；
3.按抗多价人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7小分子抗体Fab和聚乙二醇5000的摩尔比为1：10～1：30加入聚乙二醇5000。
4.反应温度15-30℃，反应时间控制在1-3h。
四、偶联细胞穿膜肽增强小分子抗体Fab穿透细胞膜进入受感染细胞的能力
可以采用多种天然来源CPPs或多种人工合成CPPs偶联抗多价人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7小分子抗体Fab。如ANTP(Antennapedia)、VP22(viral protein 22)和各种合成的短肽以及多聚精氨酸、transportan(序列为gWTLN-SAgYLLgKINLKALAALAKKIL)等。下面以穿膜肽-小分子抗体Fab-微球偶联物的制备方法和实施步骤为例说明，但不限于这种方法和实施步骤。
取抗多价人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7小分子抗体Fab纯粉1.0-3.0g、CPPs-EGFP1.0-3.0g、BSA-NS蛋白微球5.0-10.0g，分别溶于2L PBS(pH7.5，0.01mol/L)中，以体积比1：10-1:30的比例缓慢加入10-25mol/L乙醇溶液，室温搅拌反应10-30分钟，将抗多价人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7小分子抗体Fab、CPPs-EGFP反应混合物分别加入Amicon Ultra-15 超滤离心管，以醋酸盐缓冲液(pH4.5，0.01mol/L)、PBS(pH7.5，0.01mol/L)为洗涤液离心洗涤3次(4℃，3500g/min，15min/次)，BSA-NS反应混合物，以pH7.5PBS离心洗涤4次(10000rpm/min，1min/次)，以去除剩余SPDP，分别得到抗多价人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7小分子抗体Fab-PDP、CPPs-EGFP-PDP、BSA-NS-PDP的SPDP衍生物，4℃保存备用；在得到的抗多价人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7小分子抗体Fab-PDP醋酸盐溶液中加入适量DTT(使反应体系中DTT终浓度为50mmol/L)，室温轻搅30分钟，加入Amicon Ultra-15超滤离心管，以PBS(pH7.5，0.01mol/L)为洗涤液离心洗涤3次(4℃，3500g/min，15min/次)，去除剩余DTT，得到抗多价人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7小分子抗体Fab-PDP-SH溶液，立即与CPPs-EG-FP-PDP、BSA-NS-PDP(用PBS悬浮)溶液混合，4℃搅拌15-20h，用PBS离心洗涤4次，沉淀，最终得到CPPs-EG-FP-BSA-NS-抗多价人乳头瘤病毒E6、E7或E6/E7小分子抗体Fab蛋白偶联物。
由于HPV疫苗对HPV已侵入细胞、被检查出HPV感染阳性的患者无效，IgY和IgG以及普通单抗等传统抗体属于大分子，无法进入受感染细胞起作用；因此，迄今为止全世界尚没有能真正解决HPV“阳转阴”这一全球性难题的特效药，这也是每一位受HPV感染的阳性患者不得不面对的残酷现实。
HPV在人体内表现形态变化和本发明的创新点如下表所示
由于本发明所制成的长效化抗人乳头瘤病毒E6、E7、E6/E7小分子抗体Fab或抗多价人乳头瘤病毒E6、E7、E6/E7小分子抗体Fab可透过细胞膜进入受感染细胞，攻击HPV-E6/E7致癌基因蛋白，使其瘫痪失活而丧失细胞转化和致癌作用；从而，抑制病变进程并阻断病毒高拷贝表达以及阻 隔病毒在细胞间传播。因此，可将所制备的抗人乳头瘤病毒E6、E7、E6/E7小分子抗体Fab或抗多价人乳头瘤病毒E6、E7、E6/E7小分子抗体Fab制成各种稳定制剂。可根据当地人乳头瘤病毒(HPV)流行情况，将当地流行的所有或有代表性的几种型号的抗人乳头瘤病毒E6、E7、E6/E7小分子抗体Fab或抗多价人乳头瘤病毒E6、E7、E6/E7小分子抗体Fab组合应用(如2价、4价、8价、9价、15价、18价、21价、27价等)制成各种稳定制剂。所述制剂包括但不限于这些制剂：
优选地，该制剂还包括赋形剂、填充剂、溶剂、助溶剂、表面活性剂和胶囊辅料中一种或多种。
优选地，该制剂为阴道凝胶、栓剂、洗液等。
优选地，该制剂为片剂、喷雾剂、粉剂、口服液剂或胶囊。
优选地，该制剂为抗多价人乳头瘤病毒(HPV)E6、E7、E6/E7小分子抗体Fab注射用水针剂和粉针剂中的至少一种。
所述抗人乳头瘤病毒(HPV)E6、E7、E6/E7小分子抗体Fab或抗多价人乳头瘤病毒E6、E7、E6/E7小分子抗体Fab添加辅料或基料或者化学药、中药，制成液晶微囊、脂质体液晶微囊、凝胶、栓剂、乳膏剂、洗液、片剂、泡腾片、胶囊剂、软胶囊、喷雾剂中的至少一种，或者制成抗人乳头瘤病毒(HPV)E6、E7、E6/E7小分子抗体Fab注射用水针剂和粉针剂中的至少一种。作为一种消除人乳头瘤病毒(HPV)感染以及预防和治疗宫颈癌的生物药，包括以下用途：可以作为制备用于已受到人乳头瘤病毒(HPV)感染者“阳转阴”、防止宫颈癌患者手术后或放化疗后复发、预防和治疗宫颈癌的药物或相应产品的应用。
下面结合试验例和实施例，对本发明的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab及其组合物、制备方法和应用作进一步说明：
下面通过具体试验例进行详细说明。
试验例1：
抗人乳头瘤病毒E6/E7小分子抗体Fab对相对应的人乳头瘤病毒(HPV)E6蛋白的抗体结合效价检测。
分别选择HPV6型、HPV11型、HPV16型、HPV18型、HPV31型、HPV33型、HPV45型、HPV52型、HPV53型、HPV58型等型的E6蛋白 作为检测抗原，用“ELISA”方法(酶联免疫法)检测所制得的抗人乳头瘤病毒E6/E7小分子抗体Fab的抗体效价，结果如下表所示：
注：测试样本中的抗人乳头瘤病毒E6/E7小分子抗体Fab抗体溶液浓度均为1mg/mL。
从以上检测结果可看出，所制备的抗人乳头瘤病毒E6/E7小分子抗体Fab对相对应的人乳头瘤病毒(HPV)E6蛋白抗原都有很高的抗体结合效价。
试验例2：
抗人乳头瘤病毒E6/E7小分子抗体Fab对相对应的人乳头瘤病毒(HPV)E7蛋白的抗体结合效价检测。
分别选择HPV6型、HPV11型、HPV16型、HPV18型、HPV31型、HPV33型、HPV45型、HPV52型、HPV53型、HPV58型等型的E7蛋白作为检测抗原，用“ELISA”方法(酶联免疫法)检测所制得的抗人乳头瘤病毒E6/E7小分子抗体Fab的抗体效价，结果如下表所示：
注：测试样本中的抗人乳头瘤病毒E6/E7小分子抗体Fab抗体溶液浓度均为1mg/mL。
从以上检测结果可看出，所制备的抗人乳头瘤病毒E6/E7小分子抗体Fab对相对应的人乳头瘤病毒(HPV)L7蛋白抗原都有很高的抗体结合效价。
实施例1：抗人乳头瘤病毒E6/E7小分子抗体Fab凝胶使HPV检测为阳性的妇女“阳转阴”试验
(1)试验对象：年龄21～45岁，无重大脏器疾病者，无药物过敏史和无过敏体质者)，有性生活史的妇女，经HPV抗体检测和液基细胞学检查，确诊为为阳性的患者。共260例。随机分为治疗组和对照组各130例。
(2)试验方法
治疗组：采用抗人乳头瘤病毒E6/E7小分子抗体Fab妇科凝胶进行治疗。每天先用抗人乳头瘤病毒E6/E7小分子抗体Fab洗液清洗，然后阴道灌注抗人乳头瘤病毒E6/E7小分子抗体Fab妇科凝胶，每天一次，每次使 用一支，每个疗程连续使用三盒共9支。连续三个疗程。按要求接受全程追踪随访观察，患者入组35天后复诊，观察HPV感染转阴情况。
对照组：采用不含抗人乳头瘤病毒E6/E7小分子抗体Fab普通妇科凝胶进行治疗。每天阴道灌注不含抗人乳头瘤病毒E6/E7小分子抗体Fab的普通妇科凝胶，每天一次，每次使用一支，每个疗程连续使用三盒共9支。连续三个疗程。按要求接受全程追踪随访观察，患者入组35天后复诊，观察HPV感染转阴情况。
(3)追踪随访
患者按要求入组后，接受口头知情并详细填写各项临床观察表，第35天作相应检查，并将结果详细填入观察表中。如果在治疗过程中出现药物不良反应要详细填入表中，出现严重反应，立即上报相应部门并及时处理。
(4)治疗疗效判定标准
HPV检测结果分：(1)HPV浓度基本不变，(2)HPV浓度显著下降至试验前30％以下，(3)HPV检测完全阴性。无效为：HPV检测为(1)HPV浓度基本不变，(2)结果维持阳性。
(5)结果
试验35天后复诊，治疗组复查，HPVHPV浓度显著下降至试验前30％以下79例，转阴51例，无效0例，有效率为60％，转阴率为39％。对照组复查HPV转阴6例，转阴率为4.6％；无效124例。
实施例2：制备抗人乳头瘤病毒E6/E7小分子抗体Fab脂质体液晶微囊。
具体实施步骤如下：
(1)把卵磷脂和胆固醇各50％按1：5比例溶于乙醚中；
(2)将所制得的抗人乳头瘤病毒E6/E7小分子抗体Fab干粉按1：100比例加入4mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)配成浓度1％的抗体Fab溶液；
(3)将卵磷脂和胆固醇乙醚溶液和抗体Fab的PBS溶液按3：1比例混合均匀；
(4)超声处理2min(每处理0.5min，间歇.0.5min)；
(5)在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，再继续蒸发除尽乙醚；
(6)超速离心(35000r/min，30min)分离除去未包入的抗体Fab；
(7)沉淀用水洗二次，置入高速离心机离心，得沉淀；
(8)将所得的沉淀用10mmol/L PBS稀释，即制得抗人乳头瘤病毒E6/E7小分子抗体Fab脂质体液晶微囊。
实施例3：生产抗人乳头瘤病毒E6/E7小分子抗体Fab凝胶
配方：
工艺：
(1)将配方量乳糖、羟乙基纤维素(HEC)、薄荷油、香精用紫外光照射灭菌消毒24小时，无菌密封备用；
(2)按配方量蒸馏水加热至至90℃，再分别加入S-40和K-30分散剂以及乳糖，搅拌30分钟以上，溶解均匀；再冷却至60℃，分别缓慢加入吐温(滴加)和薄荷油以及甘油(滴加)，低速揽拌60分钟至充分溶解；保持温度在60℃，形成溶液A；
(3)将溶液A加热至60℃，保持温度在60℃，一边搅拌一边将医药级尿囊素加入溶液A中，低速搅拌60min，形成溶液B；
(4)将配方量表皮生长因子用适量95％的酒精溶解，一边搅拌一边加热至60℃，直至完全溶解；保持温度在60℃，得表皮生长因子酒精溶液C；
(5)一边搅拌一边将溶液C滴加入溶液B中，继续高速搅拌60min，温度始终控制在50-60℃，直至完全溶解，然后冷却至室温，得溶液D；
(6)一边搅拌一边将抗多种人乳头瘤病毒(HPV16、HPV18、HPV31、HPV58)E6/E7小分子抗体Fab加入溶液D中，低速搅拌60min，直至完全混合均匀，得溶液E；
(7)一边搅拌一边将香精(玫瑰花香精)加入溶液E中，低速搅拌60min，直至完全溶解，得溶液F；
(8)一边搅拌一边将配方量羟乙基纤维素(HEC)加入溶液F中，低速搅拌60min，直至完全溶解，形成均质稳定的溶液，测试溶液粘稠度，适合后，得溶液G；
(9)用pH计测量溶液G的pH值，用柠檬酸调节pH值至4.5±0.1；
(10)静置一夜，直至上部泡沫全部消溶后，再将溶液G分装在清洗消毒过的塑料桶中，贴上标签出厂。
实施例4：生产抗人乳头瘤病毒E6/E7小分子抗体Fab乳膏剂
配方：
工艺：
(1)按配方量蒸馏水加热至至90℃，再分别加入Span-80和吐温K-30以及乳糖，搅拌30分钟以上，溶解均匀；再冷却至60℃，分别缓慢加入山梨酸钾和甘油(滴加)，低速揽拌60分钟至充分溶解；保持温度在60℃，形成溶液A；
(2)将配方量薄荷醇用适量95％的酒精溶解，一边搅拌一边加热至60℃，直至完全溶解；得溶液B；
(3)将溶液A加热至60℃，保持温度在60℃，一边搅拌一边将溶液B滴加入溶液A，低速揽拌30分钟至充分溶解；保持温度在60℃，形成溶液C；
(4)将液体石蜡加热至60℃，保持温度在60℃，一边低速搅拌一边分别将凡士林、十八烷酸、十八烷醇加入，一边低速搅拌一边加热使其熔融，形成溶液D；
(5)将溶液D加热至60℃，保持温度在60℃，一边搅拌一边将溶液C加入溶液D中，低速搅拌60min，形成溶液E；
(6)降低搅拌速度，乳化一定时间，成型后停止加热，冷却至40℃左右，然后一边低速搅拌一边将抗多种人乳头瘤病毒(HPV16、HPV18、HPV31、HPV58)E6/E7小分子抗体Fab加入溶液E中，充分研磨搅拌均匀，制成o/w乳膏，静置冷却至室温，得溶液F；
(7)用pH计测量溶液F的pH值，调节pH值至4.5±0.1；
(8)静置一夜，将溶液F分装在清洗消毒过的塑料管中，贴上标签装入包装盒出厂。
实施例5：生产抗人乳头瘤病毒E6/E7小分子抗体Fab阴道栓剂
配方：
工艺：
(1)按配方量90％蒸馏水加热至至90℃，加入明胶溶胀。冷却至60℃，形成溶液A；
(2)保持溶液A温度在60℃，一边搅拌一边将配方量甘油加入溶液A，混匀，冷至40℃以下，得溶液B；
(3)将抗多种人乳头瘤病毒(HPV16、HPV18、HPV31、HPV58)E6/E7小分子抗体Fab加入溶液B，低速揽拌30分钟至充分溶解；冷却至室温，得溶液C；
(4)用pH计测量溶液C的pH值，调节pH值至4.5±0.1；
(5)静置一夜，将溶液C分装在清洗消毒过的塑料管中，贴上标签装入包装盒出厂。
实施例6：生产抗人乳头瘤病毒E6/E7小分子抗体Fab洗液
配方：
工艺：
(1)将配方量海藻精华、医药级甘油、薄荷油、香精以及403、503发泡剂用紫外光照射灭菌消毒24小时，无菌密封备用；
(2)将配方量蒸馏水加热至90℃，停留15分钟；再冷却至60℃，一边搅拌一边先后加入海藻精华和医药级甘油，低速揽拌30分钟，直至完全溶解，冷却至室温，得溶液A；
(3)一边搅拌一边将香精(玫瑰花香精)加入溶液A中，低速搅拌60min，直至完全溶解，得溶液B；
(4)将403加热至80℃，然后一边搅拌一边将503徐徐滴加入到403中，低速搅拌30min，得到溶液C；
(5)保持溶液C温度在80℃，一边搅拌一边将薄荷油徐徐滴加入到溶液C中，低速搅拌60min，得到溶液D；
(6)将溶液D加热至90℃高温灭菌5min，然后冷却至室温；
(7)一边搅拌一边将溶液B缓慢地加到溶液D中，低速搅拌60min；如未形成均质稳定的乳状溶液，则需延长搅拌时间，制得溶液E；
(8)一边搅拌一边将抗多种人乳头瘤病毒(HPV16、HPV18、HPV31、HPV33)E6/E7小分子抗体Fab缓慢地加到溶液E中，低速搅拌60min；如未形成均质稳定的乳状溶液，则需延长搅拌时间，制得溶液F；
(9)用pH计测量溶液F的pH值，采用柠檬酸或pH4.5磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液调节pH值至4.5±0.1；
(10)静置一夜，直至上部泡沫全部消溶后，再将溶液F液分装在清洗消毒过的塑料容器中，贴上标签出厂。
实施例7：生产抗人乳头瘤病毒E6/E7小分子抗体Fab泡腾片
配方：
工艺：
(1)将NaHCO360℃干燥2h，加20％PEG乙醇液适量制软材，14目尼龙筛制粒60℃干燥备用；
(2)枸椽酸、乳糖、MCC混匀80目粉碎，加于2％HPMC醇液中搅匀；
(3)加入抗多种人乳头瘤病毒(HPV16、HPV18、HPV31、HPV33)E6/E7小分子抗体Fab、氢氧化铝混匀过一次14目筛，再加硬脂酸镁混匀压片即得；
(4)检验合格后水泡眼包装，外套铝塑复合膜塑料袋密封，装盒，装箱入库。
实施例8：生产抗人乳头瘤病毒E6/E7小分子抗体Fab片剂
配方：
工艺
(1)山梨糖醇过60目筛两次备用；
(2)羧甲基纤维素分散于30％乙醇中制成1％乙醇溶液；
(3)将(1)项用适量(2)项制软材，14目筛网制粒，60℃通风干燥，18目筛整粒；用40目筛筛出适量细粉与抗多种人乳头瘤病毒(HPV16、HPV18、HPV31、HPV58)E6/E7小分子抗体Fab充分混匀；
(4)再拌入硬脂酸镁，一起与整批颗粒混合均匀，密闭4小时以上；
(5)压片机压片，每片600mg；
(6)检验合格后，包装，全验出厂。
实施例9：生产抗人乳头瘤病毒E6/E7小分子抗体Fab硬胶囊。
配方：
工艺：
(1)将抗多种人乳头瘤病毒(HPV16、HPV18、HPV31、HPV58)E6/E7小分子抗体Fab和药用葡萄糖按重量比1:1比例混合，充分搅拌均匀；
(2)用胶囊充填机将小分子抗体Fab和药用葡萄糖混合物定量分装入药用胶囊，每粒装300mg；
(3)将胶囊装瓶，检验出厂。
实施例10：生产抗人乳头瘤病毒E6/E7小分子抗体Fab软胶囊
配方：
工艺：
(1)将吐温加热至50℃，一边搅拌一边将大豆油徐徐滴加入到吐温中，高速(3000r/min)搅拌15min，冷却到室温，得到溶液A；
(2)将配方量蒸馏水采用高压蒸气灭菌，加热到121-126℃，压力升至102.9kPa(1.05kg/cm2)，停留60min，然后冷却到室温；
(3)将配方量抗多种人乳头瘤病毒(HPV16、HPV18、HPV31、HPV58)E6/E7小分子抗体Fab先用高温灭菌后冷却到室温的蒸馏水溶解，充分搅拌均匀，制成抗体水溶液B；
(4)一边搅拌一边缓慢地将抗多种人乳头瘤病毒(HPV16、HPV18、HPV31、HPV58)E6/E7小分子抗体Fab水溶液B加入到溶液A中，高速(3000r/min)搅拌60min以上，得到溶液C；经检测，溶液C中80％粒径在2～50μm范围，平均收率可达91.4％；
(5)将所制成的纳米微囊溶液C加入软胶囊机滚压模切断成型，每粒300mg；
(6)将压模成型的软胶囊干燥定型；
(7)采用铝塑包装机包装；
(8)纸盒包装，检验合格出厂。
实施例11：生产抗人乳头瘤病毒E6/E7小分子抗体Fab注射剂
将所制得的抗人乳头瘤病毒E6/E7小分子抗体Fab制成一种新型注射剂，供“两癌筛查”检出为阳性的受人乳头瘤病毒(HPV)感染者(一般用于CIN2-CIN3中重度感染)注射，或者用于宫颈癌患者辅助治疗以及手术后阻止复发。具体配方和生产工艺如下：
配方：
工艺：
(1)将配方量注射用水加0.1％针用活性炭，60℃搅拌15min；脱炭过滤；滤液密闭加热100℃30min，冷却至室温备用；
(2)一边搅拌一边分别将配方量磷酸二氢钠一水合物和磷酸氢二钠七水合物以及氯化钠加入占配方量90％的经活性炭处理过的灭菌注射用水中，加热溶解；另取聚山梨醇酯-80，加入PEG400混匀；在搅拌下加入上述混合液中；再加0.1％针用活性炭，60℃搅拌15min,脱炭过滤；滤液密闭加热100℃30min，冷却至室温备用，得混合液A；
(3)一边搅拌一边将抗多种人乳头瘤病毒(HPV16、HPV18、HPV31、HPV58)E6/E7小分子抗体Fab加入占配方量10％的经活性炭处理过的灭菌注射用水，充分溶解，得抗体溶液B。
(4)一边搅拌一边将抗体溶液B以细流加于混合液A中，充分溶解，得溶液C。
(5)用0.1mol的NaOH溶液调节溶液C的pH值至6.0～7.5。
(6)采用已灭菌的0.45μm串联0.22μm微孔滤膜将溶液C过滤除菌。于无菌灌封机中灌封于无菌容器中；灯检、检漏、印字、包装出厂。
本发明所包含的信息，在未脱离下述权利要求的精神和保护范围下，本发明各种偏离精确的描述，对于与本发明相关的本领域技术人员来说是显而易见的。本发明并不认为限制在所定义的程序、性质或组成的范围内，因为优选的实施例和其他描述只用于说明目前提供发明的特定方面。对于在化学、生物化学或相关领域的技术人员来说，实现本发明于各种修改的描述模式，都应属于本发明所附权利要求的保护范围内。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进或变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种抗人乳头瘤病毒小分子抗体，其特征在于，所述抗人乳头瘤病毒小分子抗体由如下方法制备得到：
A、制备抗原：在人乳头瘤病毒多肽中加入弗氏佐剂，并置于高速匀浆器中高速匀化，得到免疫用的人乳头瘤病毒多肽抗原；
B、制备免疫蛋：每隔两周对产蛋鸡注射一次免疫用的人乳头瘤病毒多肽抗原，注射2-5次，最后一次注射后的至少第12天后取产蛋鸡所产免疫蛋，并进行编码标记，得到抗人乳头瘤病毒-IgY免疫蛋；
C、制备抗人乳头瘤病毒-IgY粗提物；
D、制备抗人乳头瘤病毒-IgY纯品溶液；
E、制备抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab：将抗人乳头瘤病毒-IgY纯品溶液调节pH至3.0-5.0，加入催化蛋白质酶；充分搅拌溶解，产生酶促反应，然后低温高速旋转离心，弃去沉淀得上清液，对上清液进行超滤，得到浓缩液；再将超滤后所获浓缩液进行凝胶层析，将层析收集物透析浓缩，得到抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab。
2.根据权利要求1所述的抗人乳头瘤病毒小分子抗体，其特征在于，步骤E制备得到的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab还利用聚乙二醇、右旋糖苷或聚氨基酸长效化修饰，得到长效化的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab。
3.根据权利要求2所述的抗人乳头瘤病毒小分子抗体，其特征在于，步骤E制备得到的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab利用聚乙二醇进行长效化修饰，且利用聚乙二醇长效化修饰的工艺条件如下：
调节硼酸缓冲液pH值至6.5-10.0，在抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab中加入调节pH后的硼酸缓冲液，使抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab的浓度为0.1-0.5mg/mL，加入聚乙二醇进行反应，且抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab与聚乙二醇的摩尔比的比值为1/10～1/30，反应温度为15℃～30℃，反应时间控制在1h～3h。
4.根据权利要求1所述的抗人乳头瘤病毒小分子抗体，其特征在于，步骤E得到的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab还通过被干燥得到粉末状的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab；
粉末状的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab还被天然来源的CPPs或人工合成的CPPs偶联得到渗透细胞膜能力强的偶联的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab，其中偶联的方法包括：
取如下质量份数的粉末状的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab干粉1-3份、CPPs-EGFP1-3份、BSA-NS蛋白微球5-10份，分别溶于各自的pH7.5、0.01mol/L的PBS，得到浓度为0.5-1.5g/L的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab溶液、浓度为0.5-1.5g/L的CPPs-EGFP溶液、浓度为2.5-5g/L的蛋白微球溶液，再分别以体积比1:10～1:30的比例缓慢加入10-25mol/L的乙醇溶液，室温搅拌反应10-30分钟，将抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab的反应混合物和CPPs-EGFP的反应混合物分别加入超滤离心管，分别以pH4.5、0.01mol/L的醋酸盐缓冲液和pH7.5、0.01mol/L的PBS为洗涤液在4℃条件下离心洗涤；将BSA-NS蛋白微球反应混合物加入超滤离心管，并以pH7.5、0.01mol/L的PBS在4℃条件下离心洗涤，以去除剩余SPDP，分别得到抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab-PDP、CPPs-EGFP-PDP、BSA-NS-PDP的SPDP衍生物，4℃保存备用；在得到的抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab-PDP醋酸盐溶液中加入适量DTT使反应体系中DTT终浓度为50mmol/L，室温下轻搅30分钟，加入超滤离心管中，以pH7.5、0.01mol/L的PBS为洗涤液在4℃条件下离心洗涤，去除剩余DTT，得到抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab-PDP-SH溶液，并立即与CPPs-EG-FP-PDP、BSA-NS-PDP溶液混合，4℃搅拌15-20h，用PBS离心洗涤，沉淀，最终得到CPPs-EG-FP-BSA-NS-抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab蛋白偶联物。
5.根据权利要求1所述的抗人乳头瘤病毒小分子抗体，其特征在于，步骤C中采用纯水提取法、氯仿萃取法、冷乙醇沉淀法或硫酸铵沉淀法制备抗人乳头瘤病毒-IgY粗提物。
6.根据权利要求5所述的抗人乳头瘤病毒小分子抗体，其特征在于，步骤C中采用纯水提取法制备抗人乳头瘤病毒-IgY粗提物，具体包括：把所制备的抗人乳头瘤病毒-IgY免疫蛋用流动水洗净，酒精擦洗消毒，再用打蛋机打碎抗人乳头瘤病毒-IgY免疫蛋，采用蛋黄筛筛滤去蛋清，留下蛋黄，搅拌均匀；再按蛋黄液体积的3-8倍加入蒸馏水，进行稀释并混合均匀，用1.0N HCI溶液调pH至5.5-6.5；将调好pH值的稀释液进一步充分搅拌均匀，然后将其冷却至2-6℃，静置12小时-24小时；将稀释液于高速离心；取分离所得的上清液置超滤器中进行超滤浓缩10-20倍；继而加入浓度为1.0-3.0％的海藻酸钠液，缓慢添加海藻酸钠液至终浓度为0.1-0.2％，搅拌至出现浑浊；再加入1.0-3.0％CaCl2液，至终浓度为0.1-0.2％，搅拌均匀，3-4℃静置8-12小时；高速离心并取上清液，得到抗人乳头瘤病毒-IgY粗提物；
步骤D具体包括：将制得抗人乳头瘤病毒-IgY粗提物溶解于pH7.0、0.01mol/L的M PB磷酸盐缓冲液中，再先后分别过离子交换柱和凝胶层析柱层析，得到抗人乳头瘤病毒-IgY纯品溶液；
步骤A中的人乳头瘤病毒多肽为HPV-E6、HPV-E7或HPV-E6-E7；人乳头瘤病毒多肽与弗氏佐剂的质量比的比值为(1-10):(10-1)；
步骤E中的催化蛋白酶加入质量比的比例为0.01％-0.1％；然后，低温高速离心。
7.一种抗人乳头瘤病毒小分子抗体的制备方法，其特征在于，包括：
A、制备抗原：在人乳头瘤病毒多肽中加入弗氏佐剂，并置于高速匀浆器中高速匀化，得到免疫用的人乳头瘤病毒多肽抗原；
B、制备免疫蛋：每隔两周对产蛋鸡注射一次免疫用的人乳头瘤病毒多肽抗原，注射2-5次，最后一次注射后的至少第12天后取产蛋鸡所产免疫蛋，并进行编码标记，得到抗人乳头瘤病毒-IgY免疫蛋；
C、制备抗人乳头瘤病毒-IgY粗提物；
D、制备抗人乳头瘤病毒-IgY纯品溶液；
E、制备抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab：将抗人乳头瘤病毒-IgY纯品溶液调节pH至3.0-5.0，加入催化蛋白质酶；充分搅拌溶解，产生酶促反应，然后低温高速旋转离心，弃去沉淀得上清液，对上清液进行超滤，得到浓缩液；再将超滤后所获浓缩液进行凝胶层析，将层析收集物透析浓缩，得到抗人乳头瘤病毒小分子抗体Fab。
8.权利要求1-6任一项权利要求所述的抗人乳头瘤病毒小分子抗体作为制备用于防治人乳头瘤病毒(HPV)感染、和/或用于预防和治疗宫颈癌的药物、消毒产品、保健品或医疗器械中的应用。
9.一种组合物，其特征在于，包括权利要求1-6任一项权利要求所述的抗人乳头瘤病毒小分子抗体以及至少一种其它药学上可接受的组分。
10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述抗人乳头瘤病毒小分子抗体添加辅料或基料或者化学药、中药，制成液晶微囊、凝胶、栓剂、乳膏剂、洗液、片剂、泡腾片、胶囊剂、软胶囊、喷雾剂中的至少一种，或者制成抗人乳头瘤病毒(HPV)E6、E7、E6/E7小分子抗体Fab注射用水针剂和粉针剂中的至少一种。
11.权利要求9或10所述的组合物作为制备用于防治人乳头瘤病毒(HPV)感染、和/或用于预防和治疗宫颈癌的药物、消毒产品、保健品或医疗器械中的应用。
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