CN108740684B

CN108740684B - 压热声复合失活芽胞方法及设备

Info

Publication number: CN108740684B
Application number: CN201810421105.2A
Authority: CN
Inventors: 刘东红; 吕瑞玲; 丁甜; 周建伟; 王文骏; 叶兴乾; 曾天泽
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2018-04-27
Filing date: 2018-05-04
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2038-05-04
Also published as: CN108740684A

Abstract

本发明公开了一种压热声复合失活芽胞方法，将待灭菌产品于温度75～85℃，压力450～550kPa，振幅为100％，频率为20khz进行超声处理25～35min，芽孢失活效果显著。本发明采用压热声复合的方法处理待灭菌处理，在温度不超过85℃的条件下具有较高的芽胞失活效率，与现有技术相比，不仅能够减少能源消耗，还能降低对食品品质的影响，保障食品安全。本发明还公开一种压热声复合失活芽胞设备，包括杀菌罐、氮气罐、冷水池、热水池、温度继电器、超声振动装置、温度探头、泵组件和电磁阀组件，满足上述方法超声、压强和热联合杀菌的设备要求。

Description

压热声复合失活芽胞方法及设备

技术领域

本发明涉及杀菌方法及设备，具体涉及一种压热声复合失活芽胞方法及设备。

背景技术

随着经济的发展和生活水平的提高，食品成为一个越来越活跃的舞台，消费者对自己所吃的食物有了更高的要求，而影响食品的一些重要的属性如风味、质地、外观和营养等与加工方式有着解不开的关系。热处理是最原始最传统的杀菌方式，也是目前工业上应用最广泛的，已经有许多研究致力于热杀菌的机理和对食品品质的影响。近年来，为了满足个性化食品的需求，各类新型食品加工技术和方法应运而生，但是由于各种原因还未在工业上普及，因此迄今为止，热杀菌仍然是食品杀菌的最主要和最有效的方法。

超声波是一种有效的辅助灭菌方法，已经成功用于废水处理、饮用水消毒等领域，在液体食品灭菌中的应用也有较多的研究，如啤酒、橙汁、酱油等。超声波所具有的杀菌效力主要由于超声波所产生的空化作用，达到加快食品灭菌的速率。但是单独的超声波作用很难达到实际应用所要求的效果。

高压条件下，微生物的遗传物质、蛋白结构等方面都发生一定的改变，细胞壁和细胞膜受到一定程度的损坏，微生物的生理功能将部分或者全部丧失，甚至导致微生物失活甚至死亡，但是单独使用高压技术具有一定的局限性，不能完全杀死所有的细菌，将高压杀菌结合其他方法杀菌效果更为明显。

非热杀菌在有效杀死微生物的同时最大程度上保持了产品的风味和营养物质，避免了热杀菌破坏食品原有的结构以及风味。但是非热杀菌有一定的局限性，单独作用往往效果较差，因此，可以将热与各项非热杀菌技术联合改善自身缺点，使非热技术有更好的应用前景。

芽胞作为产芽胞细菌的休眠体，在生长环境缺乏营养或有害代谢物质积累过多时形成。芽胞是整个生物界抗逆性最强的生命体，在抗热、抗化学药物、抗辐射、抗高压等方面更是首屈一指。芽胞极强的抗性对食品加工中杀菌环节是一个巨大的挑战，若不能有效杀灭或控制芽胞，芽胞萌发后会导致食品腐败，产生的毒素也对人体健康构成潜在威胁。现工业上常用的杀菌手段为热处理，而芽胞的热抗性极高，如枯草芽胞杆菌芽胞在88℃时的D值为30.2min，故为保证食品安全，不得不过度热处理。因此，寻找一种有效的芽胞失活手段具有重大意义。

压热声作为一种新型加工技术，多用于提高食品保鲜效果，如非专利文献《压热声处理对酶活性影响的评述》告知压热声处理能够使酶失活达到保鲜效果。酶作为一种普通的蛋白质，一些简单的处理即可使其活性降低甚至失活，如单独的热处理或超声处理等等，而芽胞作为细菌的特殊休眠体结构，无法与参照酶进行相应的处理工作，且尚未查询到压热声技术应用于芽胞的失活相关文献。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提出一种压热声复合失活芽胞方法及设备。

为了解决上述问题，本发明提出一种压热声复合失活芽胞设备：

所述压热声复合失活芽胞设备包括杀菌罐、夹套、氮气罐、冷水池、热水池和超声振动装置；

所述超声振动装置包括依次相连的超声发生器、超声换能器和超声探头；

所述杀菌罐与氮气罐相连通；

所述夹套套装在杀菌罐外表面，且夹套分别与冷水池和热水池相连通；

所述超声换能器安装在杀菌罐顶部，超声探头安装在超声换能器上，且超声探头的端部密封的贯穿杀菌罐后伸入其内腔Ⅰ中。

作为本发明压热声复合失活芽胞设备的改进：

所述压热声复合失活芽胞设备还包括泵组件、电磁阀组件、温度继电器和温度探头；

所述温度继电器分别与泵组件、电磁阀组件和温度探头相连；

所述温度探头的端部伸入内腔Ⅰ中。

作为本发明压热声复合失活芽胞设备的进一步改进：

所述泵组件包括冷水泵和热水泵；电磁阀组件包括电磁阀Ⅰ和电磁阀Ⅱ；

所述冷水泵、热水泵、电磁阀Ⅰ和电磁阀Ⅱ分别与温度继电器相连。

所述夹套上从上至下依次设有出水口和进水口；

所述进水口通过冷水泵与冷水池相连通，还通过热水泵与热水池相连通；

所述出水口通过电磁阀Ⅰ与冷水池相连通，还通过电磁阀Ⅱ与热水池相连通；

作为本发明压热声复合失活芽胞设备的进一步改进：

所述杀菌罐上设有进气口和出气口；

所述进气口处设有减压阀，进气口通过减压阀与氮气罐相连通；

所述出气口处设有泄压阀；

所述夹套为位于进气口和出气口下方。

为了解决上述问题，本发明还提出一种压热声复合失活芽胞方法(该方法利用上述设备实现)，包括以下步骤：

将待灭菌产品放入杀菌罐的内腔Ⅰ中，于75～85℃的加热温度，450～550kPa的加压压力，进行振幅为100％(114μm)，频率为20khz的超声处理25～35min。

作为本发明压热声复合失活芽胞方法的改进：

将待灭菌产品放入杀菌罐的内腔Ⅰ中，于温度80℃的加热温度，于500kPa的加压压力，进行振幅为100％(114μm)，频率为20khz的超声处理30min。

作为本发明压热声复合失活芽胞方法的进一步改进：

加热的方法为：

首先通过温度继电器设定加热温度；

温度探头实时检测待灭菌产品的温度，并将温度信号发送至温度继电器，温度继电器根据所接收的温度信号控制电磁阀组件和泵组件工作；

当待灭菌产品的温度低于所设定加热温度，温度继电器控制热水泵工作，热水池中的加热水(85～100℃)进入夹套的内腔Ⅱ中；同时，温度继电器控制电磁阀Ⅱ打开，夹套的内腔Ⅱ中的水由电磁阀Ⅱ回到热水池中；

反之，则温度继电器控制冷水泵工作，冷水池中的冷却水(常温水，15～35℃)进入夹套内腔Ⅱ中；同时，温度继电器控制电磁阀Ⅰ打开，夹套内腔Ⅱ中的水由电磁阀Ⅰ回到冷水池中。

作为本发明压热声复合失活芽胞方法的进一步改进：

所述超声处理的方法为：

利用超声发生器发出超声信号，超声换能器将该信号超声信号转换为电信号传递到超声探头上，超声探头在杀菌罐的内腔Ⅰ中根据该信号发生特定振幅的振动；

所述超声探头的端部距离杀菌罐的内腔Ⅰ底部1±0.05cm。

作为本发明压热声复合失活芽胞方法的进一步改进：

加压的方法为：

利用氮气罐向杀菌罐的内腔Ⅰ中注入高纯度氮气，并通过减压阀调节压力，直至杀菌完成后打开泄压阀放出氮气。

与现有技术相比，本发明的技术优势在于：

本发明采用超声波与高压以及热联用的方法失活芽胞；与单独的热处理、超声处理相比，压热声可以较大程度上失活芽胞。另一方面，减少杀菌时间可以降低能源损耗，起到了节能、降耗、环保的重要作用。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为本发明压热声复合失活芽胞设备结构示意图；

图2为本发明空白对照中芽胞超微结构示意图；

图3为本发明实施例1中芽胞超微结构示意图；

图4为本发明对比例1-1中芽胞超微结构示意图；

图5为本发明对比例1-2中芽胞超微结构示意图；

图6为本发明对比例1-3中芽胞超微结构示意图；

图7为本发明对比例1-4中芽胞超微结构示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1、压热声复合失活芽胞设备，如图1所示，包括杀菌罐1、氮气罐3、冷水池4、热水池5、温度继电器6、超声振动装置、温度探头8、泵组件和电磁阀组件。

泵组件包括冷水泵41和热水泵51；电磁阀组件包括电磁阀Ⅰ42和电磁阀Ⅱ52。

超声振动装置包括依次相连的超声发生器72、超声换能器70和超声探头71；超声发生器72作为驱动电源与超声换能器70和超声探头71相连。当超声发生器72发出超声信号时，超声换能器70将该超声信号转换为电信号传递到超声探头71上，超声探头71发生特定振幅的振动。

杀菌罐1的内腔Ⅰ100用于放置待灭菌的产品；超声换能器70安装在杀菌罐1顶部，超声探头71安装在超声换能器70上，且超声探头71的端部密封的贯穿杀菌罐1后伸入其内腔Ⅰ100中，本实施例中，超声探头71的端部距离杀菌罐1的内腔Ⅰ100底部约1cm。

杀菌罐1上设有进气口11和出气口12，进气口11通过减压阀31与氮气罐3相连通，出气口12处设有泄压阀32，出气口12通过泄压阀32与外界环境相连通。

在实际使用过程中，工作人员通过打开氮气罐3向杀菌罐1内腔Ⅰ100中注入高纯度氮气，并通过减压阀31调节至所需的压力，杀菌完成后打开泄压阀32放出氮气(如图1中出气口12处箭头所示，排出氮气)。

杀菌罐1上还设有夹套2，夹套2套装在杀菌罐1外表面，并位于进气口11和出气口12下方。夹套2上从上至下依次设有出水口22和进水口21；如图1中粗实线及粗实线上的箭头所示，进水口21通过冷水泵41与冷水池4相连通，还通过热水泵51与热水池5相连通，即，冷水池4依次通过冷水泵41和进水口21与夹套2内腔Ⅱ101相连通，热水池5依次通过热水泵51和进水口21与夹套2内腔Ⅱ101相连通。出水口22通过电磁阀Ⅰ42与冷水池4相连通，还通过电磁阀Ⅱ52与热水池5相连通。

温度探头8的端部伸入杀菌罐1的内腔Ⅰ100中，浸没于待灭菌样品中，实时检测待灭菌样品的温度。温度探头8与温度继电器6信号相连，温度继电器6还与冷水泵41、热水泵51、电磁阀Ⅰ42和电磁阀Ⅱ52电相连(为了图面的整洁，故在图1中省略了温度继电器6与热水泵51和电磁阀Ⅱ52连线)。

在实际工作过程中，当温度探头检测到样品温度高于设置温度时，温度继电器6发出信号打开冷水泵41(同时打开电磁阀Ⅰ42)，冷却水进入夹套2内腔Ⅱ101(夹套2内腔Ⅱ101中的水由电磁阀Ⅰ42回到冷水池4中)；当样品温度低于设置温度时，温度继电器6打开热水泵51(同时打开电磁阀Ⅱ52)，加热水进入夹套2内腔Ⅱ101(夹套2内腔Ⅱ101中的水由电磁阀Ⅱ52回到热水池5中)。

注：本实施例中加热水采用95℃的热水，在实际工作中，可根据加热温度选用85～100℃的热水。本实施例中冷却水采用常温水(25℃)。

利用上述压热声复合失活芽胞设备对芽胞进行处理，具体处理步骤如下：

本发明采用的芽胞为青岛海博生物科技有限公司的ATCC14579蜡样芽胞杆菌。

1、加热处理：向杀菌罐1的内腔Ⅰ100中放入待灭菌样品。

本实施例中将25mL无菌水放入杀菌罐1的内腔Ⅰ100中，设置预热温度为80℃。

此时温度继电器6打开热水泵51(同时打开电磁阀Ⅱ52)，热水池5中的热水通过热水泵51进入夹套2内腔Ⅱ101进行加热处理(夹套2内腔Ⅱ101中的水由电磁阀Ⅱ52回到热水池5中)。

杀菌罐1内腔Ⅰ100中的温度探头8可以实时检测待灭菌样品的温度，温度继电器6在温度高于或低于设定温度时会实时打开相应的电磁阀组件和泵组件。因此在整个杀菌过程中杀菌罐1内腔Ⅰ100的温度均保持在80±2℃内(信号传递与水浴仍需要一定的时间，因此温度仍有一定的波动)。

注：实际工作过程中，将待灭菌产品可直接放入杀菌罐1内腔Ⅰ100直接进行加热杀菌。本实施例中将芽胞悬液直接加热至80℃，加热期间对芽胞也有失活作用，较难量化。因此采用预热的方法，即可更精确量化其效果，从而便于分析不同参数对芽孢失活效果的影响。

2、加压及超声处理：当预热温度到达80℃时加入向无菌水中加入2.0×10⁸CFU/mL的芽胞悬液5mL。关闭杀菌罐1，打开氮气罐3将杀菌罐1的内腔Ⅰ100中的压力增加至500kPa(大气压为100kPa，额外增加400kPa压力)压力，并用振幅100％(本实施例中振幅为114μm)，频率20khz的超声处理30min。

注：上述加热、超声与加压工作同时发生。

压力越大效果越好，但是在实际过程中，压力越高对容器(杀菌罐1)的要求也越高，压力为450～550kPa时，即满足一般容器的要求，又具有较好的杀菌效果。

温度越高杀菌效果越好，但是过高的温度对待灭菌样品以及仪器损伤程度较大，灭菌温度为75～85℃时，即不会对待灭菌样品品质造成较大影响，又具有较好的杀菌效果，与现有技术相比，还减少能源损耗。

超声处理中并非时间的越长灭菌效果越好，综合考虑温度、压力和超声三种处理方式，发现于温度75～85℃，压力450～550kPa，进行振幅为100％(114μm)，频率为20khz的超声处理25～35min杀菌效果显著。与现有过度热处理实现芽孢失活先比，本发明无需升高杀菌温度或延长杀菌时间即可实现对芽孢的失活，能够保障食品安全又能保证食品品质，还能使杀菌温度低、时间短，减少能源消耗。

3、步骤2完成后，停止超声处理，并打开泄压阀32杀菌罐1内腔Ⅰ100恢复常压(100kPa)。此时将温度设定为室温(25℃)，温度继电器传递信号打开冷水泵41(同时打开电磁阀Ⅰ42)，冷却水进入夹套2内腔Ⅱ101(夹套2内腔Ⅱ101中的水由电磁阀Ⅰ42回到冷水池4中)，进行冷却处理。待温度冷却至室温(25℃)取出。

对比例1-1、将实施例1中步骤2的压强改为100kPa(常压)，即，仅进行加热超声复合杀菌；其余等同于实施例1。

对比例1-2、实施例1步骤1中预热温度改为25℃(室温)，即，仅进行加压超声复合杀菌；其余等同于实施例1。

对比例1-3、25mL无菌水预热至80℃后加入2.0×10⁸CFU/mL的芽胞悬液5mL，混匀后80℃处理30min，即，仅进行加热杀菌。

注：进行上述加热处理可使酶失活。

对比例1-4、25mL无菌水预热至25℃加入2.0×10⁸CFU/mL的芽胞悬液5mL，用振幅100％，频率20khz的超声处理30min，即，仅进行超声杀菌。

注：进行上述超声处理可使酶部分活性失活。

对比例2-1、将实施例1步骤1和2中处理温度改为60℃，其余等同于实施例1。

对比例2-2、将实施例1步骤2中超声时长改为10min，其余等同于实施例1。

实验1、芽胞失活情况测定：

将上述实施例1灭菌后所得的溶液取0.1mL均匀涂布与20mLNA+01％可溶性淀粉培养基，37℃恒温培养24h之后计数，并设置空白对照(25mL无菌水混合5mL芽胞悬液作为空白对照)进行相同的实验，具体数据如表1所示。

将上述所有对比例所得的溶液按照上述实施例1进行实验的步骤依次实验，具体数据如表1所示。

表1不同处理后平板技术菌落数单位：log(CFU/mL)

	菌落数/log(CFU/mL)
		空白对照	7.30±0.02
实施例1	4.18±0.03
		对比例1-1	6.78±0.08
对比例1-2	7.00±0.02
		对比例1-3	6.92±0.12
对比例1-4	7.18±0.03
		对比例2-1	6.25±0.08
对比例2-2	5.71±0.01

由表1的数据可见，可导致酶失活的单独的超声处理、热处理对芽胞的失活效果不佳，超声联合压强处理对芽胞失活的效果亦不显著，超声联合热处理对芽胞失活效果虽有协同但是效果仍不显著，但是超声在与压强和热联合作用后对芽胞失活有较好的协同作用，处理后失活芽胞的数量大大增加。

实验2：芽胞超微结构测定：

将处理组和对照组样品(25mL无菌水混合5mL芽胞悬液作为空白对照)溶液在8000r/min离心10min，取沉淀，所得沉淀用0.85％生理盐水洗涤3次(离心同上)。其次用2.5％的戊二醛溶液4℃固定过夜，之后倒掉固定液，用0.1mol/L、pH7.0的磷酸盐缓冲液漂洗样品三次，每次15min；再用1％的锇酸溶液固定样品1-2h后，用0.1mol/L、pH7.0的磷酸盐缓冲液漂洗样品三次，每次15min；之后用梯度浓度(包括30％，50％，70％，80％，90％，95％六种浓度)的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100％的乙醇处理20min，之后过渡到纯丙酮处理20min；用包埋剂将样品包埋起来，70℃加热过夜，即得到包埋好的样品。样品在LEICA EMUC7型超薄切片机中切片，获得70-90nm的切片，切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50％乙醇饱和溶液各染色5-10min，即可在JEM-1230透射电镜中观察，以比较不同处理后芽胞超微结构的变化。

由图2～7所示，超声处理口能够破坏芽胞超微结构，但是本发明压热声处理之后对其内容物以及形态破坏更明显，如图3所示芽胞内容物泄露。

与现有技术相比，本发明利用压热声复合的方法处理待灭菌产品，可以大大提高芽胞的失活效率，与现有技术相比降低对食品品质的影响，保障食品安全。本发明无需提高杀菌温度或延长杀菌时间即可有效杀菌，从而降低成本，减少能源的消耗。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.压热声复合失活芽胞方法，其特征在于：

所用的压热声复合失活芽胞设备包括杀菌罐(1)、夹套(2)、氮气罐(3)、冷水池(4)、热水池(5)和超声振动装置；

所述超声振动装置包括依次相连的超声发生器(72)、超声换能器(70)和超声探头(71)；

所述杀菌罐(1)与氮气罐(3)相连通；

所述夹套(2)套装在杀菌罐(1)外表面，且夹套(2)分别与冷水池(4)和热水池(5)相连通；

所述超声换能器(70)安装在杀菌罐(1)顶部，超声探头(71)安装在超声换能器(70)上，且安装在超声换能器上的端部密封的贯穿杀菌罐(1)后伸入其内腔Ⅰ(100)中；

所述压热声复合失活芽胞设备还包括泵组件、电磁阀组件、温度继电器(6)和温度探头(8)；

所述温度继电器(6)分别与泵组件、电磁阀组件和温度探头(8)相连；

所述温度探头(8)的端部伸入内腔Ⅰ(100)中；

所述泵组件包括冷水泵(41)和热水泵(51)；电磁阀组件包括电磁阀Ⅰ(42)和电磁阀Ⅱ(52)；

所述冷水泵(41)、热水泵(51)、电磁阀Ⅰ(42)和电磁阀Ⅱ(52)分别与温度继电器(6)相连；

所述夹套(2)上从上至下依次设有出水口(22)和进水口(21)；

所述进水口(21)通过冷水泵(41)与冷水池(4)相连通，还通过热水泵(51)与热水池(5)相连通；

所述出水口(22)通过电磁阀Ⅰ(42)与冷水池(4)相连通，还通过电磁阀Ⅱ(52)与热水池(5)相连通；

芽胞为ATCC14579蜡样芽胞杆菌；

压热声复合失活芽胞方法包括以下步骤：

1)、加热处理：向杀菌罐(1)的内腔Ⅰ(100)中放入待灭菌样品；

将25mL无菌水放入杀菌罐(1)的内腔Ⅰ(100)中，设置预热温度为80℃；

此时温度继电器(6)打开热水泵(51)，且同时打开电磁阀Ⅱ(52)，热水池(5)中的热水通过热水泵(51)进入夹套(2)内腔Ⅱ(101)进行加热处理，夹套(2)内腔Ⅱ(101)中的水由电磁阀Ⅱ(52)回到热水池(5)中；

杀菌罐(1)内腔Ⅰ(100)中的温度探头(8)可以实时检测待灭菌样品的温度，温度继电器(6)在温度高于或低于设定温度时会实时打开相应的电磁阀组件和泵组件；因此在整个杀菌过程中杀菌罐(1)内腔Ⅰ(100)的温度均保持在80±2℃内；

2)、加压及超声处理：当预热温度到达80℃时加入向无菌水中加入2.0×10⁸CFU/mL的芽胞悬液5mL；关闭杀菌罐(1)，打开氮气罐(3)将杀菌罐(1)的内腔Ⅰ(100)中的压力增加至500kPa压力，并用振幅100％，频率20khz的超声处理30min；

3)、步骤2)完成后，停止超声处理，并打开泄压阀(32)杀菌罐(1)内腔Ⅰ(100)恢复常压；此时将温度设定为室温，温度继电器传递信号打开冷水泵(41)，同时打开电磁阀Ⅰ(42)，冷却水进入夹套(2)内腔Ⅱ(101)，此时夹套(2)内腔Ⅱ(101)中的水由电磁阀Ⅰ(42)回到冷水池( 4) 中，进行冷却处理；待温度冷却至室温取出。

2.根据权利要求1所述的压热声复合失活芽胞方法，其特征在于：

所述杀菌罐(1)上设有进气口(11)和出气口(12)；

所述进气口(11)处设有减压阀(31)，进气口(11)通过减压阀(31)与氮气罐(3)相连通；

所述出气口(12)处设有泄压阀(32)；

所述夹套(2)为位于进气口(11)和出气口(12)下方。