CN108732296B - 交联葡聚糖微球的交联度检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种交联葡聚糖微球的交联度检测方法，先用高碘酸钠与交联葡聚糖微球进行氧化还原反应，此时交联葡聚糖微球中未被交联剂修饰的葡萄糖残基被高碘酸钠定量氧化生成甲酸，氧化反应完成后，滴定生成的甲酸，从而计算出未修饰的葡聚糖质量，代入交联度＝(微球总质量‑未修饰葡聚糖质量)/微球总质量×100％的公式中最终测得微球的交联度。本发明开创性地对交联葡聚糖微球的交联度进行了定义，即微球中交联剂修饰部分的质量占整个微球质量的百分比。试验佐证本发明的交联度检测方法得到的交联度数值是正确、合理的，适用于科研和实际生产过程对微球交联度的检测。

Description

交联葡聚糖微球的交联度检测方法

技术领域

本发明涉及交联葡聚糖微球的交联度检测方法。

背景技术

葡聚糖是白色念珠菌在蔗糖介质中合成的一种以α-1,6-键连接的葡萄糖聚合物。葡聚糖无毒性且具有良好的生物黏附性、生物相容性、生物降解性和凝胶特性，在药物控释及栓塞治疗方面具有独特优势。葡聚糖是是良好的微球制备原料，葡聚糖微球在生物医药领域具有广泛的应用前景。

交联葡聚糖由葡聚糖在糖的长链间用交联剂交联而成，常用的交联剂为1-氯代-2,3-环氧丙烷，葡聚糖与1-氯代-2,3-环氧丙烷的交联产物的化学结构式如下。除了化学结构式中所表述的交联取代修饰，不可避免的葡聚糖与交联剂的交联产物中还会存在单取代修饰的情况，即交联剂的官能团只有一端与葡聚糖的基团连接，单取代修饰和交联修饰均视作交联产物。

此外，也可以使用其他交联剂与葡聚糖进行交联反应，例如BDDE、二乙烯基砜等。

目前行业内将不同规格型号的交联葡聚糖用英文字母G表示,G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如,G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克,同样G-200为每克干胶吸水20克。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100、G-150、和G-200。G值越大，交联度越小，因此吸水量越大。因此,“G”反映了凝胶的交联程度、膨胀程度及分布范围。

对于交联葡聚糖微球，其交联度还对微球稳定性、机械属性具有显著影响，理论上来说交联度越大，微球越稳定，吸水能力越弱，耐酶解能力越强，同时机械强度越大。

我们虽然知道交联葡聚糖微球的交联度与其各项性能密切相关，可通过产品的吸水性、粘弹性、耐酶性、推挤力等指标佐证其交联度，但是在实际生产过程中，对于每批次生产得到的交联葡聚糖微球，交联度只能通过间接的方法获取，即在反应过程中扣除各个后处理环节中残留的交联剂量来计算出参加反应的交联剂的量，从而间接得到该批产品的交联度。但由于该法未曾考虑各环节中交联剂自身的分解，故得出的交联度大都偏高，且此法不能直接对成品进行交联度的测定，故存在一定的限制。

关于行业内公开的交联产物的交联度检测方法，如交联HA凝胶修饰度的测定，是根据面积归一化法，总的修饰度t-MOD由分子排阻色谱图中修饰片段的峰面积计算得到；通过SEC-MS分析，悬挂修饰度(p-MOD，即上述单交联取代)和交联修饰度(c-MOD)由总离子流色谱图(TIC)中悬挂修饰和交联修饰片段的离子峰面积占比计算得到。上述对交联HA交联度的检测方法操作繁琐，设备昂贵，不普及，误差较大，结果不可靠，生产中不适用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种交联葡聚糖微球的交联度检测方法。

实现本发明目的的技术方案是一种交联葡聚糖微球的交联度检测方法，所述交联度是微球中交联剂修饰部分的质量占整个微球质量的百分比，其中修饰部分质量包括交联修饰的葡聚糖质量、单取代修饰的葡聚糖质量和交联剂片段三部分质量之和；检测方法如下：

用电子天平精密称取质量为m、单位g的受试交联葡聚糖微球，将其转移至容量为V_a mL容量瓶中，用移液管量取高碘酸钠溶液并转移至上述容量瓶中，摇匀，容量瓶外周用锡纸包好避光，在2℃～10℃下进行氧化还原反应；高碘酸钠溶液的加入量保证能完全氧化交联葡聚糖微球。

反应过程中隔时间吸取进行氧化反应的容量瓶中的溶液至容量瓶中，用水稀释后摇匀，测定溶液的吸光值。

待吸光值达到稳定，认定反应结束，此时从容量瓶中吸取V_b mL上清液到锥形瓶中，向锥形瓶中加入V_b/10mL乙二醇，摇匀，在室温、黑暗条件下静置后，向锥形瓶中加入2～3滴酚酞试剂，摇匀，然后用浓度为c、单位mol/L的氢氧化钠溶液进行滴定，记录下消耗的体积V₁。

以相同体积V_b mL蒸馏水加V_b/10mL乙二醇溶液做空白，以同样的方法操作，进行滴定，记录下空白消耗的体积V₀。

代入交联度计算公式

中计算得到交联度。

上述氧化还原反应所用的高碘酸钠溶液的浓度为0.03mol/L～0.1mol/L。

上述滴定用的氢氧化钠溶液的浓度为0.005mol/L～0.1mol/L。

本发明具有积极的效果：(1)本发明开创性地对交联葡聚糖微球的交联度进行了定义，即微球中交联剂修饰部分的质量占整个微球质量的百分比，其中修饰部分质量包括交联修饰的葡聚糖质量、单取代修饰的葡聚糖质量和交联剂片段质量之和。

(2)本发明对交联度进行检测时，先用高碘酸钠与交联葡聚糖微球进行氧化还原反应，此时交联葡聚糖微球中未被交联剂修饰的葡萄糖残基被高碘酸钠定量氧化生成甲酸，1mol葡萄糖残基与2mol高碘酸钠反应生成1mol甲酸，而被交联修饰的葡聚糖、单取代修饰的葡聚糖不会被高碘酸钠氧化生成甲酸。氧化反应完成后，滴定生成的甲酸，从而计算出未修饰的葡聚糖质量(其质量＝甲酸物质的量×葡萄糖残基相对分子质量(162g/mol))，代入公式交联度＝(微球总质量-未修饰葡聚糖质量)/微球总质量×100％的中最终测得微球的交联度。

(3)本发明还进行了测得的不同交联度微球的耐酶性试验，发现按照本发明测得的交联度越大的微球，其耐酶性越强，与理论性能相符合，证实本发明的交联度检测方法得到的交联度数值是正确、合理的，适用于科研和实际生产过程对微球交联度的检测。

具体实施方式

(实施例1)

用电子天平精密称取0.20008g的1号受试交联葡聚糖微球(该份待测试交联葡聚糖微球在制备时，交联剂环氧氯丙烷的加入质量为葡聚糖的质量的25％)，将其转移至50mL容量瓶中，用移液管量取50mM的高碘酸钠溶液50.00mL并转移至上述50mL容量瓶中，摇匀，容量瓶外周用锡纸包好避光，在4℃下进行氧化还原反应，反应过程中每隔24h充分振摇容量瓶一次。

氧化还原反应的方程式如下：

反应过程中每隔24h吸取0.1mL容量瓶中的溶液至100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，于223nm处测定溶液的吸光值。

反应7天后，吸光值达到稳定，此时从容量瓶中吸取20.00mL上清液到锥形瓶中，向锥形瓶中加入2mL乙二醇，摇匀，在室温、黑暗条件下静置20min后，向锥形瓶中加入2～3滴酚酞试剂，摇匀，然后用0.01M的氢氧化钠溶液进行滴定，记录下消耗的体积V₁为26.22mL。

以相同体积20mL蒸馏水加2mL乙二醇溶液做空白，以同样的方法操作，进行滴定，记录下空白消耗的体积V₀为0.20ml。

代入交联度计算公式：

中。

上式中，V₁为样品液消耗氢氧化钠滴定液的体积，单位ml。

V₀为空白对照液消耗氢氧化钠滴定液的体积，单位ml。

c为氢氧化钠滴定液浓度，单位mol/L。

162g/mol为葡聚糖链中葡萄糖残基分子摩尔质量。

m为葡聚糖微球的质量，单位g。

(实施例2)

用电子天平精密称取0.20049g的2号受试交联葡聚糖微球(该份待测试交联葡聚糖微球在制备时，交联剂环氧氯丙烷的加入质量为葡聚糖的质量的46.9％)，将其转移至50mL容量瓶中，用移液管量取50mM的高碘酸钠溶液50.00mL并转移至上述50mL容量瓶中，摇匀，容量瓶外周用锡纸包好避光，在4℃下进行氧化还原反应，反应过程中每隔24h充分振摇容量瓶一次。

反应过程中每隔24h吸取0.1mL容量瓶中的溶液至100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，于223nm处测定溶液的吸光值。

反应7天后，吸光值达到稳定，此时从容量瓶中吸取20.00mL上清液到锥形瓶中，向锥形瓶中加入2mL乙二醇，摇匀，在室温、黑暗条件下静置20min后，向锥形瓶中加入2～3滴酚酞试剂，摇匀，然后用0.01M的氢氧化钠溶液进行滴定，记录下消耗的体积V₁为18.80mL。

以相同体积20mL蒸馏水加2mL乙二醇溶液做空白，以同样的方法操作，进行滴定，记录下空白消耗的体积V₀为0.05ml。

代入交联度计算公式：

(实施例3)

本实施例的交联葡聚糖微球的交联度检测方法其余与实施例1相同，不同之处在于：

本实施例检测的是3号受试样品，该份待测试交联葡聚糖微球在制备时，交联剂环氧氯丙烷的加入质量为葡聚糖质量的60％。

3号受试样品的称取量为0.20071g。

本实施例用0.01M的氢氧化钠溶液滴定时，消耗的体积V₁为18.16mL。

以相同体积20mL蒸馏水加2mL乙二醇溶液做空白，以同样的方法操作，进行滴定，记录下空白消耗的体积V₀为0.05ml。

代入交联度计算公式：

(实施例4)

本实施例的交联葡聚糖微球的交联度检测方法其余与实施例1相同，不同之处在于：

本实施例检测的是4号受试样品，该份待测试交联葡聚糖微球在制备时，交联剂环氧氯丙烷的加入质量为葡聚糖质量的80％。

4号受试样品的称取量为0.20082g。

本实施例用0.01M的氢氧化钠溶液滴定时，消耗的体积V₁为17.93mL。

以相同体积20mL蒸馏水加2mL乙二醇溶液做空白，以同样的方法操作，进行滴定，记录下空白消耗的体积V₀为0.20ml。

代入交联度计算公式：

实施例1至实施例4的待测试交联葡聚糖微球采用本领域现有的乳化交联法制备，只是各实施例的微球在制备时，交联剂的用量不同。

(试验例、不同交联度的交联葡聚糖微球的耐酶性试验)

试验方法如下：

首先分别配置浓度为0.05mg/mL(0.5-1.25U/mL)、0.2mg/mL(2-5U/mL)、0.4mg/mL(10-25U/mg)右旋糖酐酶溶液。

各浓度的右旋糖酐酶溶液是称取好右旋糖酐酶干粉后，用5.0mM醋酸铵缓冲液配置成相应浓度。其中5.0mM醋酸铵缓冲液的配置方法为：称取醋酸铵115.5mg，加入300mL水溶解，加入醋酸调节溶液的pH值为6.0。

对于每个浓度的右旋糖酐酶溶液，分别称取1至4号样本微球各0.1g转移至15mL塑料试管中，加入酶溶液5mL，在37℃水浴摇床中进行水解，摇床转速设为120rpm。

实验现象及结果：

(1)对于浓度为0.05mg/mL(0.5-1.25U/mL)右旋糖酐酶溶液组，酶解2h后，25％ECH微球开始出现酶解现象，其它微球无变化；酶解26h后，25％ECH微球基本水解完全，微球水解成澄清溶液，其它交联度的微球无变化。

(2)对于浓度为0.2mg/mL(2-5U/mL)右旋糖酐酶溶液组，酶解20min后，25％ECH微球开始出现酶解现象，其它微球无变化；酶解18h后，25％ECH微球基本水解完全，微球水解成澄清溶液，其它交联度的微球无变化。

(3)对于浓度为0.4mg/mL(10-25U/mg)右旋糖酐酶溶液组，酶解30min后，25％ECH微球开始出现酶解现象，其它微球无变化；酶解8h后，25％ECH微球基本水解完全，微球水解成澄清溶液，其它交联度的微球无变化。24h后，其它微球仍未出现降解现象，酶溶液随着时间的推移，由澄清变为浑浊，不知是否是酶发生活力下降还是变性的缘故导致。

耐酶解实验总结：通过以上所有试验可以得到交联剂的投入量与交联度及耐酶性的关系，结果见下表：

除了本发明所述的交联葡聚糖微球，对于其他形状的交联葡聚糖，也可以采取本方法检测其交联度。也即本发明的检测方法并不受限于交联葡聚糖的形状。

Claims (3)

1.一种交联葡聚糖微球的交联度检测方法，其特征在于：

所述交联度是微球中交联剂修饰部分的质量占整个微球质量的百分比，其中修饰部分质量包括交联修饰的葡聚糖质量、单取代修饰的葡聚糖质量和交联剂片段三部分质量之和；检测方法如下：

用电子天平精密称取质量为m、单位g的受试交联葡聚糖微球，将其转移至容量为V_amL容量瓶中，用移液管量取高碘酸钠溶液并转移至上述容量瓶中，摇匀，容量瓶外周用锡纸包好避光，在2℃～10℃下进行氧化还原反应；高碘酸钠溶液的加入量保证能完全氧化交联葡聚糖微球；

反应过程中隔时间吸取进行氧化反应的容量瓶中的溶液至容量瓶中，用水稀释后摇匀，测定溶液的吸光值；

待吸光值达到稳定，认定反应结束，此时从容量瓶中吸取V_bmL上清液到锥形瓶中，向锥形瓶中加入V_b/10mL乙二醇，摇匀，在室温、黑暗条件下静置后，向锥形瓶中加入2～3滴酚酞试剂，摇匀，然后用浓度为c、单位mol/L的氢氧化钠溶液进行滴定，记录下消耗的体积V₁；

以相同体积V_bmL蒸馏水加V_b/10mL乙二醇溶液做空白，以同样的方法操作，进行滴定，记录下空白消耗的体积V₀；

代入交联度计算公式

中计算得到交联度。

2.根据权利要求1所述的交联葡聚糖微球的交联度检测方法，其特征在于：高碘酸钠溶液的浓度为0.03mol/L～0.1mol/L。

3.根据权利要求1所述的交联葡聚糖微球的交联度检测方法，其特征在于：滴定用的氢氧化钠溶液的浓度为0.005mol/L～0.1mol/L。