CN108728468B - 克隆目标dna片段的方法及载体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了克隆目标DNA片段的方法及载体，所述方法包括：识别位于目标DNA片段的一侧的CRISPR‑Cas9识别位点以及分别位于所述目标DNA片段两侧的整合位点和第一重组位点，所述第一重组位点位于所述目标DNA片段与所述CRISPR‑Cas9识别位点的之间；将整合位点、识别位点以及第一重组位点克隆到载体中，将spacer序列整合到所述载体上sgRNA序列的5’端；通过同源重组将将所述载体整合到所述目标DNA片段所在的遗传物质上；诱导所述阳性克隆的Cas9编码序列的表达，切割产生的片段两端的两个第一重组位点之间发生同源重组；筛选携带所述目标DNA片段的质粒。本发明的方法步骤简单，成本低，效率高，特别适用从生物体中克隆大的目标DNA片段。

Description

克隆目标DNA片段的方法及载体

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种克隆目标DNA片段的方法及载体。

背景技术

基于CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列，Clustered Regularly InterspacedSmall Palindromic Repeats)/Cas9系统的基因组编辑方法已经深刻的改变了生命科学领域的研究方法和研究内容。CRISPR/Cas9系统是原核生物中广泛存在的适应性免疫系统之一，用于应对外源核酸分子入侵，例如降解噬菌体来源的核酸分子，降解转化入细胞中的外源质粒等。当细胞被首次入侵之后，部分外源DNA序列被捕获，以间隔子(spacer)形式有规律的整合，成为CRISPR序列。为了精确区分自身和外源的DNA分子，外源的DNA分子中spacer序列下游(5’-3’方向)存在PAM(Protospacer Adjacent Motif)基序5’-NGG-3’。当细胞遭遇二次攻击时，这段序列会转录为非编码RNA——crRNA(CRISPR RNA)。在CRISPR II型系统中，还存在一个非编码RNA——tracrRNA与crRNA结合，其被加工，然后指导唯一的蛋白酶Cas9寻找spacer序列和PAM序列，切割二次攻击的DNA双链分子。为了便于载体构建，crRNA:tracrRNA双元分子可以融合为单个的RNA分子——sgRNA(single guide RNA)，其5’端的20nt是spacer，负责识别特定基因的区域。这样只要同时表达Cas9蛋白和sgRNA就有可能实现基因组编辑。与其他类型的CRISPR系统相比，II型系统结构更紧凑。对于CRISPR/Cas9系统，只需要设计不同的RNA序列即可实现针对特异位点的识别和切割。

目前定向克隆大片段DNA的方法中，已经有报道在体外尝试使用CRISPR/Cas9系统，类似于限制性内切酶的作用，将目标片段从基因组DNA中分离出来。这种方法的缺点在于过分依赖体外制备的高质量、文库构建级别的基因组DNA。由于制备高质量基因组DNA的技术需要丰富经验，常规实验室往往无法便捷的使用。因此，直接从生物体内克隆大片段DNA到载体上就成为一种很有优势的选择。然而，目前已经报道的直接从体内克隆大片段DNA的方法都是基于位点特异性重组系统，需要将重组酶识别位点预先整合到目标DNA片段的两侧，然后诱导重组酶表达使目标DNA片段环出。这种方法的缺点是需要经过反复的遗传操作，时间成本较大。

发明内容

现有技术中克隆大片段DNA时，过分依赖体外制备的高质量、文库构建级别的基因组DNA，所以成本较高、技术复杂、效率较低。此外，体内克隆的方法需要多步遗传操作导入位点特异性重组酶的识别位点，费时费力。

本发明针对上述缺点，通过将CRISPR/Cas9技术与同源重组技术相结合，开发了一种只通过简单遗传操作即可直接从生物体内克隆目标DNA片段到载体上的方法，所述方法包括以下步骤：(1)识别位于所述目标DNA片段的一侧的CRISPR-Cas9识别位点，所述CRISPR-Cas9识别位点为23nt的序列，包含20nt的spacer序列以及位于所述spacer序列3’端的3nt的PAM序列；(2)识别分别位于所述目标DNA片段两侧的整合位点和第一重组位点，其中，所述第一重组位点位于所述目标DNA片段与所述CRISPR-Cas9识别位点的之间；(3)将所述整合位点、所述CRISPR-Cas9识别位点以及所述第一重组位点克隆到所述载体中，其中，所述CRISPR-Cas9识别位点在所述载体上的位置位于所述整合位点和所述第一重组位点之间，所述载体具有Cas9的编码序列、sgRNA序列以及第一抗性基因的编码序列，其中所述Cas9编码序列是诱导型表达，所述抗性基因和sgRNA是组成型表达；(4)将所述spacer序列克隆到所述载体上sgRNA序列的5’端；(5)所述载体上的整合位点在所述生物体内与所述目标DNA片段一侧的整合位点发生同源重组，从而将所述载体整合到所述目标DNA片段所在的遗传物质上，然后通过所述第一抗性基因筛选发生载体整合的阳性克隆；(6)诱导所述阳性克隆的Cas9编码序列的表达，然后分别位于CRISPR-Cas9系统切割的产生的片段两侧的两个所述第一重组位点之间发生同源重组，生成包含所述目标DNA片段的质粒；(7)提取质粒，通过所述第一抗性基因筛选获得携带所述目标DNA片段的质粒。该方法步骤简单，成本低，效率高。该方法特别适用从生物体，尤其是真核生物中克隆大的目标DNA片段，同时可以敲除所述生物体的目标DNA片段。

根据一个实施方式，所述方法进一步包括：识别位于所述目标DNA片段一侧的第二重组位点，其中，所述CRISPR-Cas9识别位点位于所述第一重组位点位于和所述第二重组位点之间；并且在步骤(3)中将所述第二重组位点也整合到所述载体中，其中所述第二重组位点在所述载体上位于所述整合位点和所述CRISPR-Cas9识别位点之间；在步骤(6)中，位于所述CRISPR-Cas9系统切割的产生的片段末端的两个所述第二重组位点之间发生同源重组。该方法特别适用从原核生物中克隆所述目标DNA片段，因为原核生物如果不能通过第二重组位点之间发生的同源重组完成DNA修复，可能会影响其代谢功能，导致死亡。

优选地，所述载体具有第二抗性基因的编码序列及其表达元件，并且所述第二抗性基因的编码序列在所述载体上位于所述第二重组位点和所述整合位点之间。可以通过第二抗性基因筛选通过第二重组位点发生的同源重组，有助于筛选同时敲除所述目标DNA片段的所述生物体。

根据一个实施方式，所述载体包括pMB1、p15A、pSC101复制子的任一种或多种。上述复制子为低拷贝数的复制子，可以使得大片段的DNA比较稳定。

根据一个实施方式，所述载体包括一种或多种限制性内切酶的单一酶切位点。外源DNA片段可以通过这些酶切位点整合的载体上。

根据一个实施方式，所述载体为SG5复制子被删除的pCRISPR-Cas9载体，并且步骤(5)和步骤(7)中用安普霉素(Apramycin)进行筛选，步骤(6)中用硫链丝菌素诱导所述Cas9编码序列的表达。所述载体还可以是SG5复制子被删除的pKCCas9do载体。

根据一个实施方式，所述整合位点1的长度为2～3kb，所述第一重组位点和所述第二重组位点的长度为300～700bp。这样可确保了同源重组介导的质粒整合主要通过所述整合位点进行，而不在所述第一重组位点进行。

所述目标DNA片段包括大片段的调控序列、含有大片段内含子和调控序列的基因、或者由功能相关基因构成的基因簇。

本发明还提供了用于从生物体内克隆目标DNA片段的载体，其中，所述载体包括Cas9的编码序列、sgRNA序列以及第一抗性基因的编码序列，其中所述Cas9编码序列是诱导型表达，所述抗性基因和sgRNA是组成型表达；并且所述载体上具有整合位点、CRISPR-Cas9识别位点以及第一重组位点，所述CRISPR-Cas9识别位点在所述载体上的位置位于所述整合位点和所述第一重组位点之间，其中所述CRISPR-Cas9识别位点为23nt的序列，包含20nt的spacer序列以及位于所述spacer序列3’端的3nt的PAM序列；并且在所述生物体中，所述CRISPR-Cas9识别位点位于所述目标DNA片段的一侧，所述整合位点和第一重组位点分别位于所述目标DNA片段的两侧，并且，所述第一重组位点位于所述DNA片段与所述CRISPR-Cas9识别位点的之间。

根据一个实施方式，所述载体上还整合有第二重组位点，所述第二重组位点位于所述CRISPR-Cas9识别位点和整合位点之间，并且在所述生物体中，所述CRISPR-Cas9识别位点位于所述第一重组位点位于和所述第二重组位点之间。

优选地，所述载体具有第二抗性基因的编码序列及其表达元件，并且所述第二抗性基因的编码序列在所述第二重组位点和所述整合位点之间。

根据一个实施方式，所述载体包括pMB1、p15A、pSC101复制子的任一种或多种。上述复制子为低拷贝数的复制子，可以使得大片段的DNA比较稳定。

根据一个实施方式，所述载体包括一种或多种限制性内切酶的单一酶切位点。外源DNA片段可以通过这些酶切位点整合的载体上。

根据一个实施方式，所述载体为SG5复制子被删除的pCRISPR-Cas9载体。所述载体还可以是SG5复制子被删除的pKCCas9do载体。

附图说明

通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为根据本发明一个实施方式的方法的技术原理示意图；

图2为根据本发明另一个实施方式的方法的技术原理示意图；

图3为pCRISPR-Cas9载体的图谱；

图4为pNTU33101载体的图谱；

图5为天蓝色链霉菌M145菌株的act合成基因簇、整合位点以及重组位点的示意图；

图6为pNTU33102载体的图谱；

图7为携带目标DNA片段的质粒的酶切图谱；

图8为携带目标DNA片段的质粒的在目标DNA片段两端的测序结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。

本发明结合CRISPR/Cas9技术精确、高效的特点和同源重组技术简单易行的特点，发明了一种利用CRISPR/Cas9技术从生物体内直接克隆大片段目标DNA的方法，并将其应用于克隆链霉菌的基因簇，开创了一种新的克隆大片段目标DNA的方法。

所述生物体可为动物、植物或微生物等能够进行遗传操作的各种真核、原核生物，例如其注释基因含有大片段内含子和调控序列的生物体，或者是含有抗虫基因、抗病基因等功能基因的基因簇的生物体。遗传操作的方法包括转化、接合转移、转导和转染等。

所述生物体可为链霉菌，链霉菌是近半数抗生素的重要来源。链霉菌中抗生素合成基因往往成簇存在，因此克隆大片段DNA是挖掘天然产物资源的重要技术支撑。作为抗生素的重要来源的链霉菌包括，例如灰色链霉菌(链霉素产生菌)、阿维链霉菌(阿维菌素产生菌)、远青链霉菌(硫链丝菌素产生菌)、肉桂链霉菌(莫能菌素产生菌)、白色链霉菌(盐霉素产生菌)以及金色链霉菌(四环素产生菌)等。

所述目标DNA片段为所关注生物基因组上的一段DNA。所述目标DNA片段还可来源于细胞器，例如线粒体(线粒体DNA)、叶绿体(叶绿体DNA)，以及细菌和真菌的质粒。所述目标DNA片段可为大片段的调控序列，可以是含有大片段内含子和调控序列的基因，或者是基因簇，例如由功能相关基因构成的基因簇。这些功能相关的基因可以是在同一代谢物合成途径的合成或调控基因。这些代谢物包括具有抗虫、抗生素活性的次生代谢物等。

具体地，所述方法包括如下步骤：

(1)识别位于所述目标DNA片段的一侧的CRISPR-Cas9识别位点，所述CRISPR-Cas9识别位点为23nt的序列，包含20nt的spacer以及位于所述spacer序列的3’端的3nt的PAM序列；所述CRISPR-Cas9识别位点可位于目标DNA片段的侧翼序列中。

本领域中公知筛选CRISPR-Cas9识别位点的步骤，具体地，识别CRISPR-Cas9包括以下步骤：

i)鉴定位于所述DNA片段一侧的以5’-NGG-3’结尾的23nt序列(所述N是A、T、C或G)，包含spacer的20nt和PAM的3nt，将包含连续五个T的序列排除；

ii)将3’端的15个碱基，包含spacer的12nt和PAM的3nt，与所述生物体的基因组序列进行BLAST比对，排除不特异的序列；

iii)将选好的20nt spacer序列与sgRNA序列融合，用RNAfold服务器进行RNA二级结构的预测。

(2)识别分别位于所述DNA片段两侧的整合位点和第一重组位点，其中，所述第一重组位点位于所述DNA片段与所述CRISPR-Cas9识别位点的之间。整合位点全长序列和第一重组位点全长序列与基因组上的其他序列的一致性都不超过30％，从而避免基因组结构的紊乱，整合位点全长序列和第一重组位点全长序列与所述生物体的基因组序列进行BLAST比对，从而排除不特异的序列。

(3)将所述整合位点、所述CRISPR-Cas9识别位点以及所述第一重组位点克隆到载体中，所述CRISPR-Cas9识别位点在所述载体上的位置位于所述整合位点和所述第一重组位点之间。

可以使用基于同源片段的克隆方法，例如Clontech公司的In-fusion试剂盒，还有酵母组装方法TAR。优选使用Gibson Assembly方法进行克隆，Gibson Assembly方法的优点是简单，廉价。

所述载体具有Cas9的编码序列、sgRNA序列以及第一抗性基因的编码序列，其中所述Cas9编码序列是诱导型表达，所述抗性基因和sgRNA是组成型表达。所述载体可包括pMB1、p15A、pSC101复制子的任一种或多种，上述复制子为低拷贝数的复制子，可以使得大片段的DNA比较稳定。所述载体还可包括一种或多种限制性内切酶的单一酶切位点，以便于外源DNA通过这些酶切位点整合的载体上。这样的载体包括SG5复制子被删除的pCRISPR-Cas9载体，或者删除掉SG5复制子的pKCCas9do载体(该载体发表于Acta Biochim BiophysSin,2015,47(4),231～243。可以从addgene网站(http://www.addgene.org/)购得，编号为No.62552)。

(4)将所述spacer序列整合到所述载体上sgRNA序列的5’端；可以通过特异性限制性内切酶的酶切位点将所述spacer序列整合到所述载体上sgRNA序列的5’端。

(5)所述载体上的整合位点在所述生物体内与所述目标DNA片段一侧的整合位点发生同源重组，从而将所述载体整合到所述目标DNA片段所在的遗传物质上，然后通过所述第一抗性基因筛选发生载体整合的阳性克隆。所述载体可通过同源重组介导的质粒整合到所述DNA片段所在的基因组中。

所述整合位点的长度为2～3kb，所述第一重组位点的长度为300～700bp。这样确保了同源重组介导的质粒整合主要通过整合位点进行，而不在第一重组位点进行。

关于质粒整合的方法，对于链霉菌来说接合转移比较合适；对于其它生物，例如动物或者真菌，需要使用相应的遗传操作方法，比如转染和转化。

当所述生物体为链霉菌时，可以使用SG5复制子被删除的pCRISPR-Cas9载体；该载体含有oriT，负责接合转移时DNA在细胞之间穿梭。如果所述载体为SG5复制子被删除的pCRISPR-Cas9载体，则用安普霉素进行筛选。

(6)诱导所述阳性克隆的Cas9编码序列的表达，然后使得分别位于CRISPR-Cas9系统切割的产生的同一片段两端的两个所述第一重组位点之间发生同源重组，生成包含所述目标DNA片段的质粒。如果所述载体为SG5复制子被删除的pCRISPR-Cas9载体，则用硫链丝菌素(Tsr)诱导CRISPR-Cas9系统的表达。

(7)提取质粒，通过所述第一抗性基因筛选获得携带所述目标DNA片段的质粒。如果所述载体为SG5复制子被删除的pCRISPR-Cas9载体，则用安普霉素进行筛选。

如图1所示，根据上述实施方式的方法包括如下步骤：

(1)识别位于所述目标DNA片段的一侧的CRISPR-Cas9识别位点(*)、整合位点(1)、第一重组位点(2)。所述DNA片段与这些位点在染色体上的顺序为整合位点(1)、目标DNA片段、第一重组位点(2)和CRISPR-Cas9识别位点，它们的顺序还可以相反。

(2)将CRISPR-Cas9识别位点(*)、整合位点(1)和第一重组位点(2)克隆并整合到载体上，这些位点在载体上的顺序为整合位点(1)、CRISPR-Cas9识别位点和第一重组位点(2)，它们的顺序还可以相反。

(3)所述载体的序列通过同源重组整合到染色体上；

(4)诱导CRISPR-Cas9系统的表达，切割两个CRISPR-Cas9识别位点；

(5)CRISPR-Cas9系统切割产生携带目标DNA的片段，其通过第一重组位点(2)之间发生的同源重组，生成携带目标DNA的载体。

根据一个实施方式，所述方法还可以包括识别位于所述DNA片段一侧的第二重组位点，其中，所述CRISPR-Cas9识别位点位于所述第一重组位点位于和所述第二重组位点之间，并且在步骤(3)中将所述第二重组位点也整合到所述载体中，其中所述第二重组位点在所述载体上位于所述整合位点和所述CRISPR-Cas9识别位点之间；在步骤(6)中，使得位于CRISPR-Cas9系统切割的产生的不同片段末端的两个所述第二重组位点之间发生同源重组。这样，可以在克隆所述DNA片段的同时，获得目标DNA片段被敲除的生物体。第二重组位点的全长序列与基因组上的其他序列的一致性不超过30％，从而避免基因组结构的紊乱，第二重组位点的序列与所述生物体的基因组序列进行BLAST的比对，从而排除不特异的序列。

优选地，所述载体具有第二抗性基因的编码序列及其表达元件，并且所述第二抗性基因的编码序列在所述载体上位于所述第二重组位点和所述整合位点之间，这样可以通过第二抗性基因筛选通过第二重组位点发生的同源重组。

如图2所示，根据本发明一个实施方式的方法包括如下步骤：

(1)识别位于所述目标DNA片段的一侧的CRISPR-Cas9识别位点(4)、整合位点(1)、第一重组位点(2)和第二重组位点(3)。所述DNA片段与这些位点在染色体上的顺序为整合位点(1)、目标DNA片段、第一重组位点(2)、CRISPR-Cas9识别位点和第二重组位点(3)，它们的顺序还可以相反。

(2)将CRISPR-Cas9识别位点(4)、整合位点(1)、第一重组位点(2)和第二重组位点(3)克隆并整合到载体上，这些位点在载体上的顺序为整合位点(1)、第二重组位点(3)、CRISPR-Cas9识别位点和第一重组位点(2)，它们的顺序还可以相反。

(3)所述载体的序列通过同源重组整合到染色体上；

(4)诱导CRISPR-Cas9系统的表达，切割CRISPR-Cas9识别位点；

(5)CRISPR-Cas9系统切割生成携带目标DNA的片段以及被打断的染色体序列，两者分别通过第一重组位点(2)和第二重组位点(3)位点发生同源重组，生成携带目标DNA的载体和目标DNA被敲除的染色体。

应当注意，尽管在附图中以特定顺序描述了本发明方法的操作，但是，这并非要求或者暗示必须按照该特定顺序来执行这些操作，或是必须执行全部所示的操作才能实现期望的结果。相反，流程图中描绘的步骤可以改变执行顺序。附加地或备选地，可以将多个步骤合并为一个步骤执行，和/或将一个步骤分解为多个步骤执行。

本发明还提供了用于从生物体内克隆目标DNA片段的载体，其中，所述载体包括Cas9的编码序列、sgRNA序列以及第一抗性基因的编码序列，其中所述Cas9编码序列是诱导型表达，所述抗性基因和sgRNA是组成型表达；并且所述载体上具有整合位点、CRISPR-Cas9识别位点以及第一重组位点，所述CRISPR-Cas9识别位点在所述载体上的位置位于所述整合位点和所述第一重组位点之间，其中所述CRISPR-Cas9识别位点为23nt的序列，包含20nt的spacer序列以及位于所述spacer序列3’端的3nt的PAM序列；并且在所述生物体中，所述CRISPR-Cas9识别位点位于所述目标DNA片段的一侧，所述整合位点和第一重组位点分别位于所述目标DNA片段的两侧，并且，所述第一重组位点位于所述DNA片段与所述CRISPR-Cas9识别位点的之间。所述载体上还整合有第二重组位点，所述第二重组位点位于所述CRISPR-Cas9识别位点和所述目标DNA片段之间，并且在所述生物体中，所述CRISPR-Cas9识别位点位于所述第一重组位点位于和所述第二重组位点之间。优选地，所述载体具有第二抗性基因的编码序列及其表达元件，并且所述第二抗性基因的编码序列在所述第二重组位点和所述整合位点之间。

图6显示了根据本发明一个实施方式的载体的示意图，所述载体命名为pNTU33102。所述载体具有Cas9的编码序列、sgRNA序列、第一抗性基因安普霉素抗性蛋白位点acc(3)Ⅳ的编码序列以及第二抗性基因tsr抗性基因的编码序列，其中，所述Cas9编码序列具有响应Tsr的tipA启动子。所述载体还具有Stu I、Nco I和SnaB I的酶切位点。spacer序列通过Nco I和SnaB I的酶切位点插入到了sgRNA序列的5’端。整合位点(1)、第一重组位点(2)、CRISPR-Cas9识别位点(4)、和第二重组位点(3)以所述顺序通过Gibson AssemblyDNA组装方法整合到载体的Stu I位点。所述载体还可以由删除掉SG5复制子的pKCCas9do载体经遗传操作后获得。

实施例1，利用CRISPR-Cas9技术从天蓝色链霉菌中直接克隆act基因簇的方法。

使用的试剂和载体等

pCRISPR-Cas9(ACS Synth.Biol.,2015,4(9),1020–1029页；Genbank登陆号KR011749，图3)载体来源于丹麦技术大学(Technical University of Denmark)TilmannWeber教授实验室。也可以根据Genbank公布的载体序列自行合成该载体。

天蓝色链霉菌M145菌株是广泛使用的链霉菌研究的模式菌株。本发明的天蓝色链霉菌M145菌株来源于ATCC菌种保藏库(保藏编号ATCC BAA-471)。

本实施例从天蓝色链霉菌M145菌株直接克隆了act合成基因簇。包括以下步骤：

1、改造pCRISPR-Cas9载体，删除其中的SG5复制子(位于载体的9627～11069bp)，使该载体在链霉菌中无法自主复制。新载体命名为pNTU33101(图4)。该载体的抗性筛选标记为安普霉素，该载体的CRISPR-Cas9系统的表达受到硫链丝菌素诱导。具体步骤如下：

用pCRISPR-Cas9载体作为模板，引物1和引物2进行PCR。

引物1(5’-3’)：gcgttcaagggccgaaagccgagggtctgcctgccgtgaggt

引物2(5’-3’)：tcggctttcggcccttgaacgcctcgttcagcgacaccgtct

PCR使用东洋纺(TOYOBO)的KOD plus(货号KOD-211)。

PCR反应体系为50μL：

PCR的条件如下：

预变性：94℃2分钟

30个循环：变性98℃10秒

延伸68℃10分钟

PCR产物回收后转化感受态的大肠杆菌即可以得到删除SG5复制子的pCRISPR-Cas9载体。大肠杆菌可以是任何商业化的载体克隆用大肠杆菌，例如Top10、DH5α、JM109等。

2、识别在目标DNA片段--天蓝色链霉菌act基因簇的侧翼序列中的CRISPR-Cas9识别位点(4)，并且选取合适的整合位点(1)、第一重组位点(2)和第二重组位点(3)。这4个位点在天蓝色链霉菌基因组(Genebank登陆号：NC_003888)上的位置和大小分别为：

整合位点(1)：5509957～5512067，大小：2111bp

第一重组位点(2)：5534737～5535274，大小：541bp

第二重组位点(3)：5535361～5535887，大小：527bp

CRISPR-Cas9识别位点(4)：5535275～5535297，大小：23nt

CRISPR-Cas9识别位点(4)位于重组位点2和3之间，包含20nt的spacer序列和3nt的PAM序列(CGG)。

图5显示了M145菌株的act合成基因簇，以及CRISPR-Cas9识别位点(4)、整合位点(1)、第一重组位点(2)和第二重组位点(3)在染色体上的位置示意图，其中，灰色背景表示spacer序列，PAM序列添加下划线。每一个带箭头的方框代表一个基因，其中基因SCO5072和SCO5092涂黑显示。

3、按照原始载体已经发表的方法(ACS Synth.Biol.,2015,4(9),1020–1029页)，将spacer克隆至Nco I和SnaB I酶切位点之间。

克隆spacer所用的引物为：

引物3(5’-3’)：

CATGCCATGGcacgcggttcgcccgttcgaGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

(下划线是Nco I的酶切位点，小写的碱基是spacer序列)

引物4(5’-3’)：

ACGCCTACGTAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCC

(下划线是SnaB I的酶切位点)

PCR使用东洋纺(TOYOBO)的KOD plus(货号KOD-211)。

PCR反应体系为50μL:

PCR的条件如下：

预变性：94℃2分钟

30个循环：变性98℃10秒

退火58℃30秒

延伸68℃10秒，

然后直接取1μL的PCR产物进行酶切，10μL的酶切体系(Fermentas)：

将pNTU33101进行酶切(Fermentas)，50μL体系：

将pNTU33101酶切产物进行电泳，并回收质粒片段(约10Kb)。取2μL引物3和4的PCR酶切产物，取1μL pNTU33101酶切回收产物进行连接，使用TAKARA连接试剂盒Solution I(货号6022)3μL，最终体系为6μL，反应5分钟，转化大肠杆菌，然后筛选阳性克隆。

4、通过Gibson Assembly DNA方法，将CRISPR-Cas9识别位点(4)、整合位点(1)、第一重组位点(2)和第二重组位点(3)整合到载体上。其中，模板是天蓝色链霉菌M145菌株的基因组DNA。利用已经广泛使用的Gibson Assembly DNA组装方法将三条PCR产物整合到连接有spacer的pNTU33101载体中的Stu I位点，得到的载体命名为pNTU33102(图5)。

克隆整合位点(1)所用的引物为：

引物5(5’-3’)：tctcgtcgaaggcactagaagggaagagggcaacctctacctggtc

引物6(5’-3’)：

tgcgaagctggcGAGGGGTTGTTGCTGAACATCTTGAC

克隆第二重组位点(3)所用的引物为：

引物9(5’-3’)：CAACAACCCCTCgccagcttcgcacctcctccccga

引物10(5’-3’)：

gcgggcggctgctggtcgtc

克隆第一重组位点(2)所用的引物为：

引物7(5’-3’)：

cccggtgttcgacagttgcggcgag

引物8(5’-3’)：

ggtcgatccccgcatataggGTGCTCGACGCCTGCACCGACCT

Cas9识别位点4是通过引物合成在PCR过程中引入的，具体地，引物7黑体下划线部分为spacer的部分序列，PAM的部分序列用方框标出，引物10中黑体下划线部分为spacer的反向互补序列，PAM反向互补的部分序列用方框标出。

PCR使用东洋纺(TOYOBO)的KOD plus(货号KOD-211)。

PCR反应体系为50μL：

PCR的条件如下：

预变性：94℃2分钟

30个循环：变性98℃10秒

退火58℃30秒

延伸68℃2分钟

连接有spacer的pNTU33101载体中用Stu I(Fermentas货号FD0424)进行酶切，10μL体系：

Gibson Assembly使用NEB的2×预混反应体系(货号E2611S)，20μL，于50℃反应1小时：

反应产物转化大肠杆菌，并筛选阳性克隆。

5、利用接合转移的方法将载体pNTU33102整合到天蓝色链霉菌基因组中(实验步骤参见Tobias Kieser,Mervyn J.Bibb,Mark J.Buttner,Keith F.Chater,DavidA.Hopwood,Practical Streptomyces Genetics,John Innes Foundation(2000),249-250页)，即将pNTU33102质粒导入到感受态的天蓝色链霉菌M145菌株中。

接合转移实验步骤为：

(1)天蓝色链霉菌新鲜孢子悬浮于1mL无菌水中。

(2)50℃水浴热激10分钟后置于室温。

(3)将含有pNTU33102质粒的大肠杆菌ET12567菌株(链霉菌实验室广泛使用)过夜培养物在加入等体积的孢子悬液中。

(4)涂布MS培养基平板，于28℃培养。

(5)培养14小时后，用含有0.5mg萘啶酮酸和1mg安普霉素的1mL无菌水覆盖培养基，静置晾干后于28℃培养4～5天，待接合子长出后，筛选具有安普霉素抗性的接合子。因为质粒因为无法自主复制，必须与染色体重组，所以可以用安普霉素筛选到接合转移的接合子。

MS培养基(1L)：甘露醇(Mannitol)20克、黄豆饼粉20克、琼脂粉20克。

6、用YEME液体培养基培养具有安普霉素抗性的接合子，在28℃培养48小时后，加入1μM硫链丝菌素诱导CRISPR-Cas9系统，目标DNA片段两侧的Cas9的识别位点4均被切割，生成携带目标DNA的片段以及被打断的染色体序列，两者分别通过第一重组位点(2)和第二重组位点(3)位点发生同源重组，生成携带目标DNA的载体和目标DNA被敲除的染色体。

YEME培养基(1L)：酵母浸粉(Yeast Extract)3克，细菌蛋白胨(Bacto-peptone)5克，麦芽提取物(Malt Extract)3克，葡萄糖10克，蔗糖100克。

7、提取质粒，将所述质粒重新转入大肠杆菌中，涂布在含有安普霉素的平板上，对得到的克隆进行筛选，获得携带目标DNA片段的克隆。阳性克隆的酶切和测序验证

提取阳性克隆的质粒，跑电泳，根据质粒条带大小鉴定对得到的克隆，筛选含有捕获大片段的克隆。对阳性克隆提取质粒，进一步酶切(图7)和测序验证(图8)。图7中，左图为BamHI酶切鉴定结果，右图为BglⅡ和StuI双酶切鉴定结果。图8显示了对携带目标DNA片段的质粒的目标DNA片段两端的测序结果。从图7和图8中可以看出，目标DNA片段已经克隆到了载体上。

本发明结合CRISPR/Cas9技术精确、高效的特点和同源重组技术简单易行的特点，开创了一种利用CRISPR/Cas9技术从生物体内直接克隆大片段目标DNA的方法。所述方法步骤简单，成本低，效率高，特别适用从生物体中克隆大的目标DNA片段。

以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。

Claims (10)

1.一种从生物体内克隆目标DNA片段到载体上的方法，包括如下步骤：

(1)识别位于所述目标DNA片段一侧的CRISPR-Cas9识别位点，所述CRISPR-Cas9识别位点为23nt的序列，包含20nt的spacer序列以及位于所述spacer序列3’端的3nt的PAM序列；

(2)识别分别位于所述目标DNA片段两侧的整合位点和第一重组位点，其中，所述第一重组位点位于所述目标DNA片段与所述CRISPR-Cas9识别位点的之间；

(3)将所述整合位点、所述CRISPR-Cas9识别位点以及所述第一重组位点克隆到所述载体中，其中，所述CRISPR-Cas9识别位点在所述载体上的位置位于所述整合位点和所述第一重组位点之间，且所述CRISPR-Cas9识别位点的一端连接所述整合位点，另一端连接所述第一重组位点，其中，所述载体具有Cas9的编码序列、sgRNA序列以及第一抗性基因的编码序列，其中所述Cas9编码序列是诱导型表达，所述第一抗性基因的编码序列和所述sgRNA序列是组成型表达；

(4)将所述spacer序列克隆到所述载体上sgRNA序列的5’端；

(5)所述载体上的整合位点在所述生物体内与所述目标DNA片段一侧的整合位点发生同源重组，从而将所述载体整合到所述目标DNA片段所在的遗传物质上，然后通过所述第一抗性基因筛选发生载体整合的阳性克隆；

(6)诱导所述阳性克隆的Cas9编码序列的表达，切割分别位于所述目标DNA片段两侧的两个CRISPR-Cas9识别位点，然后分别位于CRISPR-Cas9系统切割产生的同一个DNA片段两端的两个所述第一重组位点之间发生同源重组，生成包含所述目标DNA片段的质粒；

(7)提取所述质粒，通过所述第一抗性基因筛选获得携带所述目标DNA片段的质粒。

2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括：

识别位于所述目标DNA片段一侧的第二重组位点，其中，所述CRISPR-Cas9识别位点位于所述第一重组位点位于和所述第二重组位点之间；并且

在步骤(3)中将所述第二重组位点也整合到所述载体中，其中所述第二重组位点在所述载体上位于所述整合位点和所述CRISPR-Cas9识别位点之间，且所述整合位点、所述第二重组位点、所述CRISPR-Cas9识别位点和所述第一重组位点依次连接；

在步骤(6)中，位于所述CRISPR-Cas9系统切割产生的片段末端的两个所述第二重组位点之间发生同源重组。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述载体包括pMB1、p15A、pSC101复制子的任一种或多种，以及一种或多种限制性内切酶的单一酶切位点。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述载体为SG5复制子被删除的pCRISPR-Cas9载体，并且步骤(5)和步骤(7)中用安普霉素进行筛选，步骤(6)中用硫链丝菌素诱导所述Cas9编码序列的表达。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述目标DNA片段包括大片段的调控序列、含有大片段内含子和调控序列的基因、或者由功能相关基因构成的基因簇。

6.根据权利要求2所述的方法，其中，所述整合位点的长度为2～3kb，所述第一重组位点和所述第二重组位点的长度为300～700bp。

7.一种用于从生物体内克隆目标DNA片段的载体，其中，所述载体包括Cas9的编码序列、sgRNA序列以及第一抗性基因的编码序列，其中所述Cas9编码序列是诱导型表达，所述抗性基因和sgRNA是组成型表达；

所述载体上具有整合位点、CRISPR-Cas9识别位点以及第一重组位点，所述CRISPR-Cas9识别位点在所述载体上的位置位于所述整合位点和所述第一重组位点之间，且所述CRISPR-Cas9识别位点的一端连接所述整合位点，另一端连接所述第一重组位点，其中

所述CRISPR-Cas9识别位点为23nt的序列，包含20nt的spacer序列以及位于所述spacer序列的3’端的3nt的PAM序列；并且

在所述生物体中，所述CRISPR-Cas9识别位点位于所述目标DNA片段的一侧，所述整合位点和第一重组位点分别位于所述目标DNA片段的两侧，并且所述第一重组位点位于所述DNA片段与所述CRISPR-Cas9识别位点的之间；

所述载体上的整合位点在所述生物体内与所述目标DNA片段一侧的整合位点发生同源重组，从而将所述载体整合到所述目标DNA片段所在的遗传物质上；分别位于CRISPR-Cas9系统切割产生的同一个DNA片段两端的两个所述第一重组位点之间发生同源重组，以生成包含所述目标DNA片段的质粒。

8.根据权利要求7所述的载体，其中，所述载体上还整合有第二重组位点，其中，所述第二重组位点在所述载体上位于所述整合位点和所述CRISPR-Cas9识别位点之间，且所述整合位点、所述第二重组位点、所述CRISPR-Cas9识别位点和所述第一重组位点依次连接；

并且在所述生物体中，所述CRISPR-Cas9识别位点位于所述第一重组位点位于和所述第二重组位点之间；

其中，位于所述CRISPR-Cas9系统切割产生的片段末端的两个所述第二重组位点之间发生同源重组，以生成包含所述目标DNA片段的质粒。

9.根据权利要求7或8所述的载体，其中，所述载体包括pMB1、p15A、pSC101的任一种或多种复制子，以及一种或多种限制性内切酶的单一酶切位点。

10.根据权利要求7或8所述的载体，其中，所述载体为SG5复制子被删除的pCRISPR-Cas9载体。

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