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CN108697772B - 用于治疗视网膜病的组合物和方法 - Google Patents

用于治疗视网膜病的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于治疗视网膜病的方法，所述方法包括向对象施用有效量的Na/K ATP酶/Src受体复合物的多肽拮抗剂。所述视网膜病可包括糖尿病性视网膜病。本发明还提供了减少视网膜脉管系统中血管生成的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用、例如通过玻璃体内注射来施用Na/K ATP酶/Src受体复合物的多肽拮抗剂的步骤。

Description

用于治疗视网膜病的组合物和方法
相关申请
本申请要求2015年12月30日提交的美国临时申请序列号62/273,224的优先权，其全部公开内容通过该引用并入本文中。
政府利益
本发明是在国立卫生研究院(National Institute of Health)授予的资助号HL109015下由政府支持完成的。政府在本发明中享有一定权利。
技术领域
本公开的主题涉及用于治疗视网膜病和/或减少视网膜脉管系统中血管生成的组合物和方法。特别地，本公开的主题涉及多肽和利用所述多肽治疗视网膜病和/或减少视网膜脉管系统中血管生成的方法。
背景技术
Na/K-ATP酶在大多数真核细胞中普遍表达，并通过将Na+泵出细胞和将K+泵入细胞来帮助维持跨膜离子梯度。Na/K-ATP酶经由至少两个结合基序直接与Src相互作用：一个位于α1亚基的CD2和Src SH2之间；而另一个涉及第三胞质结构域(CD3)和Src激酶结构域。这种Na/K-ATP酶和Src复合物的形成充当乌本苷(ouabain)的受体以激发蛋白激酶级联。具体地，乌本苷与Na/K-ATP酶的结合将破坏后者的相互作用，然后导致不同途径的组装和激活，所述途径包括ERK级联、PLC/PKC途径和ROS产生。此外，这种相互作用使Src保持在非活性状态。因此，Na/K-ATP酶起到内源性负Src调节剂的功能。还参见国际专利申请号WO 2008/054792和WO 2010/071767，二者都通过引用并入本文。
Src家族激酶是52-62-kDa膜相关非受体酪氨酸激酶，并且它们响应各种细胞外配体，参与几种酪氨酸磷酸化相关的信号传导途径。例如，Src含有至少三个蛋白质相互作用结构域。SH3结构域与多聚脯氨酸基序结合，并且SH2结构域与磷酸化酪氨酸残基相互作用。所述激酶结构域与核苷酸反应并使底物磷酸化。蛋白质配体与SH3或SH2结构域的结合可以激活Src。还报道了与Src的激酶结构域结合的蛋白质能够调节Src活性。
还应理解，Na+/K+-ATP酶与Src和Src家族激酶相互作用而形成功能性受体。乌本苷与该受体的结合激活Src，Src进而使各种效应物磷酸化，导致不同途径包括Ras/Raf/ERK1/2和磷酸酶C/蛋白激酶C级联的组装和活化，以及细胞内Ca2+和细胞ROS产生增加。这些信号传导途径的激活最终导致改变心脏和肾脏功能、刺激细胞增殖和组织纤维化、保护组织抵抗缺血/再灌注损伤、抑制癌细胞生长等等。Src和ROS也参与VEGF表达的诱导。虽然许多已知的Src和Src家族激酶抑制剂被开发为ATP类似物，同ATP竞争与这些激酶的结合，但这样的Src抑制剂缺乏途径特异性。
另外，许多类型的视网膜病是增殖性的，最经常由新生血管化(neovascularization)或血管过度生长引起。血管生成是可能导致失明或严重视力丧失的视网膜病的前兆。糖尿病性视网膜病(DR)是糖尿病的并发症，并且是发达国家中工作年龄成人失明的主要原因。2012年全世界有超过3.71亿糖尿病患者，并且这一数字正在迅速增加。该疾病由高葡萄糖诱导的血管功能障碍和重塑引发。随后因为VEGF和其他生长因子的产生增加引起组织缺血/缺氧和后续的血管生成(新生血管化)，导致增生性糖尿病性视网膜病(PDR)。此外，在糖尿病性视网膜病的病理条件下，ROS增加和Src激活是VEGF介导的内皮细胞增殖和血管渗漏的关键，VEGF介导的内皮细胞增殖和血管渗漏是糖尿病新生血管化的病理基础。由于组织纤维化，DR可进一步发展为视网膜表面上的纤维血管增生，引起视网膜脱离。
尽管DR的管理取得了相当大的进步，但各种疗法的并发症已经带来了对治疗DR的新方式的需求。以前的研究已经表明了VEGF在眼部新生血管化中的重要作用。在动物模型和PDR患者中，眼部VEGF的水平升高。此外，将VEGF注射到正常的灵长类动物眼睛中引起了类似于DR中所见的病理过程，包括微动脉瘤形成和血管通透性增加。因为VEGF已经显示出在视网膜新生血管化中起重大作用，所以已经开发了针对DR的抗VEGF治疗。在过去的10年中，已开发出几种抗VEGF药物并用于PDR患者。
许多临床研究已经证明了玻璃体内注射抗VEGF药物对PDR的益处。然而，仍有许多重要问题。首先，抗VEGF疗法没有解决该问题的根本原因(即，由于这些患者中不受控制的糖尿病导致的高葡萄糖和持续的血管重塑/纤维化)。其次，已经注意到抗VEGF治疗的临床问题部分是由于抗VEGF抗体的使用。一些观察到的副作用包括白内障形成增加、玻璃体出血、牵拉性视网膜脱离、眼内压升高、感染和黄斑裂孔。而且，有证据表明在体循环中检测到一些注射的抗VEGF抗体，这可能产生更严重的全身副作用。因此，目前对患有糖尿病性视网膜病的患者的护理存在未满足的需求，并且特别地，仍然需要用于治疗糖尿病性视网膜病的组合物和方法。
发明内容
本公开的主题满足了一些或全部上述认定的需求，在本领域普通技术人员研究本文件中提供的信息之后，这一点将变得明显。
本概要描述了本公开的主题的若干实施方式，并且在很多情况下列出了这些实施方式的变化和排列。本概要仅仅是众多并且变化的实施方式的示例。提及所给出的实施方式的一个或多个代表性特征同样是示例性的。这样的实施方式通常可在有或没有所提到的特征下存在；同样地，那些特征可应用于本公开主题的其他实施方式，不管在本概要中是否列出。为避免过度重复，本概要未列出或提出这样的特征的所有可能组合。
本公开的主题包括用于治疗视网膜病和/或减少视网膜脉管系统中血管生成的组合物和方法。特别地，本公开的主题包括利用多肽治疗视网膜病和/或减少视网膜脉管系统中血管生成的方法。在一些实施方式中，所述视网膜病是糖尿病性视网膜病。在一些实施方式中，所述多肽通过抑制Na/K-ATP酶和Src复合物的受体功能来治疗视网膜病和/或减少视网膜脉管系统中的血管生成，而在一些实施方式中，所述多肽通过充当Na/K-ATP酶和Src复合物的拮抗剂来抑制所述受体功能。
在一些实施方式中，提供了用于治疗视网膜病和/或减少视网膜脉管系统中血管生成的方法，所述方法包括向有此需要的对象施用有效量的Na/K ATP酶/Src受体复合物的多肽拮抗剂。在一些实施方式中，所述多肽拮抗剂包含SEQ ID NO：1的序列、或其片段和/或变体。在一些实施方式中，所述多肽拮抗剂还包含由选自SEQ ID NO：2-4的氨基酸序列编码的细胞穿透多肽。在一些实施方式中，施用所述多肽包括玻璃体内施用、结膜下施用、前房内施用、眼内施用或其组合。
进一步关于用于在本文中使用所描述的多肽拮抗剂的施用，在一些实施方式中，施用所述多肽拮抗剂(例如SEQ ID NO：1的多肽)减轻了一个或多个与视网膜病相关的症状和/或特征。例如，在一些实施方式中，施用所述多肽拮抗剂减少了对象眼中的细胞增殖。在一些实施方式中，施用所述多肽拮抗剂减少了对象眼中的血管内皮生长因子(VEGF)表达、血管生成和/或毛细管形成。此外，在一些实施方式中，施用所述多肽拮抗剂减少了对象眼中的新生血管化。
在研究了本文件中的描述、附图和非限制性实施例之后，本发明的其他特征和优点对于本领域普通技术人员而言将变得明显。
附图说明
图1包括的图表显示了浓度递增的本公开主题的Na/K ATP酶/Src受体多肽拮抗剂(pNaKtide)在24小时期间内对人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)增殖的作用。细胞的增殖通过溴脱氧尿苷(BrdU)分析进行测量。每个样品一式两份进行测试，并且所述BrdU分析独立进行3次。值是平均值±SEM，b和c分别指示与对照相比p<0.05和p<0.01。
图2A-2B包括的图像和图表显示了递增的pNaKtide浓度对小鼠HRMEC中血管生成的作用。图2A中的对照图组(最上面的图组)显示HRMEC在基质胶(Matrigel)上形成稳固的血管生成性小管的网络。下部三个图组显示了递增的pNaKtide对HRMEC的芽生式血管生成的结果，其中每个图组显示了来自各样品的三张代表性照片。图2B是显示来自经由Image J产生的基质胶分析的定量数据的图表。值是平均值±SEM，并且*指示p<0.05。每个样品一式两份进行测试，并且所述基质胶分析独立进行3次。
图3A-3B包括的图表和图像显示了pNaKtide处理对小鼠肿瘤异种移植模型中VEGF表达和血管形成的作用。PNaKtide处理是每2天腹膜内施用2或10mg/kg。图3A显示了用盐水或pNaKtide处理的肿瘤匀浆中VEGF表达的蛋白质印迹结果。该研究的定量结果在图表中显示，并显示了pNaKtide处理产生了总VEGF中大于50％的下降。*，p<0.05；**，p<0.01。图3B包括pNaKtide对血管生成的作用的研究结果。异种移植肿瘤的血管密度的图像通过福尔马林固定、石蜡包埋的异种移植肿瘤(盐水组14个和10mg/kg pNaKtide组6个)中的CD31的IHC染色进行评价。该图表提供了按被血管占据的肿瘤面积的百分比计算的血管密度的定量结果。
图4-8包括的视网膜脉管系统图像和图表显示了pNaKtide对氧诱导的视网膜病(OIR)的小鼠模型中新生血管化的作用。图4是正常对照的视网膜脉管系统的图像，其留在室内空气中(比例尺＝100μm)。图5包括pNaKtide对新生血管化的研究中OIR小鼠视网膜脉管系统的图像(比例尺＝100μm)。图6包括的视网膜脉管系统的图像显示了玻璃体内注射1μl的pNaKtide(0.25μg/μl)(比例尺＝100μm)对OIR小鼠模型的作用。图7包括OIR中视网膜血管覆盖的定量图表，按视网膜总面积的百分比计。数据表示为平均值±SEM，使用双尾Student t检验评估统计学差异，p值小于0.05被认为是显著的，**p<0.01。图8包括OIR中视网膜新生血管化的定量图表，按视网膜总面积的百分比计。数据表示为平均值±SEM，使用双尾Student t检验评估统计学差异，p值小于0.05被认为是显著的，**p<0.01。
序列表简要说明
SEQ ID NO：1是符合本公开主题的多肽(NaKtide)的实施方式的编码氨基酸序列；
SEQ ID NO：2是TAT细胞穿透肽的编码氨基酸序列；
SEQ ID NO：3是穿膜肽(penetratin)(AP)细胞穿透肽的编码氨基酸序列；和
SEQ ID NO：4是Na/K-ATP酶的α1亚基(A1N)的N-端聚赖氨酸结构域的编码氨基酸序列。
SEQ ID NO：5是另一种根据本公开主题的多肽(pNaKtide)的实施方式的氨基酸序列。
具体实施方式
本文件中阐述了本公开主题的一个或多个实施方式的细节。在研究本文件中提供的信息之后，对本文件中描述的实施方式的修改，以及其他实施方式，对本领域普通技术人员而言将是明显的。提供本文件中所提供的信息，并且特别是所描述的示例性实施方式的具体细节，主要是为了清楚理解，并且不应从中理解不必要的限制。
本公开的主题包括用于治疗视网膜病和/或减少视网膜脉管系统中血管生成的组合物和方法。特别地，本公开的主题包括多肽和利用所述多肽治疗视网膜病和/或减少视网膜脉管系统中血管生成的方法。
本文所用的术语“视网膜病”包括全身性疾病的眼部表现，如在糖尿病、动脉高压、视网膜静脉或动脉阻塞、镰状细胞病或动脉高血压以及早产儿视网膜病(ROP)、放射性视网膜病、镰状细胞病中看到的。在一些情况下，并且如下文进一步详细描述的，这样的视网膜病可以由血管生成性毛细管形成、血管形成、细胞增殖、血管内皮生长因子(VEGF)表达中的一种或多种水平及其组合来表征。
在本公开主题的一些实施方式中，用于在对象的视网膜脉管系统中治疗视网膜病和/或减少血管生成的多肽抑制Na/K-ATP酶和Src复合物的受体功能。在一些实施方式中，所述多肽是Na/K-ATP酶和Src复合物的受体功能的拮抗剂。在一些实施方式中，所述多肽由SEQ ID NO：1的序列(NaKtide)、或其片段和/或变体组成。
术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”在本文中可互换地用来指称蛋白质氨基酸的聚合物，不管它的大小或功能如何。术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换地用来还指称氨基酸聚合物的基因产物、同系物、直系同源物、旁系同源物、片段、任何蛋白酶衍生的肽(片段)、和其他等效物、变体和类似物。术语“多肽片段”或“片段”当涉及这样的参比多肽使用时，是指其中与所述参比多肽本身相比氨基酸残基缺失、但其中剩余的氨基酸序列通常与所述参比多肽的对应位置一致的的多肽。这样的缺失可能出现在所述参比多肽的氨基端、所述参比多肽的羧基端、或二者。多肽片段也可以包括“功能片段”在内，在这种情况下所述片段保留所述参比多肽的一些或全部活性。
术语“变体”，用于本文中时，是指与所述参比多肽有一或多个氨基酸差异的氨基酸序列。在一些实施方式中，变体多肽可以与参比多肽相差一个或多个氨基酸替换。例如，NaKtide多肽变体可与SEQ ID NO：1的NaKtide多肽相差一个或多个氨基酸替换，即突变。对此，包含两个或更多个突变的组合的多肽变体可分别被称为双重突变体、三重突变体等。要认识到，某些突变可引起多肽功能的显著改变，而其他突变在所述多肽的功能上将引起很少乃至觉察不出的改变。
在一些实施方式中，本发明的多肽包括与SEQ ID NO：1的pNaKtide多肽共有至少75％同源性的多肽。在一些实施方式中，所述多肽与SEQ ID NO：1的NaKtide多肽共有至少85％同源性。在一些实施方式中，所述多肽与SEQ ID NO：1的NaKtide多肽共有至少90％同源性。在一些实施方式中，所述多肽与SEQ ID NO：1的NaKtide多肽共有至少95％同源性。
“同一性百分比”或“同源性百分比”当在本文中用于相对于参比序列描述氨基酸序列或核酸序列时，可利用由Karlin和Altschul描述的公式确定(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268，1990，如Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877，1993修改)。这样的公式被结合在Altschul等(J.Mol.Biol.215：403-410，1990)的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序中。
在本公开的多肽的一些实施方式中，所述多肽还包含一个或多个前导序列，并且在一些实施方式中，前导序列包括但不限于细胞穿透肽(CPP)。术语“细胞穿透肽”(CPP)在本文中用于泛指在细胞中发现的促进分子货物跨质膜转运的短肽。在一些情况下，所述分子货物包括其他多肽，例如在本文中描述的多肽。当然，所述细胞穿透肽可以经由许多手段包括共价键和/或非共价键与所述分子货物(例如多肽)接合。然而，在许多情况下，这样的细胞穿透肽将经常包括比较高浓度的带正电荷的氨基酸，例如赖氨酸和精氨酸，并且将具有下述序列，所述序列含有带电荷(极性)和不带电荷的氨基酸的交替模式。
在本公开主题的一些实施方式中，示例性前导序列或细胞穿透肽可包括反式激活转录激活因子(TAT)细胞穿透肽，其由SEQ ID NO：2(GRKKRRQRRRPPQ)的序列表示。另一个示例性的前导序列包括穿膜肽(AP)，其由SEQ ID NO：3(RQIKIWFQNRRMKWKK)的序列表示。又一个示例性的前导序列包括Na/K-ATP酶的α1亚基(A1N)的N端聚赖氨酸结构域(A1N)的编码氨基酸序列，其由SEQ ID NO：4(KKGKKGKK)的序列表示。不过，普通技术人员将领会，其他前导序列，包括其他细胞穿透肽，也可以连同本公开的多肽一起使用。在一些实施方式中，包含与SEQ ID NO：1的NaKtide序列连接的前导序列例如细胞穿透肽的多肽在本文中被称为pNaKtide(例如，SEQ ID NO：5；GRKKRRQRRRPPQSATWLALSRIAGLCNRAVFQ，其包含与SEQ IDNO：1的NaKtide序列融合的SEQ ID NO：2的TAT细胞穿透肽)。
本公开的主题还包括和使用包含本文中描述的多肽以及可药用载体的药物组合物。实际上，当在本文中提到某些实施方式时，术语“多肽”和/或“组合物”可以用于或不用于指称包含所述多肽的药物组合物。
术语“可药用载体”用于本文中时是指无菌水或非水溶液、分散体、悬液或乳液，以及用于在临使用之前复原为无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。适当的流动性可例如通过使用包衣材料例如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持所需要的粒度和通过使用表面活性剂来维持。这些组合物也可以含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过包含各种抗菌和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等来确保预防微生物的作用。包含等渗剂例如糖、氯化钠等，也可以是合乎需要的。
通过包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶，可引起所述可注射药物形式的延长吸收。可注射的储库形式是通过形成所述药物在可生物降解的聚合物例如聚丙交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐)中的微囊基质而制成的。取决于多肽与可生物降解的聚合物的比率和所使用的特定可生物降解聚合物的性质，可以控制多肽释放速率。可注射的储库制剂也可以通过将所述多肽截留在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。所述可注射制剂可例如通过细菌截留型过滤器进行过滤或通过以无菌固体组合物的形式纳入杀菌剂来灭菌，所述无菌固体组合物可在临使用之前溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中。合适的惰性载体可包括糖，例如乳糖。
合适的制剂还可包括水和非水无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、杀菌性抗生素、和使所述制剂与目标接受者的体液等渗的溶质；以及水和非水无菌悬液，其可包含悬浮剂和增稠剂。
所述组合物也可以采取例如在油性或水性介质中的悬液、溶液或乳液的形式，并可含有配制剂例如悬浮、稳定和/或分散剂。或者，所述多肽可以是用于在使用之前用合适的介质例如无菌无热原水进行构建的粉末形式。
所述制剂可以在单位剂量或多剂量容器、例如密封的安瓿和小瓶中存在，并可以在冷冻或冷冻-干燥(冻干)条件下储存，在使用之前即刻只需要添加无菌液体载体。
对于口服施用，所述组合物可以采取例如用可药用的赋形剂通过常规方法制备的片剂或胶囊的形式，所述可药用的赋形剂例如粘结剂(例如，预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉乙醇酸钠)；或润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。所述片剂可通过本领域中已知的方法包衣。
用于口服施用的液体制剂可采取例如溶液、糖浆或悬液的形式，或者它们可作为在使用之前用水或其他合适的介质构建的干产物存在。这样的液体制剂可通过常规技术用可药用添加剂制备，所述可药用添加剂例如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯树胶)；非水介质(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分级植物油)；和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或者山梨酸)。所述制剂也可以酌情含有缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。可适当配制用于口服施用的制剂以产生活性化合物的控释。对于含服施用，所述组合物可采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
所述组合物也可以被配制为用于植入或注射的制剂。因此，例如，所述化合物可用合适的聚合或疏水材料配制(例如，作为在可接受的油中的乳液)或用离子交换树脂配制，或配制为难溶衍生物(例如，作为难溶盐)。所述化合物也可以被配制在直肠组合物、乳膏或洗剂、或透皮贴剂中。
如本文所述，本公开的主题还包括用多肽治疗视网膜病的方法。方法的一些实施方式包括向有此需要的对象施用本文公开的多肽之一。所述多肽可通过抑制Na/K-ATP酶和Src复合物的受体功能来治疗视网膜病，并且在一些实施方式中，所述多肽通过充当Na/K-ATP酶和Src复合物的拮抗剂来抑制所述受体功能。
术语“抑制”不一定在所有情况下都是指完全灭活全部靶标生物活性的能力。相反，技术人员将理解，术语“抑制”在有些情况下可以与术语“减少”可互换地使用，并且是指减少靶标的生物活性，例如当配体结合靶标的位点时可发生的；阻断靶标的生化途径中的蛋白质；与靶标的非天然复合物，等等。这种生物活性的减少可相对于对照来确定，其中所述对照可代表不施用抑制剂的环境。例如，在一些实施方式中，相对于对照的活性减少可以是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或100％减少。
进一步关于视网膜病的治疗，术语“治疗”是指旨在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理性状况、或病症的对象的医疗管理。该术语包括积极治疗，即专门针对疾病、病理性状况、或病症改善的治疗，并且还包括病因治疗(causal treatment)，即针对去除相关的疾病、病理性状况、或病症的病因的治疗。另外，该术语包括：姑息治疗，即旨在减轻症状而不是治愈疾病、病理性状况、或病症的治疗；预防性治疗，即针对最小化或者部分或完全抑制相关的疾病、病理性状况、或病症的发展的治疗；和支持性治疗，即用于补充针对相关的疾病、病理性状况、或病症的改善的另一种疗法的治疗。
视网膜病的治疗可以几种不同的方式测量和量化。在一些实施方式中，视网膜病的治疗尤其可以通过血管形成和VEGF表达或其组合来测量和量化。可替选地或附加地，视网膜病的治疗可以通过血管生成性毛细管形成来表征。视网膜病的治疗也可以通过减少血管生成、在其他情况下减少和/或抑制VEGF表达、减少细胞增殖、及其组合来表征。在一些实施方式中，本文所述的增加和/或减少可以参照患有视网膜病并且尚未用本公开的多肽之一治疗的对照对象。在其他实施方案中，本文所述的增加和/或减少可以参照对象在用本公开的多肽之一治疗之前的基线测量。视网膜病的这样的特征或症状可以通过本领域普通技术人员已知的许多方法来测量。
在本公开主题的一些实施方式中，本文描述的多肽的施用不需要治疗、抑制和/或减少视网膜病的每种症状或特征。例如，在本公开主题的一些实施方式中，多肽的施用减少了对象的视网膜脉管系统中的血管生成或新血管形成的量。因此，在一些实施方式中，还提供了降低视网膜脉管系统中血管生成的方法，所述方法包括将NaK ATP酶/Src受体复合物的多肽拮抗剂施用给有此需要的对象。在一些实施方式中，所述多肽拮抗剂包含SEQ IDNO：1的序列、或其片段和/或变体。在一些实施方式中，所述多肽拮抗剂还包含由选自SEQID NO：2-4的氨基酸序列编码的细胞穿透多肽。
对于施用如本文公开的治疗组合物(例如，包含SEQ ID NO：5的序列的多肽拮抗剂)，可以使用将小鼠剂量转换为人类剂量的换算因数进行基于施用于鼠科动物模型的剂量外推人类剂量的常规方法：每千克人类剂量＝每千克小鼠剂量/12(Freireich等，(1966)Cancer Chemother Rep.50：219-244)。剂量也可以按每平方米体表面积的毫克数给出，因为这种方法而不是体重达到了对于某些代谢和排泄功能的良好相关性。而且，如Freireich等所述，体表面积可用作成人和儿童以及不同动物物种中药物剂量的共同标准(Freireich等，(1966)Cancer Chemother Rep.50：219-244)。简而言之，为了在任何给定物种中将mg/kg剂量表示为等效的mg/sq m剂量，将所述剂量乘以适当的km因数。在成年人中，100mg/kg等于100mg/kg×37kg/sq m＝3700mg/m2。
根据本公开主题的方法施用治疗组合物的合适方法包括但不限于：口服施用、透皮施用、吸入施用、经鼻施用、局部施用、阴道内施用、经眼施用、耳内施用、脑内施用、直肠施用、和胃肠外施用，后者包括注射剂例如静脉内施用、动脉内施用、肌内施用、皮下施用、玻璃体内施用、前房内(前房中)施用、视网膜下施用、眼球筋膜下(sub-Tenon’s)施用、眼球周施用、经由局部滴眼剂施用等等。施用可以是连续的或间歇性的。在多个方面中，制剂可以治疗性施用；即为了治疗已有的疾病或病情而施用。在另外的多个方面中，制剂可以预防性施用；即为了预防疾病或病情而施用。
在一些实施方式中，并且对于眼制剂而言，施用的途径包括但不限于局部眼施用、结膜下注射、前房内注射、玻璃体内注射和眼内植入。局部滴眼施用，眼药的最常见和创伤性最小的形式，在施用后的眼生物利用度低，并经常用于眼睛前段的疾病。血眼屏障，包括睫状体上皮和视网膜色素上皮之间的紧密连接复合体，是保护眼睛的防御机制。不幸的是，它们也担当了全身施用药物的相当大的屏障，但结膜下、前房内和玻璃体内注射可以将药物输送到眼睛的前房和后房。那么，对于眼部应用，在有些情况下，可以通过局部滴眼剂滴注、或结膜下、前房内或玻璃体内注射、或通过眼内植入，将pNaKtide应用于玻璃体。
无论施用的途径如何，本公开的主题的组合物通常以有效实现期望反应的量施用。因此，术语“有效量”在本文中用于指足以产生可测量的生物响应(例如，视网膜病或血管发生减轻)的治疗组合物(例如，pNaKtide)的量。本发明的治疗组合物中活性成分的实际剂量水平可变化，以便针对特定对象和/或应用施用有效实现期望治疗响应的活性化合物的量。当然，在任何特定情况下的有效量将取决于各种因素，包括治疗组合物的活性、制剂、施用途径、与其他药物或治疗的组合、所治疗病情的严重程度、以及所治疗对象的身体状况和既往病史。优选地，施用最小剂量，并且在没有剂量限制性毒性的情况下将剂量逐步升高至最低有效量。确定和调节治疗有效剂量，以及评价何时和如何进行这样的调节，是本领域普通技术人员已知的。
关于制剂和剂量的其他指导，参见美国专利号5,326,902；5,234,933；PCT国际公布号WO 93/25521；Berkow等，(1997)默克医疗信息手册(The Merck Manual of MedicalInformation)，Home编著，Merck Research Laboratories，Whitehouse Station，NewJersey；Goodman等，(1996)Goodman&Gilman治疗学药理学基础(Goodman&Gilman's thePharmacological Basis of Therapeutics)，第9版，McGraw-Hill Health ProfessionsDivision，New York；Ebadi，(1998)
CRC临床药理学桌面参考(CRC Desk Reference of Clinical Pharmacology).CRC Press，Boca Raton，Florida；Katzung，(2001)基础&临床药理学(Basic&ClinicalPharmacology)，第8版，Lange Medical Books/McGraw-Hill Medical Pub.Division，NewYork；Remington等，(1975)Remington制药科学(Remington's PharmaceuticalSciences)，第15版，Mack Pub.Co.，Easton，Pennsylvania；以及Speight等，(1997)Avery药物治疗：疾病管理中药物的性质、选择、治疗用途和经济价值的指导(Avery's DrugTreatment：A Guide to the Properties，Choice，Therapeutic Use and Economic Valueof Drugs in Disease Management)，第4版，Adis International，Auckland/Philadelphia；Duch等，(1998)Toxicol.Lett.100-101:255-263。
用于本文中时，术语“对象”包括人类和动物对象二者。因此，根据本公开的主题提供兽医治疗用途。因此，本公开的主题提供了对哺乳动物例如人类、以及由于濒危而具有重要性的那些哺乳动物例如西伯利亚虎、具有经济重要性的那些哺乳动物例如在农场饲养以供人类食用的动物、和/或对人类具有社交重要性的动物例如作为宠物或在动物园中豢养的动物的治疗。这样的动物的例子包括但不限于：食肉动物如猫和狗；猪类，包括家猪、阉猪(hog)和野猪；反刍动物和/或有蹄类动物例如牛、阉牛(oxen)、羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼；以及马。还提供了鸟类的治疗，包括濒危和/或在动物园中豢养的那些种类的鸟、以及禽类、更特别是驯养的禽类、即家禽例如火鸡、鸡、鸭、鹅、珍珠鸡等的治疗，因为它们对人类也具有经济重要性。由此，还提供了家畜的治疗，所述家畜包括但不限于驯养的猪类、反刍动物、有蹄类动物、马(包括赛马)、家禽等。
除非另有说明，否则本公开主题的实践可采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分说明。参见，例如，分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)(1989)，第2版，Sambrook，Fritsch和Maniatis编著，Cold SpringHarbor Laboratory Press，16和17章；美国专利号4,683,195；DNA克隆(DNA Cloning)，I和II册，Glover编著，1985；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)，M.J.Gait编著，1984；核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)，D.Hames&S.J.Higgins编著，1984；转录和翻译(Transcription and Translation)，B.D.Hames&S.J.Higgins编著，1984；动物细胞培养(Culture Of Animal Cells)，R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987；固定化的细胞和酶(Immobilized Cells And Enzymes)，IRL Press，1986；Perbal(1984)，分子克隆实用指南(A Practical Guide To Molecular Cloning)；参见酶学中的方法(Methods InEnzymology)(Academic Press，Inc.，N.Y.)；哺乳动物细胞的基因转移载体(GeneTransfer Vectors For Mammalian Cells)，J.H.Miller和M.P.Calos编著，Cold SpringHarbor Laboratory，1987；酶学方法(Methods In Enzymology)，154和155卷，Wu等编著，Academic Press Inc.，N.Y.；细胞和分子生物学中的免疫化学方法(ImmunochemicalMethods In Cell And Molecular Biology)(Mayer和Walker编著，Academic Press，London，1987；实验免疫学手册(Handbook Of Experimental Immunology)，I-IV卷，D.M.Weir和C.C.Blackwell编著，1986。
本文公开的主题由以下具体但非限制性的实施例进一步说明。所述实施例可以包括数据汇编，其是在与本文公开的主题相关的开发和实验过程期间在各种时间下收集的代表性数据。
实施例
实施例1-4的材料和方法
pNaKtide对细胞增殖的作用.为了测量递增的pNaKtide对HRMEC的作用，将细胞与溴脱氧尿苷(BrdU)一起温育，溴脱氧尿苷是核苷酸类似物，其在S期期间掺入增殖细胞的DNA中。温育过夜后，所述细胞用0.1μM、1μM和5μM的pNaKtide处理24小时。然后计数BrdU阳性细胞的数量作为细胞增殖的指示。
细胞培养.正常人原代视网膜内皮细胞(HRMEC)购自Cell Systems，WA。将它们维持在根据制造商的方案制备的含有生长因子并补充有5％胎牛血清(FBS)的内皮基础培养基(EBM)(下文称为EGM-2完全培养基)中。所述EBM培养基和补充剂购自Lonza(Basel，瑞士)。使用HRMEC的所有实验均在第3-8代之间进行。在实验期间，将HRMEC在减EGM-2培养基(下文称为EGM-R培养基)中温育，所述培养基由含有1/4浓度的生长因子和0.5％FBS的EBM培养基组成。
BrdU分析.溴脱氧尿苷(BrdU)是胸苷核苷酸类似物，其仅在S期期间掺入(代替胸苷)增殖细胞的DNA中。将HRMEC以10,000个细胞/孔的密度铺在8孔胶原蛋白包被的腔室玻片中。
在37℃温育过夜后，将培养基改为EGM-R培养基。所述细胞用在EGMR中的指定浓度的所述肽在37℃下处理24小时。BrdU掺入的速率通过BrdU试剂盒(Roche Biochemicals，Indianaplis，IN，USA)根据制造商的说明测量。在每个样品的三个独立区域中计数BrdU阳性细胞数量。对照未处理细胞中BrdU阳性细胞的分率假定为1。所述肽处理的HRMEC中BrdU阳性细胞的相对数量按掺入BrdU的HRMEC的分率计算。每个样品一式两份进行测试，并且所述BrdU分析独立进行3次。
所有数据利用GraphPad Prism Software，Inc.(La Jolla，CA，USA)作图，并且表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。来自对照和处理样品的结果用方差分析继之以Neumann-Keuls多重比较检验进行比较。使用95％置信区间完成所有分析。当p<0.05时，数据被认为是显著的。
pNaKtide对血管生成和VEGF表达的作用.为了测量增加pNaKtide对HRMEC的作用，将细胞进行处理以促进细胞分化成毛细管样结构。随后收获细胞，接种在聚合基质胶上并补充0.5μM、1μM和5μM的pNaKtide并温育24小时。PNaKtide对血管生成和VEGF表达的作用的进一步研究如本文所述在肿瘤异种移植模型中进行。
基质胶分析.将减生长因子(GFR)的基质胶(BD Biosciences，Bedford，MA)用于促进HRMEC分化成毛细管样结构。将总共100μL解冻的GFR-基质胶添加到96孔组织培养板中，然后在37℃温育60分钟来允许聚合。在基质胶分析之前，在100mm组织培养皿中将HRMEC在EGM-2完全培养基中培养至70％合生。在所述分析的当天，收获HRMEC并重新悬浮于EGM-R培养基中。随后，将HRMEC(2.0X105细胞/ml)在EGM-R培养基中接种在聚合的GFR-基质胶上，补充指定浓度的pNaKtide，并在37o C温育24小时。
使用Leica DMIL相差显微镜(Leica Microsystems，Welzar，德国)在每个样品的三个独立视野中拍摄血管生成性毛细管形成。每个样品一式两份进行测试，并且整个实验独立进行3次。
肿瘤异种移植物中血管生成的抑制.通过将5X 106DU145细胞皮下注射到6周龄雌性NOD SCID小鼠(Charles River)的左和右胁中来建立肿瘤异种移植物。当肿瘤达到100mm3的平均体积时，小鼠每隔一天用盐水或pNaKtide(以2mg/kg和10mg/kg体重的剂量)腹膜内(IP)注射，共五次。关于pNaKtide抑制体内血管生成的能力对来自对照和pNaKtide处理的小鼠的肿瘤进行分析。用针对CD-31的抗体将肿瘤免疫染色以鉴定血管。使用山羊多克隆抗CD31抗体和ImmPRESS Reagent抗山羊Ig过氧化物酶。阴性对照通过用正常山羊免疫球蛋白替代第一抗体进行。然后，使用Image J定量CD-31阳性区域，并且按被血管占据的肿瘤组织面积的百分比来计算血管密度。还使用抗VEGF抗体通过蛋白质印迹评估VEGF的产生。
实施例1-PNaKtide以剂量依赖性方式减少HRMEC的增殖
PNaKtide对小鼠HRMEC增殖的作用的研究显示pNaKtide有效减少HRMEC的增殖。试验肽在24小时内对人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)增殖的作用显示出对照肽CBM-FF在HRMEC中没有抗增殖活性(图1)。然而，pNaKtide肽在0.5、1和5微摩尔浓度下以剂量依赖性方式有力地抑制HRMEC的增殖(图1)。
实施例2-PNaKtide在基质胶分析中减少血管生成性小管的形成
利用小鼠HRMEC中血管生成性小管形成的研究来探查pNaKtide对血管生成的作用。图2A中的对照图组(最上面的图组)显示HRMEC在基质胶上形成稳固的血管生成性小管的网络。当pNaKtide肽存在时，如在底部三个图组中观察到的，HRMEC的芽生式血管生成减少。PNaKtide的抗血管生成活性是浓度依赖性的；在5微摩尔浓度的pNaKtide下观察到最大作用(图2B)。
实施例3–PNaKtide治疗对VEGF表达和新生血管化的作用
为了检查pNaKtide对VEGF表达和新生血管化的作用，并探查pNaKtide的应用是否有效阻断VEGF表达和血管生成，使用肿瘤异种移植模型，并测量从对照和pNaKtide处理的动物分离的肿瘤中的血管形成和VEGF表达。图3A显示了VEGF在肿瘤匀浆中的表达的结果和在pNaKtide处理的肿瘤匀浆中VEGF表达降低的结果。蛋白质印迹显示pNaKtide处理造成总VEGF减少大于50％。
PNaKtide对血管生成的作用的研究结果显示，pNaKtide处理降低了异种移植肿瘤的血管密度。图3B显示了在福尔马林固定、石蜡包埋的异种移植肿瘤中CD31的IHC染色(盐水组14个和10mg/kg pNaKtide组6个)。血管密度按被血管占据的肿瘤面积百分比计算。对照小鼠中的血管密度约为10％，并且pNaKtide处理使所述密度降至约2.5％，如图3B中的图表所示。
如图3A-3B所示，pNaKtide处理(2和10mg/kg，每两天i.p.)降低VEGF表达和血管形成。在10mg/kg下，它抑制约50％的VEGF表达，导致新血管形成降低70％。总之，体内结果因此表明，施用pNaKtide对抑制VEGF有用。不希望受任何特定理论的束缚，因为抗VEGF疗法在糖尿病性视网膜病中是临床有效的，所以认为pNaKtide对VEGF产生的阻断作用将产生与抗VEGF疗法观察到的水平相同的效益。
实施例4-PNaKtide对新生血管化的作用
还在氧诱导的视网膜病(OIR)的小鼠模型中根据Smith实验室开发的方案评估了pNaKtide对新生血管化的作用。简而言之，出生后(P)7天的同窝小鼠幼仔(C57BL/6，n＝9)与它们的母亲一起在舱室(BioSpherix Proox Model 110Hyperoxia，BioSpherix，Ltd.)中暴露于高氧浓度(75％±2％)5天。在P12时，通过腹膜内注射氯胺酮和甲苯噻嗪混合物麻醉小鼠。然后将pNaKtide以0.25μg/μl溶解于PBS中，并使用微注射器(NanoFil syringe；World Precision Instruments，Inc.，Sarasota，FL，美国)进行玻璃体内注射。将pNaKtide(1μl)注入右眼，同时左眼作为对照。在P17时杀死小鼠。立即获取眼睛并在室温下在4％PFA中固定1小时。在解剖显微镜下解剖视网膜，并用特异性结合内皮细胞的凝集素溶液(Isolectin B4–594，Alexa Fluor 594–I21413，Molecular Probes)染色。在解剖显微镜下，将染色的视网膜切四个切口并平放安装。
然后用Zeiss荧光显微镜得到视网膜脉管系统的图像，然后使用Photoshop和Image J软件分析来自同一视网膜的多个图像的血管损失和新生血管化。如图6的图像所示，与图5的OIR对照相比，玻璃体内注射pNaKtide减少了新生血管化的量。这些图像显示pNaKtide通过抑制VEGF表达来有力和有效地阻断血管生成。图7和8按总视网膜的百分比分别显示了视网膜的视网膜血管覆盖和新生血管面积的量化。与对照处理相比，pNaKtide治疗降低了总视网膜的新生血管和视网膜血管覆盖面积二者，这进一步证实了施用pNaKtide可用于治疗视网膜病。
实施例1-4的总结
上述实施例证明，pNaKtide减少了正常人原代视网膜内皮细胞(HRMEC)中的细胞增殖，并且该细胞增殖的抑制是剂量依赖性的。此外，当细胞在基质胶中生长时，pNaKtide剂量依赖性地降低血管生成性毛细管形成。所述实施例进一步显示pNaKtide抑制VEGF表达和血管形成，并且有力且有效地阻断血管生成，特别是在视网膜脉管系统中。
应理解，在不背离本文公开的主题的范围下，可改变本文公开的主题的各种细节。此外，在本文中提供的描述只是为了说明性目的，而不是为了限制性目的。
另外，虽然在本文中所用的术语被认为是本领域普通技术人员充分了解的，仍阐明定义以便于解释本文公开的主题。除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语所具有的含义与本文公开的主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同。虽然在本文公开的主题的实践或检验中可使用与本文中所述的相似或等效的许多方法、装置和材料，但现在描述代表性的方法、装置和材料。
此外，遵循长期以来的专利法惯例，不带数量说明的指称物和“所述”当用于本申请、包括权利要求书中时是指“一或多”。因此，例如，提到“多肽”包括多个这样的多肽，以此类推。除非另有说明，在说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、性质例如反应条件等的所有数值应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，除非有与此相反的指示，在本说明书和权利要求书中阐述的数值参数是近似值，其可取决于由本文公开的主题寻求得到的期望性质而变化。
用在本文中时，术语“约”，当是指质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的值或量时，意味着在一些实施方式中包括所述规定量的±20％、在一些实施方式中±10％、在一些实施方式中±5％、在一些实施方式中±1％、在一些实施方式中±0.5％、和在一些实施方式中±0.1％的变动，因为这样的变动适合于执行本公开的方法。还要理解，有许多值在本文中公开，并且各值在本文中除了所述值本身之外，也作为“约”该特定特值公开。例如，如果公开了值“10”，那么也公开了“约10”。还要理解，两个特定单位之间的每个单位也被公开。例如，如果公开了10和15，那么也公开了11、12、13和14。
在整个本文件中，提到了各种参考文献。所有这样的参考文献通过引用并入本文中，包括在下面列表中列出的参考文献：
参考文献
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序列表
SEQ ID NO：1
SATWLALSRIAGLCNRAVFQ
SEQ ID NO：2
GRKKRRQRRRPPQ
SEQ ID NO：3
RQIKIWFQNRRMKWK K
SEQ ID NO：4
KKGKKGKK
SEQ ID NO：5
GRKKRRQRRRPPQSATWLALSRIAGLCNRAVFQ
Figure IDA0001745760080000011
Figure IDA0001745760080000021

Claims (10)

1.一种Na/K ATP酶/Src受体复合物的多肽拮抗剂在制备用于通过向有此需要的对象施用有效量的多肽拮抗剂治疗增殖性视网膜病的药物中的用途，其中所述多肽拮抗剂包含SEQ ID NO：1的序列或其功能片段。
2.权利要求1的用途，其中所述多肽拮抗剂还包括由选自SEQ ID NO：2-4的氨基酸序列编码的细胞穿透多肽。
3.权利要求1的用途，其中所述增殖性视网膜病是糖尿病性视网膜病。
4.权利要求1的用途，其中施用步骤包括玻璃体内施用、结膜下施用、前房内施用、眼内施用或其组合。
5.权利要求1的用途，其中施用所述多肽拮抗剂减少对象眼中的细胞增殖。
6.权利要求1的用途，其中施用所述多肽拮抗剂减少对象眼中的VEGF表达、血管生成和/或毛细管形成。
7.权利要求1的用途，其中施用所述多肽拮抗剂减少对象眼中的新生血管化。
8.一种Na/K ATP酶/Src受体复合物的多肽拮抗剂在制备用于通过向有此需要的对象施用有效量的多肽拮抗剂减少视网膜脉管系统中血管生成的药物中的用途，其中所述多肽拮抗剂包含SEQ ID NO：1的序列或其功能片段。
9.权利要求8的用途，其中所述多肽拮抗剂还包括由选自SEQ ID NO：2-4的氨基酸序列编码的细胞穿透多肽。
10.权利要求8的用途，其中施用所述多肽拮抗剂包含玻璃体内注射所述多肽拮抗剂。
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