CN108624554B - 一种非基因修饰光操控双向调节人脐带间充质干细胞增殖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种非基因修饰光操控双向调节人脐带间充质干细胞增殖的方法，包括：在光波长为400～480nm、光强度为95～105μw/cm2的条件下，通过准直镜用蓝光照射准直镜下95～105mm处人脐带间充质干细胞85～95min，进行负向调控；或者通过准直镜用蓝光照射准直镜下95～105mm处人脐带间充质干细胞115～125min，进行正向调控。本发明首次仅通过特定参数设置下的蓝光照射达到双向操控人脐带间充质干细胞增殖速度的目的，不需要在干细胞中转入外源基因、不涉及病毒转染载体，不添加任何其它物质，更加符合“无创光医疗”的临床应用需求，具有广阔的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种非基因修饰光操控双向调节人脐带间充质干细胞增殖的方法，属于间充质干细胞培养应用技术领域。
背景技术
人类许多疾病(如肝脏疾病、血液系统疾病、神经系统疾病等)都是缘于机体在细胞、组织、器官水平上受到不同原因的损伤导致细胞功能出现异常、缺陷或丧失。目前的常规药物治疗只能缓解症状，很难从组织层面根治疾病；而器官/组织移植治疗则面临着器官来源匮乏、术后抗排斥治疗费用高昂等严峻问题。人脐带间充质干细胞(human umbilicalcord-derived mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，在骨、神经、肝脏、心脏等组织工程方面具有广阔的临床应用前景，有可能从根本上治愈多种疾病。
脐带间充质干细胞在疾病的治疗中有巨大的应用前景，但要真正实现其在临床上的应用，有许多问题亟待解决，如细胞培养、定向分化、功能重塑及其与机体微环境的交互作用等。在这些问题中，精准调控脐带间充质干细胞增殖是其中的核心关键问题。所以，研发脐带间充质干细胞的有效培养及其操控技术意义重大且非常迫切。
近年研究显示，环境中物理因素(光、力、电、磁、热等)可以形成局域场效应，影响干细胞的命运。在所有影响干细胞的因素中，“光”的操控特征最丰富，如非接触、精确高效、远程控制、瞬时开关等，特别适合应用于操控干细胞及后续临床治疗探索。目前较普遍使用的光操控技术是通过病毒载体将光敏感离子通道基因(主要是ChR2-GFP或NpHR-GFP)转入干细胞进行后续调控。但是，其中的关键要素：“需要病毒转染外源基因”极大地限制了其在疾病临床治疗中的应用。在无创光医疗的科学发展趋势中，亟需探索“非基因修饰“类型的光操控手段进行干细胞有效培养。然而，到目前为止，“非基因修饰”类型光操控间充质干细胞增殖的应用报道非常少。现有应用报道中，中国专利文献CN107541493A(申请号CN201711042351.9)提出蓝光在影响小鼠神经干细胞增殖分化中的应用，该专利只报道了针对小鼠神经干细胞进行光操控的应用研究。人源和鼠源物种差异巨大，更关键的是，脐带间充质干细胞和神经干细胞的在自我更新和多向分化潜能性等多方面差异显著，所以该专利并不适用于人脐带间充质干细胞培养技术领域。
综上所述，脐带间充质干细胞在疾病的治疗中有巨大的应用前景。非基因修饰类型的光操控技术与现有光操控技术相比，不需要在干细胞中转入外源基因、不涉及病毒转染载体，更加符合“无创光医疗”的临床应用需求。然而现有影响脐带间充质干细胞增殖的因素均没有涉及非基因修饰光操控技术，不涉及本发明提供的基于光波长(400-480nm)照射间充质干细胞引出的双向(负向抑制、正向促进)调节细胞增殖的技术方法。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种非基因修饰光操控双向调节人脐带间充质干细胞增殖的新方法。涉及负向调节(抑制)和正向调节(促进)间充质干细胞增殖两个技术方案。
本发明中第一个技术方案：非基因修饰光操控负向调节(抑制)间充质干细胞增殖。在光波长为400～480nm、光强度为95～105μw/cm2的条件下，通过准直镜用蓝光照射准直镜下95-105mm处人脐带间充质干细胞85～95min，本发明具体操作步骤如下：
(1)人脐带间充质干细胞的原代培养：取分离的人脐带间充质干细胞，接入脐带间充质干细胞增殖培养基中，在36～38℃、5％CO2条件下培养3～4天，细胞密度达到80％～90％，制得原代培养后细胞；
(2)人脐带间充质干细胞的传代培养：取步骤(1)制得的原代培养后细胞，冲洗掉残余培养基，胰酶溶液进行细胞消化，进行细胞混悬，然后转接至脐带间充质干细胞增殖培养基中，36～38℃、5％CO2条件下进行细胞培养3～4天，获得传代细胞；
(3)蓝光照射细胞：取步骤(2)获得的传代细胞，在光波长为400～480nm、光强度为95～105μw/cm2的条件下，照射85～95min，制得照射后细胞；
(4)人脐带间充质干细胞的增殖培养：将所述步骤(3)制得的照射后细胞进行增殖培养。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中所述人脐带间充质干细胞为采用如下步骤处理的细胞：取分离的人脐带间充质干细胞，接入脐带间充质干细胞增殖培养基中，在36～38℃、5％CO2条件下培养3～4天。
根据本发明优选的，所述步骤(1)、(2)和(4)中的脐带间充质干细胞增殖培养基，组分如下：
Alpha-MEM 50mL、20mg/mL的bFGF 5μL、浓度20mg/mL的EGF 5μL、20mg/mL的VEGF 5μL、20mg/mL的PDGF-BB 5μL、浓度10万U/mL的青霉素50μL、浓度10万U/mL的链霉素50μL。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，细胞混悬步骤如下：吹打细胞至完全脱落，加入等体积细胞增殖培养基中和混匀，700～1000rpm离心3～8min，弃上清，加1～3mL所述脐带间充质干细胞增殖培养基将细胞重悬，吹打混匀。
根据本发明进一步优选的，离心速度为800rpm，离心时间为5min，加入的细胞增殖培养基量为1mL。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，冲洗残余培养基：真空泵吸去培养皿中原有培养基，PBS冲洗残余培养基2～5次。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，光波长为445nm、光强度为100μw/cm2的条件下，照射人脐带血间充质干细胞时间为90min。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，增殖培养为在36～38℃、5％CO2条件下培养3～4天。
本发明中第二个技术方案：非基因修饰光操控正向调节(促进)间充质干细胞增殖。在光波长为400～480nm、光强度为95～105μw/cm2的条件下，通过准直镜用蓝光照射准直镜下95-105mm处人脐带血间充质干细胞115～125min，本发明具体操作步骤如下：
在光波长为400～480nm、光强度为95～105μw/cm2的条件下，通过准直镜用蓝光照射准直镜下95-105mm处人脐带血间充质干细胞115～125min，本发明具体操作步骤如下：
(1)人脐带间充质干细胞的原代培养：取分离的人脐带间充质干细胞，接入脐带间充质干细胞增殖培养基中，在36～38℃、5％CO2条件下培养3～4天，细胞密度达到80％～90％，制得原代培养后细胞；
(2)人脐带间充质干细胞的传代培养：取步骤(1)制得的原代培养后细胞，冲洗掉残余培养基，胰酶溶液进行细胞消化，进行细胞混悬，然后转接至脐带血间充质干细胞增殖培养基中，36～38℃、5％CO2条件下进行细胞培养3～4天，获得传代细胞；
(3)蓝光照射细胞：取步骤(2)获得的传代细胞，在光波长为400～480nm、光强度为95～105μw/cm2的条件下，照射115～125min，制得照射后细胞；
(4)人脐带间充质干细胞的增殖培养：将所述步骤(3)制得的照射后细胞进行增殖培养。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中所述人脐带间充质干细胞为采用如下步骤处理的细胞：取分离的人脐带间充质干细胞，接入脐带间充质干细胞增殖培养基中，在36～38℃、5％CO2条件下培养3～4天。
根据本发明优选的，所述步骤(1)、(2)和(4)中的脐带间充质干细胞增殖培养基，组分如下：
Alpha-MEM 50mL、20mg/mL的bFGF 5μL、浓度20mg/mL的EGF 5μL、20mg/mL的VEGF 5μL、20mg/mL的PDGF-BB 5μL、浓度10万U/mL的青霉素50μL、浓度10万U/mL的链霉素50μL。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，细胞混悬步骤如下：吹打细胞至完全脱落，加入等体积细胞增殖培养基中和混匀，700～1000rpm离心3～8min，弃上清，加1～3mL所述脐带间充质干细胞增殖培养基将细胞重悬，吹打混匀。
根据本发明进一步优选的，离心速度为800rpm，离心时间为5min，加入的细胞增殖培养基量为1mL。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，冲洗残余培养基：真空泵吸去培养皿中原有培养基，PBS冲洗残余培养基2～5次。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，光波长为445nm、光强度为100μw/cm2的条件下，照射人脐带间充质干细胞时间为120min。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，增殖培养为在36～38℃、5％CO2条件下培养3～4天。
有益效果
本发明首次仅通过特定参数设置下的蓝光照射达到双向操控(负向抑制、正向促进)人脐带间充质干细胞增殖速度的目的，对人脐带间充质干细胞增殖速度具有正向和负向调控的效果明显；并且，本方法不需要在干细胞中转入外源基因、不涉及病毒转染载体，不添加任何其它物质，更加符合“无创光医疗”的临床应用需求，具有广阔的临床应用前景。
附图说明
图1、为实施例1采用的蓝光照射平台示意图；
图中：1、光源发射器；2、准直镜；3、光源发射器发射出的光束；4、放置培养皿的底座；
图2、为获得的人脐带间充质干细胞悬液放大10倍的照片；
图3、放大400倍后蓝光照射90min人脐带间充质干细胞增殖4天后EdU增殖照片；
图4、放大400倍后蓝光照射120min人脐带间充质干细胞增殖4天后EdU增殖照片；
图5、放大400倍后对照组人脐带间充质干细胞增殖4天后EdU增殖照片；
图6、放大400倍后蓝光照射60min人脐带间充质干细胞增殖4天后EdU增殖照片；
图7、EdU增殖结果量化图；
图中：显示来自三个独立实验的汇总数据。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001，通过单因素方差分析确定。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例1、
一、人脐带间充质干细胞的原代培养
表1：增殖培养基组成成分
二、人脐带间充质干细胞的传代培养
1、显微镜下观察细胞生长状态及细胞密度，当细胞密度达到80％至90％时，在超净工作台进行细胞传代操作。
2、将细胞培养基，PBS溶液，胰酶溶液放入水浴锅中预热半小时后，从水浴锅中取出，75％酒精擦拭表面后，转移至超净工作台中。
3、用真空泵吸去培养皿中原有培养基，加入适量PBS溶液清洗残余培养基，真空泵吸去，重复操作三次。最后一次弃掉PBS溶液后，加入1mL胰酶溶液，对细胞进行消化。
4、约2-3min，消化完成，用微量移液器吹打细胞，使培养皿中的细胞完全脱落下来，加入等体积细胞培养基中和，吹打混匀后，全部转移至洁净的15mL玻璃离心管中，800rpm离心5min。
5、弃上清，加入1mL细胞培养基将细胞重悬，吹打混匀后，使用微量移液器将其全部转移至培养皿中，轻轻晃动，使细胞分散均匀。37℃CO2细胞培养箱中培养。
三、蓝光照射平台的搭建
1、将光源1固定在300mm的支柱上，并在下方安装厚度为10mm的准直镜2，且光源1和准直镜2均能在支柱上自由活动，打开电源，利用准直镜2对光源光束3进行准直，准直后焦距为40mm，如图1所示。
2、利用Sanwa Laser Power Meter LP1型光强度计测定准直镜下100mm处的光强度，调节电源输出功率直到光强度为100μw/cm2，此时电源输出功率为25mw。
3、固定光源1和准直镜2高度，锁定电源输出功率，备用。
四、蓝光照射细胞
1、取刚传代的人脐带间充质干细胞悬液进行细胞计数，细胞密度以10万/mL为宜，将细胞悬液种入6孔板中，每孔2mL。
2、将实验组细胞置于光强度为100μw/cm2的波长为445nm的蓝光照射平台中进行90min照射，对照组细胞置于相同环境下的暗盒中相同时间。
五、EdU增殖实验
1、取对数生长期细胞，将细胞以2万左右密度接种于24孔板中，培养至正常生长阶段。EdU标记
2、用细胞培养基按1000:1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50μM EdU培养基。
3、每孔加入200μL 50μM EdU培养基孵育2小时，弃培养基。
4、PBS清洗1到2次，每次5分钟。
细胞固定化
5、每孔加入300μL细胞固定液(即含4％多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟，弃固定液。
6、每孔加入500μL 2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶。
7、每孔加入500μL PBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS。
8、(加强)每孔加入300μL渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10分钟；PBS清洗1次，5分钟。
Apollo染色
9、每孔加入200μL的1×Apollo染色反应液，避光室温下脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液。
10、每孔加入300μL渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床清洗2到3次，每次10分钟，弃渗透剂。
11、(加强)每孔每次加入300μL甲醇清洗1到2次，每次5分钟；PBS清洗1次，每次5分钟。
DNA染色
12、在载玻片上滴加含有DAPI的封片剂10μL，将细胞飞片倒扣在上面，无色指甲油封片。
13、显微镜观察拍照。
六、观察结果
观察实验结果,EdU试验统计结果如表2所示，EdU增殖图如图3所示。
表2 EDU实验统计结果
实施例2
一、人脐带间充质干细胞的原代培养
表1：增殖培养基组成成分
二、人脐带间充质干细胞的传代培养
1、显微镜下观察细胞生长状态及细胞密度，当细胞密度达到80％至90％时，在超净工作台进行细胞传代操作。
2、将细胞培养基，PBS溶液，胰酶溶液放入水浴锅中预热半小时后，从水浴锅中取出，75％酒精擦拭表面后，转移至超净工作台中。
3、用真空泵吸去培养皿中原有培养基，加入适量PBS溶液清洗残余培养基，真空泵吸去，重复操作三次。最后一次弃掉PBS溶液后，加入1mL胰酶溶液，对细胞进行消化。
4、约2-3min，消化完成，用微量移液器吹打细胞，使培养皿中的细胞完全脱落下来，加入等体积细胞培养基中和，。吹打混匀后，全部转移至洁净的15mL玻璃离心管中，800rpm离心5min。
5、弃上清，加入1mL细胞培养基将细胞重悬，吹打混匀后，使用微量移液器将其全部转移至培养皿中，轻轻晃动，使细胞分散均匀。37℃CO2细胞培养箱中培养。
三、蓝光照射平台的搭建
1、将光源1固定在300mm的支柱上，并在下方安装厚度为10mm的准直镜2，且光源1和准直镜2均能在支柱上自由活动，打开电源，利用准直镜2对光源光束3进行准直，准直后焦距为40mm，如图1所示。
2、利用Sanwa Laser Power Meter LP1型光强度计测定准直镜下100mm处的光强度，调节电源输出功率直到光强度为100μw/cm2，此时电源输出功率为25mw。
3、固定光源1和准直镜2高度，锁定电源输出功率，备用。
四、蓝光照射细胞
1、取刚传代的人脐带间充质干细胞悬液进行细胞计数，细胞密度以10万/mL为宜，将细胞悬液种入6孔板中，每孔2mL。
2、将实验组细胞置于光强度为100μw/cm2的波长为445nm的蓝光照射平台中进行120min照射，对照组细胞置于相同环境下的暗盒中相同时间。
五、EdU增殖实验
1、取对数生长期细胞，将细胞以2万左右密度接种于24孔板中，培养至正常生长阶段。EdU标记
2、用细胞培养基按1000:1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50μM EdU培养基。
3、每孔加入200μL 50μM EdU培养基孵育2小时，弃培养基。
4、PBS清洗1到2次，每次5分钟。
细胞固定化
5、每孔加入300μL细胞固定液(即含4％多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟，弃固定液。
6、每孔加入500μL 2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶。
7、每孔加入500μL PBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS。
8、(加强)每孔加入300μL渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10分钟；PBS清洗1次，5分钟。
Apollo染色
9、每孔加入200μL的1×Apollo染色反应液，避光室温下脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液。
10、每孔加入300μL渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床清洗2到3次，每次10分钟，弃渗透剂。
11、(加强)每孔每次加入300μL甲醇清洗1到2次，每次5分钟；PBS清洗1次，每次5分钟。
DNA染色
12、在载玻片上滴加含有DAPI的封片剂10μL，将细胞飞片倒扣在上面，无色指甲油封片。
13、显微镜观察拍照。
六、观察结果
观察实验结果，EdU实验统计结果如表3所示，EdU增殖图如图4所示。
表3 EDU实验统计结果
实施例3
一、人脐带间充质干细胞的原代培养
表1：增殖培养基组成成分
二、人脐带间充质干细胞的传代培养
1、显微镜下观察细胞生长状态及细胞密度，当细胞密度达到80％至90％时，在超净工作台进行细胞传代操作。
2、将细胞培养基，PBS溶液，胰酶溶液放入水浴锅中预热半小时后，从水浴锅中取出，75％酒精擦拭表面后，转移至超净工作台中。
3、用真空泵吸去培养皿中原有培养基，加入适量PBS溶液清洗残余培养基，真空泵吸去，重复操作三次。最后一次弃掉PBS溶液后，加入1mL胰酶溶液，对细胞进行消化。
4、约2-3min，消化完成，用微量移液器吹打细胞，使培养皿中的细胞完全脱落下来，加入等体积细胞培养基中和，。吹打混匀后，全部转移至洁净的15mL玻璃离心管中，800rpm离心5min。
5、弃上清，加入1mL细胞培养基将细胞重悬，吹打混匀后，使用微量移液器将其全部转移至培养皿中，轻轻晃动，使细胞分散均匀。37℃CO2细胞培养箱中培养。
三、蓝光照射平台的搭建
1、将光源1固定在300mm的支柱上，并在下方安装厚度为10mm的准直镜2，且光源1和准直镜2均能在支柱上自由活动，打开电源，利用准直镜2对光源光束3进行准直，准直后焦距为40mm，如图1所示。
2、利用Sanwa Laser Power Meter LP1型光强度计测定准直镜下100mm处的光强度，调节电源输出功率直到光强度为100μw/cm2，此时电源输出功率为25mw。
3、固定光源1和准直镜2高度，锁定电源输出功率，备用。
四、蓝光照射细胞
1、取刚传代的人脐带间充质干细胞悬液进行细胞计数，细胞密度以10万/mL为宜，将细胞悬液种入6孔板中，每孔2mL。
2、将实验组细胞置于光强度为100μw/cm2的波长为445nm的蓝光照射平台中分别进行0min(图5)、60min(图6)照射，对照组细胞置于相同环境下的暗盒中相同时间。
五、Edu增殖实验
1、取对数生长期细胞，将细胞以2万左右密度接种于24孔板中，培养至正常生长阶段。EdU标记
2、用细胞培养基按1000:1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50μM EdU培养基。
3、每孔加入200μL 50μM EdU培养基孵育2小时，弃培养基。
4、PBS清洗1到2次，每次5分钟。
细胞固定化
5、每孔加入300μL细胞固定液(即含4％多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟，弃固定液。
6、每孔加入500μL 2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶。
7、每孔加入500μL PBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS。
8、(加强)每孔加入300μL渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10分钟；PBS清洗1次，5分钟。
Apollo染色
9、每孔加入200μL的1×Apollo染色反应液，避光室温下脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液。
10、每孔加入300μL渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床清洗2到3次，每次10分钟，弃渗透剂。
11、(加强)每孔每次加入300μL甲醇清洗1到2次，每次5分钟；PBS清洗1次，每次5分钟。
DNA染色
12、在载玻片上滴加含有DAPI的封片剂10μL，将细胞飞片倒扣在上面，无色指甲油封片。
13、显微镜观察拍照。
六、观察结果
观察实验结果，EdU实验统计结果如表4所示，EdU增殖图如图5、图6所示。
表4 EDU实验统计结果
结合实施例1、2、3得出实验结果：
1、实验结果如图7所示，与对照组相比(图5)，在光强度为100μw/cm2的蓝光照射平台中处理90分钟，人脐带间充质干细胞的增殖能力受到抑制(图3)，在光强度为100μw/cm2的蓝光照射平台中处理60分钟和120分钟，人脐带间充质干细胞的增殖能力增强，其中处理120分钟对人脐带间充质干细胞的增殖能力增强效果更为显著(图4)。
2、蓝光能够双向调节人脐带间充质干细胞的增殖，用光强度为100μw/cm2的蓝光照射90分钟，对人脐带间充质干细胞的增殖具有负向调节作用；用光强度为100μw/cm2的蓝光照射60分钟及120分钟，对人脐带间充质干细胞的增殖具有正向调节作用。
Claims (9)
1.非基因修饰光操控正向调节间充质干细胞增殖的方法，在光波长为400～480nm、光强度为95～105μw/cm2的条件下，通过准直镜用蓝光照射准直镜下95～105mm处人脐带血间充质干细胞115～125min，步骤如下：
(1)人脐带间充质干细胞的原代培养：取分离的人脐带间充质干细胞，接入脐带间充质干细胞增殖培养基中，在36～38℃、5% CO2条件下培养3～4天，细胞密度达到80%～90%，制得原代培养后细胞；
(2)人脐带间充质干细胞的传代培养：取步骤（1）制得的原代培养后细胞，冲洗掉残余培养基，胰酶溶液进行细胞消化，进行细胞混悬，然后转接至脐带血间充质干细胞增殖培养基中，36～38℃、5% CO2条件下进行细胞培养3～4天，获得传代细胞；
(3)蓝光照射细胞：取步骤（2）获得的传代细胞，在光波长为400～480nm、光强度为95～105μw/cm2的条件下，照射115～125min，制得照射后细胞；
(4) 人脐带间充质干细胞的增殖培养：将所述步骤（3）制得的照射后细胞进行增殖培养。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中所述人脐带间充质干细胞为采用如下步骤处理的细胞：取分离的人脐带间充质干细胞，接入脐带间充质干细胞增殖培养基中，在36～38℃、5% CO2条件下培养3～4天。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）和（2）中的脐带间充质干细胞增殖培养基，组分如下：
Alpha-MEM 50mL、20mg/mL 的bFGF 5μL、浓度20mg/mL的EGF 5μL、20mg/mL 的VEGF 5μL、20mg/mL 的PDGF-BB 5μL、浓度10万U/mL的青霉素 50μL、浓度10万U/mL的链霉素50μL。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中的增殖培养采用脐带间充质干细胞增殖培养基进行培养，组分如下：
Alpha-MEM 50mL、20mg/mL 的bFGF 5μL、浓度20mg/mL的EGF 5μL、20mg/mL 的VEGF 5μL、20mg/mL 的PDGF-BB 5μL、浓度10万U/mL的青霉素 50μL、浓度10万U/mL的链霉素50μL。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，细胞混悬步骤如下：吹打细胞至完全脱落，加入等体积细胞增殖培养基中和混匀，700～1000 rpm离心3～8 min，弃上清，加1～3mL所述脐带间充质干细胞增殖培养基将细胞重悬，吹打混匀。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，离心速度为800rpm，离心时间为5min，加入的细胞增殖培养基量为1mL。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，冲洗残余培养基：真空泵吸去培养皿中原有培养基，PBS冲洗残余培养基2～5次。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，光波长为445nm、光强度为100μw/cm2的条件下，照射人脐带间充质干细胞时间为120min。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，增殖培养为在36～38℃、5%CO2条件下培养3～4天。
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