CN108614038B - 一种测定奥贝胆酸原料药有关物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明建立了一种能够控制奥贝胆酸有关物质的检测方法，具体地，选择适当的溶剂，通过HPLC‑ELSD对样品进行检测，已知杂质采用外标法，未知杂质及总杂采用1％的主成分对照品对产品的有关物质进行控制。
Description
技术领域
本发明涉及原料药有关物质的测定，具体的，本发明涉及奥贝胆酸原料药有关物质的测定。
背景技术
奥贝胆酸(OBDS)是鹅去氧胆酸的结构修饰物6-乙基鹅去氧胆酸,它是Intercept制药公司开发的一种法尼酯X受体激动剂，可通过活化法尼醇X受体，间接抑制胆酸生物合成的限速酶细胞色素7A1(CYP7A1)的基因表达，进而抑制胆酸合成，可用于治疗原发性胆汁性肝硬化和非酒精性脂肪性肝病。
非酒精性脂肪肝炎是一种脂肪肝疾病，据Intercept称，非酒精性脂肪肝炎到2020年有望成为肝脏移植的主要因素。这种疾病目前尚无获得批准的治疗药物，这就催生了一个潜在重磅级的市场，促使生物制药公司在这一领域投入巨资进行药物研发。
奥贝胆酸具有较好的临床价值和应用前景，国内外的研究所和药企均十分重视对该药的研发和生产。目前，由于该原料药为三萜类化合物，没有共轭体系，紫外吸收很弱，原料有关物质的控制是难点，检索国内外相关文献及专利，均未见相关检测方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于建立一种能够控制奥贝胆酸有关物质的检测方法，具体地，选择适当的溶剂，通过HPLC-ELSD(蒸发光检测器)对样品进行检测，已知杂质采用外标法，未知杂质及总杂采用1％的主成分对照品对产品的有关物质进行控制；由于蒸发光检测器灵敏度较差，需要通过适当溶剂的选择，增大样品浓度及进样量，才可满足测定要求；但是，在样品浓度和进样量增大的情况下，主峰严重过载，如果采用面积归一化及主成分自身对照法，均存在较大偏差，若采用外标法，能准确的对杂质的含量进行测定，确保药品的质量，该方法具有以下优点：1、采用适当的溶剂溶解OBDS，可使溶解度达到15-30mg/ml；2、能够将有关物质有效分离、并且能够量化控制；3、该方法具有普遍适用性，适用于向生产公司转移；4、该方法具有足够的灵敏度，可以对杂质进行有效控制。
本发明提供一种能够控制奥贝胆酸有关物质的检测方法，步骤为：1)使用乙腈和水混合溶剂溶解奥贝胆酸原料药：2)通过HPLC-ELSD对样品进行检测，色谱条件为：使用C18耐酸色谱柱，流动相为乙腈和0.1％甲酸；3)已知杂质采用外标法，未知杂质及总杂采用1％的主成分对照品对产品的有关物质进行控制。
在本发明的一个具体实施方案中，所述混合溶剂乙腈和水体积比为75：25-85:15，优选地，其体积比为80:20。
在本发明的一个具体实施方案中，所述样品的浓度为15-30mg/ml，优选地，所述样品浓度为20mg/ml。
在本发明的一个具体实施方案中，所述ELSD的漂移管温度为35-40度。
在本发明的一个具体实施方案中，色谱柱为C18酸性色谱柱，优选地，色谱柱为ZORBAX SB-C18色谱柱，其参数为4.6*250mm,5um
在本发明的一个具体实施方案中，流动相为乙腈和0.1％甲酸，其体积比为50:50-60:40，优选地，其体积比为55:45。
在本发明的一个具体实施方案中，流动相的流速为0.2-1.2ml/min，优选地，流动相的流速为1.0ml/min。
附图说明
图1：在稀释剂为乙腈：水(80:20，v/v)条件下，主峰平头，对称性良好。
图2：稀释剂为乙腈：水(90:10，v/v)条件下，主峰峰形前沿。
图3：最优流动相条件乙腈-0.1％甲酸水(55：45，v/v)条件下奥贝胆酸和各杂质分离情况，各峰的保留时间如各峰标注所示，从左向右顺序依次为D-1、SM1、D-5、D-6、D-2、OBDS、D-4。
具体实施方式
以下实施例用于进一步理解本发明，但不是对本发明的限制。
奥贝胆酸原料药及其中间物质的制备参考CN104781272A。
实施例1：稀释剂的选择及溶液浓度
仪器和条件：
Agilent1260液相色谱仪，泵的型号为G1311A，紫外检测器型号G1315D，及Chemstation处理软件，色谱柱：Agilent ZorbaxSB-C18(250*4.6mm，5μm)，蒸发光散射检测器(ELSD)，流动相：乙腈-0.1％甲酸水(55:45，v/v)，流速1ml/min，进样量20μl，ELSD的漂移管温度为38度；定量方式：已知杂质采用外标法，未知杂质及总杂采用1％的主成分对照品对产品的有关物质进行控制。
表1：
试验步骤及结论：
结论：稀释剂体积比范围为75:25-85:15，样品溶解良好，峰型良好。最佳稀释剂为乙腈：水为80：20。结果参见图1和2。
溶液浓度的选择:
结论：样品浓度范围为15mg/ml-30mg/ml之间，该浓度范围，峰形较好，且能满足样品测定的限度要求。
实施例2：蒸发光散射检测器参数的选择
仪器和条件：
Agilent1260液相色谱仪，泵的型号为G1311A，紫外检测器型号G1315D，及Chemstation处理软件，色谱柱：Agilent ZorbaxSB-C18(250*4.6mm，5μm)，蒸发光散射检测器(ELSD)，溶剂为乙腈和水(80:20，v/v)，溶液浓度为20mg/ml，流动相：乙腈-0.1％甲酸水(55:45，v/v)，流速1ml/min，进样量20μl，ELSD的漂移管温度为38度；定量方式：已知杂质采用外标法，未知杂质及总杂采用1％的主成分对照品对产品的有关物质进行控制
试验步骤:
采用上述色谱条件，调整不同漂移管温度，以谱图的噪声(6*SD)及峰形为考察标准，进行优化。
表2：试验结果：
| 漂移管温度(度) | 噪声(6*SD)及峰形 |
| 30-34 | 未出峰 |
| 35-40 | 0.13，峰形好 |
| 41-45 | 峰形差 |
结论：漂移管温度为35-40度峰型良好。
实施例3：流动相比例的确定
仪器和条件：
Agilent1260液相色谱仪，泵的型号为G1311A，紫外检测器型号G1315D，及Chemstation处理软件，色谱柱：Agilent ZorbaxSB-C18(250*4.6mm，5μm)，蒸发光散射检测器(ELSD)，溶剂为乙腈和水(80:20，v/v)，溶液浓度为20mg/ml，流动相：乙腈-0.1％甲酸水，流速1ml/min，进样量20μl，ELSD的漂移管温度为38度；定量方式：已知杂质采用外标法，未知杂质及总杂采用1％的主成分对照品对产品的有关物质进行控制。
试验步骤：
系统适用性溶液：取OBDS及各杂质适量，精密称定，置同一容量瓶中，稀释剂稀释定容至刻度，摇匀，即得(OBDS浓度20mg/ml,各杂质浓度0.1mg/ml)。
采用上述色谱条件，调整不同流动相比例，以杂质分离度为考察指标，对流动相的比例进行优化。
表3：试验结果：
结论：流动相乙腈-0.1％甲酸水比例为50:50-60:40，v/v，各杂质可完全分离
最优流动相条件为乙腈-0.1％甲酸水为55：45(v/v)，该条件下奥贝胆酸和各杂质分离情况如下表所示(参见附图3)：
表4：
结论：采用该洗脱条件，各杂质的分离度均符合要求。
实施例4：色谱柱类型的确定
仪器和条件：
Agilent1260液相色谱仪，泵的型号为G1311A，紫外检测器型号G1315D，及Chemstation处理软件，蒸发光散射检测器(ELSD)，溶剂为乙腈和水(80:20，v/v)，溶液浓度为20mg/ml，流动相：乙腈-0.1％甲酸水(55:45，v/v)，流速1ml/min，进样量20μl,ELSD的漂移管温度为38度；定量方式:已知杂质采用外标法，未知杂质及总杂采用1％的主成分对照品对产品的有关物质进行控制。
试验步骤：
采用上述色谱条件，调整不同类型的色谱柱，以杂质峰形为考察指标，对色谱柱的类型进行考察。
表5：试验结果：
结论：由以上数据可知，最优色谱柱应为耐酸性的色谱柱，如Agilent zorbaxSB-C18(4.6*250mm,5um)。
实施例5：最佳流速的确定
仪器和条件：
Agilent1260液相色谱仪，泵的型号为G1311A，紫外检测器型号G1315D，及Chemstation处理软件，色谱柱：Agilent ZorbaxSB-C18(250*4.6mm，5μm)，蒸发光散射检测器(ELSD)，溶剂为乙腈和水(80:20，v/v)，溶液浓度为20mg/ml，流动相：乙腈-0.1％甲酸水(55:45，v/v)，进样量20μl，ELSD的漂移管温度为38度；定量方式：已知杂质采用外标法，未知杂质及总杂采用1％的主成分对照品对产品的有关物质进行控制。
试验步骤：
系统适用性溶液：取OBDS及各杂质适量，精密称定，置同一容量瓶中，稀释剂稀释定容至刻度，摇匀，即得(OBDS浓度20mg/ml,各杂质浓度0.1mg/ml)。
采用上述色谱条件，调整不同的流速，以杂质保留时间及分离度为考察指标，对流进行考察。
表6：试验结果：
结论：由以上数据可知，该方法的流速范围为0.8-1.2ml/min，最佳流速为1.0ml/min。
实施例6：本发明方法专属性测试
仪器和条件：
Agilent1260液相色谱仪，泵的型号为G1311A，紫外检测器型号G1315D，及Chemstation处理软件，色谱柱：Agilent ZorbaxSB-C18(250*4.6mm，5μm)，蒸发光散射检测器(ELSD)，溶剂为乙腈和水(80:20，v/v)，溶液浓度为20mg/ml，流动相：乙腈-0.1％甲酸水(55:45，v/v)，流速1ml/min，进样量20μl，ELSD的漂移管温度为38度；定量方式：已知杂质采用外标法，未知杂质及总杂采用1％的主成分对照品对产品的有关物质进行控制
试验步骤：
稀释剂：乙腈：水(80:20，v/v)
系统适用性溶液：取OBDS及各杂质适量，精密称定，置同一容量瓶中，稀释剂稀释定容至刻度，摇匀，即得(OBDS浓度20mg/ml,各杂质浓度0.1mg/ml)。
表7：试验结果：
结论：稀释剂对样品测定不产生干扰，该方法专属性良好。
实施例7：该方法的灵敏度测试
仪器和条件：
Agilent1260液相色谱仪，泵的型号为G1311A，紫外检测器型号G1315D，及Chemstation处理软件，色谱柱：Agilent ZorbaxSB-C18(250*4.6mm，5μm)，蒸发光散射检测器(ELSD)，溶剂为乙腈和水(80:20，v/v)，溶液浓度为20mg/ml，流动相：乙腈-0.1％甲酸水(55:45，v/v)，流速1ml/min，进样量20μl，ELSD的漂移管温度为38度；定量方式：已知杂质采用外标法，未知杂质及总杂采用1％的主成分对照品对产品的有关物质进行控制。
试验步骤：
取SM1、D-3、D-5、D-6、OBDS样品适量，精密称定，置不同容量瓶中，稀释剂稀释至一定的浓度，以10*S/N(S/N：信号/噪声)≤各杂质的响应≤20*S/N(S/N：信号/噪声)为宜,即为各杂质的定量限浓度。
表8：试验结果：
| 物质代号 | 定量限(μg/ml) | 相当于供试品浓度(％) |
| SM1 | 5.12 | 0.02％ |
| D-3 | 16.42 | 0.08％ |
| D-5 | 10.57 | 0.05％ |
| D-6 | 12.48 | 0.06％ |
| OBDS | 15.75 | 0.08％ |
结论:供试品浓度0.1％以下的杂质，均可定量测定，该方法灵敏度符合相关要求。
实施例8：该方法的线性测试
仪器和条件：
Agilent1260液相色谱仪，泵的型号为G1311A，紫外检测器型号G1315D，及Chemstation处理软件，色谱柱：Agilent ZorbaxSB-C18(250*4.6mm，5μm)，蒸发光散射检测器(ELSD)，溶剂为乙腈和水(80:20，v/v)，溶液浓度为20mg/ml，流动相：乙腈-0.1％甲酸水(55:45，v/v)，流速1ml/min，进样量20μl，ELSD的漂移管温度为38度；定量方式：已知杂质采用外标法，未知杂质及总杂采用1％的主成分对照品对产品的有关物质进行控制。
试验步骤：
取各杂质适量，精密称定，从定量限浓度至10倍定量限浓度，均匀配制5个浓度点，进行线性测定。
表9：试验结果：
| 杂质代码 | 线性范围(μg/ml) | 相关系数(R<sup>2</sup>) |
| SM1 | 5.12-51.2 | 0.998 |
| D-3 | 16.42-164.2 | 0.999 |
| D-5 | 10.57-105.7 | 0.999 |
| D-6 | 12.48-124.8 | 0.999 |
| OBDS | 15.75-157.5 | 0.999 |
结论：考虑原研产品暂未上市，杂质限度均未知，因此均在定量限浓度向上增大10倍浓度，取5个点做线性实验，线性关系良好。
实施例9：该方法的准确度测试
仪器和条件：
Agilent1260液相色谱仪，泵的型号为G1311A，紫外检测器型号G1315D，及Chemstation处理软件，色谱柱：Agilent ZorbaxSB-C18(250*4.6mm，5μm)，蒸发光散射检测器(ELSD)，溶剂为乙腈和水(80:20，v/v)，溶液浓度为20mg/ml，流动相：乙腈-0.1％甲酸水(55:45，v/v)，流速1ml/min，进样量20μl，ELSD的漂移管温度为38度；定量方式：已知杂质采用外标法，未知杂质及总杂采用1％的主成分对照品对产品的有关物质进行控制。
试验步骤：
对照品溶液：取SM1对照品适量，精密称定，置容量瓶中，稀释剂稀释定容至刻度，摇匀即得(浓度为0.1mg/ml)。
供试品溶液：取OBDS样品适量，精密称定，置容量瓶中，稀释剂稀释定容至刻度，摇匀即得(浓度为20mg/ml)。
回收率测试溶液：取SM1对照品，精密称定，加入供试品溶液中，SM1加入浓度分别为限度浓度的50％、100％、150％。
表10：试验结果：
结论：对奥贝胆酸终产品步骤中的残留杂质进行回收率测定，由以上数据可知，针对该杂质，方法准确度符合要求。
Claims (9)
1.一种奥贝胆酸有关物质的检测方法，步骤为：1)使用乙腈和水混合溶剂溶解奥贝胆酸得到样品，其中所述样品的浓度为15-30mg/ml；2)通过HPLC-ELSD对所述样品进行检测，色谱条件为：使用C18耐酸色谱柱，流动相为乙腈和0.1％甲酸；3)所述样品中的已知杂质采用外标法，未知杂质及总杂采用1％的主成分作为对照品，对奥贝胆酸的有关物质进行控制；其中所述有关物质包括3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸、鹅去氧胆酸、3α-羟基-6-亚乙基-7-氧代-5β-胆烷-24-酸甲酯、3α-羟基-6α-乙基-7-氧代-5β-胆烷-24-酸甲酯和3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷-24-酸甲酯；其中所述流动相中乙腈和0.1％甲酸的体积比为50:50-60:40。
2.如权利要求1所述的检测方法，所述混合溶剂中乙腈和水体积比为75:25-85:15。
3.如权利要求1或2所述的检测方法，其中所述样品的浓度为20mg/ml。
4.如权利要求3所述的检测方法，其中所述ELSD的漂移管温度为35-40度。
5.如权利要求3所述的检测方法，其中所述色谱柱为ZORBAX SB-C18色谱柱。
6.如权利要求3所述的检测方法，其中所述流动相中乙腈和0.1％甲酸的体积比为55:45。
7.如权利要求3所述的检测方法，其中所述流动相的流速为0.2-1.2ml/min。
8.如权利要求7所述的检测方法，其中所述流动相的流速为1.0ml/min。
9.如权利要求3所述的检测方法，所述混合溶剂中样品的浓度为20mg/ml，所述ELSD的漂移管温度为35-40度,所述色谱柱为ZORBAX SB-C18色谱柱,所述流动相中乙腈和0.1％甲酸的体积比为55:45,所述流动相的流速为1.0ml/min。
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