CN108610415A - 一种抗体复合物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种抗体复合物的制备方法。本发明通过在冰冻条件下实现C端‑C端连接的二价或双特异性抗体复合物的制备，条件温和，反应速度快，收率较高。相比常规方法所生产的C端‑N端连接的二价或双特异性抗体复合物本发明能够得到更高的亲和力，相比现有制备C端‑C端连接的二价或双特异性抗体的二硫桥接法或点击化学法，本发明具有更好的特异性和稳定性，同时步骤较少，表现在只在C端生成的醛基进行连接，生成的腙键或肟键在生理条件下稳定并且用还原剂还原后不可逆。

Description

一种抗体复合物的制备方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种C端-C端(羧基端-羧基端)连接的二价或双特异性，以及多价或多特异性抗体复合物的制备方法，特别是纳米抗体复合物的制备方法。

背景技术

到目前为止，美国FDA已经批准超过50个单克隆抗体药物进入市场，这些药物在癌症，感染，自身免疫性疾病等病症的治疗上发挥了巨大的作用。据统计，2013年全球抗体药物的销售额达到750亿美元，占据全部生物药物销售额的一半。除了已经上市的单克隆抗体外，还有超过300个抗体处于研发当中。在这些抗体中，以抗体片段合成多价，多特异性的工程抗体由于其更优的特性正在占据越来越高的比重(Holliger,P.and P.J.Hudson(2005)."Engineered antibody fragments and the rise of single domains."NatureBiotechnology 23(9):1126-1136)。多价或多特异性抗体相比抗体单体而言具有以下几方面的优势。第一，因为具有多抗原结合部位，多价或多特异性抗体具有更高的亲和力，所以以在体内或体外结合靶标分子更加快速和稳定。第二，由于分子量增加，从而延长在体内循环的的半衰期，使得药物作用时间变长。第三，多特异性抗体能够识别不同的抗原，这赋予了常规抗体所没有的新功能。例如应用于特异性T细胞募集(bispecific T cell engager,BiTE)以杀伤肿瘤细胞，其中以单链可变区抗体(Single chain fragment variable,scFv)作为单元构筑的双特异性抗体(Blinatumomab)能够有效的治疗白血病和非霍奇金淋巴瘤，已于2014年底由美国FDA批准上市。除此之外多特异性还被广泛应用于治疗体内多种毒素或病原体以及体外诊断等领域，具有广阔的应用前景和市场。

现有制备二价或双特异性，以及多价或多特异性抗体大部分采用的是重组基因表达技术，具体表现为将抗体片段的基因序列顺序连接起来，抗体基因序列之间插入柔性肽段的基因如甘氨酸丝氨酸重复序列或天然抗体铰链区的序列，以提高抗体单元的自由度(Cuesta,A.M.,et al.(2010).，Trends in Biotechnology 28(7):355-362)。这种常规方法虽然已经被广泛的应用，但是其技术属性决定其只能合成C端-N端(羧基端-氨基端)连接的多抗体复合物。由于抗体活性区域大多在N端附近，所以C端-N端连接的方式容易造成N端的空间位阻影响抗体的活性(van Lith,S.A.M.,et al.(2017)，Bioconjug Chem 28(2):539-548)。因此，发展C端-C端连接的技术是最为理想的方式。现有C端-C端连接的技术多采用二硫键桥接和点击化学法，二硫键桥接法多不稳定而且易受本地二硫键影响，而点击化学法过程较多而且复杂(Witte,M.D.,et al.(2012)，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 109(30):11993-11998)，因此急需发展一种简便的稳定的C端-C端连接技术。

现有多价或多特异性抗体的构筑单元主要有scFv和纳米抗体(nanobody,singledomain antibody,sdAb)两种。纳米抗体也称单域抗体，是发现于骆驼科体内的一种抗体分子。其大小只有常规单克隆抗体的十分之一，却具备与其相当的抗原结合能力；在稳定性，原核表达，结合隐藏抗原表位等方面更胜一筹。由于相比scFv具有更小的结构，所以纳米抗体更加适合做为多价或多特异性抗体的构筑单元，具有广阔的应用前景和市场(Muyldermans,S.(2013).Vol 82 82:775-797)。

由于二价或双特异性，多价或多特异性抗体的重要作用，已有C端-N端连接合成方式需要改良，发展简单的稳定的C端-C端连接是一种最理想的合成方式。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了用于以单域抗体或纳米抗体为构筑单元合成共价的C端-C端连接的二价抗体复合物的方法。

一种C端-C端连接的二价抗体或双特异性抗体复合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)通过基因重组在抗体的C末端融合FGE识别氨基酸序列，通过体外加入FGE进行催化，得C末端定点醛基修饰的抗体；

(2)将C末端定点醛基修饰的抗体与醛基反应性同双官能接头，在冰冻条件下反应，得二价抗体复合物，其中所述C末端定点醛基修饰的抗体与醛基反应性同双官能接头的摩尔比为1:0.4～1.2；

(3)将C末端定点醛基修饰的抗体与醛基反应性同双官能接头，在冰冻条件下反应，得单一同双官能接头连接的抗体，其中所述C末端定点醛基修饰的抗体与醛基反应性同双官能接头的摩尔比为1:5～15；

(4)将步骤(3)得到的抗体和C末端定点醛基修饰的抗体，在冰冻条件下反应，得双特异性抗体复合物，其中步骤(3)得到的抗体和C末端定点醛基修饰的抗体的可变区不同。

进一步，在上述技术方案中，在步骤(2)、步骤(3)以及步骤(4)中，所述的冰冻条件为-5℃～30℃，优选为-10℃～25℃，更优选为-20℃。

进一步，在上述技术方案中，在步骤(2)、步骤(3)以及步骤(4)中，所述的在冰冻条件下反应是指在-5℃～-30℃的温度下反应2～48h，所述温度优选-10℃～-25℃，更优选为-20℃，所述反应时间优选为10-30h，更优选为24h。

进一步，在上述技术方案中，在步骤(2)、步骤(3)以及步骤(4)中，所述的在冰冻条件下反应的反应体系的pH值为4.0～7.5，pH值优选为4-5，更优选为4。

进一步，在上述技术方案中，在步骤(1)中，所述抗体为纳米抗体、单链抗体scFV或可变区抗体Fab。

进一步，在上述技术方案中，在步骤(1)中，所述的FGE识别氨基酸序列为含有半胱氨酸-X-脯氨酸-X-精氨酸，所述X为任意天然氨基酸，优选FGE识别氨基酸序列为LCTPSR。进一步，在上述技术方案中，在步骤(2)、步骤(3)中，所述的醛基反应性同双官能接头为R-L-R，其中R为包含氨基、酰肼基、氧氨基、苯肼基或吡啶肼基的醛基反应性基团，L为具有-(CH₂CH₂-O)n和/或-(O-CH₂CH₂)n作为构成单元的聚合物，其中，n为1至100的整数，n优选为1到50，更优选为10到30。

进一步，在上述技术方案中，所述FGE的基因编码序列来源于结核分枝杆菌或人类。

进一步，在上述技术方案中，在步骤(3)中，将在冰冻条件下反应后的反应产物，通过体积排阻层析分离，得单一同双官能接头连接的抗体。

进一步，在上述技术方案中，在步骤(4)中，所述的步骤(3)得到的抗体与C末端定点醛基修饰的抗体的摩尔比为1:1～3。

在上述技术方案中，在步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)中所述的反应体系中还加入还原剂，将生成的C＝N双键还原成C-N单键可增加腙键或者肟键的稳定性，对于所述还原剂以及其加入量不做特别限定，本领域技术人员可以根据常规技术选择适当的还原剂以及加入量，优选地，还原剂可使用硼氢化钠、氰基硼氢化钠等，加入量为需还原物质摩尔量的10倍以上。

本发明中，所述的FGE为甲酰甘氨酸生成酶，所述的C端-C端连接的二价抗体复合物是指两个相同的抗体各自通过羧基端与同双官能接头连接而得到的二聚体，所述C端-C端连接的双特异性抗体复合物是指两个具有不同可变区的抗体各自通过羧基端与同双官能接头连接而得到的具有双特异性的抗体复合物。所述单一同双官能接头连接的抗体是指同双官能接头两端中只有一端连接了抗体而形成的复合物。

本发明优选的技术方案中，所述的C末端定点醛基修饰的抗体，可以按照如下方法制备得到：

①在抗体的基因序列3’端加入甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的识别肽段的基因序列，将该重组基因连接于载体，转入大肠杆菌表达宿主菌或毕赤酵母或哺乳动物细胞等宿主细胞中进行重组表达，表达的抗体经提取、纯化得3’端(C-端)融合有FGE识别氨基酸序列的重组抗体，所述提取以及纯化均可以采用本领域常规的方法进行，如纯化可采用金属螯合亲和层析初步纯化，再经体积排阻层析精细纯化等；其中所述FGE识别肽段优选LCTPSR，所述质粒优选pET21a或pET23a；

②在体外，将该重组抗体和一定量的FGE混合，在适当的缓冲液条件和温度下FGE催化重组抗体的C-端的标签转化为侧链带有醛基基团，即得到本发明所述的C末端定点醛基修饰的抗体，其中，所述重组抗体与FGE的加入量优选为按摩尔比1:5～10，缓冲液优选三乙醇胺-盐酸缓冲液，pH 7.0-9.0，缓冲液中加入1-5mM巯基乙醇，离子强度50-150mM氯化钠，催化温度优选18℃至30℃。

本发明优选的技术方案中，所述C端-C端连接的二价抗体复合物，可按如下方法制备得到：将上述得到的C末端定点醛基修饰的抗体与醛基反应性同双官能接头，按照摩尔比1:0.5～1.0混合，在-5℃～-30℃、pH 4-5的条件下反应2-24h，可完成醛基反应性同双官能接头与抗体C末端醛基的连接，从而形成共价稳定的C端-C端连接的二价抗体复合物，最终收率为50％左右。

本发明优选的技术方案中，所述C端-C端连接的双特异性抗体复合物，可按如下方法制备得到：

(1)将上述得到的C末端定点醛基修饰的抗体与醛基反应性同双官能接头，按照摩尔比1:5-15混合，在-5℃～-30℃、pH 4-5的条件下反应2-24h，可完成醛基反应性同双官能接头与抗体C末端醛基的连接，获得单一同双官能接头连接的抗体；其中，优选地，反应产物可经体积排阻色谱分离，得纯化的单一同双官能接头连接的抗体，用于下一步反应。

(2)将上述步骤(1)得到的单一同双官能接头连接的抗体与C末端定点醛基修饰的抗体按照摩尔比1:1～3混合，在-5℃～-30℃、pH 4-5的条件下反应2-24h，其中，单一同双官能接头连接的抗体与C末端定点醛基修饰的抗体的可变区不同，从而可得到C端-C端连接的双特异性抗体复合物，最终收率为30％左右。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：

本发明通过在冰冻条件下实现C端-C端连接的二价或双特异性抗体复合物，条件温和，反应速度快，收率较高。相比常规方法所生产的C端-N端连接的二价或双特异性抗体复合物本发明能够得到更高的亲和力(如图1)，所述亲和力是基于表面等离子体共振所测得平衡解离常数。相比现有制备C端-C端连接的二价或双特异性抗体的二硫桥接法或点击化学法，本发明具有更好的特异性，同时步骤较少，表现在只在C端生成的醛基进行连接，生成的腙键或肟键在生理条件下稳定并且用还原剂还原后不可逆，同时由于添加了聚乙二醇的接头，其血液半衰期能够延长。

附图说明

图1为一纳米抗体的结构、通过传统方法制备C-N连接的二价或双特异性纳米抗体结构以及通过本发明制备C-C连接的二价或双特异性纳米抗体结构的示意图。

图2A为使用荧光分子对醛基化修饰纳米抗体进行标记，在SDS-PAGE上对其分离的结果，图2B为在高效液相色谱法联用点喷雾电离轨道离子阱质谱对醛基化修饰纳米抗体精确定量，所示图谱为去卷积后分子量-丰度图。

图3为加入双酰肼功能化PEG400连接头，在不同pH值和温度下反应后24小时后的产物在SDS-PAGE上的分离结果。

图4A为高效液相色谱法测定二价抗体产率在-20℃冰冻温度下随时间的变化，图4B为在不同温度下二价纳米抗体产率随时间的变化。

图5A为分别加入不同长度连接头的二价纳米抗体在SDS-PAGE上的分离结果，图5B为体积排阻层析对含有不同长度接头二价纳米抗体的分离纯化。

图6为利用体积排阻层析对连接了同双官能接头的纳米抗体B单体进行分离

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。

下述实施例中所用的材料：

纳米抗体A：编码基因序列如SEQ ID NO.1，其中第511-528位的序列ctgtgcaccccgtctcgt为FGE识别序列；

纳米抗体B：编码基因序列如SEQ ID NO.2，其中第499-516位的序列ctgtgcaccccgtctcgt为FGE识别序列。

实施例1纳米抗体的C末端定点修饰

将纳米抗体A的编码基因序列克隆至表达载体质粒pET23a中，导入大肠杆菌T7Shuffle(DE3)中进行表达，收集菌体，并细胞破碎，从细胞破碎上清中利用金属螯合亲和层析HisTrap HP 5mL(GE Healthcare)纯化纳米抗体，最终产量在100毫克每升发酵液左右。将纯化的纳米抗体经超滤浓缩换液至三乙醇胺缓冲液(25mM TEAM，pH9.0，150mM NaCl，1mM巯基乙醇)，纳米抗体浓度为5mg/mL，加入最终浓度为纳米抗体摩尔量约十分之一即1mg/mL的纯度为>90％FGE酶(FGE酶分子量约为33kDa，纳米抗体分子量约为18kDa)，在18℃条件下温和震荡催化反应20小时，反应后离心去除蛋白沉淀，得到羧基端定点醛基化修饰的纳米抗体A，命名为纳米抗体A0。

用高效液相色谱联用高分辨电喷雾电离质谱准确检测醛基修饰效率，图2B所示为蛋白质质谱图去卷积后分子量-丰度图，在图谱中可见修饰前和修饰后的蛋白质(纳米抗体)谱峰，醛基化修饰后，蛋白的分量约减少18Da，通过比较两者的积分峰面积可以确定蛋白的醛基化修饰效率。也可以将反应后的蛋白溶液经超滤浓缩换液至酸性缓冲液(如0.1M醋酸缓冲液pH 4.0含150mM NaCl)，随后加入终浓度为500μmol/L带有酰肼基团的荧光分子Lucifer Yellow CH lithium slat(Thermo Fisher)对醛基进行标记，经SDS-PAGE的分析也可对C末端醛基修饰效率初步定量，如图2A所示，由于标记上Lucifer Yellow荧光分子，蛋白在紫外成像下可见明显荧光，同时蛋白由于标记上一个荧光分子导致分子量增加在SDS-PAGE上表现为迁移率降低，对比没有标记上的蛋白条带向上迁移，可通过灰度扫描粗略对醛基化修饰进行定量。

实施例2在冰冻条件下实现制备C-C连接二价纳米抗体

将实施例1制备得到的羧基端定点醛基化修饰的纳米抗体A(纳米抗体A0)超滤浓缩换液至酸性缓冲液，0.1M醋酸缓冲液pH 4.0或0.1M MES缓冲液pH5.5，或者中性缓冲液0.2M PBS pH7.4，纳米抗体A0的浓度为2mg/mL即100μmol/L。取一定量配置好的纳米抗体A0，加入双官能接头HZ-PEG-HZ 400(双酰肼聚乙二醇-400)和还原剂氰基硼氢化钠，其中HZ-PEG-HZ 400和氰基硼氢化钠在反应体系中的终浓度分别为50μmol/L和1mmol/L，即，在反应体系中PEG与纳米抗体的摩尔比为1:2，氰基硼氢化钠和纳米抗体的摩尔比为10:1。将加入好的反应混合物，放入低温槽中降温至-30℃，使反应混合物成为冰冻状态，然后调整至不同温度，分别为-30℃，-20℃，-10℃以及-5℃，反应0～25h。其中，将反应混合物成为冰冻状态然后调整至各反应温度，这样能够缩短样品结冰的时间，从而缩短反应时间，本发明中将所述反应混合物直接放入相应温度也可以。另外，还设有37℃和-80℃反应条件，即如上所述，换液至不同酸性缓冲液的纳米抗体中，加入HZ-PEG-HZ 400和还原剂(加入量同上)后，将反应液温度调整至37℃和-80℃后，继续反应0～25h。图3为在不同pH值和温度下反应24小时后的反应产物在SDS-PAGE上的电泳图，可见在-20℃度和pH 4.0的条件下可见明显的二价纳米抗体条带。

将反应后的溶液用氢氧化钠调节pH至中性，随后通过高效液相色谱法将反应后的混合物进行分离分析并对比相应峰积分面积可计算反应收率。图4A为高效液相色谱法测定二价抗体产率在-20℃冰冻温度下随时间的变化，图4B为在不同温度下二价纳米抗体产率随时间的变化。可见，在反应24小时左右收率可达到最大，-30℃和-5℃均反应较慢。在-10℃到-20℃区间内反应能较快发生。在-10℃到-20℃区间，二价纳米收率为30％至50％之间。

图5A为上述分别加入不同长度连接头的反应产物在SDS-PAGE上的电泳图，其中泳道M为蛋白Marker，1-4泳道依次别为纳米抗体A0(终浓度100μmol/L)中加入双功能接头(终浓度50μmol/L)，O-linker、HZ-PEG-HZ 400、HZ-PEG-HZ1000和HZ-PEG-HZ2000后的反应产物，5-8依次为纳米抗体B0(终浓度100μmol/L)中加入双功能接头(终浓度50μmol/L)，O-linker、HZ-PEG-HZ400、HZ-PEG-HZ1000和HZ-PEG-HZ2000后的反应产物。图5A中可见，泳道1-8在40kDa左右均出现一定量的二价纳米抗体条带，表明对纳米抗体A0和B0而言，加入不同长度的双功能接头，在冰冻条件下反应后均可以生成一定量的二价纳米抗体。图5B为上述分别加入不同长度连接头的反应产物通过体积排阻层析分离纯化的结果色谱图。图5B中可见，反应后溶液中还会残留有单体，连接了接头的单体和二价抗体，其中二价抗体能够很好的被分离出来进行下一步的研究。

实施例3冰冻法制备C-C连接的双特异性纳米抗体

(1)将纳米抗体B的编码基因序列克隆至表达载体质粒pET23a中，导入大肠杆菌T7Shuffle(DE3)中进行表达，收集菌体，并细胞破碎，从细胞破碎上清中利用金属螯合亲和层析HisTrap HP 5mL(GE Healthcare)纯化纳米抗体，最终产量约为100毫克每升发酵液。将纯化的纳米抗体经超滤浓缩换液至三乙醇胺缓冲液(25mM TEAM，pH 9.0，150mM NaCl，1mM巯基乙醇)，纳米抗体浓度为5mg/mL，加入最终浓度为纳米抗体摩尔量约十分之一即1mg/mL的纯度为>90％FGE酶(FGE酶分子量约为33kDa，纳米抗体分子量约为18kDa)，在18℃条件下温和震荡催化反应20小时，反应后离心去除蛋白沉淀，得到羧基端定点醛基化修饰的纳米抗体B，命名为纳米抗体B0。

(2)将上一步所得纳米抗体B0超滤浓缩换液至酸性缓冲液(0.1M醋酸缓冲液pH4.0，含150mM NaCl)，终浓度为2mg/mL即100μmol/L。取一定量配置好的纳米抗体B0，分别加入不同长度双功能接头，O-linker、HZ-PEG-HZ400、HZ-PEG-HZ1000和HZ-PEG-HZ2000，双功能接头在反应体系中的终浓度为1mmol/L，即，在反应体系中双功能接头与纳米抗体的摩尔比为10:1，另外加入终浓度1mmol/L的氰基硼氢化钠。将该反应混合物，在-20℃冰冻条件下反应24小时。

所述体积排阻层析分离步骤如下：将反应产物，放置室温升温，待融化后加入1MNaOH溶液调节pH值为中性，随后通过体积排阻色谱柱Superdex 75Increase 10/300GL(GEHealthcare)，用20mM磷酸盐150mM NaCl pH7.4缓冲液作为运行溶液以0.6mL/min的速度进行分离，收集各个组分，通过SDS-PAGE验证条带。最后保留连接了同双官能接头的纳米抗体B单体，如图6所示。图6A为不同接头过量加入后的产物在体积排阻层析上分离纯化的色谱峰图，图6B为不同色谱峰的SDS-PAGE鉴定(泳道0、3、6、10分别为过量加入双功能接头O-linker、HZ-PEG-HZ400、HZ-PEG-HZ1000和HZ-PEG-HZ2000后的反应产物，其余泳道为图6A中对应的色谱峰组分)。可见，一定量的连接了接头的纳米抗体可以有效得被分离纯化以用于下一步的研究。

(3)上一步所得的连接了同双官能接头的纳米抗体B与等摩尔比的实施例1中的醛基化修饰纳米抗体A混合，并将反应溶液用醋酸调至pH 4.0，另外加入终浓度1mmol/L的氰基硼氢化钠，随后在-20℃下反应至少24小时，所得反应后产物通过体积排阻色谱柱Superdex 75Increase 10/300GL分离可得C-C连接的双特异性纳米抗体A-B。收率为20％到40％。

实施例4二价及双特异性纳米抗体的亲和常数测定

通过表面等离子体共振(SPR)确定二价或者双特异性纳米抗体与抗原的结合亲和力和动力学参数，所述表面等离子体共振在使用CM5传感器芯片和HBS-EP(10mM HEPES(pH7.4)，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％v/v P20)运行缓冲液的Biacore T200上进行。通过EDC/NHS法将抗原β2微球蛋白通过氨基偶联在芯片表面，最终固载量约为700Ru。各个循环测定由以下步骤组成：首先用120秒注射二价或双特异性纳米抗体，然后监控解离180秒，每个循环后注射60秒glycine-hcl缓冲液(10mM,pH 1.5)以再生。使用Biacore评估软件，通过所得的传感图以标准1：1结合模型全局拟合，确定动力学参数。由表1所示，A0为C末端醛基化修饰的纳米抗体A，B0为C末端醛基化修饰的单体纳米抗体B，A1-A4为采用本发明方法以A0为单元构筑的C-C连接二价纳米抗体，A1采用两端是氧氨基的接头，即O-linker，A2采用两端是酰肼基的PEG400接头即HZ-PEG-HZ 400，A3采用两端是酰肼基的PEG1000接头即HZ-PEG-HZ 1000，A4采用两端是酰肼基的PEG2000接头即HZ-PEG-HZ 2000，其中，连接二价纳米抗体反应温度均为-20℃，反应时间为24h，反应体系pH值为4.0。B1-B5为采用本发明方法以B0为单元构筑的C-C连接二价纳米抗体，具体的含义同A1-A5，反应条件同上。C1-C4为采用本发明方法以纳米抗体A0和B0为单元构筑的C-C连接的双特异性纳米抗体，C1采用两端是氧氨基的接头即O-linker，C2采用两端是酰肼基的PEG400接头即HZ-PEG-HZ 400，C3采用两端是酰肼基的PEG1000接头即HZ-PEG-HZ 1000，C4采用两端是酰肼基的PEG2000接头即HZ-PEG-HZ 2000，其中，连接抗体反应温度均为-20℃，反应时间为24h，反应体系pH值为4.0。A5和B5为基因重组表达C-N连接二价纳米抗体，C5和C6为基因重组表达C-N连接双特异性纳米抗体。所述C-N连接二价或双特异性纳米抗体为本领域常规方法制备得到，即将两段相同或不同的纳米抗体编码基因通过化学合成或PCR技术串联，两段基因之间的连接为编码柔性氨基酸序列的基因，本发明中采用3段重复的甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸柔性氨基酸序列作为接头，然后将合成后的基因转入表达质粒pET21a中，在大肠杆菌胞内进行表达。A5序列为SEQ ID NO.3，B5序列为SEQ ID NO.4，C5序列为SEQ ID NO.5，C6序列为SEQID NO.6。C5和C6为以纳米抗体A0和B0为单元构筑的基因重组表达C-N连接二价纳米抗体，C5连接顺序为A0-B0，C6的连接顺序为B0-A0，两者都采用3段重复的甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸柔性氨基酸序列作为接头。表1为，如以上所述.利用表面等离子体共振技术对不同长度C端-C端连接二价纳米抗体，双特异性纳米抗体，以及常规方法生产的C端-N端连接二价纳米抗体，双特异性纳米抗体的结合速率常数K_a，解离速率常数K_d以及所得出的亲和力常数K_D。

表1.

表1的结果显示：用表面等离子体共振检测，C-N构建的及C-C构建的二价纳米抗体或双特异性抗体在亲和力上相比其单体均有不同程度提升，其中C-C连接的A1和A2相比C-N连接的A5亲和力高出20倍到30倍，同样的，B3和B4相比B5亲和力也高出20到30倍。C-C连接的双特异性抗体C1-C4亲和力要高出C-N连接的C5和C6约40到50倍。综上所述，C-C连接的二价或双特异性纳米抗体，在抗原结合能力上要优于C-N连接的抗体。

最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本申请所作的举例，是优选的实施例。而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本申请型的保护范围之中。

序列表

<110> 大连理工大学

<120> 一种抗体复合物的制备方法

<130> 2011

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 537

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

catatggccc aggtgcagct cgtggagtct gggggagggt tggtgcaggc tggggggtca 60

ctgagactct cctgtgcagc ctctggatcc actttggatt cttattacat aggctggttc 120

cgccaggccc caggcaaaga gcgcgagggg gtctcatgta ttagtagtag tggtaatagc 180

atacgttatg tagattccgt gaaggaccga ttcaccatct ctagagacaa cggcaagaac 240

acggcctatc tccacatcaa cagcctgaaa cctgaggaca cggccgttta ttactgtgca 300

gcgagtcgtc gagggcgcat accgggccta ccttgtagtt tagtacgtga acgctatgcc 360

tattggggcc aggggaccca ggtcaccgtg agctcagaac ccaagacacc aaaaccacaa 420

ccacaaccac aaccacaacc ccaaccggat cctacaacag aaggaggcgg tgggagccac 480

caccaccacc accacggagg cggtgggagc ctgtgcaccc cgtctcgtta actcgag 537

<210> 2

<211> 525

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

catatggccc aagttcaact gcaagaatct ggcggcggtt ctgttcaagc aggcggtagt 60

ctgcgtctga gttgtgcagc aagcggttat accgattccc gctattgtat ggcctggttt 120

cgtcaagctc cgggtaaaga acgcgagtgg gttgcacgta tcaacagcgg tcgcgatatc 180

acctactacg cagatagcgt taaaggccgc tttaccttca gccaggataa cgcgaaaaac 240

accgtctacc tgcagatgga tagtctggaa ccggaagata ccgcgaccta ttattgcgca 300

accgatatcc cgctgcgttg tcgcgatatt gtagcaaaag gcggcgacgg ttttcgttat 360

tggggtcaag gtacccaagt taccgtgagc tcagaaccca agacaccaaa accacaacca 420

caaccacaac cacaacccca acccaatcct acaacagaag aattccacca tcaccaccat 480

catggtggcg gtggttcgct gtgcaccccg tcccgttgac tcgag 525

<210> 3

<211> 1017

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 3

catatggccc aggtgcagct cgtggagtct gggggagggt tggtgcaggc tggggggtca 60

ctgagactct cctgtgcagc ctctggatcc actttggatt cttattacat aggctggttc 120

cgccaggccc caggcaaaga gcgcgagggg gtctcatgta ttagtagtag tggtaatagc 180

atacgttatg tagattccgt gaaggaccga ttcaccatct ctagagacaa cggcaagaac 240

acggcctatc tccacatcaa cagcctgaaa cctgaggaca cggccgttta ttactgtgca 300

gcgagtcgtc gagggcgcat accgggccta ccttgtagtt tagtacgtga acgctatgcc 360

tattggggcc aggggaccca ggtcaccgtg gaacccaaga caccaaaacc acaaccacaa 420

ccacaaccac aaccccaacc ggatcctaca acagaagaat tcggtggtgg aggctccggc 480

ggagggggta gtggcggcgg tggaagtaag cttgcccagg tgcagctcgt ggagtctggg 540

ggagggttgg tgcaggctgg ggggtcactg agactctcct gtgcagcctc tggatccact 600

ttggattctt attacatagg ctggttccgc caggccccag gcaaagagcg cgagggggtc 660

tcatgtatta gtagtagtgg taatagcata cgttatgtag attccgtgaa ggaccgattc 720

accatctcta gagacaacgg caagaacacg gcctatctcc acatcaacag cctgaaacct 780

gaggacacgg ccgtttatta ctgtgcagcg agtcgtcgag ggcgcatacc gggcctacct 840

tgtagtttag tacgtgaacg ctatgcctat tggggccagg ggacccaggt caccgtgagc 900

tcagaaccca agacaccaaa accacaacca caaccacaac cacaacccca accggatcct 960

acaacagaag gaggcggtgg gagccaccac caccaccacc accaccacta actcgag 1017

<210> 4

<211> 1005

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 4

catatggccc aagttcaact gcaagaatct ggcggcggtt ctgttcaagc aggcggtagt 60

ctgcgtctga gttgtgcagc aagcggttat accgattccc gctattgtat ggcctggttt 120

cgtcaagctc cgggtaaaga acgcgagtgg gttgcacgta tcaacagcgg tcgcgatatc 180

acctactacg cagatagcgt taaaggccgc tttaccttca gccaggataa cgcgaaaaac 240

accgtctacc tgcagatgga tagtctggaa ccggaagata ccgcgaccta ttattgcgca 300

accgatatcc cgctgcgttg tcgcgatatt gtagcaaaag gcggcgacgg ttttcgttat 360

tggggtcaag gtacccaagt taccgtggaa cccaagacac caaaaccaca accacaacca 420

caaccacaac cccaacccaa tcctacaaca gaagaattcg gaggcggtgg gagcggaggc 480

ggtgggagcg gaggcggtgg atccgcccaa gttcaactgc aagaatctgg cggcggttct 540

gttcaagcag gcggtagtct gcgtctgagt tgtgcagcaa gcggttatac cgattcccgc 600

tattgtatgg cctggtttcg tcaagctccg ggtaaagaac gcgagtgggt tgcacgtatc 660

aacagcggtc gcgatatcac ctactacgca gatagcgtta aaggccgctt taccttcagc 720

caggataacg cgaaaaacac cgtctacctg cagatggata gtctggaacc ggaagatacc 780

gcgacctatt attgcgcaac cgatatcccg ctgcgttgtc gcgatattgt agcaaaaggc 840

ggcgacggtt ttcgttattg gggtcaaggt acccaagtta ccgtgagctc agaacccaag 900

acaccaaaac cacaaccaca accacaacca caaccccaac ccaatcctac aacagaagga 960

ggcggtggga gccaccacca ccaccaccac caccactaac tcgag 1005

<210> 5

<211> 1008

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 5

catatggccc aggtgcagct cgtggagtct gggggagggt tggtgcaggc tggggggtca 60

ctgagactct cctgtgcagc ctctggatcc actttggatt cttattacat aggctggttc 120

cgccaggccc caggcaaaga gcgcgagggg gtctcatgta ttagtagtag tggtaatagc 180

atacgttatg tagattccgt gaaggaccga ttcaccatct ctagagacaa cggcaagaac 240

acggcctatc tccacatcaa cagcctgaaa cctgaggaca cggccgttta ttactgtgca 300

gcgagtcgtc gagggcgcat accgggccta ccttgtagtt tagtacgtga acgctatgcc 360

tattggggcc aggggaccca ggtcaccgtg gaacccaaga caccaaaacc acaaccacaa 420

ccacaaccac aaccccaacc ggatcctaca acagaagaat tcggaggcgg tgggagcgga 480

ggcggtggga gcggaggcgg tggatccgcc caagttcaac tgcaagaatc tggcggcggt 540

tctgttcaag caggcggtag tctgcgtctg agttgtgcag caagcggtta taccgattcc 600

cgctattgta tggcctggtt tcgtcaagct ccgggtaaag aacgcgagtg ggttgcacgt 660

atcaacagcg gtcgcgatat cacctactac gcagatagcg ttaaaggccg ctttaccttc 720

agccaggata acgcgaaaaa caccgtctac ctgcagatgg atagtctgga accggaagat 780

accgcgacct attattgcgc aaccgatatc ccgctgcgtt gtcgcgatat tgtagcaaaa 840

ggcggcgacg gttttcgtta ttggggtcaa ggtacccaag ttaccgtgag ctcagaaccc 900

aagacaccaa aaccacaacc acaaccacaa ccacaacccc aacccaatcc tacaacagaa 960

ggaggcggtg ggagccacca ccaccaccac caccaccact aactcgag 1008

<210> 6

<211> 1008

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 6

catatggccc aagttcaact gcaagaatct ggcggcggtt ctgttcaagc aggcggtagt 60

ctgcgtctga gttgtgcagc aagcggttat accgattccc gctattgtat ggcctggttt 120

cgtcaagctc cgggtaaaga acgcgagtgg gttgcacgta tcaacagcgg tcgcgatatc 180

acctactacg cagatagcgt taaaggccgc tttaccttca gccaggataa cgcgaaaaac 240

accgtctacc tgcagatgga tagtctggaa ccggaagata ccgcgaccta ttattgcgca 300

accgatatcc cgctgcgttg tcgcgatatt gtagcaaaag gcggcgacgg ttttcgttat 360

tggggtcaag gtacccaagt taccgtggaa cccaagacac caaaaccaca accacaacca 420

caaccacaac cccaacccaa tcctacaaca gaagaattcg gaggcggtgg gagcggaggc 480

ggtgggagcg gaggcggtgg atccgcccag gtgcagctcg tggagtctgg gggagggttg 540

gtgcaggctg gggggtcact gagactctcc tgtgcagcct ctggatccac tttggattct 600

tattacatag gctggttccg ccaggcccca ggcaaagagc gcgagggggt ctcatgtatt 660

agtagtagtg gtaatagcat acgttatgta gattccgtga aggaccgatt caccatctct 720

agagacaacg gcaagaacac ggcctatctc cacatcaaca gcctgaaacc tgaggacacg 780

gccgtttatt actgtgcagc gagtcgtcga gggcgcatac cgggcctacc ttgtagttta 840

gtacgtgaac gctatgccta ttggggccag gggacccagg tcaccgtgag ctcagaaccc 900

aagacaccaa aaccacaacc acaaccacaa ccacaacccc aaccggatcc tacaacagaa 960

ggaggcggtg ggagccacca ccaccaccac caccaccact aactcgag 1008

Claims (10)

1.一种C端-C端连接的二价抗体或双特异性抗体复合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)通过基因重组在抗体的C末端融合FGE识别氨基酸序列，通过体外加入FGE进行催化，得C末端定点醛基修饰的抗体；

(2)将C末端定点醛基修饰的抗体与醛基反应性同双官能接头，在冰冻条件下反应，得二价抗体复合物，其中所述C末端定点醛基修饰的抗体与醛基反应性同双官能接头的摩尔比为1:0.4～1.2；

(3)将C末端定点醛基修饰的抗体与醛基反应性同双官能接头，在冰冻条件下反应，得单一同双官能接头连接的抗体，其中所述C末端定点醛基修饰的抗体与醛基反应性同双官能接头的摩尔比为1:5～15；

(4)将步骤(3)得到的抗体和C末端定点醛基修饰的抗体，在冰冻条件下反应，得双特异性抗体复合物，其中步骤(3)得到的抗体和C末端定点醛基修饰的抗体的可变区不同。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)、步骤(3)以及步骤(4)中，所述的冰冻条件为-5℃～-30℃。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)、步骤(3)以及步骤(4)中，所述的在冰冻条件下反应是指在-5℃～-30℃下放置2～48h。

4.根据权利要求1～3的任一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)、步骤(3)以及步骤(4)中，所述的在冰冻条件下反应的反应体系pH值为4.0～7.5。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述抗体为纳米抗体、单链抗体scFV或可变区抗体Fab。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述的FGE识别氨基酸序列为含有半胱氨酸-X-脯氨酸-X-精氨酸，所述X为任意天然氨基酸。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)和步骤(3)中，所述的醛基反应性同双官能接头为R-L-R，其中R为包含氨基、酰肼基、氧氨基、苯肼基或吡啶肼基的醛基反应性基团，L为具有-(CH₂CH₂-O)n和/或-(O-CH₂CH₂)n作为构成单元的聚合物，其中，n为1至100的整数。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述FGE的基因编码序列来源于结核分枝杆菌或人类。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，将在冰冻条件下反应后的反应产物，通过体积排阻层析分离，得单一同双官能接头连接的抗体。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述的步骤(3)得到的抗体与C末端定点醛基修饰的抗体的摩尔比为1:1～3。