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CN108602878B - C端赖氨酸缀合免疫球蛋白 - Google Patents

C端赖氨酸缀合免疫球蛋白 Download PDF

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CN108602878B
CN108602878B CN201680074660.1A CN201680074660A CN108602878B CN 108602878 B CN108602878 B CN 108602878B CN 201680074660 A CN201680074660 A CN 201680074660A CN 108602878 B CN108602878 B CN 108602878B
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immunoglobulin
terminal lysine
acid residue
lysine
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Eisai Co Ltd
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Abstract

本文提供了缀合免疫球蛋白和使用微生物转谷氨酰胺酶产生缀合免疫球蛋白的方法。

Description

C端赖氨酸缀合免疫球蛋白
相关申请
本申请要求于2015年12月18日提交的美国临时申请No.62/269,138的优先权，其全部内容通过引用明确并入本文。
技术领域
本文提供了C端赖氨酸缀合免疫球蛋白及其制备方法。
背景技术
单克隆抗体的实用性从基础研究扩展到治疗和诊断应用。将抗体与功能剂缀合的能力甚至进一步扩展其功能。缀合抗体的制造通常涉及将接头、药物或其他功能剂缀合至单克隆抗体(mAb)的重(HC)和轻(LC)链上的反应性赖氨酸半胱氨酸残基。参见Deonarain,et al.,“Emerging formats for next-generation antibody drug conjugates”,ExpertOpinion in Drug Discovery(2015),10(5):463-481。赖氨酸缀合通常通过基于琥珀酰亚胺(NHS)或基于异硫氰酸酯的化学来介导。基于半胱氨酸的缀合需要部分还原抗体以破坏一些链间二硫键，从而产生游离硫醇侧链。硫醇反应性功能剂然后可以与抗体上的游离硫醇反应以产生抗体-药物缀合物(ADC)。这两种方法均导致多个赖氨酸或半胱氨酸的修饰，导致具有药物与抗体(DAR)比率的分布和随机位置处的药物修饰的ADC的非均质混合物。
近来推动利用位点特异性缀合技术作为产生具有限定的DAR的均质ADC产物的方式已经产生了几种方法，包括工程化未配对的半胱氨酸，引入非天然氨基酸和位点特异性酶促修饰。虽然这些方法产生均质产物，但它们各有缺点。基于半胱氨酸的缀合需要另外的步骤来去除未配对的半胱氨酸上的封端半胱氨酸，谷胱甘肽或甚至轻链。参见例如Junutula,et al.,“Site-Specific Conjugation of a Cytotoxic Drug to an AntibodyImproves Therapeutic Index”,Nature Biotechnology,(2008)26:925-932；Chen,etal.,“Charge-based Analysis of Antibodies with Engineered Cysteines”,MAbs(2009)1(6):563-571；Gomez,et al.,“Effect of temperature,pH,dissolved oxygen,and hydrolysate on the formation of triple light chain antibodies in cellculture”Biotechnol Progress(2010),26:1438-1445。此外，目前用于基于半胱氨酸的缀合物的基于马来酰亚胺的化学的血清不稳定性已被证明引起对效力丧失或脱靶毒性的担忧。Alley,et al.,“Contribution of Linker Stability to the Activities ofAnticancer Immunoconjugates”,Bioconjugate Chemistry(2008)19(3):759-765；Shen,et al.,“Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeuticactivity of antibody-drug conjugates”,Nature Biotechnology(2012)30:184-189。引入非天然氨基酸需要基于基因修饰细胞或无细胞体系中的表达。Hallam,et al.,“Unnatural Amino Acids in Novel Antibody Conjugates”,Future Med.Chem.(2014)6(11):1309-1324。此外，非天然氨基酸的存在可能引发患者的免疫原性应答。然而，位点特异性酶促修饰可潜在地利用抗体序列中天然的野生型氨基酸，从而使免疫原性的可能性最小化。此外，通常由蛋白质修饰酶形成的翻译后键非常稳定。
已经使用称为转谷氨酰胺酶的蛋白质家族研究了蛋白质的位点特异性酶促修饰，其催化在谷氨酰胺的γ-羧基酰胺基团(酰基供体)与赖氨酸的ε-氨基(酰基受体)之间形成稳定的异肽键(参见图1)(参见，例如，Yokoyama,et al.,“Properties and Applicationsof Microbial Transglutaminase”,Appl.Microbiol.Biotech.(2004)64:47-454；Strop,“Versatility of Microbial Transglutaminase”,Bioconjugate Chemistry,(2014)25(5):855-862；Kieliszek et al.,“Microbial Transglutaminase and its Applicationin the Food Industry”,Folia Microbiol(2014)59:241-250)。最近，几个团队已经探索利用转谷氨酰胺酶作为产生ADC的手段(参见例如Josten et al.,“Use of MicrobialTransglutaminase for the Enzymatic Biotinylation of Antibodies”,J.ImmunolMethods,(2000)240:47-54；Mindt et al.,“Modification of DifferentIgG1Antibodies via Glutamine and Lysine Using Bacterial and Human TissueTransglutaminase”,Bioconjugate Chemistry(2008)19(1):271-278)；Jeger,et al.,“Site-specific and stoichiometric modification of antibodies by bacterialtransglutaminase”Angew.Chem.Int.Ed.Engl.(2010)49:9995-9997；Strop et al.,“Location Matters:Site of Conjugation Modulates Stability andPharmacokinetics of Antibody Drug Conjugates”,Chem Biol(2013)20(2):161-167；Dennler et al.,“Transglutaminase-Based Chemo-Enzymatic Conjugation ApproachYields Homogeneous Antibody–Drug Conjugates”,Bioconjugate Chemistry(2014)25(3):569-578；Siegmund,et al.,“Locked by Design:A Conformationally ConstrainedTransglutaminase Tag Enables Efficient Site-Specific Conjugation”,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.(2015)54(45):13420-13424)。转谷氨酰胺酶存在于从细菌到人类的生物体中，其在结构和功能上相关，但每个都参与特定的细胞过程。从细菌Streptomyces mobaraensis中分离出的微生物转谷氨酰胺酶(微生物转谷氨酰胺酶)已广泛用于整个食品工业中，以将蛋白质交联在一起用于各种应用。除了低制造成本之外，由于其能够在广泛的pH，盐和温度条件下运行，因此它是一种有吸引力的缀合技术。
尽管经过二十年的研究，但微生物转谷氨酰胺酶的底物特异性尚未明确定义。通常，暴露的环上具有疏水性或带正电荷的相邻残基的谷氨酰胺或赖氨酸往往是优选的。参见Taguchi et al.,“Substrate specificity analysis of microbialtransglutaminase using proteinaceous protease inhibitors as natural modelsubstrates”,J.Biochem.(2000)128:415-425；Sugimura et al.,“Identification ofpreferred substrate sequences of microbial transglutaminase from Streptomycesmobaraensis using a phage-displayed peptide library”,Arch.Biochem.Biophys.(2008)477:379-383；Tagami et al.,“Substrate specificity of microbialtransglutaminase as revealed by three-dimensional docking simulation andmutagenesis”,Protein Eng.Des.Sel.(2009)22:747-752。已经发现酰基供体谷氨酰胺的含量比酰基受体赖氨酸更重要。参见例如Ohtsuka et al.,“Substrate specificities ofmicrobial transglutaminase for primary amines”,J.Agric.Food Chem.(2000)48:6230-6233；Ohtsuka et al.,“Comparison of substrate specificities oftransglutaminases using synthetic peptides as acyl donors”,Biosci.Biotechnol.Biochem.(2000)64:2608-2613；Gundersen et al.,“Microbialtransglutaminase displays broad acyl-acceptor substrate specificity”,Appl.Microbiol.Biotechnol.(2013)98:219-230。
由于微生物转谷氨酰胺酶对酰基受体胺的特异性较低，迄今为止的研究仅集中于抗体谷氨酰胺残基的转酰胺基化。参见Josten et al.,Mindt et al.,Jeger et al.,Strop et al.,Dennler et al.,和Siegmund et al.上文引用。人IgG由平均80个赖氨酸组成，其中80-90％被预测为是溶剂暴露的(Gautier et al.,“Lysine ConjugatedProperties in Human IgGs Studied by Integrating High-Resolution Native MassSpectrometry and Bottom-Up Proteomics”,Proteomics(2015)15(16):2756-2765；数据未示出)，并且IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4的C端密码子是赖氨酸(Ellison et al.,DNA(1981)1:11-18；Ellison et al..(“Ellison et al..2”),Proc.Nat.Acad.Sci.USA,(1982)79:1984-1988；Ellison et al.,Nucleic Acid Res.(1982)10:4071-4079)。然而，血清衍生IgG缺乏该赖氨酸(Wang et al.,J.Immunol.(1980)125:1048-1054；Edelman et al.,ProcNatl Acad.Sci.USA(1969)63:78-85；Frangione et al.,Biochemistry(1980)19:4304-4308；Pink et al.,Biochem.J.(1970)117:33-47)。对IgD已经观察到相同情况(White etal.,Science(1985)228:733-737；Lin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1981)78:504-508；Shinoda et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1981)78:785-789)。IgG1在HEK293和CHO细胞中的重组表达也导致缺乏C端Lys447的蛋白质(Ellison et al.；Harris et al.,Eur.J.Biochem.(1990)194:611-620；Harris,J.Chromatogr.A(1995)705:129-134；Dicket al.,Biotechnol.Bioeng.(2008)100:1132-1143)。
迄今为止，本领域普通技术人员认为，由于IgG表面上的反应性赖氨酸过多，利用基于胺供体的底物以使赖氨酸转酰胺化可产生非均质ADC产物(Josten等和Jeger等)，因此，使用基于胺供体的底物以使免疫球蛋白上的赖氨酸残基转酰胺化已被阻止。
因此，需要免疫球蛋白的位点特异性酶促修饰以产生具有可预测的缀合速率的缀合物。这将允许创建具有相对均质的DAR的ADC。
发明内容
本发明令人惊讶地公开了，虽然没有观察到通过微生物转谷氨酰胺酶修饰野生型免疫球蛋白赖氨酸，但是当使用C端氨基酸延伸，保护C端免疫球蛋白赖氨酸残基免受羧肽酶切割时，微生物转谷氨酰胺酶能够利用天然C端赖氨酸作为酰基受体。令人惊讶的是，使用微生物转谷氨酰胺酶缀合C端赖氨酸导致缀合功能剂的位点特异性和可预测的引入。
在一个方面，本文公开的是用于产生缀合免疫球蛋白的方法，所述方法包括孵育免疫球蛋白与微生物转谷氨酰胺酶和包含酰基供体底物的功能剂，其中所述免疫球蛋白包含C端赖氨酸之后的至少一个氨基酸残基，其中所述酰基供体底物包含谷氨酰胺残基，并且其中所述功能剂是治疗剂或诊断剂，其中所述微生物转谷氨酰胺酶将所述免疫球蛋白的所述C端赖氨酸缀合至所述功能剂上的所述酰基供体底物的所述谷氨酰胺残基，从而产生所述缀合免疫球蛋白。
在另一方面，本文公开了用于产生缀合免疫球蛋白的方法，所述方法包括i)孵育免疫球蛋白与微生物转谷氨酰胺酶和酰基供体底物，其中所述免疫球蛋白包含C端赖氨酸之后的至少一个氨基酸残基，并且其中所述酰基供体底物包含谷氨酰胺残基和反应性基团，其中所述微生物转谷氨酰胺酶将所述免疫球蛋白的所述C端赖氨酸缀合至所述酰基供体底物的所述谷氨酰胺残基，和ii)将功能剂缀合至所述酰基供体底物的所述反应性基团，其中所述功能剂是治疗剂或诊断剂，从而产生所述缀合免疫球蛋白。
在一个实施方式中，酰基供体底物的反应性基团通过点击化学与功能剂缀合。
在一个实施方式中，C端赖氨酸是免疫球蛋白的重链上的赖氨酸447(K447)。
在一个实施方式中，免疫球蛋白包含C端赖氨酸之后的一个氨基酸残基，并且C端赖氨酸之后的一个氨基酸残基为甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺或组氨酸。在另一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸之后包含一个氨基酸残基，并且其中C端赖氨酸之后的一个氨基酸残基不包含脯氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸或精氨酸。
在一个实施方式中，包含酰基供体底物的功能剂是根据式(I)或(II)之一：
(Z)m-Gln-(L)n-(Y) (I)
(Y)-(L)n-Gln-(Z)m (II)
其中Z是羧基苄氧基(CBZ)基团或氨基酸残基；Gln是谷氨酰胺氨基酸残基；每个L独立地为1至20个碳原子的直链或支链接头，其中一个或多个碳原子可以任选和独立地被氮、氧或硫原子替代，并且其中每个碳原子和氮原子可以任选地被取代；或每个L任选和独立地为氨基酸残基；m是0至5的整数；n是0至5的整数；Y是功能剂。
在一个实施方式中，包含酰基供体底物的功能剂是根据式(I)，并且其中Z是CBZ基团；其中L为聚乙二醇部分(PEG)(-O((CH2)2)-)，乙胺(-NH((CH2)2)-)或丙胺(-NH((CH2)3)-)；并且其中n是0、1、2或3。在一个实施方式中，L是聚乙二醇部分(PEG)。在另一个实施方式中，L包含一个或多个氨基酸和聚乙二醇部分(PEG)。在另一个实施方式中，包含酰基供体底物的功能剂是根据式(I)，其中Z是CBZ基团，并且其中L是氨基酸。在一个实施方式中，L是Gly；m是1；并且n是1。在另一个实施方式中，包含酰基供体底物的功能剂是根据式(II)，其中Z是CBZ基团；m是1；n是2、3或4；并且至少一个L是Gly；并且至少一个L是PEG部分。在另一个实施方式中，包含酰基供体底物的功能剂是根据式(II)，其中Z是CBZ基团；m是1；n是4；一个L是Gly并且其余三个L基团各自是PEG部分。
在一个实施方式中，酰基供体底物是根据式(III)或(IV)之一：
(Z)m-Gln-(L)n-(X) (III)
(X)-(L)n-Gln-(Z)m (IV)
其中Z是羧基苄氧基(CBZ)基团或氨基酸残基；Gln是谷氨酰胺氨基酸残基；每个L独立地为1至20个碳原子的直链或支链接头，其中一个或多个碳原子可以任选和独立地被氮、氧或硫原子替代，并且其中每个碳原子和氮原子可以任选地被取代；或每个L任选和独立地为氨基酸残基；m是0至5的整数；n是0至5的整数；X是反应性基团。
在一个实施方式中，L是聚乙二醇部分(PEG)。在另一个实施方式中，当n是2-5时，至少一个L包含一个或多个氨基酸，另一个L是聚乙二醇(PEG)部分。在一个实施方式中，酰基供体底物是根据式(III)，并且其中Z是CBZ基团；L为聚乙二醇部分(PEG)(-O((CH2)2)-)，乙胺(-NH((CH2)2)-)或丙胺(-NH((CH2)3)-)；并且其中n是0、1、2或3。在另一个实施方式中，酰基供体底物是根据式(III)，其中Z是CBZ基团，并且其中L是氨基酸。在一个实施方式中，L是Gly；n是1；并且m是1。在另一个实施方式中，酰基供体底物是根据式(IV)，其中Z是CBZ基团；m是1；n是1、2或3；并且至少一个L是Gly。
在另一个实施方式中，X是选自(1R,8S,9S)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇(BCN)，
Figure BDA0001700550010000081
反式环辛烯(TCO)，叠氮化物(N3)，炔烃，四嗪甲基环丙烯，降冰片烯，酰肼/肼和醛的反应性基团。
在一个实施方式中，治疗剂是抗体或其抗原结合部分，化学治疗剂，药物剂，放射性剂，细胞毒性剂，抗生素，小分子，核酸或多肽。在另一个实施方式中，诊断剂是荧光团，荧光染料，放射性核素或酶。
在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸之后具有两个氨基酸残基，其包含C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基和C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基是除天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸之外的任何氨基酸残基，并且其中C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，脯氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，色氨酸和甘氨酸。在另一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基是赖氨酸或精氨酸。在另一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，赖氨酸，半胱氨酸，色氨酸，精氨酸，丝氨酸和甘氨酸。
在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸之后具有三个氨基酸残基，其包含C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基，C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基和C端赖氨酸之后的第三氨基酸残基，其中C端赖氨酸之后的第三氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，脯氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，色氨酸和甘氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基不是天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，赖氨酸，半胱氨酸，色氨酸，精氨酸，丝氨酸和甘氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基不是天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，赖氨酸，半胱氨酸，色氨酸，精氨酸，丝氨酸和甘氨酸。
在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸之后具有四个氨基酸残基，其包含C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基，C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基，C端赖氨酸之后的第三氨基酸残基和C端赖氨酸之后的第四氨基酸残基，其中C端赖氨酸之后的第四氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，脯氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，色氨酸和甘氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基不是天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，赖氨酸，半胱氨酸，色氨酸，精氨酸，丝氨酸和甘氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基不是天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，赖氨酸，半胱氨酸，色氨酸，精氨酸，丝氨酸和甘氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第三氨基酸残基不是天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第三氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，赖氨酸，半胱氨酸，色氨酸，精氨酸，丝氨酸和甘氨酸。
在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸之后具有五个氨基酸残基，其包含C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基，C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基，C端赖氨酸之后的第三氨基酸残基，C端赖氨酸之后的第四氨基酸残基和C端赖氨酸之后的第五氨基酸残基，其中C端赖氨酸之后的第五氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，脯氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，色氨酸和甘氨酸组成。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基不是天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，赖氨酸，半胱氨酸，色氨酸，精氨酸，丝氨酸和甘氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基不是天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，赖氨酸，半胱氨酸，色氨酸，精氨酸，丝氨酸和甘氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第三氨基酸残基不是天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第三氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，赖氨酸，半胱氨酸，色氨酸，精氨酸，丝氨酸和甘氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第四氨基酸残基不是天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第四氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，赖氨酸，半胱氨酸，色氨酸，精氨酸，丝氨酸和甘氨酸。
在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸之后具有少于9个氨基酸残基，并且其中C端赖氨酸之后的最后一个氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，脯氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，色氨酸和甘氨酸。
在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸之后具有少于13个氨基酸残基，并且其中C端赖氨酸之后的最后一个氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，脯氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，色氨酸和甘氨酸。
在一个实施方式中，微生物转谷氨酰胺酶来自Streptomyces mobarensis。
在一个实施方式中，免疫球蛋白是IgG1免疫球蛋白。在另一个实施方式中，免疫球蛋白是IgG2，IgG3或IgG4免疫球蛋白。在一个实施方式中，免疫球蛋白是不包含尾部附加物的IgA1，IgA2或IgM免疫球蛋白。在一个实施方式中，免疫球蛋白是IgD或IgE免疫球蛋白。
在一个实施方式中，免疫球蛋白是人免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。在一个实施方式中，免疫球蛋白是嵌合免疫球蛋白或非人免疫球蛋白。
在一个实施方式中，免疫球蛋白包含两条重链和两条轻链。在一个实施方式中，免疫球蛋白的两条重链之间不存在分子内交联。
在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为1:1至2:1。
另一方面，本文描述了包含免疫球蛋白和功能剂的缀合免疫球蛋白，其中免疫球蛋白在C端赖氨酸之后包含至少一个氨基酸残基，功能剂包含酰基供体底物，其中酰基供体底物包含谷氨酰胺残基，并且功能剂是治疗剂或诊断剂，其中免疫球蛋白的C端赖氨酸与功能剂的酰基供体底物的谷氨酰胺残基缀合。
另一方面，本文描述了包含免疫球蛋白和功能剂的缀合免疫球蛋白，其中免疫球蛋白包含C端赖氨酸之后的至少一个氨基酸残基，C端赖氨酸缀合至酰基供体底物上的谷氨酰胺残基，其中酰基供体底物还包含反应性基团，反应性基团缀合至功能剂，其中功能剂为治疗剂或诊断剂。
在一个实施方式中，C端赖氨酸是免疫球蛋白的重链上的赖氨酸447(K447)。
在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸之后包含一个氨基酸残基，并且其中C端赖氨酸之后的一个氨基酸残基是甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺或组氨酸。
在另一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸之后包含一个氨基酸残基，并且其中C端赖氨酸之后的一个氨基酸残基不是脯氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸或精氨酸。
在一个实施方式中，包含酰基供体底物的功能剂是根据式(I)或(II)之一：
(Z)m-Gln-(L)n-(Y) (I)
(Y)-(L)n-Gln-(Z)m (II)
其中Z是羧基苄氧基(CBZ)基团或氨基酸残基；Gln是谷氨酰胺氨基酸残基；每个L独立地为1至20个碳原子的直链或支链接头，其中一个或多个碳原子可以任选和独立地被氮、氧或硫原子替代，并且其中每个碳原子和氮原子可以任选地被取代；或每个L任选和独立地为氨基酸残基；m是0至5的整数；n是0至5的整数；Y是功能剂。
在一个实施方式中，包含酰基供体底物的功能剂是根据式(I)，并且其中Z是CBZ基团；其中L为聚乙二醇部分(PEG)(-O((CH2)2)-)，乙胺(-NH((CH2)2)-)或丙胺(-NH((CH2)3)-)；并且其中n是0、1、2或3。在另一个实施方式中，包含酰基供体底物的功能剂是根据式(I)，其中Z是CBZ基团，并且其中L是氨基酸。在一个实施方式中，L是Gly；m是1；并且n是1。在一个实施方式中，包含酰基供体底物的功能剂是根据式(II)，其中Z是CBZ基团；m是1；n是1、2或3；并且至少一个L是Gly。在一个实施方式中，L是聚乙二醇部分(PEG)。在另一个实施方式中，L包含一个或多个氨基酸和聚乙二醇部分(PEG)。
在一个实施方式中，酰基供体底物是根据式(III)或(IV)之一：
(Z)m-Gln-(L)n-(X) (III)
(X)-(L)n-Gln-(Z)m (IV)
其中Z是羧基苄氧基(CBZ)基团或氨基酸残基；Gln是谷氨酰胺氨基酸残基；每个L独立地为1至20个碳原子的直链或支链接头，其中一个或多个碳原子可以任选和独立地被氮、氧或硫原子替代，并且其中每个碳原子和氮原子可以任选地被取代；或每个L任选和独立地为氨基酸残基；m是0至5的整数；n是0至5的整数；X是反应性基团。
在一个实施方式中，酰基供体底物是根据式(III)，并且其中Z是CBZ基团；其中L为聚乙二醇部分(PEG)(-O((CH2)2)-)，乙胺(-NH((CH2)2)-)或丙胺(-NH((CH2)3)-)；并且其中n是0、1、2或3。在另一个实施方式中，酰基供体底物是根据式(III)，其中Z是CBZ基团，并且其中L是氨基酸。在一个实施方式中，L是Gly；m是1；并且n是1。在另一个实施方式中，酰基供体底物是根据式(IV)，其中Z是CBZ基团；m是1；n是1、2或3；并且至少一个L是Gly。在一个实施方式中，L是聚乙二醇部分(PEG)。在另一个实施方式中，当n是2-5时，则至少一个L包含一个或多个氨基酸，并且一个或多个L包含聚乙二醇部分(PEG)。
在一个实施方式中，X是选自(1R,8S,9S)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇(BCN)，
Figure BDA0001700550010000131
反式环辛烯(TCO)，叠氮化物(N3)，炔烃，四嗪甲基环丙烯，降冰片烯，酰肼/肼和醛的反应性基团。
在一个实施方式中，治疗剂是抗体或其抗原结合部分，化学治疗剂，药物剂，放射性剂，细胞毒性剂，抗生素，小分子，核酸或多肽。在另一个实施方式中，诊断剂是荧光团，荧光染料，放射性核素或酶。
在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸之后具有两个氨基酸残基，其包含C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基和C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基。
在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基是除天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸之外的任何氨基酸残基，并且其中C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，脯氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，色氨酸和甘氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基是赖氨酸或精氨酸。
在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸之后具有三个氨基酸残基，其包含C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基，C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基和C端赖氨酸之后的第三氨基酸，其中C端赖氨酸之后的第三氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，脯氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，色氨酸和甘氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基不是天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，赖氨酸，半胱氨酸，色氨酸，精氨酸，丝氨酸和甘氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基不是天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，赖氨酸，半胱氨酸，色氨酸，精氨酸，丝氨酸和甘氨酸。
在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸之后具有四个氨基酸残基，其包含C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基，C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基，C端赖氨酸之后的第三氨基酸残基和C端赖氨酸之后的第四氨基酸残基，其中C端赖氨酸之后的第四氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，脯氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，色氨酸和甘氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基不是天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，赖氨酸，半胱氨酸，色氨酸，精氨酸，丝氨酸和甘氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基不是天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，赖氨酸，半胱氨酸，色氨酸，精氨酸，丝氨酸和甘氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第三氨基酸残基不是天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第三氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，赖氨酸，半胱氨酸，色氨酸，精氨酸，丝氨酸和甘氨酸。
在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸之后具有五个氨基酸残基，其包含C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基，C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基，C端赖氨酸之后的第三氨基酸残基，C端赖氨酸之后的第四氨基酸残基和C端赖氨酸之后的第五氨基酸残基，其中C端赖氨酸之后的第五氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，脯氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，色氨酸和甘氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基不是天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，赖氨酸，半胱氨酸，色氨酸，精氨酸，丝氨酸和甘氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基不是天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，赖氨酸，半胱氨酸，色氨酸，精氨酸，丝氨酸和甘氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第三氨基酸残基不是天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第三氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，赖氨酸，半胱氨酸，色氨酸，精氨酸，丝氨酸和甘氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第四氨基酸残基不是天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第四氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，赖氨酸，半胱氨酸，色氨酸，精氨酸，丝氨酸和甘氨酸。
在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸之后具有少于9个氨基酸残基，并且其中C端赖氨酸之后的最后一个氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，脯氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，色氨酸和甘氨酸。
在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸之后具有少于13个氨基酸残基，并且其中C端赖氨酸之后的最后一个氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，脯氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，色氨酸和甘氨酸。
在一个实施方式中，免疫球蛋白是IgG1免疫球蛋白。在另一个实施方式中，免疫球蛋白是IgG2，IgG3或IgG4免疫球蛋白。在一个实施方式中，免疫球蛋白是不包含尾部附加物的IgA1，IgA2或IgM免疫球蛋白。在一个实施方式中，免疫球蛋白是IgD或IgE免疫球蛋白。
在一个实施方式中，免疫球蛋白是人免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。在一个实施方式中，免疫球蛋白是嵌合免疫球蛋白或非人免疫球蛋白。
在一个实施方式中，免疫球蛋白包含两条重链和两条轻链。在一个实施方式中，免疫球蛋白的两条重链之间不存在分子内交联。
在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为1:1至2:1。
在一个实施方式中，功能剂是抗体或其抗原结合部分，并且其中免疫球蛋白和功能剂结合相同的抗原或结合不同的抗原。
另一方面，本文描述了编码缀合免疫球蛋白的核酸。另一方面，本文描述了包含核酸的质粒。在另一个实施方式中，本文描述了包含质粒的分离的细胞。
另一方面，本文描述了包含缀合免疫球蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。
在一个方面，本文描述了通过本文所述的任何方法产生的缀合免疫球蛋白。
在一个实施方式中，所述方法进一步包括在将功能剂缀合至酰基供体底物的反应性基团之前，纯化缀合至酰基供体底物的谷氨酰胺残基的免疫球蛋白的步骤。在一个实施方式中，纯化步骤包括基于尺寸的方法，如层析或渗滤。在另一个实施方式中，纯化步骤包括基于电荷的分离，例如阴离子交换或阳离子交换色谱。在另一个实施方式中，纯化步骤包含基于亲和力的步骤，例如蛋白A或蛋白G层析。
附图说明
当结合附图阅读时，进一步理解概述以及以下详细描述。为了说明所公开的方法和缀合免疫球蛋白，在附图中示出了示例性实施方式；然而，所述方法和缀合免疫球蛋白不限于所公开的具体实施方式。在附图中：
图1显示转谷氨酰胺酶反应，其中转谷氨酰胺酶催化在酰基供体谷氨酰胺和酰基受体赖氨酸之间形成异肽键并释放氨分子。
图2显示示例性Z-Gln-Gly酰基供体底物的结构。
图3显示合成一些示例性Z-Gln-Gly酰基供体底物的可能途径。
图4，包括图4A，4B和4C，显示人IgG1Fab和Fc晶体结构中溶剂暴露的赖氨酸；使用具有1.4埃探针半径的Discovery Studio 4.5测定(A)Fab VH-CH1和Vκ-Cκ，(B)Fab VH-CH1和Vλ-Cλ，和(C)Fc CH2和CH3，并以黄色突出显示。
图5显示人IgG1，κ和λ恒定结构域的序列。基于1FC1(Fcγ)，4F3F(CH1和Cκ)和4HK0(Cλ)的溶剂暴露的恒定结构域赖氨酸以红色突出显示；环内的赖氨酸标有下划线。恒定结构域根据欧盟编号系统编号。
图6，包括图6A，6B，6C，6D，6E和6F，显示与酰基供体和微生物转谷氨酰胺酶一起孵育的抗体的ESI-MS分析。将抗体与50倍摩尔过量的Z-Gln-Gly-CAD-生物素和1U/mL微生物转谷氨酰胺酶在37℃孵育过夜。在IdeS消化和还原之后，通过ESI-MS确定LC，Fd和Fc质量。
图7显示抗体01和K-Tag微生物转谷氨酰胺酶反应的ESI-MS分析。将mAb与Z-Gln-Gly-CAD-生物素和微生物转谷氨酰胺酶在37℃过夜孵育。在去糖基化和还原之后，通过ESI-MS确定(A)抗体01，(B)抗体01-HC-KTag和(C)抗体01-LC-KTag的HC和LC质量。
图8，包括图8A，8B和8C，显示抗体01的C端延伸的ESI-MS分析。(A)将抗体01mAb，(B)抗体01-L和(C)抗体01-LL与Z-Gln-Gly-CAD-生物素和微生物转谷氨酰胺酶在37℃孵育过夜并且如图7中通过ESI-MS分析质量。
图9，包括图9A-9B，说明与Lys447的单步药物缀合。(A)抗体01-L和(B)与Z-Gln-Gly-PEG2-AuF和微生物转谷氨酰胺酶在37℃孵育过夜的抗体01-L用IdeS消化并用DTT还原以产生LC，Fd和Fc片段。如方法中那样，通过反相LC-MS监测样品的280nm吸光度(AU 280)和总离子电流(TIC)。
图10显示二聚体mAb的SDS-PAGE。将用Z-Gln-Gly-N3或Z-Gln-Gly-PEG3-BCN转酰胺化的抗体01-L混合并在22℃孵育过夜。将样品还原并使用4-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶通过SDS-PAGE进行分析。HC-HC二聚体的质量约为110kDa。
具体实施方式
所公开的方法和缀合免疫球蛋白可以通过参考以下结合形成本公开的一部分的附图的详细描述而更容易地理解。应该理解，所公开的方法和缀合免疫球蛋白不限于本文描述和/或显示的具体实施方式，并且本文使用的术语仅用于描述具体实施方式的目的，并且不旨在限制所要求保护的方法或缀合免疫球蛋白。
除非另有明确说明，否则关于可能的作用机制或模式或改善理由的任何描述仅意在说明，并且所公开的方法和缀合免疫球蛋白不受任何这样提议的作用机制或模式或改善理由的正确性或不正确性约束。
在整个这个文本中，描述涉及缀合免疫球蛋白及其产生方法。在本公开描述或要求保护与缀合免疫球蛋白相关的特征或实施方式的情况下，这样的特征或实施方式同样适用于产生该缀合免疫球蛋白的方法。类似地，在本公开描述或要求保护与产生缀合免疫球蛋白的方法相关的特征或实施方式的情况下，这样的特征或实施方式同样适用于缀合免疫球蛋白。
除非上下文另有明确规定，否则对特定数值的提及至少包括该特定值。当表达值的范围时，另一个实施方式包括从一个特定值和/或到另一个特定值。此外，对范围中所述值的提及包括该范围内的每个值。所有的范围都包含端点并可组合。
当通过使用前语“约”将值表示为近似值时，将理解该特定值形成另一个实施方式。
应当理解，为了清楚起见，本文在分开的实施方式的上下文中描述的所公开的方法和缀合免疫球蛋白的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的所公开的方法和缀合免疫球蛋白的各种特征也可以分开提供或以任何亚组合形式提供。
如本文所用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述/该(the)”包括复数形式。
涉及说明书的方方面面的各种术语在说明书和权利要求全文使用。除非另有说明，否则这样的术语将被赋予其在本领域中的普通含义。其他具体定义的术语应以与本文提供的定义一致的方式来解释。
当关于数值范围使用术语“约”时，截止值或具体值被用于指示所记载的值可以与列出的值相差至多多达10％。因此，术语“约”用于包含与规定值相差±10％或更小的变化，±5％或更小的变化，±1％或更小的变化，±0.5％或更小的变化，或±0.1％的变化或更小。
“酸性氨基酸”是指在生理pH下呈现负电荷的氨基酸。遗传编码的疏水性氨基酸包括天冬氨酸盐，谷氨酸盐，天冬酰胺和谷氨酰胺。
术语“酰基供体底物”是指其上具有末端酰基的基团。优选地，“酰基供体底物”包含谷氨酰胺残基。酰基供体底物可以任选地含有另外的反应性基团。在第一个实施方式中，酰基供体底物与功能剂共价连接。在第二个实施方式中，酰基供体底物不与功能剂连接。在一个实施方式中，酰基供体底物包含谷氨酰胺残基和反应性基团。在另一个实施方式中，如本文进一步描述的，酰基供体底物包含一个或多个接头。在任何上述实施方式中，任选地存在酰基供体底物与功能剂之间或酰基供体底物与反应性基团之间的接头。
如本文所用，术语“抗体”广泛地指由4条多肽链，即2条重链(H)链和2条轻链(L)链组成的任何免疫球蛋白(Ig)分子。如本文所用，术语“抗体”还指免疫球蛋白分子的任何抗原结合部分，突变体，变体或衍生物，其保留Ig分子的必要表位结合特征。这样的突变体，变体或衍生物抗体形式在本领域中是已知的，并且本文中讨论了其非限制性实施方式。在一个实施方式中，抗体是人源化抗体。在另一个实施方式中，抗体是人抗体。在另一个实施方式中，抗体是嵌合抗体。在另一个实施方式中，抗体是非人抗体。
在全长抗体中，每条重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1，CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，散布有更保守的、称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)，类别(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亚类。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”)是指保留特异性结合抗原的能力的抗体的一个或多个片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段执行。这样的抗体实施方式也可以是双特异性，双特异性或多特异性形式；特异性结合两种或更多种不同的抗原。包含在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，即由VL，VH，CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，即包含通过铰链区处的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature 341:544-546,Winter et al.,PCT公布WO 90/05144A1，通过引用并入本文)，其包含单个可变结构域；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但它们可以使用重组方法通过使得它们能够制成单一蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子的合成接头连接(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird etal.(1988)Science 242:423-426；和Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。这样的单链抗体也意图包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。其他形式的单链抗体，例如双抗体，也包括在内。双抗体是二价双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短而不允许相同链上的两个结构域之间配对的接头，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger,P.,etal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak,R.J.,et al.(1994)Structure 2:1121-1123)。这样的抗体结合部分是本领域已知的(Kontermann and Dubeleds.,Antibody Engineering(2001)Springer-Verlag.New York.790pp.(ISBN 3-540-41354-5))。
“碱性氨基酸”是指在生理pH下呈现正电荷的氨基酸。遗传编码的疏水性氨基酸包括组氨酸，赖氨酸和精氨酸。
如本文所用，术语“生物样品”是指从受试者获得的样品，包括体内或体外获得的生物组织或流体来源的样品。这样的样品可以是但不限于从哺乳动物(包括人)分离的体液(例如血液，血浆，血清，乳汁，脊髓液，腹水或尿液)，器官，组织，部分和细胞。生物样品还可以包括生物样品(包括组织)的切片(例如器官或组织的切片部分)。生物样品还可以包括来自生物样品的提取物，例如来自生物流体(例如血液或尿液)的抗原。
术语“C端赖氨酸”是指免疫球蛋白的重链的C端。优选地，C端赖氨酸之后存在至少一个氨基酸残基。在一个实施方式中，其中在C端赖氨酸之后仅有一个氨基酸残基(氨基酸位置+1)，与C端赖氨酸直接相邻的氨基酸残基选自甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺和组氨酸。在向C端赖氨酸添加多于一个氨基酸残基(氨基酸位置+1，+2等)的情况下，与C端赖氨酸直接相邻的氨基酸残基(氨基酸位置+1)可以选自除天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸之外的任何氨基酸。在一个实施方式中，当将两个氨基酸残基添加到C端赖氨酸时，与C端赖氨酸直接相邻的氨基酸残基(氨基酸位置+1)是除天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸之外的任何氨基酸，并且C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基(氨基酸位置+2)选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，脯氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，色氨酸和甘氨酸。在一个实施方式中，当将两个氨基酸残基添加到C端赖氨酸时，与C端赖氨酸相邻的第一氨基酸残基(氨基酸位置+1)是赖氨酸或精氨酸。
在一个实施方式中，在C端赖氨酸之后存在一个氨基酸残基(氨基酸位置+1)。在另一个实施方式中，在C端赖氨酸之后存在两个氨基酸残基(氨基酸位置+1和+2)。在另一个实施方式中，在C端赖氨酸之后存在三个(氨基酸位置+1，+2和+3)，四个(氨基酸位置+1，+2，+3和+4)，五个(氨基酸位置+1，+2，+3，+4和+5)，六个(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5和+6)，七个(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6和+7)，八个(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6，+7和+8)，九个(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6，+7，+8和+9)，十个(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6，+7，+8，+9和+10)，十一个(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6，+7，+8，+9，+10和+11)，十二个(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6，+7，+8，+9，+10，+11和+12)，十三个(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6，+7，+8，+9，+10，+11，+12和+13)，十四个(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6，+7，+8，+9，+10，+11，+12，+13和+14)，十五个(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6，+7，+8，+9，+10，+11，+12，+13，+14和+15)，十六个(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6，+7，+8，+9，+10，+11，+12，+13，+14，+15和+16)，十七个(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6，+7，+8，+9，+10，+11，+12，+13，+14，+15，+16和+17)，十八个(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6，+7，+8，+9，+10，+11，+12，+13，+14，+15，+16，+17和+18)，十九个(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6，+7，+8，+9，+10，+11，+12，+13，+14，+15，+16，+17，+18和+19)或二十个(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6，+7，+8，+9，+10，+11，+12，+13，+14，+15，+16，+17，+18，+19和+20)氨基酸残基。
在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的氨基酸残基不包含GTYFQAYGT。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的氨基酸残基不包含GECTYFQAYGCTE。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的氨基酸残基不包含GENTYFQAYGNTE。
在一个实施方式中，C端赖氨酸是IgG1，IgG2，IgG3或IgG4的赖氨酸447。在另一个实施方式中，C端赖氨酸是IgD或IgE的C端赖氨酸。在另一个实施方式中，术语“C端赖氨酸”是指IgA1，IgA2或IgM的尾部附加物之前的最后一个赖氨酸残基。在一个实施方式中，去除了IgA1，IgA2或IgM的尾部附加物。在一个实施方式中，不去除IgA1，IgA2或IgM的尾部附加物。下文列出抗体的尾部附加物的序列：
IgA1 PTHVNVSVVMAEVDGTCY
IgA2 PTHVNVSVVMAEVDGTCY
IgM PTLYNVSLVMSDTAGTCY
在另一个实施方式中，可以将一个或多个氨基酸残基去除，例如从免疫球蛋白的重链的C端删除，并可以将后面跟着至少一个另外的氨基酸残基的C端赖氨酸残基添加到免疫球蛋白。例如，可以删除IgG1，IgG2，IgG3或IgG4免疫球蛋白的氨基酸残基446和447，并且可以添加后面跟着至少一个另外的氨基酸残基的C端赖氨酸，其中微生物转谷氨酰胺酶然后可以将免疫球蛋白的C端赖氨酸缀合至酰基供体底物的谷氨酰胺残基。换句话说，如果免疫球蛋白已被突变以除去野生型氨基酸位置446和447，则C端赖氨酸可存在于例如免疫球蛋白的氨基酸位置446处。一个或多个另外的氨基酸残基可以然后如本文所述在例如氨基酸位置+1，+2，+3，+4等处添加至C端赖氨酸。在一个实施方式中，可以将1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸残基去除，例如从免疫球蛋白的重链的C端删除，并可以将后面跟着至少一个另外的氨基酸残基的C端赖氨酸残基在例如如本文所述的氨基酸位置+1，+2，+3，+4等处添加至免疫球蛋白。
在另一个实施方式中，将CH3结构域从免疫球蛋白的重链的C端去除，并将后面跟着至少一个另外的氨基酸残基的C端赖氨酸残基添加至免疫球蛋白。在另一个实施方式中，将CH2结构域和CH3结构域两者从免疫球蛋白的重链的C端去除，并将后面跟着至少一个另外的氨基酸残基的C端赖氨酸残基添加至免疫球蛋白。在另一个实施方式中，将铰链区，CH2结构域和CH3结构域从免疫球蛋白的重链的C端去除，并将后面跟着至少一个另外的氨基酸残基的C端赖氨酸残基添加至免疫球蛋白。在又一个实施方式中，将CH1结构域，铰链区，CH2结构域和CH3结构域从免疫球蛋白的重链的C端去除，并将后面跟着至少一个另外的氨基酸残基的C端赖氨酸残基添加至免疫球蛋白。
术语“点击化学”是指用于高产量，高选择性，可靠和清洁的蛋白质合成和/或缀合的特定反应。参见例如King et al.,“Developments in the Field of BioorthagonalBond Forming Reactions–Past and Present Trends”,Bioconjug.Chem.,(2014)25(5):825-839；McKay et al.,“Click Chemistry in Complex Mixtures:BioorthagonalBioconjugation”,Chem.Biol.,(2014)21(9):1075-1101。
术语“嵌合的”，“嵌合的”，“嵌合抗体”等术语是指包含来自一个来源或物种的重链可变区和轻链可变区(即抗原结合区)，以及来源于不同来源或物种的重链恒定区和轻链恒定区的至少一部分的免疫球蛋白。这些部分可以通过常规技术(例如合成的)化学连接在一起，或者使用基因工程技术(例如编码嵌合抗体的蛋白质部分的DNA可以被表达以产生连续的多肽链)作为连续多肽制备。本公开涵盖的其他形式的“嵌合免疫球蛋白”是其中类别或亚类已经从原始免疫球蛋白的类别或亚类改动或改变的那些(也称为“类别转换免疫球蛋白”)。在本公开全文中，嵌合免疫球蛋白被称为“xi”。在此，“嵌合免疫球蛋白”等术语是指免疫球蛋白的序列，而不是用于产生抗体的方法。
如本文所用，“Lys447”或“赖氨酸447”是指免疫球蛋白的重链可变区的氨基酸位置447处的赖氨酸残基(如使用EU编号系统编号的)，并且其是例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgD和IgE中的C端密码子。
如本文所用，“功能剂”是指具有治疗性，诊断性或其他功能特性的试剂。在一个实施方式中，功能剂可以是治疗剂。在另一个实施方式中，功能剂可以是诊断剂。功能剂可以是大分子或小分子。大分子功能剂包括但不限于抗体及其抗原结合部分。小分子功能剂包括但不限于化学治疗剂，细胞毒性剂，抗生素，可以调节生物过程的其他有机化合物(例如药物)和多肽。
术语“人源化”，“人源化免疫球蛋白”等术语是指免疫球蛋白，其中框架或“互补决定区”(CDR)已被修饰以包含具有与母体免疫球蛋白相比不同特异性的免疫球蛋白的CDR。大多数情况下，人源化免疫球蛋白是人免疫球蛋白(受体免疫球蛋白)，其中来自受体的高变区的残基被来自非人物种(如小鼠，大鼠，兔或具有期望特异性、亲和力和能力的非人灵长类动物)的高变区(供体免疫球蛋白)的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的FWR残基被相应的非人残基替换。此外，人源化免疫球蛋白可以包含在受体免疫球蛋白或供体免疫球蛋白中未发现的残基。进行这些修饰以进一步提高免疫球蛋白性能。通常，人源化免疫球蛋白将包含基本上全部的至少一个和通常两个可变结构域，其中全部或基本上全部高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且全部或基本上全部FWR是具有人免疫球蛋白序列的那些。人源化免疫球蛋白还可以任选地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的恒定区。参见例如Riechmann,L.,et al.,Nature 332(1988)323-327；和Neuberger,M.S.,et al.,Nature 314(1985)268-270。在本公开全文中，“人源化免疫球蛋白”被称为“zu”。在本公开全文中，“人源化免疫球蛋白”等术语是指免疫球蛋白的序列，而不是用于产生免疫球蛋白的方法。
术语“诊断剂”是指可用于体内成像研究如CT，MRI和X射线和/或体外成像研究的化合物。诊断剂的非限制性实例包括荧光团，荧光染料，放射性核素和酶。
术语“供体免疫球蛋白”是指将其可变区，CDR或其他功能片段或类似物的氨基酸序列贡献给人源化免疫球蛋白，并从而为人源化免疫球蛋白提供供体免疫球蛋白的抗原特异性和中和活性特征的非人免疫球蛋白。
术语“受体免疫球蛋白”是指与供体免疫球蛋白异源的免疫球蛋白，其向人源化免疫球蛋白提供其重链和/或轻链框架区和/或其重链和/或轻链恒定区的氨基酸序列。受体免疫球蛋白可以来自任何哺乳动物。在优选的实施方式中，受体免疫球蛋白在人中是非免疫原性的。优选受体免疫球蛋白是人免疫球蛋白。
“人源化”是指产生人源化免疫球蛋白的过程，并且包括用于产生具有以上特征的人源化免疫球蛋白的任何过程，包括但不限于计算机模拟人源化，工程化物种/宿主CDR进入人免疫球蛋白，取代嵌合免疫球蛋白的框架区残基以匹配相应的人框架区，等等。
如本文所用，“免疫球蛋白”是指由基本上由免疫球蛋白基因编码的一个或多个多肽组成的蛋白质，包括κ轻链和λ轻链以及α，γ，δ，ε和μ重链。全长免疫球蛋白“轻链”(约25Kd或214个氨基酸)由NH2-末端的可变区基因(约110个氨基酸)和COOH-末端的κ或λ恒定区基因编码。全长免疫球蛋白“重链”(约50Kd或446个氨基酸)类似地由可变区基因(约116个氨基酸)和其他上述恒定区基因之一例如γ(编码约330个氨基酸)编码。“免疫球蛋白”包括：(a)免疫球蛋白多肽，即免疫球蛋白家族的多肽，其含有特异性结合特定抗原的抗原结合位点，包括所有免疫球蛋白同种型(IgG，IgA，IgE，IgM，IgD和IgY)，类别(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，IgA2)，亚类，以及每个同种型的各种单体和聚合形式，除非另有规定；和(b)免疫特异性结合抗原的这样的免疫球蛋白多肽的保守取代变体。免疫球蛋白通常描述于例如Harlow&Lane，Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory Press，1988)中。
本文公开的免疫球蛋白的一种形式构成抗体的基本结构单元。例如，抗体可以包含四聚体并且由两对相同的免疫球蛋白链组成，每对具有一条轻链和一条重链。通常，在每对中，轻链和重链可变区一起负责与抗原结合，并且恒定区负责抗体效应子功能。
除了抗体之外，免疫球蛋白可以以多种其他形式存在，包括例如：抗原结合片段或全长免疫球蛋白的部分，如Fv，Fab，(Fab')2和Fv片段；和替代性抗体形式，例如单链免疫球蛋白(scFV和scFab)，双抗，三抗，四抗，线性抗体和多特异性抗体等等。参见例如JamesD.Marks,Antibody Engineering,Chapter 2,Oxford University Press(1995)(CarlK.Borrebaeck,Ed.)。
在一个实施方式中，免疫球蛋白可以包含Fab片段。在另一个实施方式中，免疫球蛋白可以包含CH3结构域。在另一个实施方式中，免疫球蛋白可以包含重链。
如本文所用，术语“免疫特异性地”是指免疫球蛋白特异性结合针对其产生该免疫球蛋白的抗原并且不特异性结合其他肽或蛋白质的能力。免疫球蛋白，其免疫特异性结合针对其产生该免疫球蛋白的抗原，可以不结合其他多肽或蛋白质，或可以以低于针对其产生该免疫球蛋白的抗原的结合亲和力结合其他多肽或蛋白质，如通过例如免疫测定，BIAcore或本领域已知的其他试验测定的。当如使用实验技术例如但不限于放射免疫测定法(RIA)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定的，免疫球蛋白以高于任何交叉反应性抗原的结合亲和力结合抗原时，免疫球蛋白免疫特异性结合针对其产生该免疫球蛋白的抗原(参见例如Paul,ed.,Fundamental Immunology,2nd ed.,Raven Press,New York,pages 332-336(1989)，关于抗体特异性的讨论)。
如本文所用，“接头”是指用于将免疫球蛋白(通过酰基供体底物)连接至功能剂或反应性基团的间隔物，其可以是直链或支链。这样的接头可以是可切割的(例如酸不稳定或蛋白酶可切割)或不可切割的。在一个实施方式中，接头是聚乙二醇(PEG)部分。在另一个实施方式中，接头包含一个或多个氨基酸和聚乙二醇部分(PEG)。
术语“单克隆抗体”是指来源于单细胞克隆的抗体，包括任何真核或原核细胞克隆，或噬菌体克隆，而不是其产生方法。单克隆抗体显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。
“天然”指来自免疫球蛋白所来源的物种的野生型免疫球蛋白序列。
如本文所用，“同一性百分比”和类似术语用于描述两种或更多种核酸，多核苷酸，蛋白质或多肽之间的序列关系，并且在该术语的上下文中且结合该术语理解为包括：(a)参考序列，(b)比较窗口，(c)序列同一性和(d)序列同一性的百分比。
(a)“参考序列”是用作序列比较基础的限定序列。参考序列可以是规定序列的子集或全部；例如，全长cDNA或基因序列的片段，或完整的cDNA或基因序列。对于多肽，参考多肽序列的示例性长度包括至少约16个氨基酸，至少约20个氨基酸，至少约25个氨基酸，至少约35个氨基酸，至少约50个氨基酸或至少约100个氨基酸。对于核酸，参考核酸序列的示例性长度包括至少约50个核苷酸，至少约60个核苷酸，至少约75个核苷酸，至少约100个核苷酸或至少约300个核苷酸，或其附近或其间的任何整数。
(b)“比较窗口”包括提及多核苷酸或多肽序列的连续和规定区段，其中多核苷酸或多肽序列可以与参考序列进行比较，并且其中比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可以包含与参考序列(其不包含添加，取代或缺失)相比较的添加，取代或缺失(即缺口)，用于两个序列的最佳比对。示例性的比较窗口可以是至少20个连续的核苷酸或氨基酸长度，并且任选地可以是30，40，50，100或更长。本领域技术人员理解，为避免由于在多核苷酸或多肽序列中包含缺口而导致与参考序列误导性地高度相似，通常引入空位罚分并从匹配数中减去。
(c)用于比较的序列比对方法在本领域中是公知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.,2:482,1981的局部同源性算法进行；通过Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443,1970的同源性比对算法进行；通过检索Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8:2444,1988的相似性方法进行；通过这些算法的计算机化实施进行，包括但不限于：Intelligenetics,Mountain View,Calif.的PC/Gene程序中的CLUSTAL，Wisconsin Genetics Software Package,Genetics ComputerGroup(GCG),7Science Dr.,Madison,Wis.,USA中的GAP，BESTFIT，BLAST，FASTA和TFASTA；CLUSTAL程序由Higgins and Sharp,Gene,73:237-244,1988；Corpet,et al.,NucleicAcids Research,16:881-90,1988；Huang,et al.,Computer Applications in theBiosciences,8:1-6,1992；和Pearson,et al.,Methods in Molecular Biology,24:7-331,1994充分描述。可用于数据库相似性检索的BLAST程序家族包括：针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列的BLASTN；针对蛋白质数据库序列的核苷酸查询序列的BLASTX；针对蛋白质数据库序列的用于蛋白质查询序列的BLASTP；针对核苷酸数据库序列的蛋白质查询序列的TBLASTN；和针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列的TBLASTX。参见CurrentProtocols in Molecular Biology,Chapter 19,Ausubel,et al.,Eds.,GreenePublishing and Wiley-Interscience,New York,1995。上述程序的新版本或新的程序总体将无疑在未来变得可用，并且可以与本公开一起使用。
(d)“同一性百分比”意指通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列而确定的值，其中比较窗口中多核苷酸或多肽序列的部分可包含与参考序列(其不包含添加，取代或缺失)相比较的添加，取代或缺失(即缺口)，用于两个序列的最佳比对。通过确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数量以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的总位置数量并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比，而计算百分比。
“药物有效量”是指治疗受试者的免疫球蛋白的量。
“药学上可接受的载体”是指用于施用于受试者的如本文所述的免疫球蛋白的药物制剂的组分。例如，药学上可接受的载体可以是基于脂质体，基于脂质和/或基于纳米颗粒。
如本文使用的术语“反应性基团”是指可以与其他化合物如功能剂反应以形成至少一个共价键的化学官能团。在一个实施方式中，反应性基团在点击化学缀合反应中是反应性的。反应性基团的非限制性实例包括(1R,8S,9S)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇(BCN)，
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反式环辛烯(TCO)，叠氮化物(N3)，炔烃，四嗪甲基环丙烯，降冰片烯，酰肼/肼和醛。
如本文所用的术语“受试者”是指人或非人生物体。因此，本文所述的方法，免疫球蛋白和缀合免疫球蛋白均适用于人类和兽医疾病和病症两者。受试者可以是“患者”，即正在接受疾病或病症的医疗护理的活人或非人生物体，或正在被调查特定病症的病理迹象或存在/不存在的具有未确定疾病的人或非人生物体。
“取代”是指将一个氨基酸残基替换为另一个氨基酸残基。“取代”包括例如编码氨基酸残基的一个或多个DNA碱基对中的错义突变或改造化蛋白质以交换一个氨基酸与另一个氨基酸。
如本文所用，“治疗”等术语是指降低疾病症状的严重程度和/或频率，消除疾病症状和/或所述症状的根本原因，降低疾病症状的频率或可能性和/或其根本原因，以及改善或补救由疾病直接或间接造成的损害。
术语“治疗剂”意指可以施用于有需要的受试者以治疗病症的大分子或小分子。可以施用治疗剂以治疗或预防发作，减缓发展，或改善患有该病症的受试者的医学病症的一种或多种症状。治疗剂包括但不限于抗体或其抗原结合部分，化学治疗剂，放射性剂，细胞毒素剂，抗生素等。在一个实施方式中，治疗剂是小分子。在另一个实施方式中，治疗剂是多肽。
如本文所用，“与……90％相同”包括与参考项目(例如，生物序列)至少90％相同，91％相同，92％相同，93％相同，94％相同，95％相同，96％相同，97％相同，98％相同，99％相同或100％相同。
在本公开全文中使用以下缩写：抗体药物缀合物(ADC)；药物与抗体比率(DAR)；框架工作区(FWR)；互补决定区(CDR)；澳瑞他汀F(auristatin F，AuF)；可变重区(VH)；可变轻区(VL)；可变kappa(Vκ)；γ恒定区(Cγ)；κ恒定区(Cκ)；单克隆抗体(mAb)；如使用EU编号系统编号的免疫球蛋白的重链的氨基酸位置447处的赖氨酸(Lys447)。
缀合免疫球蛋白的生成
本文公开了用于产生缀合免疫球蛋白的方法，所述方法包括：孵育免疫球蛋白与微生物转谷氨酰胺酶和包含酰基供体底物的功能剂，a)其中所述免疫球蛋白包含C端赖氨酸之后的至少一个氨基酸残基，b)其中所述酰基供体底物包含谷氨酰胺残基，和c)其中所述功能剂为治疗剂或诊断剂，其中所述微生物转谷氨酰胺酶将所述免疫球蛋白的所述C端赖氨酸缀合至所述功能剂上的所述酰基供体底物的所述谷氨酰胺残基，从而产生所述缀合免疫球蛋白。
本文还公开了用于产生缀合免疫球蛋白的方法，所述方法包括：i)孵育免疫球蛋白与微生物转谷氨酰胺酶和酰基供体底物，a)其中所述免疫球蛋白包含C端赖氨酸之后的至少一个氨基酸残基，b)其中所述酰基供体底物包含谷氨酰胺残基和反应性基团，其中所述微生物转谷氨酰胺酶将所述免疫球蛋白的所述C端赖氨酸缀合至所述酰基供体底物的所述谷氨酰胺残基，和ii)将功能剂缀合至所述酰基供体底物的所述反应性基团，其中所述功能剂是治疗剂或诊断剂，从而产生所述缀合免疫球蛋白。
缀合可以通过将包含酰基供体底物的功能剂溶解在溶解溶液中并将溶解的功能剂与免疫球蛋白和微生物转谷氨酰胺酶在缀合缓冲液中孵育来进行。缀合也可以通过将酰基供体底物溶解在溶解溶液中并且将酰基供体底物与免疫球蛋白和微生物转谷氨酰胺酶在缀合缓冲液中孵育来进行。
对于水不溶性功能剂和酰基供体底物，合适的溶解溶液包括有机的水混溶性溶剂，例如二甲基亚砜(DMSO)。对于水溶性功能剂和酰基供体底物，合适的溶解溶液包括但不限于水或缓冲水溶液，例如磷酸盐缓冲盐水，pH 7.2(1×PBS)或DPBS。
功能剂或酰基供体底物的合适浓度包括约10μM至约800mM，约10mM至约100mM，约25mM至约100mM，约40mM至约100mM，约55mM至约100mM，约70mM至约100mM，约10mM至约90mM，约10mM至约75mM，约10mM至约60mM，约10mM至约50mM，约10mM至约40mM，或约10mM至约30mM。
在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约10μM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约25μM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约50μM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约100μM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约250μM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约500μM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约750μM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约1mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约10mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约20mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约30mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约40mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约50mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约60mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约70mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约80mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约90mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约100mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约150mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约200mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约250mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约300mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约350mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约400mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约450mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约500mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约550mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约600mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约650mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约700mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约750mM。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物的浓度可以是约800mM。
合适的免疫球蛋白浓度包括约0.1mg/ml至约20mg/ml，约0.5mg/ml至约20mg/ml，约1mg/ml至约20mg/ml，约5mg/ml至约20mg/ml，约10mg/ml至约20mg/ml，约0.1mg/ml至约15mg/ml，约0.1mg/ml至约12mg/ml，约0.1mg/ml至约10mg/ml，约0.1mg/ml至约5mg/ml或约0.1mg/ml至约2mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约0.1mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约0.5mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约1mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约2mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约5mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约10mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约15mg/ml。在一些实施方式中，免疫球蛋白的浓度可以是约20mg/ml。
功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的合适比率包括约1:1至100:1。在一个实施方式中，功能剂与酰基供体底物:免疫球蛋白的比率为约25:1至约75:1。在另一个实施方式中，功能剂与酰基供体底物:免疫球蛋白的比率为约40:1至约60:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是1:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是2:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是3:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是4:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是5:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是6:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是7:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是8:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是9:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是10:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是11:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是12:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是13:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是14:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是15:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是16:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是17:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是18:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是19:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是20:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是25:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是30:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是35:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是40:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是45:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是50:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是60:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是70:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是80:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是90:1。在一些实施方式中，功能剂或酰基供体底物:免疫球蛋白的比率可以是100:1。
可以在许多合适的缀合缓冲液中进行孵育，仅举几例，包括例如DPBS，1×PBS，pH7.2，磷酸钠，磷酸钾，硼酸钠，Tris和HEPES。缀合缓冲液的浓度包括约5mM至约2M，约5mM至约1M，约5mM至约500mM，约5mM至约100mM，约10mM至约100mM，约20mM至约100mM，约30mM至约100mM，约45mM至约100mM，约60mM至约100mM，约75mM至约100mM，约10mM至约90mM，约10mM至约75mM，约10mM至约60mM，约10mM至约45mM或约10mM至约30mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约10mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约20mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约30mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约40mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约50mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约60mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约70mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约80mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约90mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约100mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约250mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约500mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约750mM。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约1M。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约1.25M。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约1.5M。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约1.75M。在一些实施方式中，缀合缓冲液的浓度可以是约2M。
缀合缓冲液可以进一步包括氯化钠。合适的氯化钠浓度包括约0mM至约2M，约0mM至约1M，约1M至约2M，约500mM至约1.5M，约25mM至约500mM，约50mM至约500mM，约75mM至约500mM，约100mM至约500mM，约150mM至约500mM，约200mM至约500mM，约250mM约500mM，约300mM至约500mM，约350mM至约500mM，约400mM至约500mM，约0mM至约400mM，约0mM至约350mM，约0mM至约300mM，约0mM至约250mM，约0mM至约200mM，约0mM至约150mM，约0mM至约100mM，约0mM至约50mM，或约0mM至约25mM。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约25mM。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约50mM。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约75mM。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约100mM。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约150mM。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约200mM。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约250mM。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约300mM。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约350mM。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约400mM。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约500mM。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约750mM。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约1M。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约1.25M。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约1.5M。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约1.75M。在一些实施方式中，氯化钠的浓度可以是约2M。
缀合缓冲液的pH可以为约4至约9。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以为约5至约8。在另一个实施方式中，缀合缓冲液的pH可以为约6至约7。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约4。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约4.5。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约5。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约5.5。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约6.0。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约6.5。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约6.6。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约6.7。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约6.8。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约6.9。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约7.0。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约7.1。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约7.2。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约7.3。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约7.4。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以为约7.5。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约7.6。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约7.7。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约7.8。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约7.9。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约8.0。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约8.1。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约8.2。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约8.3。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约8.4。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约8.5。在一些实施方式中，缀合缓冲液的pH可以是约9。
为促进功能剂或酰基供体底物在缀合缓冲液中的可溶性，缀合缓冲液中有机水混溶性溶剂的最终浓度可为约0％至约20％，约2％至约20％，约5％至约20％，约8％至约20％，约11％至约20％，约16％至约20％，约0％至约18％，来自约0％至约15％，约0％至约12％，约0％至约10％，约0％至约8％，约0％至约6％，或约0％至约2％。
缀合缓冲液可以进一步包含丙二醇以促进巯基反应性化合物在缀合缓冲液中的可溶性。适合的丙二醇浓度包括约1％至约50％，约20％至约50％，约30％至约50％，约40％至约50％，约10％至约40％，约10％至约30％或约10％至约20％。在一些实施方式中，丙二醇的浓度可以为约1％或约5％。在一些实施方式中，丙二醇的浓度可以是约10％。在一些实施方式中，丙二醇的浓度可以是约20％。在一些实施方式中，丙二醇的浓度可以是约30％。在一些实施方式中，丙二醇的浓度可以是约40％。在一些实施方式中，丙二醇的浓度可以是约50％。
缀合缓冲液可以进一步包含非离子型去污剂以促进缀合免疫球蛋白在缀合缓冲液中的可溶性。示例性的非离子型去污剂包括但不限于聚山梨酯-20或聚山梨酯-80。非离子型洗涤剂的合适浓度包括约0％至约1％，约0.1％至约1％，约0.3％至约1％，约0.5％至约1％，约0.7％至约1％，约0％至约0.8％，约0％至约0.6％，约0％至约0.4％或约0％至约0.2％。在一些实施方式中，非离子型去污剂的浓度可以是约0.1％。在一些实施方式中，非离子型去污剂的浓度可以是约0.2％。在一些实施方式中，非离子型去污剂的浓度可以是约0.3％。在一些实施方式中，非离子型去污剂的浓度可以是约0.4％。在一些实施方式中，非离子型去污剂的浓度可以是约0.5％。在一些实施方式中，非离子型去污剂的浓度可以是约0.6％。在一些实施方式中，非离子型去污剂的浓度可以为约0.7％。在一些实施方式中，非离子型去污剂的浓度可以是约0.8％。在一些实施方式中，非离子型去污剂的浓度可以是约0.9％。在一些实施方式中，非离子型去污剂的浓度可以是约1.0％。
孵育可以进行约30分钟至约48小时，约1小时至约48小时，约2小时至约24小时，约24小时至约48小时，约30小时至约48小时，约36小时至约48小时，约42小时至约48小时，约2小时至约42小时，约2小时至约36小时，约2小时至约30小时，约2小时至约24小时，约2小时至约18小时，约2小时至约12小时，约30分钟至约1小时，约30分钟至约2小时或约2小时至约6小时。在一些实施方式中，孵育可以进行约30分钟。在一些实施方式中，孵育可以进行约1小时。在一些实施方式中，孵育可以进行约1.5小时。在一些实施方式中，孵育可以进行2小时。在一些实施方式中，孵育可以进行6小时。在一些实施方式中，孵育可以进行12小时。在一些实施方式中，孵育可以进行18小时。在一些实施方式中，孵育可以进行24小时。在一些实施方式中，孵育可以进行30小时。在一些实施方式中，孵育可以进行36小时。在一些实施方式中，孵育可以进行42小时。在一些实施方式中，孵育可以进行48小时。
孵育的温度可以为约4℃至约50℃，约18℃至约37℃，约20℃至约37℃，约22℃至约37℃，约24℃至约37℃，约26℃至约37℃，约28℃至约37℃，约30℃至约37℃，约32℃至约37℃，约34℃至约37℃，约18℃至约34℃，约18℃至约32℃，约18℃至约30℃约18℃至约28℃，约18℃至约26℃或约18℃至约24℃。在一些实施方式中，孵育可以在4℃下进行。在一些实施方式中，孵育可以在18℃下进行。在一些实施方式中，孵育可以在20℃下进行。在一些实施方式中，孵育可以在22℃下进行。在一些实施方式中，培养可以在24℃下进行。在一些实施方式中，培养可以在26℃下进行。在一些实施方式中，培养可以在28℃下进行。在一些实施方式中，培养可以在30℃下进行。在一些实施方式中，培养可以在32℃下进行。在一些实施方式中，培养可以在34℃下进行。在一些实施方式中，孵育可以在37℃下进行。在一些实施方式中，孵育可以在50℃下进行。
未引入的功能剂或酰基供体底物可以通过使用许多合适的树脂，包括但不限于G-25树脂，G-50树脂，Biogel P10或其他树脂，通过脱盐色谱法从缀合免疫球蛋白分离，排阻限度范围为5,000-10,000Da。取决于规模，色谱可以以柱形式或旋转柱形式进行。用于脱盐的合适缓冲液包括例如DPBS，1×PBS，磷酸钠，磷酸钾，硼酸钠，Tris，或者HEPES基缓冲液可以代替1×PBS。
在第一个实施方式中，包含酰基供体底物的功能剂，其包含通过酰基供体底物与C端赖氨酸缀合的谷氨酰胺残基。在该第一实施方式中，通过使酰基供体底物上的反应性基团与功能剂反应，在与免疫球蛋白缀合之前，将功能剂与酰基供体底物组合。在第二个实施方式中，首先将包含谷氨酰胺残基和反应性基团的酰基供体底物缀合至免疫球蛋白，然后将反应性基团连接至功能剂。
酰基供体底物可以包含接头“L”。接头可以是不可切割的接头或可切割的接头。示例性的接头包括，例如，含二硫键的接头，基于缩醛的接头和基于缩酮的接头。在一些方面，接头可以是不可切割的接头。合适的不可切割接头包括但不限于一个或多个氨基酸，聚乙二醇(PEG)或烷基。在一些实施方式中，接头可以包含PEG。在一些方面，接头可以是可切割的接头。合适的可切割接头包括例如缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄基。在一些方面，接头可以是含二硫键的接头。在一些方面，接头可以是基于缩醛的接头。在一些方面，接头可以是基于缩酮的接头。接头还可以是单独或与另外的接头例如一个或多个PEG基团组合的一个或多个氨基酸。
包含谷氨酰胺残基的酰基供体底物可以存在于功能剂中，是功能剂的部分，或附着于功能剂。合适的功能剂包括例如荧光团，荧光染料，多肽，免疫球蛋白，抗生素，核酸，放射性核素，化学接头，小分子，螯合剂，脂质，核酸(如DNA或RNA)和药物。在一些方面，功能剂可以包含荧光团。在一些方面，功能剂可以包含荧光染料。在一些方面，功能剂可以包含多肽。在一些方面，功能剂可以包含免疫球蛋白。在一些方面，功能剂可以包含抗生素。在一些方面，功能剂可以包含核酸(例如DNA或RNA)。在一些方面，功能剂可以包含放射性核素。在一些方面，功能剂可以包含小分子。在一些方面，功能剂可以包含螯合剂(例如，DOTA，CHX-A”-DTPA，NOTA等)。在一些方面，功能剂可以包含脂质。在一些方面，功能剂可以包含药物。在一些方面，功能剂可以包含任何上文列出的功能剂的组合。
酰基供体底物(即，第一酰基供体底物)可以与第二酰基供体底物或接头结合，第二酰基供体底物或接头与具有第二重链可变区和第二轻链可变区的第二免疫球蛋白结合，第二重链可变区具有C端赖氨酸，其中C端赖氨酸在赖氨酸之后具有至少一个氨基酸残基。例如，第一酰基供体底物和第二酰基供体底物可分别具有第一和第二化学接头作为第一和第二功能剂。第一和第二化学接头可以通过多种合适的方式彼此结合，包括例如通过点击化学。
在一个实施方式中，包含酰基供体底物的功能剂是根据式(I)或(II)之一：
(Z)m-Gln-(L)n-(Y) (I)
(Y)-(L)n-Gln-(Z)m (II)
其中Z是羧基苄氧基(CBZ)基团或氨基酸残基；Gln是谷氨酰胺氨基酸残基；每个L独立地为1至20个碳原子的直链或支链接头，其中一个或多个碳原子可以任选和独立地被氮、氧或硫原子替代，并且其中每个碳原子和氮原子可以任选地被取代；或每个L任选和独立地为氨基酸残基；m是0至5的整数；n是0至5的整数；Y是功能剂。
在另一个实施方式中，酰基供体底物是根据式(III)或(IV)之一：
(Z)m-Gln-(L)n-(X) (III)
(X)-(L)n-Gln-(Z)m (IV)
其中，
Z是羧基苄氧基(CBZ)基团或氨基酸残基；Gln是谷氨酰胺氨基酸残基；每个L独立地为1至20个碳原子的直链或支链接头，其中一个或多个碳原子可以任选和独立地被氮、氧或硫原子替代，并且其中每个碳原子和氮原子可以任选地被取代；或每个L任选和独立地为氨基酸残基；m是0至5的整数；n是0至5的整数；X是反应性基团。
在一个实施方式中，Z是CBZ基团。在另一个实施方式中，Z是氨基酸残基。
在一个实施方式中，L是氨基酸残基。在一个实施方式中，n是2-5，并且每个L独立地是氨基酸残基。在另一个实施方式中，L是具有1至20个碳原子的直链或支链接头，其中一个或多个碳原子可以任选和独立地被氮、氧或硫原子替代，并且其中每个碳和氮原子可以任选地被取代。在另一个实施方式中，L是聚乙二醇(PEG)部分。在另一个实施方式中，n是2-5，并且一个或多个L包含一个或多个氨基酸，并且一个或多个另外的L基团包含聚乙二醇部分(PEG)。
在一个实施方式中，m为0。在另一个实施方式中，m为1。在另一个实施方式中，m为2。在另一个实施方式中，m为3。在另一个实施方式中，m为4。在另一个实施方式中，m为5。
在一个实施方式中，n为0。在另一个实施方式中，n为1。在另一个实施方式中，n为2。在另一个实施方式中，n为3。在另一个实施方式中，n为4。在另一个实施方式中，n为5。
在一个实施方式中，X是(1R,8S,9S)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇(BCN)。在另一个实施方式中，X是
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在另一个实施方式中，X是反式环辛烯(TCO)。在另一个实施方式中，X是叠氮化物(N3)。在另一个实施方式中，X是炔烃。在另一个实施方式中，X是四嗪甲基环丙烯。在另一个实施方式中，X是降冰片烯。在另一个实施方式中，X是酰肼/肼。在另一个实施方式中，X是醛。
在一个实施方式中，对于根据式(I)的酰基供体底物，Z是CBZ基团；L是聚乙二醇部分(PEG)(-O((CH2)2)-)，乙胺(-NH((CH2)2)-)或丙胺(-NH((CH2)3)-)；并且n是0、1、2或3。
在另一个实施方式中，酰基供体底物是根据式(I)，其中Z是CBZ基团，并且L是氨基酸。在一个实施方式中，L是Gly。在该实施例的一个方面中，m是1，并且n是1。
在一个实施方式中，酰基供体底物是根据式(II)，其中Z是CBZ基团；m是1；n是1、2或3；并且至少一个L是Gly。
在一个实施方式中，对于根据式(III)的酰基供体底物，Z是CBZ基团；L是聚乙二醇部分(PEG)(-O((CH2)2)-)，乙胺(-NH((CH2)2)-)或丙胺(-NH((CH2)3)-)；并且n是0、1、2或3。
在另一个实施方式中，酰基供体底物是根据式(III)，其中Z是CBZ基团，并且L是氨基酸。在一个实施方式中，L是Gly。在该实施例的一个方面中，m是1，并且n是1。
在一个实施方式中，酰基供体底物是根据式(IV)，其中Z是CBZ基团；m是1；n是1、2或3；并且至少一个L是Gly。
在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸(例如Lys447)之后具有添加的1至20个氨基酸残基。在一个实施方式中，其中在C端赖氨酸之后添加1个氨基酸残基，与C端赖氨酸相邻的添加的氨基酸残基(氨基酸位置+1)选自甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺和组氨酸。在一个实施方式中，其中在C端赖氨酸之后添加1个氨基酸残基，与C端赖氨酸相邻的添加的氨基酸残基(氨基酸位置+1)不是脯氨酸，天冬氨酸或谷氨酸。在一个实施方式中，其中在C端赖氨酸之后添加1个氨基酸残基，与C端赖氨酸相邻的添加的氨基酸残基(氨基酸位置+1)不是赖氨酸或精氨酸。
在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸(例如Lys447)之后具有添加的2个氨基酸残基(氨基酸位置+1和+2)。在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸(例如Lys447)之后具有添加的3个氨基酸残基(氨基酸位置+1，+2和+3)。在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸(例如Lys447)之后具有添加的4个氨基酸残基(氨基酸位置+1，+2，+3和+4)。在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸(例如Lys447)之后具有添加的5个氨基酸残基(氨基酸位置+1，+2，+3，+4和+5)。在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸(例如Lys447)之后具有添加的6个氨基酸残基(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5和+6)。在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸(例如Lys447)之后具有添加的7个氨基酸残基(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6和+7)。在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸(例如Lys447)之后具有添加的8个氨基酸残基(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6，+7和+8)。在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸(例如Lys447)之后具有添加的9个氨基酸残基(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6，+7，+8和+9)。在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸(例如Lys447)之后具有添加的10个氨基酸残基(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6，+7，+8，+9和+10)。在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸(例如Lys447)之后具有添加的11个氨基酸残基(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6，+7，+8，+9，+10和+11)。在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸(例如Lys447)之后具有添加的12个氨基酸残基(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6，+7，+8，+9，+10，+11和+12)。在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸(例如Lys447)之后具有添加的13个氨基酸残基(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6，+7，+8，+9，+10，+11，+12，和+13)。在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸(例如Lys447)之后具有添加的14个氨基酸残基(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6，+7，+8，+9，+10，+11，+12，+13和+14)。在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸(例如Lys447)之后具有添加的15个氨基酸残基(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6，+7，+8，+9，+10，+11，+12，+13，+14，和+15)。在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸(例如Lys447)之后具有添加的16个氨基酸残基(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6，+7，+8，+9，+10，+11，+12，+13，+14，+15和+16)。在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸(例如Lys447)之后具有添加的17个氨基酸残基(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6，+7，+8，+9，+10，+11，+12，+13，+14，+15，+16和+17)。在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸(例如Lys447)之后具有添加的18个氨基酸残基(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6，+7，+8，+9，+10，+11，+12，+13，+14，+15，+16，+17和+18)。在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸(例如Lys447)之后具有添加的19个氨基酸残基(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6，+7，+8，+9，+10，+11，+12，+13，+14，+15，+16，+17，+18和+19)。在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸(例如Lys447)之后具有添加的20个氨基酸残基(氨基酸位置+1，+2，+3，+4，+5，+6，+7，+8，+9，+10，+11，+12，+13，+14，+15，+16，+17，+18，+19和+20)。
在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸(例如Lys447)之后具有添加的少于9个氨基酸残基。在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸(例如Lys447)之后具有添加的少于13个氨基酸残基。在一个实施方式中，免疫球蛋白在C端赖氨酸(例如Lys447)之后不具有添加的序列：GTYFQAYGT，GECTYFQAYGCTE或GENTYFQAYGNTE。
在一个实施方式中，其中在C端赖氨酸之后添加或存在两个或更多个氨基酸残基，C端赖氨酸之后添加或存在的最后一个氨基酸残基(即，离C端赖氨酸最远的添加的氨基酸残基)选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，脯氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，色氨酸和甘氨酸。在一个实施方式中，其中在C端赖氨酸之后添加或存在两个或更多个氨基酸残基，C端赖氨酸之后添加或存在的最后一个氨基酸残基不是赖氨酸或精氨酸。
所公开的方法可以对人源化免疫球蛋白进行。因此，在一些实施方式中，免疫球蛋白可以是人源化免疫球蛋白。
所公开的方法可以对人免疫球蛋白进行。因此，在一些实施方式中，免疫球蛋白可以是人免疫球蛋白。在另一个实施方式中，免疫球蛋白可以是非人免疫球蛋白。
在一个实施方式中，所公开的方法可以对IgG1，IgG2，IgG3或IgG4免疫球蛋白进行。在一个实施方式中，该方法对IgG1免疫球蛋白进行。在一个实施方式中，该方法对IgG2免疫球蛋白进行。在一个实施方式中，该方法对IgG3免疫球蛋白进行。在一个实施方式中，该方法对IgG4免疫球蛋白进行。
在一个实施方式中，所公开的方法可以对IgA1，IgA2或IgM免疫球蛋白进行。在一个实施方式中，该方法对IgA1免疫球蛋白进行。在一个实施方式中，该方法对IgA2免疫球蛋白进行。在一个实施方式中，该方法对IgM免疫球蛋白进行。在一个实施方式中，IgA或IgM免疫球蛋白具有尾部附加物。在另一个实施方式中，IgA或IgM免疫球蛋白除去尾部附加物。
在一个实施方式中，该方法对IgD或IgE免疫球蛋白进行。在一个实施方式中，该方法对IgD免疫球蛋白进行。在一个实施方式中，该方法对IgE免疫球蛋白进行。
对于本文所述的方法，在一个实施方式中，微生物转谷氨酰胺酶来自马杜拉放线菌物种T-2，环状芽孢杆菌BL32，枯草芽孢杆菌孢子，产氨棒状杆菌，谷氨酸棒状杆菌，肠杆菌物种C2361，普罗维登斯菌物种C1112，茂原链轮丝菌(也称为Streptomycesmobarensis)，平板链霉菌M5218，吸水链霉菌，变铅青链霉菌，变铅青链霉菌JT46/pAE053，利迪链霉菌，平板链霉菌，Streptomyces sioyansis，Streptoverticilliumgriseocarneum，Streptoverticillium ladakanum NRRL-3191，轮枝链霉菌物种s-8112，或猪链球菌。在一个实施方式中，微生物转谷氨酰胺酶来自Streptomyces mobarensis。
对于本文所述的方法，在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶从选自紫花苜蓿，甜菜，向日葵，玉米，大豆，拟南芥，烟草，莱茵衣藻，杜氏盐藻，水稻和迷迭香的植物分离。
对于本文所述的方法，在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶是哺乳动物的，并且从转谷氨酰胺酶1至7和因子XIII分离。
在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶与本文描述的微生物转谷氨酰胺酶至少75％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％相同。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶与来自Streptomycesmobarensis的微生物转谷氨酰胺酶至少75％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％相同。转谷氨酰胺酶可以从
Figure BDA0001700550010000471
或Zedira(产品号T001)购买。在另一个实施方式中，转谷氨酰胺酶被纯化。在另一个实施方式中，转谷氨酰胺酶被重组表达并随后使用本领域普通技术人员已知的方法纯化。
在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约0.1单位/mL至约250单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约1单位/mL至约25单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约1单位/mL至约25单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约0.1单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约0.5单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约1单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约5单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约10单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约15单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约20单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约25单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约50单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约75单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约100单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。在一个实施方式中，转谷氨酰胺酶以约150单位/mL，200单位/mL或250单位/mL的浓度存在于本文所述的方法中。
对于本文提供的方法，在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为约1:1至约2:1。在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为约1:1至约2:1。在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为约1:1。在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率为约2:1。在一个实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率是已知的并且通过遵循本文公开的方法一致地可再现。如本文所用，功能剂与免疫球蛋白的比率是基于组合物中功能剂与抗体池中免疫球蛋白的缀合比率的平均值计算。
在本文提供的其中在C端赖氨酸之后存在至少两个另外的氨基酸残基并且其中所述至少两个另外的氨基酸残基中的一个包含赖氨酸的实施方式中，功能剂与免疫球蛋白的比率基于作为赖氨酸的另外氨基酸残基的数量增加。例如，其中两个另外的氨基酸残基存在于C端赖氨酸之后，并且所述另外的氨基酸残基中的一个也是赖氨酸，则存在两个赖氨酸残基，导致具有四个转酰胺基位点的抗体，并且功能剂与免疫球蛋白的比率为约2:1至约4:1。作为另一个实例，其中在C端赖氨酸之后存在五个另外的氨基酸残基，并且所述另外的氨基酸残基中的两个是赖氨酸，存在三个(总)赖氨酸残基，导致具有六个转酰胺基位点的抗体，并且功能剂与免疫球蛋白的比率为约2:1至约6:1。
缀合免疫球蛋白
本文还公开了包含本文公开的任何免疫球蛋白的缀合免疫球蛋白，其中在C端位置处的赖氨酸(例如，位置447处的赖氨酸或“Lys447”)在C端赖氨酸之后具有至少一个另外的氨基酸残基，并且与包含酰基供体底物的功能剂缀合，其中酰基供体底物包含谷氨酰胺残基。另外的实施方式包括包含本文公开的任何免疫球蛋白的缀合免疫球蛋白，其中C端位置处的赖氨酸(例如，位置447处的赖氨酸或“Lys447”)在C端赖氨酸之后具有至少一个另外的氨基酸残基赖氨酸，并与酰基供体底物缀合，其中酰基供体底物包含谷氨酰胺残基和反应性基团，其中反应性基团可在酰基供体底物与免疫球蛋白缀合后与功能剂反应。
在一个实施方式中，与C端赖氨酸相邻的氨基酸残基(氨基酸位置+1)包含甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺或组氨酸。在一个实施方式中，与C端赖氨酸相邻的氨基酸残基(氨基酸位置+1)包含甘氨酸。在一个实施方式中，与C端赖氨酸相邻的氨基酸残基(氨基酸位置+1)包含丙氨酸。在一个实施方式中，与C端赖氨酸相邻的氨基酸残基(氨基酸位置+1)包含缬氨酸。在一个实施方式中，与C端赖氨酸相邻的氨基酸残基(氨基酸位置+1)包含亮氨酸。在一个实施方式中，与C端赖氨酸相邻的氨基酸残基(氨基酸位置+1)包含异亮氨酸。在一个实施方式中，与C端赖氨酸相邻的氨基酸残基(氨基酸位置+1)包含甲硫氨酸。在一个实施方式中，与C端赖氨酸相邻的氨基酸残基(氨基酸位置+1)包含苯丙氨酸。在一个实施方式中，与C端赖氨酸相邻的氨基酸残基(氨基酸位置+1)包含酪氨酸。在一个实施方式中，与C端赖氨酸相邻的氨基酸残基(氨基酸位置+1)包含色氨酸。在一个实施方式中，与C端赖氨酸相邻的氨基酸残基(氨基酸位置+1)包含丝氨酸。在一个实施方式中，与C端赖氨酸相邻的氨基酸残基(氨基酸位置+1)包含苏氨酸。在一个实施方式中，与C端赖氨酸相邻的氨基酸残基(氨基酸位置+1)包含半胱氨酸。在一个实施方式中，与C端赖氨酸相邻的氨基酸残基(氨基酸位置+1)包含天冬酰胺。在一个实施方式中，与C端赖氨酸相邻的氨基酸残基(氨基酸位置+1)包含谷氨酰胺。在一个实施方式中，与C端赖氨酸相邻的氨基酸残基(氨基酸位置+1)包含组氨酸。在一个实施方式中，其中在C端赖氨酸之后添加1个氨基酸残基，与C端赖氨酸相邻的添加的氨基酸残基(氨基酸位置+1)不是脯氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸或精氨酸。
在另一个实施方式中，如果超过一个氨基酸被添加到C端赖氨酸，则最后一个另外的氨基酸(即位于所添加的氨基酸残基的C端处的氨基酸)可以是任何氨基酸酸，除了赖氨酸或精氨酸。例如，其中在C端赖氨酸之后添加两个氨基酸残基，该序列包含C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基(氨基酸位置+1)和C端赖氨酸之后的第二氨基酸(氨基酸位置+2)，其中C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基(氨基酸位置+1)是除天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸之外的任何氨基酸残基，并且其中C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基(氨基酸位置+2)选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，脯氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，色氨酸和甘氨酸。在一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基是赖氨酸或精氨酸。在另一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基(氨基酸位置+2)不是赖氨酸或精氨酸。
作为另一个实例，其中在C端赖氨酸之后添加五个氨基酸残基(氨基酸位置+1，+2，+3，+4和+5)，该序列包含C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基(氨基酸位置+1)，C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基(氨基酸位置+2)，C端赖氨酸之后的第三氨基酸残基(氨基酸位置+3)，C端赖氨酸之后的第四氨基酸残基(氨基酸位置+4)和C端赖氨酸之后的第五氨基酸残基(氨基酸位置+5)。C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基可以是除天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸之外的任何氨基酸残基。C端赖氨酸之后的第二，第三和第四氨基酸残基可以是任何氨基酸。然而，C端赖氨酸之后的第五氨基酸残基(氨基酸位置+5)选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，脯氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，色氨酸和甘氨酸。在另一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第五氨基酸残基(氨基酸位置+5)不是赖氨酸或精氨酸。在另一个实施方式中，C端赖氨酸之后的第一，第二，第三或第四氨基酸残基(氨基酸位置+1，+2，+3和/或+4)可以各自为赖氨酸或精氨酸。
在一些实施方式中，免疫球蛋白可以是人源化的。在其他实施方式中，免疫球蛋白是人的。在另一个实施方式中，免疫球蛋白是嵌合的。
包含谷氨酰胺残基和反应性基团的酰基供体底物还可以包含接头“L”。同样，含有包含谷氨酰胺残基的酰基供体底物的功能剂可以在功能剂和分子的酰基供体底物部分之间具有接头。接头可以是不可切割的接头或可切割的接头。示例性的接头包括，例如，含二硫键的接头，基于缩醛的接头和基于缩酮的接头。在一些方面，接头可以是不可切割的接头。合适的不可切割接头包括但不限于聚乙二醇(PEG)或烷基。在一些实施方式中，接头可以包含PEG。在一些方面，接头可以是可切割的接头。合适的可切割接头包括例如缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄基。在一些方面，接头可以是含二硫键的接头。在一些方面，接头可以是基于缩醛的接头。在一些方面，接头可以是基于缩酮的接头。
本发明的缀合免疫球蛋白包含功能剂。合适的功能剂包括例如治疗剂或诊断剂。合适的功能剂包括例如荧光团，荧光染料，多肽，免疫球蛋白，抗生素，核酸，放射性核素，化学连接剂，小分子，螯合剂，脂质和药物。在一些方面，功能剂可以包含荧光团。在一些方面，功能剂可以包含荧光染料。在一些方面，功能剂可以包含多肽。在一些方面，功能剂可以包含免疫球蛋白。在一些方面，功能剂可以包含抗生素。在一些方面，功能剂可以包含核酸(例如DNA或RNA)。在一些方面，功能剂可以包含放射性核素。在一些方面，功能剂可以包含小分子。在一些方面，功能剂可包含螯合剂(例如，DOTA，CHX-A”-DTPA，NOTA等)。在一些方面，功能剂可以包含脂质。在一些方面，功能剂可以包含药物。在一些方面，功能剂可以包含任何上述功能剂的组合。
因此，所公开的缀合免疫球蛋白包括但不限于免疫球蛋白-荧光团C端赖氨酸缀合物，免疫球蛋白-荧光染料C端赖氨酸缀合物，免疫球蛋白-多肽C端赖氨酸缀合物，免疫球蛋白-免疫球蛋白C端赖氨酸缀合物，免疫球蛋白-抗生素C端赖氨酸缀合物，免疫球蛋白-核酸C端赖氨酸缀合物，免疫球蛋白-放射性核素C端赖氨酸缀合物，免疫球蛋白-化学接头C端赖氨酸缀合物，免疫球蛋白-小分子C端赖氨酸缀合物，免疫球蛋白-螯合剂C端赖氨酸缀合物，免疫球蛋白-脂质C端赖氨酸缀合物和免疫球蛋白-药物C端赖氨酸缀合物。
本文公开的任何免疫球蛋白可以与本文公开的任何功能剂缀合。例如，缀合免疫球蛋白可包含荧光团，荧光染料，多肽，免疫球蛋白，抗生素，核酸，放射性核素，化学接头，小分子，螯合剂，脂质或药物。
在一些实施方式中，免疫球蛋白可以缀合至小分子抗肿瘤剂，例如澳瑞他汀。在一些方面，功能剂可以是澳瑞他汀F(AuF)。因此，所公开的缀合免疫球蛋白包括与澳瑞他汀F的任何上述公开的缀合免疫球蛋白(AuF Lys447缀合物)。
药物组合物
本文还提供了药物组合物。在一些实施方式中，药物组合物可以包含本文公开的任何免疫球蛋白。在一些实施方式中，药物组合物可以包含本文公开的任何缀合免疫球蛋白。在一个实施方式中，药物组合物包含缀合免疫球蛋白和药学上可接受的载体。
编码免疫球蛋白的核酸分子和包含核酸分子的宿主细胞
本文还提供了编码本文公开的任何免疫球蛋白的核酸分子。作为实例，在一个实施方式中，核酸分子编码包含重链可变区和轻链可变区的免疫球蛋白，轻链可变区具有C端位置处的赖氨酸(例如位置447或“Lys447”)和选自甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺和组氨酸的C端赖氨酸之后的一个或多个氨基酸。
还公开了包含任何公开的核酸分子的宿主细胞。合适的宿主细胞包括但不限于哺乳动物细胞，细菌细胞，酵母细胞，昆虫细胞等等。
提供以下实施例以进一步描述本文公开的一些实施方式。这些实施例旨在说明而不是限制所公开的实施方式。
实施例
实例1：材料和方法
诱变
根据制造商的方案使用Stratagene的QuikChange XL产生突变。所需的突变通过DNA测序来确认。
转染和稳定细胞系生成
对于每毫升要用ExpiFectamine转染的细胞，将333.3ng HC质粒和333.3ng LC质粒在50μL Opti-MEM(ThermoFisher)中孵育5-10分钟。同样地，将2.67μL ExpiFectamine在50μL Opti-MEM中孵育。将ExpiFectamine溶液加入到DNA混合物中，并在室温下孵育20-30分钟。将DNA:ExpiFectamine混合物加入到细胞中，同时旋转并在37℃，8％CO2下以125rpm振荡孵育。第二天，将每毫升细胞5μL增强子1和50μL增强子2加入到转染中，继续孵育另外7-10天。
转染后1至3天，在含有5μg/mL杀稻瘟菌素和400μg/mL博莱霉素(Invivogen)的T75烧瓶中，通过将1mL转染子加入到14mL DMEM中来选择表达抗体的稳定池。耐药细胞生长至汇合后，用FreeStyle 293表达培养基置换培养基24至48小时。通过轻敲烧瓶(胰蛋白酶化导致低活力，数据未显示)使细胞物理移位，然后以6×105个细胞/mL接种在125mL摇瓶中的30mL FreeStyle 293表达培养基中。将培养物在37℃，8％CO2下以125rpm振荡进行培养。
mAb生产
在FreeStyle 293表达培养基中以0.6至1×106个细胞/mL接种稳定转染的细胞系池。细胞在37℃，8％CO2下孵育，以125rpm振荡。培养物达到1×106个细胞/mL的密度两天后，将终浓度为10g/L Select Soytone(BD Biosciences)，5mM戊酸(Sigma Aldrich)和1:100CD脂质浓缩物(ThermoFisher)进料至培养物。当细胞活力小于50％时(7-10天)，将培养物在Beckman JLA8.1000转子中以8000rpm离心1小时。然后将上清液通过0.2μm PES过滤器过滤并在4℃或-20℃储存直至纯化。
mAb纯化
使用两种方法之一纯化mAb。对于小于10mL的mAb上清液，使用蛋白A树脂的批量纯化方法进行亲和层析。使用预填充蛋白A柱纯化大于25mL的mAb上清液。
批量纯化
将Prosep-vA高容量蛋白A树脂(Millipore)用DPBS平衡，并将100μL加入3至6mL的样品中。在4℃孵育1小时至过夜后，用1mL DPBS洗涤树脂三次并以18,000×g离心30秒。通过加入400μL 0.1M甘氨酸，pH 2.9，然后以18,000×g离心30秒，从树脂洗脱样品。样品用40μL 1M Tris，pH 8.0中和。使用0.5mL Amicon Ultra，10k截止滤器(Millipore)，通过以18,000×g离心3-5分钟将样品浓缩至约100μL，更换缓冲液。浓缩的样品用400μL DPBS稀释，然后离心。该过程总共重复四次。
柱纯化
蛋白A柱(GE Healthcare)用10柱体积(CV)的20mM磷酸钠，10mM EDTA，pH 7.2平衡。然后装载样品，随后用10CV平衡缓冲液洗涤未结合的材料。使用5CV的0.1M甘氨酸，pH2.9洗脱样品。合并含有mAb的级分，并使用MWCO 20K Slide-A-Lyzer(ThermoFisher)在DPBS中透析。
Z-Gln-Gly底物合成
Z-Gln-Gly-OH购自Bachem，Z-Gln-Gly-CAD-生物素购自Zedira(图2)。
Z-Gln-Gly-五氟苯基酯(Z-Gln-Gly-PFP)合成来自Pasternack等。{Pasternack，1997 15/id}，具有修饰(图3)。Z-Gln-Gly-OH(328.8mg，0.975mmol)和五氟苯酚(Sigma，183.3mg，0.996mmol)溶解在10mL N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)中。然后加入EDAC-HCl(Sigma，201mg，1.04mmol)并将反应在室温下在N2下孵育2小时。向反应中加入100mL冷乙醚并在-80℃下过夜沉淀。通过离心收集粗产物，并从20mL 60℃甲醇中重结晶。最终产物用冷乙醚冲洗并在N2流中干燥。最终产量为219.04mg(44.7％)。ESI-MS(在0.1％甲酸中在50％乙腈直接输注)m/z 504.0([M+H]，86％)，526.0([M+Na]，100％)，542.0([M+K]，22％)。
Z-Gln-Gly-丙基叠氮化物(Z-Gln-Gly-N3)
将Z-Gln-Gly-PFP(21.24mg，4.22×10-5mol)和叠氮基丙胺(Click ChemistryTools，42.2μL 0.91M储备溶液，在DMF中，3.84×10-5mol)溶于0.42mL终体积的DMF。在N2下，将反应在室温下搅拌过夜。在乙腈流动相中，在H2O/0.1％甲酸中，使用0.1％甲酸，通过HPLC纯化产物。将产物真空干燥。最终产量为10.7mg(60.4％)。ESI-MS(梯度纯化)m/z420.2([M+H]，100％)，442.1([M+Na]，32％)。
Z-Gln-Gly-PEG3-内-双环壬炔(Z-Gln-Gly-PEG3-BCN)
Z-Gln-Gly-PFP(18.4mg，3.66×10-5mol)和内-双环[6,1,0]壬-4-炔-9-基-PEG3胺(Conju探针，175μL的0.27M储备溶液，在DMF中，4.75×10-5mol)溶于0.37mL最终体积的DMF中。在N2下，将反应在室温下搅拌过夜。在乙腈流动相中，在H2O/0.1％甲酸中，使用0.1％甲酸，通过HPLC纯化产物。将产物真空干燥。最终产量为0.6mg(2％)。ESI-MS(梯度纯化)m/z688.2([M+H]，100％)，710.2([M+Na]，69％)。
Z-Gln-Gly-PEG2-澳瑞他汀F(Z-Gln-Gly-PEG2-AuF)
将Z-Gln-Gly-PFP(22.2mg，4.37×10-5mol)溶于0.85mL DMF中，并加入和混合1,2-乙二胺(2.3×10-5L，3.5×10-4mol)。在N2下，将反应在室温下搅拌过夜。在乙腈流动相中，在H2O/0.1％甲酸中，使用0.1％甲酸，通过HPLC纯化产物。将产物真空干燥。Z-Gln-Gly-NH2的最终产量为3.8mg(23％)。ESI-MS(梯度纯化)m/z 380.1([M+H]，100％)。将Z-Gln-Gly-NH2(3.8mg，1.01×10-5mol)和NHS-PEG2-AuF(10.3mg，1.03×10-5mol)溶于0.2mL DMF中。加入三乙胺(14μL，1×10-4mol)并将反应在N2下在室温下孵育过夜。在乙腈流动相中，在H2O/0.1％甲酸中，使用0.1％甲酸，通过HPLC纯化一半的反应。将产物真空干燥。CBZ-Gln-Gly-PEG2-AuF的最终产量为3.8mg(60％)。ESI-MS(梯度纯化)m/z 634.0([M+H]2+，100％)，645.1([M+Na]2+，45％)。1267.0([M+H]，16％)。
微生物转谷氨酰胺酶反应
100μg/mL至2.5mg/mL浓度范围的mAb与785μM的Z-Gln-Gly-生物素(Zedira)，Z-Gln-Gly-N3，Z-Gln-Gly-BCN或Z-Gln-Gly-PEG2-AuF与1U/mL微生物转谷氨酰胺酶(Zedira)在DPBS中在37℃下孵育至少16小时。
mAb缀合的超高效液相色谱(UPLC)/ESI-MS分析
将纯化的抗体在DPBS中稀释至1mg/mL(如果低于1.0mg/mL，则使样品保持原始浓度)。使用Zeba旋转脱盐柱将含有二甲基亚砜(DMSO)的反应脱盐。然后使用PNGase F(NEB)使mAb去糖基化或通过IdeS(Promega)消化成Fab'2和Fc片段。为了使mAb去糖基化，将G7缓冲液(5或10μL)和PNGase F(1或2μL)加入到mAb(50或100μL)中。将反应在Discover微波(CEM)中孵育2个循环：1)微波功率10W，37℃，10分钟，然后等待3-5分钟；2)微波功率2W，37℃，10分钟。通过加入二硫苏糖醇(DTT)至终浓度为20mM，然后在60℃孵育3分钟，使部分去糖基化样品还原。为了产生Fab'2和Fc片段，将50U/μL的IdeS加入到0.5mg/mL的mAb中并在37℃孵育0.5-1小时。除了如上所述还原的抗体01-C外，IdeS样品没有还原。
然后使用Waters Acquity UPLC和Q-Tof Premier质谱仪分析样品。将样品(每种0.5-2μg)注射到65℃的MassPrep微量脱盐柱上，在0.05mL/min下，在95％流动相A中平衡5分钟，10分钟梯度(5-90％B)，并在95％流动相A中再平衡10分钟，从柱洗脱。流动相A为在水中的0.1％甲酸。流动相B是乙腈中的0.1％甲酸。Q-Tof质谱仪运行在正离子，V模式下，检测500-4000m/z范围。源参数如下：毛细管电压，2.25kV(完整抗体)-2.50kV(还原抗体)；取样锥电压，65.0V(完整抗体)或50.0V(还原抗体)；源温度，100℃；去溶剂化温度，250℃；去溶剂化气流量，550升/小时。使用MassLynx MaxEnt 1功能将蛋白质峰解卷积。
反相液相色谱(LC)-MS
在37℃下在1U/mL TGase存在下将抗体01-L(1mg/mL)与50倍摩尔过量的Z-Gln-Gly-PEG2-AuF一起孵育过夜。通过IdeS将mAb消化成Fab'2和Fc片段，并如上所述用DTT还原。使用具有SQD和PDA检测器的Waters Alliance HPLC分析样品。将样品(0.5-2μg)在65℃下注射到Proteomix RP-1000柱(4.6X50mM，Sepax)上。在1mL/min流速下，采用75％流动相A(在水中的0.1％TFA)中1.5分钟平衡，和13.5分钟的梯度[25-65％流动相B(在乙酸乙酯中的0.1％TFA)]，发生LC，Fc和Fd片段的分离。
SQD质谱仪以正离子，V模式运行，检测200-2000m/z范围。源参数如下：毛细管电压，3.00kV；采样锥电压，40℃；源温度，120℃；去溶剂化温度，250℃；去溶剂化气流，800L/hr。扫描时间，1秒。蛋白质峰由MassLynx MaxEnt 1功能解卷积。PDA检测器在280nm。
实施例2：IgG抗体上溶剂暴露的赖氨酸的分析
检测了IgG1-κFab(抗体01,4F3F)，IgG1-λFab(4HK0)和IgG1Fc(1FC1)的晶体结构的潜在酰基受体位点。由于微生物转谷氨酰胺酶倾向于优选溶剂暴露的底物谷氨酰胺和环内的赖氨酸{Spolaore，2012 17/id}，使用具有1.4埃探针半径的Discovery Studio v4.5突出显示溶剂暴露的赖氨酸(图4)。在抗体01VH中有7个溶剂暴露的赖氨酸，3个在环中。由于利用不同的可变区家族和体细胞超变，赖氨酸的数量可以在mAb之间变化，因此还基于4F3F结构中残基的类似位置分析了5种其他抗体的VH区中赖氨酸的溶剂暴露。这些VH区可能含有1-5个溶剂暴露的赖氨酸，1或2个存在于环中。在抗体01Vκ中有6个溶剂暴露的赖氨酸，4个在环中。来自四种其他抗体的VK区可能含有3-5个溶剂暴露的赖氨酸，2个在环中。抗体05利用λ链，并且基于轻链的序列相似性使用4HK0的晶体结构确定赖氨酸的溶剂暴露。抗体05在Vλ结构域中可能具有2个溶剂暴露的赖氨酸，只有1个在环中。
分别使用4F3F，1FC1和4HK0的晶体结构分析CH1和κ，Fc和λ的恒定结构域。IgG1恒定结构域具有23个溶剂暴露的赖氨酸，13个在环中。κ恒定区具有8个赖氨酸，5个在环中。λ具有6个溶剂暴露的赖氨酸，半数在环中。总体而言，所分析的抗体的范围为每mAb环中42至50个溶剂暴露的赖氨酸。
为了确定微生物转谷氨酰胺酶是否可以使IgG抗体上的天然赖氨酸残基转酰胺化，将抗体与50倍摩尔过量的Z-Gln-Gly-CAD-生物素和1U/mL微生物转谷氨酰胺酶在37℃过夜孵育。用IdeS消化样品并用DTT还原，并通过质谱法分析LC，Fd和Fc片段的质量。样品没有去糖基化，并且对于每个Fc观察到对应于G0F(+1445Da)和G1F(+1608Da)糖型的两个质量峰。抗体04在VH中还含有N-连接的糖基化位点，观察到两种聚糖种类，G2FS和G2FS2。所有样品缺乏C端赖氨酸(128Da)，如通过Fc的观察质量与理论质量之间的-130至-132Da差异所证明的。虽然不同抗体中有42-50个潜在的酰基受体赖氨酸，但是HC和LC都不被酰基供体底物修饰(图6，表1)。
表1-与酰基供体和微生物转谷氨酰胺酶一起孵育的抗体的ESI-MS分析
ZQG-CAD-biotin:+631Da
Figure BDA0001700550010000591
Figure BDA0001700550010000601
表1：通过图6中的ESI-MS确定LC，Fd和Fc的质量。通过从观察到的质量中减去氨基酸序列以确定质量变化(Δ质量)而确定每个片段的理论质量。-128Da的Δ质量是由于Lys447的切割引起的。Fc用一种或两种寡糖G0F或G1F糖基化。
还分析基因融合至抗体01HC或LC(分别为HC-KTag或LC-KTag)的C端的产生的含有具有两个已知赖氨酸酰基受体位点的肽(GGSTKHKIPGGS；{Takazawa，2004 23/id})的两个阳性对照。将KTag mAb与Z-Gln-Gly-CAD-生物素和微生物转谷氨酰胺酶一起孵育。用PNGase F去糖基化并用DTT还原样品。通过质谱分析重链和轻链的质量。LC-KTag mAb用至多两个Z-Gln-Gly-CAD-生物素分子修饰，与KTag中两个赖氨酸的修饰一致(图7，表2)。
表2-C端K-Tag的转酰胺基作用
Z-Gln-Gly-CAD-生物素:+631Da
Figure BDA0001700550010000602
Figure BDA0001700550010000603
通过图7中的ESI-MS确定HC和LC的质量。通过从观察到的质量减去氨基酸序列以确定质量变化(Δ质量)而确定每个片段的理论质量。-128Da的Δ质量是由于Lys447的切割，+631Da的Δ质量表示增加一个Z-Gln-Gly-CAD-生物素。缀合至HC或LC的Z-Gln-Gly-CAD-生物素分子的数量通过质量变化除以Z-Gln-Gly-CAD-生物素的质量来确定。通过将单个HC或LC峰的信号强度除以样品中所有HC或LC峰的强度之和来确定缀合百分比。
向HC添加KTag令人惊讶地导致向HC添加不仅两个，而是至多三个Z-Gln-Gly-CAD-生物素分子。由于KTag中只有两个赖氨酸，mAb中的赖氨酸是第三个酰基受体位点。鉴于与KTag的接近程度，最可能的mAb赖氨酸受体位点是重链Lys447。
实施例3：单个氨基酸延伸对于Lys447的转酰胺基作用是充分的
在HEK293和CHO细胞中重组IgG表达期间，Lys447通常被羧肽酶B切割{Harris，1990 7/id；Harris，1995 6/id；Dick，2008 3/id}。然而，向HC C端添加KTag阻断Lys447的去除，从而允许微生物转谷氨酰胺酶利用Lys447作为酰基受体位点。为了确定微生物转谷氨酰胺酶是否可以使用Lys447作为不含KTag的酰基受体，Lys447的切割通过在抗体01的C端添加一个或两个亮氨酸(分别为抗体01-HC-L或抗体01-HC-LL)来阻断。将纯化的mAb与Z-Gln-Gly-CAD-生物素和微生物转谷氨酰胺酶一起孵育，并分析去糖基化HC的质量。实际上，添加一个或两个亮氨酸保留了Lys447，并且用与Lys447的转酰胺基作用一致的单一酰基供体底物修饰了HC(图8；表3)。
表3-具有C端亮氨酸的抗体01的转酰胺基作用
Z-Gln-Gly-CAD-biotin:+631Da
Figure BDA0001700550010000611
通过ESI-MS确定HC和LC的质量。如表2中测定Z-Gln-Gly-CAD-生物素(Δ质量＝631Da)与mAb的缀合百分比。
将C端亮氨酸添加至两种其他mAb。将野生型和突变mAb与微生物转谷氨酰胺酶和Z-Gln-Gly-CAD-生物素一起在37℃孵育过夜。如上所述通过质谱分析每个样品的Fc片段。与抗体01一样，添加C端亮氨酸导致突变体但不是野生型mAb的转酰胺基作用(表4)。
表4-具有C端亮氨酸的单克隆抗体的转酰胺基作用
Z-Gln-Gly-CAD-biotin:+631Da
Figure BDA0001700550010000621
将mAb与Z-Gln-Gly-CAD-生物素和微生物转谷氨酰胺酶在37℃过夜孵育，然后用IdeS消化以产生Fab和Fc片段。如图6中通过ESI-MS分析IdeS产生的Fc片段的质量，并且如表2中测定与Z-Gln-Gly-CAD-生物素的缀合百分比(Δ质量＝631Da)。
为了确定其他氨基酸是否可以阻断Lys447的切割，并且如果它们为微生物转谷氨酰胺酶修饰Lys447提供了合适的环境，剩余的氨基酸作为单一残基延伸添加至C端。分析样品使用Z-Gln-Gly-CAD-生物素通过微生物转谷氨酰胺酶的修饰。如上所述通过质谱分析Fc片段的质量。不出所料，另外的C端赖氨酸或精氨酸不保护Lys447的切割，因为它们是羧肽酶B的底物(表5)。在其余的氨基酸中，只有C端脯氨酸和酸性残基不促进与底物100％缀合。除了与缀合至Z-Gln-Gly-CAD-生物素(+631Da)相关的平均+628Da的位移外，还观察到+400Da的质量移位。这可能是由于来自Z-Gln-Gly-CAD-生物素的合成或后者的降解的Z-Gln-Gly-CAD的小百分比。
表5-C端氨基酸对Lys447的转酰胺基作用的效果
Z-Gln-Gly-CAD:+404Da
Z-Gln-Gly-CAD-生物素:+631Da
Figure BDA0001700550010000631
Figure BDA0001700550010000641
将mAb与Z-Gln-Gly-CAD-生物素和微生物转谷氨酰胺酶在37℃过夜孵育，然后用IdeS消化以产生Fab和Fc片段。如图6中通过ESI-MS分析IdeS产生的Fc片段的质量(数据未显示)，并且如表2中确定与Z-Gln-Gly-CAD-生物素和Z-Gln-Gly-CAD的缀合百分比(分别为Δ质量＝631Da和404Da)。
由于添加单赖氨酸或精氨酸C端氨基酸的切割，无法获得任一氨基酸对Lys447上的转酰胺基作用的效果。因此，亮氨酸被添加到赖氨酸和精氨酸变体的C端。此外，还用脯氨酸，天冬氨酸和谷氨酸盐变体研究了另外的C端亮氨酸的效果。另外的亮氨酸对测试的所有C端变体的转酰胺基作用具有正面效果(表6)。通过阻断赖氨酸或精氨酸的切割，Lys447被100％转酰胺化。此外，KL变体中的另外的赖氨酸也被转酰胺化，产生具有4个转酰胺基位点的抗体。C端亮氨酸也增加脯氨酸变体的转酰胺基作用至61.3％，酸性残基变体被中度地转酰胺化(表6)。
表6-两个C端氨基酸对Lys447的转酰胺基作用的效果
Z-Gln-Gly-CAD-生物素:+631Da
Figure BDA0001700550010000642
Figure BDA0001700550010000651
表6：mAb与Z-Gln-Gly-CAD-生物素和微生物转谷氨酰胺酶在37℃过夜孵育，然后用IdeS消化产生Fab和Fc片段。如图6中通过ESI-MS分析IdeS产生的Fc片段的质量(数据未显示)，并且如表2中确定与Z-Gln-Gly-CAD-生物素和Z-Gln-Gly-CAD的缀合百分比(分别为Δ质量＝631Da和404Da)。
实施例4：各种抗体同种型的C端赖氨酸的转酰胺基作用
CH3(或者在IgE和IgM的情况下为CH4)的C端残基对于所有人类同种型是赖氨酸(表7)。因此，可能的是该赖氨酸可以被用作其他同种型上的缀合位点。IgG2，IgG3和IgG4版本的抗体01在具有或不具有另外的C端亮氨酸或天冬氨酸盐的情况下制备。将mAb与微生物转谷氨酰胺酶和Z-Gln-Gly-CAD-生物素一起在37℃孵育过夜，并如上所述通过质谱法分析Fc片段的质量。与IgG1一样，C端赖氨酸在HEK293细胞中的表达期间被除去，除非存在另外的C端残基(表8)。野生型IgG2，IgG3或IgG4或C端天冬氨酸盐没有发现转酰胺基作用，但C端亮氨酸促进了mAb的转酰胺基作用。
表7-不同人类同种型的CH3或CH4C端密码子的比对
IgG1...LSLSPGK*
IgG2...LSLSPGK*
IgG3...LSLSPGK*
IgG4...LSLSLGK*
IgA1&2...IDRLAGKPTH...
IgD...VSVNPGK*
IgE...TDHGPMK*
IgM...VDKSTGKPTL...
比对CH3(对于IgE和IgM为CH4)的C端密码子。包括IgA和IgM的尾部附加物的三个N末端密码子。
表8-具有C端亮氨酸的IgG2，IgG3和IgG4的转酰胺基作用
Z-Gln-Gly-CAD-生物素:+631Da
Figure BDA0001700550010000652
Figure BDA0001700550010000661
将mAb与Z-Gln-Gly-CAD-生物素和微生物转谷氨酰胺酶在37℃过夜孵育，然后用IdeS消化以产生Fab和Fc片段。如图6中通过ESI-MS分析IdeS产生的Fc片段的质量(数据未显示)，并如表2中确定与Z-Gln-Gly-CAD-生物素的缀合百分比(Δ质量＝631Da)。
实施例5：酰基供体底物
与C端赖氨酸缀合的一种功用是用于制造位点特异性ADC。功能剂与C端赖氨酸的缀合可以通过两种方法中的一种来实现。首先，两步法需要微生物转谷氨酰胺酶将C端赖氨酸缀合至用反应性基团如BCN，DBCO，TCO，叠氮化物(N3)，炔烃，四嗪或马来酰亚胺合成的酰基供体。第二步涉及使用例如无铜点击化学或硫醇反应性化学将功能剂缀合至反应性基团。因此，如方法部分详述的，将氨基-PEG3-BCN或氨丙基-N3添加到Z-Gln-Gly的羟基上。如上所述将抗体01-HC-L与Z-Gln-Gly，Z-Gln-Gly-CAD-生物素，Z-Gln-Gly-N3或Z-Gln-Gly-PEG3-BCN和微生物转谷氨酰胺酶一起孵育。将样品脱盐，去糖基化，还原，并通过ESI-MS分析以确定将底物添加至mAb。所有四种底物均有效地缀合至抗体01-HC-L(表9)。
表9-各种官能团缀合至Lys447
Figure BDA0001700550010000671
将mAb与Z-Gln-Gly-CAD-生物素和微生物转谷氨酰胺酶在37℃过夜孵育，然后用IdeS消化以产生Fab和Fc片段。如图6中通过ESI-MS分析IdeS产生的Fc片段的质量(数据未显示)，并如表2中测定与各种底物的缀合百分比。
第二种方法涉及单一缀合步骤，其中功能剂用酰基供体基团合成。该方法通过在PEG2-澳瑞他汀F(Z-Gln-Gly-PEG2-AuF)上合成Z-Gln-Gly基团来测试。将Z-Gln-Gly-PEG2-AuF与抗体01-L和微生物转谷氨酰胺酶在37℃孵育过夜。在用IdeS消化并用DTT还原后，通过反相LC-MS分析监测280nm处的吸光度。对于抗体01-L观察到三个峰(图9)。通过ESI-MS分析每个峰的质量，并且第一个峰被确定为LC，第二个是Fc，并且第三个是Fd。对于与Z-Gln-Gly-PEG2-AuF和微生物转谷氨酰胺酶一起孵育的抗体01-L观察到第四个峰。尽管该峰不可以与Fd峰完全分离，但确定该峰的大部分的面积(图9B，插图)为Fc和Fc-Z-Gln-Gly-PEG2-AuF峰的总面积的75.4％(表10)。因此，实现了大于1.58的DAR。
表10-澳瑞他汀F单步缀合至Lys447
Figure BDA0001700550010000672
将mAb与酰基供体底物和微生物转谷氨酰胺酶在37℃孵育过夜，然后用IdeS消化并用DTT还原以产生LC，Fc和Fd片段。通过将图9中Fc+化合物的UV 280峰面积除以Fc和Fc+化合物峰的总面积来计算缀合百分比。
实施例6：二聚体抗体分子的产生
向免疫球蛋白的C端赖氨酸添加官能团的另一个功用是二聚体mAb-mAb分子的产生。例如，可以使用无铜点击化学将BCN缀合的mAb缀合至N3缀合的mAb。因此，将等体积的Z-Gln-Gly-N3或Z-Gln-Gly-PEG3-BCN抗体01-HC-L反应混合并使其在22℃孵育过夜。使用4-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶通过SDS-PAGE分析还原反应的二聚化HC(～110kDa)(图10)。事实上，用BCN和N3修饰的重链形成二聚体重链分子。
本领域技术人员将认识到，可以对本发明的优选实施方式进行许多改变和修改，并且可以在不脱离本发明的精神的情况下做出这样的改变和修改。因此，意图是所附权利要求覆盖落入本发明的真实精神和范围内的所有这样的等同变化。
Figure IDA0001700550060000011
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Claims (16)

1.一种缀合免疫球蛋白，其包含免疫球蛋白和功能剂，其中
a）所述免疫球蛋白包含C端赖氨酸之后的至少一个氨基酸残基但少于13个氨基酸残基，其中所述C端赖氨酸是使用EU编号系统编号的所述免疫球蛋白的重链上的赖氨酸447（K447），
i) 其中，当所述免疫球蛋白包含所述C端赖氨酸之后的一个氨基酸残基时，所述C端赖氨酸之后的所述一个氨基酸残基是甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺或组氨酸；
ii) 其中，当所述免疫球蛋白包含所述C端赖氨酸之后的两个氨基酸残基，其包含所述C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基和所述C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基时，所述C端赖氨酸之后的所述第一氨基酸残基是除天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸之外的任何氨基酸残基，并且其中所述C端赖氨酸之后的所述第二氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，脯氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，色氨酸和甘氨酸；以及
iii) 其中，当所述免疫球蛋白包含所述C端赖氨酸之后的三个至12个氨基酸残基时，所述C端赖氨酸之后的最后一个氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，脯氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，色氨酸和甘氨酸；
b）所述功能剂包含酰基供体底物，其中所述酰基供体底物包含谷氨酰胺残基，和
c）所述功能剂是治疗剂或诊断剂，
其中所述免疫球蛋白的所述C端赖氨酸与所述功能剂的所述酰基供体底物的所述谷氨酰胺残基缀合。
2.一种缀合免疫球蛋白，其包含免疫球蛋白和功能剂，其中
a）所述免疫球蛋白包含C端赖氨酸之后的至少一个氨基酸残基但少于13个氨基酸残基，其中所述C端赖氨酸是使用EU编号系统编号的所述免疫球蛋白的重链上的赖氨酸447（K447），
i) 其中，当所述免疫球蛋白包含所述C端赖氨酸之后的一个氨基酸残基时，所述C端赖氨酸之后的所述一个氨基酸残基是甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺或组氨酸；
ii) 其中，当所述免疫球蛋白包含所述C端赖氨酸之后的两个氨基酸残基，其包含所述C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基和所述C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基时，所述C端赖氨酸之后的所述第一氨基酸残基是除天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸之外的任何氨基酸残基，并且其中所述C端赖氨酸之后的所述第二氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，脯氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，色氨酸和甘氨酸；以及
iii) 其中，当所述免疫球蛋白包含所述C端赖氨酸之后的三个至12个氨基酸残基时，所述C端赖氨酸之后的最后一个氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，脯氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，色氨酸和甘氨酸；
b）所述C端赖氨酸与酰基供体底物上的谷氨酰胺残基缀合，其中所述酰基供体底物还包含反应性基团，
c）所述反应性基团与功能剂缀合，其中所述功能剂是治疗剂或诊断剂。
3.权利要求1或2所述的缀合免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含所述C端赖氨酸之后的一个氨基酸残基。
4.权利要求1所述的缀合免疫球蛋白，其中包含所述酰基供体底物的所述功能剂是根据式（I）或（II）之一：
(Z)m-Gln-(L)n-(Y) (I)
(Y)-(L)n-Gln-(Z)m (II)
其中，
Z是羧基苄氧基（CBZ）基团或氨基酸残基；
Gln是谷氨酰胺氨基酸残基；
每个L独立地为1至20个碳原子的直链或支链接头，其中一个或多个所述碳原子可以任选和独立地被氮、氧或硫原子替代，并且其中每个碳原子和氮原子可以任选地被取代；或每个L任选并独立地为氨基酸残基；
m是0至5的整数；
n是0至5的整数；和
Y是功能剂。
5.权利要求4所述的缀合免疫球蛋白，其中包含所述酰基供体底物的所述功能剂：
(i) 是根据式（I），并且其中Z是CBZ基团；其中L为聚乙二醇部分（PEG）（-O((CH2)2)-），乙胺（-NH((CH2)2)-）或丙胺（-NH((CH2)3)-）；并且其中n是0、1、2、3、4或5；
(ii) 是根据式（I），其中Z是CBZ基团，并且其中L是氨基酸；或者
(iii) 是根据式（II），其中Z是CBZ基团；m是1；n是1、2或3；并且至少一个L是Gly。
6.权利要求2所述的缀合免疫球蛋白，其中所述酰基供体底物根据式（III）或（IV）之一：
(Z)m-Gln-(L)n-(X) (III)
(X)-(L)n-Gln-(Z)m (IV)
其中，
Z是羧基苄氧基（CBZ）基团或氨基酸残基；
Gln是谷氨酰胺氨基酸残基；
每个L独立地为1至20个碳原子的直链或支链接头，其中一个或多个所述碳原子可以任选和独立地被氮、氧或硫原子替代，并且其中每个碳原子和氮原子可以任选地被取代；或每个L任选并独立地为氨基酸残基；
m是0至5的整数；
n是0至5的整数；和
X是反应性基团。
7.权利要求6所述的缀合免疫球蛋白，其中所述酰基供体底物：
(i) 是根据式（III），并且其中Z是CBZ基团；其中每个L独立地为聚乙二醇部分（PEG）（-O((CH2)2)-），乙胺（-NH((CH2)2)-）或丙胺（-NH((CH2)3)-）；并且其中n是0、1、2、3、4或5；或者(ii) 是根据式（III），其中Z是CBZ基团，并且L是氨基酸；或者
(iii) 是根据式（IV），其中Z是CBZ基团；m是1；n是1、2或3；并且至少一个L是Gly。
8.权利要求1或权利要求2所述的缀合免疫球蛋白，其中所述治疗剂是抗体或其抗原结合部分，药物剂，小分子或核酸；或者
其中所述诊断剂是荧光团，放射性核素或酶。
9.权利要求1或权利要求2所述的缀合免疫球蛋白，其中所述治疗剂是多肽。
10.权利要求8所述的缀合免疫球蛋白，其中所述药物剂是放射性剂，细胞毒性剂或抗生素。
11.权利要求1或权利要求2所述的缀合免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白：
(i) 是IgG1免疫球蛋白；或者
(ii) 是IgG2，IgG3或IgG4免疫球蛋白；或者
(iii) 是IgA1，IgA2或IgM免疫球蛋白；或者
(iv) 是IgD或IgE免疫球蛋白；或者
(v) 是人免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白；或者
(vi) 是嵌合免疫球蛋白或非人免疫球蛋白；或者
(vii) 包含两条重链和两条轻链。
12.一种药物组合物，其包含权利要求1-11中任一项所述的缀合免疫球蛋白和药学上可接受的载体。
13.一种产生权利要求1、4和5中任一项所述的缀合免疫球蛋白的方法，所述方法包括：
孵育免疫球蛋白与微生物转谷氨酰胺酶和包含酰基供体底物的功能剂，
a）其中所述免疫球蛋白包含C端赖氨酸之后的至少一个氨基酸残基但少于13个氨基酸残基，其中所述C端赖氨酸是使用EU编号系统编号的所述免疫球蛋白的重链上的赖氨酸447（K447），
i) 其中，当所述免疫球蛋白包含所述C端赖氨酸之后的一个氨基酸残基时，所述C端赖氨酸之后的所述一个氨基酸残基是甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺或组氨酸；
ii) 其中，当所述免疫球蛋白包含所述C端赖氨酸之后的两个氨基酸残基，其包含所述C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基和所述C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基时，所述C端赖氨酸之后的所述第一氨基酸残基是除天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸之外的任何氨基酸残基，并且其中所述C端赖氨酸之后的所述第二氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，脯氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，色氨酸和甘氨酸；以及
iii) 其中，当所述免疫球蛋白包含所述C端赖氨酸之后的三个至12个氨基酸残基时，所述C端赖氨酸之后的最后一个氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，脯氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，色氨酸和甘氨酸；
b）其中所述酰基供体底物包含谷氨酰胺残基，和
c）其中所述功能剂是治疗剂或诊断剂，
其中所述微生物转谷氨酰胺酶将所述免疫球蛋白的所述C端赖氨酸缀合至所述功能剂上的所述酰基供体底物的所述谷氨酰胺残基，从而产生所述缀合免疫球蛋白。
14.一种产生权利要求2、6和7中任一项所述的缀合免疫球蛋白的方法，所述方法包括：
1）孵育免疫球蛋白与微生物转谷氨酰胺酶和酰基供体底物，
a）其中所述免疫球蛋白包含C端赖氨酸之后的至少一个氨基酸残基但少于13个氨基酸残基，其中所述C端赖氨酸是使用EU编号系统编号的所述免疫球蛋白的重链上的赖氨酸447（K447），和
i) 其中，当所述免疫球蛋白包含所述C端赖氨酸之后的一个氨基酸残基时，所述C端赖氨酸之后的所述一个氨基酸残基是甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺或组氨酸；
ii) 其中，当所述免疫球蛋白包含所述C端赖氨酸之后的两个氨基酸残基，其包含所述C端赖氨酸之后的第一氨基酸残基和所述C端赖氨酸之后的第二氨基酸残基时，所述C端赖氨酸之后的所述第一氨基酸残基是除天冬氨酸，谷氨酸或脯氨酸之外的任何氨基酸残基，并且其中所述C端赖氨酸之后的所述第二氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，脯氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，色氨酸和甘氨酸；以及
iii) 其中，当所述免疫球蛋白包含所述C端赖氨酸之后的三个至12个氨基酸残基时，所述C端赖氨酸之后的最后一个氨基酸残基选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，缬氨酸，丝氨酸，脯氨酸，苏氨酸，丙氨酸，酪氨酸，组氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸，色氨酸和甘氨酸；
b）其中所述酰基供体底物包含谷氨酰胺残基和反应性基团，
其中所述微生物转谷氨酰胺酶将所述免疫球蛋白的所述C端赖氨酸缀合至所述酰基供体底物的所述谷氨酰胺残基，并且
2）将功能剂与所述酰基供体底物的所述反应性基团缀合，其中所述功能剂是治疗剂或诊断剂，
从而产生所述缀合免疫球蛋白。
15.权利要求14所述的方法，其中所述酰基供体底物的所述反应性基团通过点击化学与所述功能剂缀合。
16.权利要求13或权利要求14所述的方法，其中所述微生物转谷氨酰胺酶是Streptomyces mobarensis微生物转谷氨酰胺酶。
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