CN108588040A - 重组MtMetRS、其晶体及它们在制备抗结核药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了重组MtMetRS、其晶体及它们在制备抗结核药物中的应用。重组MtMetRS的氨基酸序列如序列表中序列2所示。制备重组MtMetRS晶体的方法，为采用结晶液使重组MtMetRS溶液中的重组MtMetRS结晶，得到重组MtMetRS晶体；所述结晶液中含有醋酸钙、二甲胂酸钠和PEG8000。重组MtMetRS无配体晶体的三维结构与WWW.PDB.ORG已公开的晶体结构(PDB code：6AX8)在底物结合口袋及催化结构域等与酶活性相关的结构上存在构象上的重大差异。与6AX8在这些关键区域显著不同的结构信息是设计特异性药物的基础。本发明提供的重组MtMetRS是获得重组MtMetRS无配体晶体的基础，也是MtMetRS抑制剂筛选设计的必须技术。本发明具有重大的应用价值。

Description

重组MtMetRS、其晶体及它们在制备抗结核药物中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及重组MtMetRS、其晶体及它们在制备抗结核药物中的应用，尤其涉及重组MtMetRS晶体的制备及它们在抗结核药物设计中的应用。

背景技术

结核病(TB)是由结核分枝杆菌引起的严重感染性疾病。抗生素在结核病治疗中的长期使用，引起耐药结核菌感染病例增多，为结核病的防治工作带来前所未有的严峻挑战。因此，发现新的药物靶点和设计新型抗结核药物迫在眉睫。

氨酰tRNA合成酶(aminoacyl-tRNAsynthetases，aaRS)作为细胞内高度保守蛋白酶家族，参与到生物遗传信息翻译过程中，负责将氨基酸转移到对应的tRNA上，是确保细胞内遗传信息忠实翻译的酶。氨酰tRNA合成酶系统有20种酶组成。理论上每一种酶均是一种抗生素的作用靶点。在这20种酶中甲硫氨酰tRNA合成酶对生命活动的影响最大，它不仅识别初始tRNA，同时参与蛋白质肽链的延伸，因此，对甲硫氨酰tRNA合成酶的抑制，可以最大程度的抑制生命活动。除此之外，不同物种来源的MetRS具有结构上的多样性。在近几年的aaRS抑制剂研究中，发现了一些氨酰-tRNA合成酶抑制剂，具有高选择性和强抑制能力。aaRS已被证明是理想的抗生素作用靶点。由于目前临床使用的抗结核药物作用靶点均不在氨酰tRNA合成酶系统，因此针对氨酰tRNA合成酶系统的抑制剂与目前药物没有交叉耐药性。

结核分枝杆菌甲硫氨酰tRNA合成酶(Mycobacterium tuberculosisMethionyl-tRNAsynthetase，MtMetRS)的研究从上个世纪末报道其氨酰化反应后就没有新的进展，这与其重组蛋白制备困难有关。由于MetRS抑制剂存在专一性强，抗菌谱覆盖面窄的问题。用于结核病治疗的MetRS抑制剂需要依据MtMetRS结构进行设计和筛选。获得准确的MtMetRS分子模型是基于结构理性设计抑制剂的基础。目前，在蛋白质结构数据库PDB中含有配体的结核分枝杆菌MetRS的晶体结构，但是并未获得无配体的MtMetRS结构。因此，针对结核分枝杆菌甲硫氨酰tRNA合成酶的结构学研究首先需要解决重组蛋白的制备和结晶问题。

发明内容

本发明的目的是制备MtMetRS无配体晶体并解析其结构，为制备抗结核药物提供作用靶点。

本发明首先保护重组MtMetRS，其氨基酸序列可如序列表中序列2所示。

编码所述重组MtMetRS的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可为b1)或b2)：

b1)编码区是序列表中序列1所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子。

含有所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物也属于本发明的保护范围。

本发明还保护所述重组MtMetRS、或、上述任一所述核酸分子、或、含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物的应用，可为A1)至A5)中的至少一种；

A1)制备重组MtMetRS的无配体晶体；

A2)制备抗结核药物；

A3)制备MetRS抑制剂；

A4)设计和/或筛选小分子化合物；

A5)治疗结核病。

上述应用中，所述小分子化合物具体可为抗生素。

本发明还保护所述重组MtMetRS的无配体晶体。

本发明还保护制备所述重组MtMetRS的无配体晶体的方法，为采用结晶液使重组MtMetRS溶液中的重组MtMetRS结晶，得到重组MtMetRS的无配体晶体；

所述结晶液中含有醋酸钙、二甲胂酸钠和PEG8000。

上述方法中，所述结晶液中可含有0.08-0.12M醋酸钙、0.08-0.12M二甲胂酸钠和4-6mg/100mLPEG8000，其pH值为6.0-6.2。所述结晶液可为含有0.08-0.12M醋酸钙、0.08-0.12M二甲胂酸钠和4-6mg/100mLPEG8000的水溶液，其pH值为6.0-6.2。所述结晶液具体可为含有0.1M醋酸钙、0.1M二甲胂酸钠和5mg/100mLPEG8000的水溶液，其pH值为6.1。

上述方法中，所述结晶的条件可为17-23℃(如17-20℃、20-23℃、17℃、20℃或23℃)静置48h以上(如48h、3d、4d、6d、10d、15d、20d或25d)。

上述方法中，所述“采用结晶液使重组MtMetRS溶液中的重组MtMetRS结晶”具体可采用悬滴法。

上述方法中，所述“重组MtMetRS溶液”可为利用大肠杆菌表达所述重组MtMetRS时，重组大肠杆菌破碎后，经Ni亲和层析柱纯化，再经超滤浓缩管和分子筛柱浓缩，最后得到的蛋白溶液。所述超滤浓缩管截留分子量可为10KD。所述分子筛柱可为superdex200分子筛柱，分子筛缓冲液可为含100mM NaCl和50mM Tris的水溶液，pH值8.5。

本发明还保护上述任一所述方法制备的重组MtMetRS的无配体晶体。

本发明还保护一种用于筛选MtMetRS抑制剂或筛选抑制结核分枝杆菌或筛选抗结核病药物的模型，可为所述重组MtMetRS的无配体晶体。

本发明还保护上述任一所述重组MtMetRS的无配体晶体的应用，可为A2)至A5)中的至少一种；

A2)制备抗结核药物；

A3)制备MetRS抑制剂；

A4)设计和/或筛选小分子化合物；

A5)治疗结核病。

上述应用中，所述小分子化合物具体可为抗生素。

上述任一所述结晶液也属于本发明的保护范围。

上述任一所述结晶液在制备所述重组MtMetRS的无配体晶体中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述重组MtMetRS晶体的三维结构可如图1中A所示。

上述任一所述MetRS抑制剂具体可为MtMetRS抑制剂。

本发明的发明人为了获得MtMetRS无配体的晶体结构，在天然MtMetRS的氨基酸序列的基础上进行设计，增加了促进结晶序列，得到序列表中序列1所示的重组MtMetRS的编码基因，编码序列表中序列2所示的重组MtMetRS。通过对重组MtMetRS的表达、纯化工艺流程的优化，以及设计、优化重组MtMetRS无配体晶体的制备工艺流程，获得了重组MtMetRS无配体晶体，并最终获得了重组MtMetRS无配体晶体的三维结构信息。该结构与WWW.PDB.ORG已公开的晶体结构(PDB code：6AX8)在底物结合口袋及催化结构域等与酶活性相关的结构上存在构象上的重大差异。与6AX8在这些关键区域显著不同的结构信息是设计特异性药物的基础。重组MtMetRS在催化反应中，具有不同于其它物种的构型变化，对其构型变化的抑制可以筛选设计出高选择的抗生素。在小分子化合物的筛选中，需要重组MtMetRS无配体晶体的辅助，后期化合物结构的优化也需要通过重组MtMetRS无配体的晶体与小分子化合物的浸泡获得结合方式数据。本发明提供的重组MtMetRS和结晶液是获得重组MtMetRS无配体晶体的基础，也是MtMetRS抑制剂筛选设计的必须技术。本发明具有重大的应用价值。

附图说明

图1为无配体MtMetRS和结合配体MtMetRS(6AX8)的三维结构。

图2为重组MtMetRS无配体晶体结构和人细胞质MetRS(HcMetRS)晶体结构分析。

图3为制备的重组MtMetRS无配体晶体及其X射线衍射图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、重组MtMetRS的制备

本发明的发明人经过大量实验，通过在天然蛋白质MtMetRS的两端添加若干个碱性氨基酸，得到可以制备无配体晶体的重组MtMetRS。可见，在天然蛋白质MtMetRS的两端添加若干个碱性氨基酸形成的阳离子多肽链与其他分子表面的阴离子区结合，可以帮助堆积形成蛋白质晶体，是制备无配体晶体的必须条件。重组MtMetRS为非天然蛋白质，是在天然蛋白质MtMetRS的基础上进行改造获得的蛋白质。

一、重组质粒pQE60-MtMetRS的构建

将pQE60载体(QIAGEN公司的产品)的NcoⅠ识别序列和BglⅡ识别序列间的DNA分子替换为序列表的序列1所示的双链DNA分子，保持pQE60载体的其它序列不变，得到重组质粒pQE60-MtMetRS。

重组质粒pQE60-MtMetRS表达序列表中序列2所示的重组MtMetRS。

二、重组质粒pQE60-MtMetRS的表达和纯化

平衡液：含100mM NaCl、50mM Tris、10mM咪唑和0.1％(v/v)β-巯基乙醇的水溶液，pH值为8.5。

洗涤液：含100mM NaCl、50mM Tris、10mM咪唑和0.1％(v/v)β-巯基乙醇的水溶液，pH值为8.5。

洗脱液：含100mM NaCl、50mM Tris、350mM咪唑和0.1％(v/v)β-巯基乙醇的水溶液，pH值为8.5。

裂解液：含200mM NaCl、50mM的Tris-HCl、10mM imidazole、0.1％(v/v)β-巯基乙醇和1mM PMSF的水溶液，pH值为8.5。

1、将重组质粒pQE60-MtMetRS导入大肠杆菌M15，得到重组大肠杆菌。

2、将步骤1得到的重组大肠杆菌接种于含200mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃、2000rpm振荡培养，得到OD_600nm值约为0.8的培养菌液。

3、取步骤2得到的培养菌液，先冰浴放置30min，然后加入IPTG，得到诱导体系；诱导体系中，IPTG的浓度为0.5mmol/L。

4、取步骤3得到的诱导体系，14-18℃、200rpm振荡培养12-18h。

5、取完成步骤4的诱导体系，4000rpm离心15min，收集菌体。

6、用冰冷的裂解液重悬步骤5收集的菌体，然后在冰上超声破碎(超声功率400W，5s破碎5s间隙，共99次)，得到菌体破碎液。

7、取步骤6得到的菌体破碎液，15000rpm离心30min，收集上清液。

8、取步骤7收集的上清液，0.45μm滤膜过滤，收集滤液。

9、取Ni亲和层析柱(QIAGEN公司的产品)，①用25mL平衡液洗脱(目的为平衡柱子)，②加入步骤8收集的滤液，③用25mL洗涤液洗脱(目的为去除杂蛋白)，④用20mL洗脱液洗脱，收集用洗脱液进行洗脱得到的过柱后溶液。

10、取步骤9收集的过柱后溶液，置于截留分子量为10KD的超滤浓缩管进行超滤浓缩，得到蛋白浓缩液。

11、取步骤10得到的蛋白浓缩液，使用superdex200分子筛柱(分子筛缓冲液：含100mM NaCl和50mM Tris的水溶液，pH值8.5)进行纯化，纯化后的蛋白浓缩为浓度为7.8mg/mL的蛋白溶液。

实施例2、重组MtMetRS无配体晶体的制备及其结构的独特性

一、重组MtMetRS无配体晶体的制备

采用悬滴法进行重组MtMetRS的结晶，具体步骤如下：

1、在小孔中加入200μL结晶液。

结晶液：含0.1M醋酸钙、0.1M二甲胂酸钠和5mg/100mLPEG8000的水溶液，pH值为6.1。

2、将1体积份实施例1中步骤11得到的浓度为7.8mg/mL的蛋白溶液和1体积份结晶液在玻片上混匀，然后覆盖在完成步骤1的小孔上，使用凡士林密封。

3、完成步骤2后，20℃静置15-25天，得到重组MtMetRS无配体晶体。

步骤(3)得到的重组MtMetRS无配体晶体及其X射线衍射图见图3(衍射条件为：X-ray波长：1埃，距离：200mM，转角：0.2度)。重组MtMetRS无配体晶体的三维结构见图1中A。

二、重组MtMetRS无配体晶体结构的独特性

WWW.PDB.ORG已公开的晶体结构(PDB code：6AX8)(见图1中B)和重组MtMetRS无配体晶体的结构存在重要差异，差异主要存在于催化结构域与酶活性相关的区域上。WWW.PDB.ORG已公开的晶体结构(PDB code：6AX8)中，催化结构域处于催化状态。重组MtMetRS无配体晶体结构的底物结合口袋没有形成闭合的催化状态，参与底物ATP结合的氨基酸多肽与6AX8的外形也不同，这些构形的不同使无配体的MtMetRS分子表面存在多个特异性的疏水口袋与MtMetRS的酶活性相关。这些口袋是设计特异性抑制的靶标。

通过分析重组MtMetRS无配体晶体结构和人细胞质MetRS(HcMetRS)晶体结构(见图2，结核分枝杆菌无配体MetRS即为重组MtMetRS无配体晶体)，发现在tRNA氨基酸接受臂结合区的HcMetRS是一个结合面，而MtMetRS分子是一个疏水口袋。这为设计特异性抑制剂提供了结构生物学证据。此外还发现在重组MtMetRS的核酸结合环和α10之间及β2和β3之间存在的特异性疏水口袋与重组MtMetRS的构象变化相关，这两个疏水口袋的占据可以抑制底物诱导的重组MtMetRS构象变化，也是很好的抑制剂设计靶点。

<110> 中国医学科学院病原生物学研究所

<120> 重组MtMetRS、其晶体及它们在制备抗结核药物中的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1608

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

atgggccacc atcatcatca tcatatgaag ccctattacg tcaccaccgc gatcgcatat 60

cccaacgctg caccccacgt aggtcacgcc tacgaataca tcgccaccga cgcgatcgcc 120

cggttcaaac ggctggatcg ctatgacgtg cgcttcctga ccgggaccga cgagcatggc 180

ctgaaggtcg cacaagccgc cgcggcagcg ggcgtgccca ccgcggcgct tgcccggcgc 240

aattccgacg tgtttcagcg catgcaggag gcgctgaaca tctccttcga ccgattcatc 300

cgcactaccg atgccgacca ccacgaggcg tccaaggaac tctggcgacg gatgtcggcg 360

gccggcgaca tctatctgga caactattcc gggtggtact cggtgcgcga cgagcggttc 420

ttcgtcgaat cggagaccca acttgtcgac ggcacgcgcc tgacggtaga gaccggcacg 480

ccggtgacct ggaccgagga gcagacctac ttcttccggc tgtcggccta taccgacaag 540

ctgctggccc actatcacgc caaccccgac ttcatcgcgc cggagacgcg gcgcaacgaa 600

gtgatcagct tcgtctccgg cggcctggac gacctgtcga tctcgcgcac ctcgtttgac 660

tggggtgtgc aggtgcccga gcaccccgac cacgtcatgt acgtctgggt cgacgcgctg 720

accaattacc tgaccggggc gggcttcccg gataccgact cggagttgtt ccgccgctac 780

tggcccgccg atttgcacat gatcggcaag gacatcatca ggtttcatgc cgtctattgg 840

ccggcgtttt tgatgtcagc cggaatcgag ttgccgcgaa ggatcttcgc gcacgggttc 900

ttgcacaacc gcggcgagaa gatgagtaaa tcggtgggca acatcgtcga cccggttgcc 960

ctggcggaag cgctcggggt ggaccaggtc cgctacttcc tgttgcggga ggtcccgttc 1020

ggccaggacg gcagttacag cgacgaggcc atcgtcactc ggatcaacac cgatctggcc 1080

aacgagctcg gcaacttggc ccaacgctcg ttgtcgatgg tggccaaaaa ccttgacggc 1140

agggtgccca acccgggtga gttcgccgac gccgacgccg cgctgcttgc gaccgccgat 1200

ggcttgttgg agcgagtgcg cggtcacttc gacgcacagg cgatgcacct ggcgctggag 1260

gcgatctggc tgatgctcgg cgacgcgaac aagtactttt cggtgcagca gccgtgggta 1320

ctgcgcaaga gcgagtccga agccgatcag gcccggttcc gcaccacgct ctacgtcacc 1380

tgcgaggtag tccgcatcgc ggcactgctg atccagccgg tgatgccgga gtcggccggc 1440

aaaattttgg acctgctcgg ccaggcccca aaccagcggt cgttcgccgc cgtaggtgtt 1500

cggctgaccc ccggcacagc gctgccgccg cccaccgggg tatttccccg ctaccagccg 1560

ccgcaaccac ccgaaggcaa gagatctcat caccatcacc atcactaa 1608

<210> 2

<211> 535

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

Met Gly His His His His His His Met Lys Pro Tyr Tyr Val Thr Thr

1 5 10 15

Ala Ile Ala Tyr Pro Asn Ala Ala Pro His Val Gly His Ala Tyr Glu

20 25 30

Tyr Ile Ala Thr Asp Ala Ile Ala Arg Phe Lys Arg Leu Asp Arg Tyr

35 40 45

Asp Val Arg Phe Leu Thr Gly Thr Asp Glu His Gly Leu Lys Val Ala

50 55 60

Gln Ala Ala Ala Ala Ala Gly Val Pro Thr Ala Ala Leu Ala Arg Arg

65 70 75 80

Asn Ser Asp Val Phe Gln Arg Met Gln Glu Ala Leu Asn Ile Ser Phe

85 90 95

Asp Arg Phe Ile Arg Thr Thr Asp Ala Asp His His Glu Ala Ser Lys

100 105 110

Glu Leu Trp Arg Arg Met Ser Ala Ala Gly Asp Ile Tyr Leu Asp Asn

115 120 125

Tyr Ser Gly Trp Tyr Ser Val Arg Asp Glu Arg Phe Phe Val Glu Ser

130 135 140

Glu Thr Gln Leu Val Asp Gly Thr Arg Leu Thr Val Glu Thr Gly Thr

145 150 155 160

Pro Val Thr Trp Thr Glu Glu Gln Thr Tyr Phe Phe Arg Leu Ser Ala

165 170 175

Tyr Thr Asp Lys Leu Leu Ala His Tyr His Ala Asn Pro Asp Phe Ile

180 185 190

Ala Pro Glu Thr Arg Arg Asn Glu Val Ile Ser Phe Val Ser Gly Gly

195 200 205

Leu Asp Asp Leu Ser Ile Ser Arg Thr Ser Phe Asp Trp Gly Val Gln

210 215 220

Val Pro Glu His Pro Asp His Val Met Tyr Val Trp Val Asp Ala Leu

225 230 235 240

Thr Asn Tyr Leu Thr Gly Ala Gly Phe Pro Asp Thr Asp Ser Glu Leu

245 250 255

Phe Arg Arg Tyr Trp Pro Ala Asp Leu His Met Ile Gly Lys Asp Ile

260 265 270

Ile Arg Phe His Ala Val Tyr Trp Pro Ala Phe Leu Met Ser Ala Gly

275 280 285

Ile Glu Leu Pro Arg Arg Ile Phe Ala His Gly Phe Leu His Asn Arg

290 295 300

Gly Glu Lys Met Ser Lys Ser Val Gly Asn Ile Val Asp Pro Val Ala

305 310 315 320

Leu Ala Glu Ala Leu Gly Val Asp Gln Val Arg Tyr Phe Leu Leu Arg

325 330 335

Glu Val Pro Phe Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Ser Asp Glu Ala Ile Val

340 345 350

Thr Arg Ile Asn Thr Asp Leu Ala Asn Glu Leu Gly Asn Leu Ala Gln

355 360 365

Arg Ser Leu Ser Met Val Ala Lys Asn Leu Asp Gly Arg Val Pro Asn

370 375 380

Pro Gly Glu Phe Ala Asp Ala Asp Ala Ala Leu Leu Ala Thr Ala Asp

385 390 395 400

Gly Leu Leu Glu Arg Val Arg Gly His Phe Asp Ala Gln Ala Met His

405 410 415

Leu Ala Leu Glu Ala Ile Trp Leu Met Leu Gly Asp Ala Asn Lys Tyr

420 425 430

Phe Ser Val Gln Gln Pro Trp Val Leu Arg Lys Ser Glu Ser Glu Ala

435 440 445

Asp Gln Ala Arg Phe Arg Thr Thr Leu Tyr Val Thr Cys Glu Val Val

450 455 460

Arg Ile Ala Ala Leu Leu Ile Gln Pro Val Met Pro Glu Ser Ala Gly

465 470 475 480

Lys Ile Leu Asp Leu Leu Gly Gln Ala Pro Asn Gln Arg Ser Phe Ala

485 490 495

Ala Val Gly Val Arg Leu Thr Pro Gly Thr Ala Leu Pro Pro Pro Thr

500 505 510

Gly Val Phe Pro Arg Tyr Gln Pro Pro Gln Pro Pro Glu Gly Lys Arg

515 520 525

Ser His His His His His His

530 535

Claims (10)

1.重组MtMetRS，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。

2.编码权利要求1所述重组MtMetRS的核酸分子。

3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为b1)或b2)：

b1)编码区是序列表中序列1所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子。

4.权利要求1所述重组MtMetRS的无配体晶体。

5.制备权利要求1所述重组MtMetRS的无配体晶体的方法，为采用结晶液使重组MtMetRS溶液中的重组MtMetRS结晶，得到重组MtMetRS的无配体晶体；

所述结晶液中含有醋酸钙、二甲胂酸钠和PEG8000。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述结晶的条件为：17-23℃静置48h以上。

7.权利要求5或6所述的方法制备的重组MtMetRS的无配体晶体。

8.一种用于筛选MtMetRS抑制剂或筛选抑制结核分枝杆菌或筛选抗结核病药物的模型，为权利要求1所述重组MtMetRS的无配体晶体。

9.K)或S)：

K)权利要求1所述重组MtMetRS、或、权利要求2或3所述核酸分子，的应用，为A1)至A5)中的至少一种；

S)权利要求1所述重组MtMetRS的无配体晶体的应用，为A2)至A5)中的至少一种；

A1)制备重组MtMetRS的无配体晶体；

A2)制备抗结核药物；

A3)制备MetRS抑制剂；

A4)设计和/或筛选小分子化合物；

A5)治疗结核病。

10.权利要求5中所述结晶液。