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CN108522291B - 利用甜叶菊新品种814011谱星3号制备高rm含量甜菊糖苷的方法 - Google Patents

利用甜叶菊新品种814011谱星3号制备高rm含量甜菊糖苷的方法 Download PDF

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CN108522291B CN201810450140.7A CN201810450140A CN108522291B CN 108522291 B CN108522291 B CN 108522291B CN 201810450140 A CN201810450140 A CN 201810450140A CN 108522291 B CN108522291 B CN 108522291B
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Abstract

本发明提供了一种甜叶菊变种植物，所述变种植物为814011谱星3号，其愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.9701。本发明同时提供了一种高RM含量的甜菊糖苷产品，其中RM/TSG大于0.08，RD/TSG大于0.08。

Description

利用甜叶菊新品种814011谱星3号制备高RM含量甜菊糖苷的 方法
本申请是发明名称为“甜叶菊新品种814011谱星3号及高RM含量甜菊糖苷的制备”的发明专利申请的分案申请，母案的申请号为“2015100366686”，母案的申请日为2015年1月23日。
技术领域
本发明涉及一种甜叶菊新品种，所述甜叶菊品种含有高含量的RM，并可由保藏的愈伤组织连续培育产生；涉及从该品种的甜叶菊干叶制备高RM含量甜菊糖苷的方法。
背景技术
甜叶菊(Stevia)，学名为Stevia Rebaudiana Bertoni，是一种多年生菊科草本植物，原产于南美巴拉圭，其叶片中含有甜菊糖苷，其甜度为蔗糖的150～300倍，是一种高甜度、低热能、味质好、安全无毒的新型天然甜味剂，可广泛应用于食品、饮料、医药、日化工业等行业。
甜菊糖苷是多组分糖苷混合物，糖苷组分及含量决定混合物的甜度和口感。甜叶菊中的甜菊糖苷含有13种组分，即甜叶菊苷A(Rebaudioside A，简称RebA或RA)、甜叶菊苷B(Rebaudioside B，简称RebB或RB)，甜叶菊苷C(Rebaudioside C，简称RebC或RC)，甜叶菊苷D(Rebaudioside D，简称RebD或RD)，甜叶菊苷E(Rebaudioside E，简称RebE或RE)，甜叶菊苷F(Rebaudioside F，简称RebF或RF)，甜叶菊苷M(Rebaudioside M，简称RebM或RM)，甜叶菊苷N(Rebaudioside N，简称RebN或RN)，甜叶菊苷O(Rebaudioside O，简称RebO或RO)，甜苷A(Dulcoside A，简称DulA或DA)，甜茶苷(Rubusoside，简称Rub或RU)；甜菊双糖苷(Steviolbioside，简称Sbio或SB)，甜菊糖(Stevioside，简称Stev或ST)；这十三种甜菊糖苷的总和成为总甜菊糖苷(Total Steviol glycosides，TSG)；其中RM相对含量较少，约占总甜菊糖苷(TSG)的0.2％。但是RM的甜度最高，约为蔗糖的300倍，而且味质最好，最接近于蔗糖的口感，不含任何不良余味，被业内人士誉为“甜菊糖苷中的黄金”，售价也是其他糖苷的3～5倍，是一种最为理想的天然甜味剂。因此，制取RM含量高的甜菊糖苷产品具有广阔的市场前景。
由于RM在甜叶菊中含量低，过去，获得高纯度RM的唯一方法是反复重结晶，反复重结晶的劣势在于产品得率低，不利于成本控制；另外由于在甜叶菊中含量低，无法大规模生产，不能满足客户的需求。因此有必要开发一种高RM含量的甜叶菊新品种，以便降低高RM含量甜菊糖苷产品生产成本并保持其稳定的得率。
发明内容
本发明提供了一种甜叶菊变种植物。在一个实施例中，变种植物为814011谱星3号，其814011谱星3号的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.9701，其所述814011谱星3号的植物及干叶中RM/TSG大于0.08，RD/TSG大于0.08。在另一个实施例中，变种植物通过以AKHL1为父本，EIRETE为母本进行杂交，得到F1代，并从所述F1代优选出性状优良且稳定的单株YF001，然后以YF001为父本，PCStar2为母本进行杂交，得到F2代，其中所述F2代表达由本发明所描述的814011谱星3号的所有生理和形态特征，其814011谱星3号的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.9701。在另一个实施例中，变种植物或其一部分表达由本发明所描述的814011谱星3号所有的生理和形态特征，其814011谱星3号的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.9701。
本发明同时提供了产生甜叶菊变种植物或其一部分的愈伤组织，甜叶菊变种植物的再生细胞及其再生细胞的组织培养。
本发明同时提供了产生甜叶菊变种植物的方法。在一个实施例中，所述方法包括：以AKHL1为父本，EIRETE为母本进行杂交，得到F1代，并从所述F1代优选出性状优良且稳定的单株YF001，然后以YF001为父本，PC Star2为母本进行杂交，得到F2代，其中所述F2代表达由本发明所描述的814011谱星3号的所有生理和形态特征，其814011谱星3号的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.9701。
本发明同时提供了一种高RM含量甜菊糖苷的制备方法。在一个实施例中，所述制备方法包括：提供用于制备高RM含量甜菊糖苷的原料，其原料为由本发明所描述的甜叶菊植物或干叶，其植物及干叶中RM/TSG大于0.08，RD/TSG大于0.08；粉碎所述原料；用水或水溶剂提取所述粉碎原料，获得甜菊糖苷产品，其中RM/TSG大于0.08，RD/TSG大于0.08。在另一个实施例中，所述制备方法包括：提供用于制备高RM含量甜菊糖苷的甜叶菊植物或干叶，其植物及干叶中RM/TSG大于0.08，RD/TSG大于0.08；所述甜叶菊植物或干叶通过愈伤组织再生或扦插由本发明所描述的甜叶菊植物而得到；粉碎所述甜叶菊植物或干叶；用水或水溶剂提取所述粉碎甜叶菊植物或干叶，获得甜菊糖苷产品，其中RM/TSG大于0.08，RD/TSG大于0.08。
本发明同时提供了一种高RM含量的甜菊糖苷产品，其中RM/TSG大于0.08，RD/TSG大于0.08。
本发明同时提供了一种甜叶菊变种植物或其一部分,源自814011谱星3号的任何一代的后代，其所述814011谱星3号的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.9701。
通过如下结合附图对优选实施例的详细描述，本发明的目的和优点是显而易见的。
附图说明
本发明的优选实施方案现在将参考附图进行说明，其中类似的附图标记表示相同的元件。
图1、杂交选育甜叶菊植物的示意图。
具体实施方式
1、高RM含量甜叶菊品种育种方法技术路线如图1所示。
采用三交育苗方法，分别选择Eirete、PC Star 2为母本，先以AKH L1为父本进行一次杂交，再以优选单株YF001为父本进行二次杂交，采收种子，育苗，移栽大田种植。以单株选择育种方式选择优良单株，经过种植观察其农艺性状和分析检测糖苷含量，性状稳定后，再用组织培养法和无性扦插繁殖方式固定其优良性状，经示范性种植后，成为新品种。
A、选育YF001
通过杂交育种的方法进行选育。首先，将母本Eirete和父本AKH L1种植于同一大棚中，通过蜜蜂封闭式授粉的方法进行杂交，收其母本的种子(F1代)进行播种、育苗、种植，根据农艺性状及色谱分析，从F1代中选出性状优良且稳定的单株，经无性扦插繁殖固定后的新品系，即YF001号单株。通过父本AKH L1与母本Eirete杂交得到的YF001，其RA、ST含量明显下降，而RD、RM的含量明显增加。
B、选育814011谱星3号(814011 PC Star 3)
以YF001为父本，PC Star 2为母本，同样通过蜜蜂封闭式授粉进行杂交和选择，收其母本的种子进行播种、育苗、种植，根据农艺性状及色谱分析，从F2代中选出性状优良且稳定的单株，经无性扦插繁殖固定后的新品系，即814011谱星3号(814011 PC Star 3)。通过父本YF001和母本PC Star 2杂交得到的814011谱星3号(814011 PC Star 3)，其RM含量又有明显的增加。
对杂交种进行检测确认的方法为薄层色谱分析和高效液相分析，分析采自所述植株814011谱星3号(814011 PC Star 3)的干燥叶，证实RM/TSG大于0.08，RD/TSG大于0.08。然后对选育出的优良品种814011谱星3号(814011 PC Star 3)进行扩繁。扩繁主要采用两种方法：愈伤组织培养和扦插，其中又以愈伤组织培养为主。
甜叶菊新品种814011谱星3号(814011 PC Star 3)的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.9701。本发明的所涉及的植物可由814011谱星3号(814011 PC Star 3)品种的保藏愈伤组织再生得到。
2、总甜菊糖苷含量为80％的高RM含量甜菊糖苷产品的制备
(a)预处理：将粉碎的814011谱星3号(814011 PC Star 3)甜叶菊干叶于热水中萃取，制成甜菊糖苷萃取液，萃取液经过絮凝沉淀和板框压滤两道工序后，进入下一道工序；
(b)一次吸附及解吸：采用树脂吸附上述萃取液中甜菊糖苷有效成分，到树脂出甜时止；用氢氧化钠稀溶液、盐酸稀溶液、纯水洗树脂，至流出液pH值达到7时止；用乙醇溶液对树脂进行分柱解吸，得含糖苷量为78～86％的解吸液，解吸液进入下一道工序；
(c)一次离子交换：解吸液依次通过一次离子交换除杂后，蒸发浓缩，得到含苷量在82～88％的浓缩液，浓缩液进入下一道工序；
(d)二次离子交换：将浓缩液再通过二次离子交换树脂进行深度除杂，浓缩得到含苷量≥80％的浓缩液，再除菌过滤，浓缩液进入下一道工序；
(e)喷雾干燥：将除菌过滤后的浓缩液喷雾干燥，得到RM/TSG大于0.08，RD/TSG大于0.08，TSG≥80％的甜菊糖苷产品。
如需要制备更高纯度的产品，则在步骤(c)后按以下步骤进行：
(d)二次吸附提纯：用二次吸附树脂三柱串联吸附上述浓缩液除杂，得到含苷量≥95％的甜菊糖苷提纯液，提纯液进入下一道工序；
(e)二次离子交换：将提纯液通过二次离子交换树脂进行深度除杂，浓缩得到含苷量≥95％的浓缩液，再经过除菌滤膜除菌过滤，浓缩液进入下一道工序；
(f)喷雾干燥：将除菌过滤后的浓缩液喷雾干燥，得到RM/TSG大于0.08，RD/TSG大于0.08，TSG≥95％的甜菊糖苷产品。
实施例
下面结合实施例对本发明做进一步详细描述。
实施例1
新品系814011谱星3号(814011 PC Star 3)的育种
用于杂交育种的父母本性状：
母本一Eirete：2010年从巴拉圭引进的甜叶菊新品种，总甜菊糖苷(TSG)含量高(大于20％)。株高80cm，叶子成披针状，叶子边缘具有明显锯齿，颜色为浓绿色，干叶中RebA含量为11.30％，St含量为10.4％，每株有6～10个分枝。
父本一AKH L1：2010年从巴拉圭引进的甜叶菊新品种，Reb A含量高。该品种为晚熟品种，株高51～70cm，大田种植前期生长慢，中后期生长旺盛，一茬大田生长期为135～150天。叶子颜色为淡绿色/黄绿色。亩产干叶200公斤以上。干叶中Reb A含量为11.5％，St含量为1.30％。
母本二谱星2号(PC Star 2)：谱赛科(江西)生物技术有限公司选育的甜叶菊新品种，RA含量高。该品种属于晚熟品种，株高80～120cm，株型直立，生长整齐，茎粗且近地面气根发达，抗性好，叶片大且厚实，一级分枝5～8个，二级分枝少而短，利于脱叶。大田种植前期生长慢，中后期旺盛。一茬大田生长期125～135天。亩产干叶220～300公斤。总甜菊糖苷(TSG)含量13％以上，其中Reb A含量10％以上，RM含量0.21％。
父本二YF001：第一次杂交后代中性状优良且稳定的优良单株，经无性扦插繁殖固定后的新品系。分枝能力强，抗性一般，干叶产量高。其RA含量高(表1)，且RD含量也高(表1)。
杂交育种过程：
2011年8月中旬开始，将所选总甜菊糖苷含量高的Eirete(母本)和Reb A糖苷含量高的AKH L1(父本)移入育种大棚内，进行杂交育种。10月初，亲本现蕾之前放入蜂箱，利用蜜蜂进行封闭式授粉杂交；11月中旬开始采收杂交种子，一直采收至12月中旬。2012年初将所得种子播种于育苗大棚内，待其长到3叶1心(约10厘米)时，将种苗移植至6×8cm的育苗袋中，并放于大棚内培养，3月初浇施一次可溶性复合肥500倍液及尿素1000倍液，3月中旬气温回暖后，将种苗移栽至试验田，并对其进行田间管理等措施。
2012年7月份采收植株鲜叶，并进行干燥，采用薄层色谱及高效液相色谱法分析干叶糖苷含量，选择RA糖苷含量低且有RD、RM糖苷含量的单株，即YF001。
YF001及其亲本含苷量检测结果见表1：
表1：YF001及其亲本检测结果：
Figure GDA0003173567270000061
ND：Not Detected(未检出)。
然后在2012年8月，以YF001为父本，PC Star 2(RM含量0.21％)为母本，重复以上杂交育种方法，2013年1月初将所得种子播种在谱赛科公司塑料大棚内进行育种，种子萌发后，秧苗长至3叶1心时，移植至6×8cm的育苗袋中，并放于大棚内培养，3月初浇施一次可溶性复合肥500倍液及尿素1000倍液，3月中旬气温回暖后，将种苗移栽至试验田，并对其进行田间管理等措施。
2013年7月份采收植株鲜叶，并进行干燥，采用薄层色谱及高效液相色谱法分析干叶糖苷含量，选育出RM/TSG大于0.08，RD/TSG大于0.08的单株，即814011谱星3号(814011PC Star 3)。
814011谱星3号及其亲本含苷量检测结果见表2：
表2：814011谱星3号(814011 PC Star 3)及其亲本含苷量检测结果
Figure GDA0003173567270000071
ND：未检出。
新品系814011谱星3号(814011 PC Star 3)的扩繁及栽培管理：
2013年10月至2014年2月，采用愈伤组织培养法将814011谱星3号(814011 PCStar 3)单株扩繁到30000株。2014年2月下旬将组培苗移植至5育苗穴盘中进行炼苗；2014年3月中下旬，将炼好的种苗移栽到大田，并进行相应的田间管理。2014年4月初(移栽后10天左右)进行查苗补缺工作，2014年4月中下旬(苗高15cm左右)开始进行打顶摘心，2014年4月中下旬开始进行第一次追肥，追施的肥料为可溶性复合肥和尿素，用量为可溶性复合肥500倍液，尿素1000倍液，2014年5月份开始进行第二次追肥管理，追施的肥料为可溶性复合肥和尿素，用量为可溶性复合肥500倍液，尿素1000倍液，后期(6月份)补施磷酸二氢钾叶面肥。2014年7月初开始进行收获，收割采用人工采收，打谷机脱叶方式，然后进行晒干，并装袋保存。
分析采自所述植株的干燥叶，通过高效液相色谱测定其成分。
814011 PC Star 3与相似品种(PC Star)中甜菊糖苷含量、各组分占总甜菊糖苷比例以及性状的比较见表3、表4以及表5。
表3：814011 PC Star 3与相似品种(PC Star)中甜菊糖苷含量比较(％wt/wt,干基)
Figure GDA0003173567270000081
ND–未检出。
表4：814011 PC Star 3与相似品种(PC Star)中各组分占总甜菊糖苷比例比较(％)
Figure GDA0003173567270000091
ND–未检出。
表5：814011 PC Star 3与相似品种(PC Star)性状比较
Figure GDA0003173567270000101
实施例2
高RM含量甜菊糖苷产品的制备
(a)预处理：将甜叶菊叶子与50℃软水按重量比1:15混合，制成甜菊糖苷提取液，经过絮凝沉淀和板框压滤两道工序，板框过滤后的滤液进入下一道工序；
(b)一次吸附及解吸：用一次吸附树脂吸附上述萃取液中甜菊糖苷有效成分，用氢氧化钠溶液、盐酸溶液处理吸附了甜菊糖苷有效成分的树脂，纯水淋洗树脂，至流出液PH值达7时止，再用乙醇溶液进行解吸，得到含苷量84.5％的解吸液，解吸液去醇进入下一道工序；
(c)一次离子交换：去醇解吸液依次通过一次离子交换除杂，蒸发浓缩得到含苷量为85.3％的一次浓缩液，浓缩液进入下一道工序；
(d)二次离子交换：将浓缩液通过二次离子交换树脂进行深度除杂，经过浓缩得到含苷量为85.4％的二次离子交换液(两次离子交换处理，含量增加0.9％)，再进行除菌滤芯除菌过滤，无菌液进入下一道工序；
(e)喷雾干燥：将无菌液进行喷雾干燥，得到RM/TSG大于0.08，RD/TSG大于0.08的甜菊糖苷产品，含苷量为85.4％。经高效液相色谱分析测定其成分：
表6产品高效液相检测结果
Figure GDA0003173567270000111
实施例3
高RM含量甜菊糖苷产品的制备
(a)预处理：将甜叶菊叶子与70℃软水按重量比1:20混合，制成甜菊糖苷提取液，经过絮凝沉淀和板框压滤两道工序，板框过滤后的滤液进入下一道工序；
(b)一次吸附及解吸：用一次吸附树脂吸附上述脱盐滤液中甜菊糖苷有效成分，用氢氧化钠溶液、盐酸溶液处理吸附了甜菊糖苷有效成分的树脂，再用乙醇溶液进行解吸，得到含苷量82.6％的解吸液，解吸液去醇进入下一道工序；
(c)一次离子交换：去醇解吸液依次通过一次离子交换除杂，蒸发浓缩得到含苷量为85.7％的一次浓缩液，浓缩液进入下一道工序；
(d)二次吸附提纯：用二次大孔吸附树脂三柱串联吸附上述离子交换液除杂，得到含苷量为96.5％甜菊糖苷提纯液，提纯液进入下一道工序；
(e)二次离子交换：通过二次离子交换树脂进行深度除杂，经过浓缩得到含苷量为96.9％的二次离子交换液，再进行除菌滤芯除菌过滤，无菌液进入下一道工序；
(f)喷雾干燥：将无菌液进行喷雾干燥，得到甜菊糖苷产品。经高效液相色谱分析，产品RM/TSG大于0.08，RD/TSG大于0.08，含苷量为97.07％。
表7产品高效液相检测结果
Figure GDA0003173567270000121
本发明中所有样品，在下列条件下，通过高效液相色谱测定其成分。
高效液相色谱检测：
一种新的高效液相色谱方法检测甜菊糖苷。每个样品需用2种方法综合检测。
方法1是用于分析RebE、RebD、RebM、RebN、RebO；方法2是用于分析RebA、Stev、RebF、RebC、DulA、Rub、RebB、Sbio。所有糖苷的标准品，包括RebE、RebD、RebM、RebN、RebO均购于美国ChromaDex公司。
检测仪器：配备二元泵、自动进样器的安捷伦1200高效液相色谱仪，DAD检测器配合化学工作站软件使用。
方法1仪器条件：
色谱柱：安捷伦Poroshell 120 SB-C18 2.7μm,4.6x150mm
柱温：40℃
流动相A：10mM磷酸二氢钠pH2.6:乙腈，75％:25％(v/v)
流动相B：水：乙腈，50％:50％(v/v)
流量：0.5mL/min进样量：5μL检测：UV 210nm运行时间：25分钟
过度时间：10分钟
进样器温度：常温
梯度程序，(％，v/v:)
时间(min) A(％) B(％)
0.0 100 0
14.0 100 0
14.5 0 100
25.0 0 100
方法2仪器条件：
色谱柱：安捷伦Poroshell 120 SB-C18 2.7μm,4.6x150mm
柱温：40℃
流动相：10mM磷酸二氢钠pH2.6:乙腈，68％:32％(v/v)
流量：1.0mL/min
进样量：5μL
检测：UV 210nm
运行时间：20分钟
进样器温度：常温

Claims (4)

1.高RM含量甜菊糖苷产品的制备方法，包括：
（a）预处理：将粉碎的 814011谱星3号甜叶菊干叶于水中萃取，制成甜菊糖苷萃取液，萃取液经过絮凝沉淀和板框压滤两道工序后，进入下一道工序；
（b）一次吸附及解吸：采用树脂吸附上述萃取液中甜菊糖苷有效成分，到树脂出甜时止；用氢氧化钠稀溶液、盐酸稀溶液、纯水洗树脂，至流出液pH值达到7时止；用乙醇溶液对树脂进行分柱解吸，得含糖苷量为78~86%的解吸液，解吸液进入下一道工序；
（c）一次离子交换：解吸液依次通过一次离子交换除杂后，蒸发浓缩，得到含苷量在82~88%的浓缩液，浓缩液进入下一道工序；
（d）二次离子交换：将浓缩液再通过二次离子交换树脂进行深度除杂，浓缩得到含苷量≥80%的浓缩液，再除菌过滤，浓缩液进入下一道工序；
（e）喷雾干燥：将除菌过滤后的浓缩液喷雾干燥，得到RM/TSG大于0.08，RD/TSG大于0.08，TSG≥80%的甜菊糖苷产品，
其中，步骤（a）中，所述甜叶菊干叶通过甜叶菊变种植物814011谱星3号的愈伤组织再生而获得，所述甜叶菊变种植物814011谱星3号的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏号为CGMCC No.9701。
2.高RM含量甜菊糖苷产品的制备方法，包括：
（a）预处理：将粉碎的814011谱星3号甜叶菊干叶于水中萃取，制成甜菊糖苷萃取液，萃取液经过絮凝沉淀和板框压滤两道工序后，进入下一道工序；
（b）一次吸附及解吸：采用树脂吸附上述萃取液中甜菊糖苷有效成分，到树脂出甜时止；用氢氧化钠稀溶液、盐酸稀溶液、纯水洗树脂，至流出液pH值达到7时止；用乙醇溶液对树脂进行分柱解吸，得含糖苷量为78~86%的解吸液，解吸液进入下一道工序；
（c）一次离子交换：解吸液依次通过一次离子交换除杂后，蒸发浓缩，得到含苷量在82~88%的浓缩液，浓缩液进入下一道工序；
（d）二次吸附提纯：用二次吸附树脂三柱串联吸附上述浓缩液除杂，得到含苷量≥95%的甜菊糖苷提纯液，提纯液进入下一道工序；
（e）二次离子交换：将提纯液通过二次离子交换树脂进行深度除杂，浓缩得到含苷量≥95%的浓缩液，再经过除菌滤膜除菌过滤，浓缩液进入下一道工序；
（f）喷雾干燥：将除菌过滤后的浓缩液喷雾干燥，得到RM/TSG大于0.08，RD/TSG 大于0.08，TSG≥95%的甜菊糖苷产品，
其中，步骤（a）中，所述甜叶菊干叶通过甜叶菊变种植物814011谱星3号的愈伤组织再生而获得，所述甜叶菊变种植物814011谱星3号的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏号为CGMCC No.9701。
3.高RM含量甜菊糖苷产品的制备方法，包括：
（a）预处理：将甜叶菊叶子与50℃软水按重量比1:15混合，制成甜菊糖苷提取液，经过絮凝沉淀和板框压滤两道工序，板框过滤后的滤液进入下一道工序；
（b）一次吸附及解吸：用一次吸附树脂吸附上述滤液中甜菊糖苷有效成分，用氢氧化钠溶液、盐酸溶液处理吸附了甜菊糖苷有效成分的树脂，纯水淋洗树脂，至流出液pH值达7时止，再用乙醇溶液进行解吸，得到含苷量84.5%的解吸液，解吸液去醇进入下一道工序；
（c）一次离子交换：去醇解吸液依次通过一次离子交换除杂，蒸发浓缩得到含苷量为85.3%的一次浓缩液，浓缩液进入下一道工序；
（d）二次离子交换：将浓缩液通过二次离子交换树脂进行深度除杂，经过浓缩得到含苷量为85.4%的二次离子交换液，再进行除菌滤芯除菌过滤，无菌液进入下一道工序；
（e）喷雾干燥：将无菌液进行喷雾干燥，得到RM/TSG大于0.08，RD/TSG大于0.08的甜菊糖苷产品，含苷量为85.4%，
其中，步骤（a）中，所述甜叶菊叶子通过甜叶菊变种植物814011谱星3号的愈伤组织再生而获得，所述甜叶菊变种植物814011谱星3号的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏号为CGMCC No.9701。
4.高RM含量甜菊糖苷产品的制备方法，包括：
（a）预处理：将甜叶菊叶子与 70℃软水按重量比1:20混合，制成甜菊糖苷提取液，经过絮凝沉淀和板框压滤两道工序，板框过滤后的滤液进入下一道工序；
（b）一次吸附及解吸：用一次吸附树脂吸附上述滤液中甜菊糖苷有效成分，用氢氧化钠溶液、盐酸溶液处理吸附了甜菊糖苷有效成分的树脂，再用乙醇溶液进行解吸，得到含苷量82.6%的解吸液，解吸液去醇进入下一道工序；
（c）一次离子交换：去醇解吸液依次通过一次离子交换除杂，蒸发浓缩得到含苷量为85.7%的一次浓缩液，浓缩液进入下一道工序；
（d）二次吸附提纯：用二次大孔吸附树脂三柱串联吸附上述浓缩液除杂，得到含苷量为96.5%甜菊糖苷提纯液，提纯液进入下一道工序；
（e）二次离子交换：通过二次离子交换树脂进行深度除杂，经过浓缩得到含苷量为96.9%的二次离子交换液，再进行除菌滤芯除菌过滤，无菌液进入下一道工序；
（f）喷雾干燥：将无菌液进行喷雾干燥，得到甜菊糖苷产品，产品 RM/TSG大于0.08，RD/TSG大于0.08，含苷量为97.07%，
其中，步骤（a）中，所述甜叶菊叶子通过甜叶菊变种植物814011谱星3号的愈伤组织再生而获得，所述甜叶菊变种植物814011谱星3号的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏号为CGMCC No.9701。
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