CN108514638A - 多组分组合物以及它们的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多组分组合物及使用它们的方法。本发明的一些实施方式包括含有第一组分和第二组分的多组分组合物，其中，所述第一组分含有Notch影响分子，且第二组分含有GPCR靶分子。还公开了含有所述多组分组合物的试剂盒。另外提供了用于向一种或多种细胞提供所述多组分组合物的方法。其他的实施方式包括使用所述多组分组合物的方法，例如，所述多组分组合物的给药方法，使用所述多组分组合物治疗生物体(例如，哺乳动物)的方法。
Description
本申请是基于申请日为2012年2月16日的中国申请201280009550.9的分案申请，本分案采用了与母案相同的标题。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2011年2月17日提交的美国临时申请No.61/463,482的优先权，并将其全部内容通过引用并入本申请。本申请还要求于2011年11月10日提交的美国临时申请No.61/558,227的优先权，并将其全部内容通过引用并入本申请。
背景技术
Notch基因家族编码单向的I型异源二聚体跨膜受体。Notch信号通过两个相邻细胞之间的跨膜配体的DSL(Delta、Serrate、Lag-2)家族被激活，并参与细胞-细胞通讯。迄今为止，已鉴定了4种Notch受体和至少5种哺乳动物配体。Notch受体为异源二聚体，各自包括胞外域(ECN)、跨膜域以及胞内域(ICN)。ICN包括参与CSL结合、锚蛋白重复序列(ankyrinrepeats，ANK)、核定位信号(NLS)和PEST序列的RAM结构域。转录激活结构域(TAD)与4种受体不同。ECN含有多个类EGF重复序列和LIN12/Notch重复序列(LNR)。
Notch信号能够以配体结合在Notch的胞外域(ECN)开始，诱导溶蛋白性裂解，并释放激活的Notch的胞内域(ICN)。然后，ICN转移到细胞核，并结合CSL(DNA结合转录因子)，起始依赖CSL的Notch靶基因的转录。
已知G蛋白偶联受体(GPCRs)具有7个跨膜域受体。GPCRs可以通过G蛋白调节下游信号通路。参与GPCRs的两个信号转导通路为cAMP和磷脂酰肌醇信号通路。存在均属于GPCR超家族的5种生长激素抑制素受体(SSTR)亚型、3种蛙皮素受体亚型和3种PACAP受体亚型。
已知生长激素抑制素(SST)(一种生长激素释放抑制因子(SRIF)，还被称为生长激素抑制激素(GHIH))为具有两种激活形式(SST-14和SST-28)的肽激素，并且能够由内分泌细胞分泌。SST能够作为多种细胞功能(例如，细胞增殖和激素释放)的内源性抑制调节剂发挥作用。SST能够通过激活G蛋白偶联SSTR或抑制生长因子的释放发挥其作用。
本发明的一些实施方式包括含有可以利用上述功能的组合物或分子的组合物。通过以下描述，本发明的其它实施方式、目的和优点将是显而易见的。
发明内容
本发明的一些实施方式包括含有第一组分和第二组分的多组分组合物，其中，所述第一组分为含有Notch影响分子的组合物，且所述第二组分为含有GPCR靶分子的组合物。在某些情况下，所述Notch影响分子可以为Notch配体，Notch受体、激活Notch信号的分子或抑制Notch信号的分子。在特定的实施方式中，所述Notch影响分子可以为VPA、SBHA、DBZ或NLE。在特定的实施方式中，所述GPCR靶分子具有细胞毒性。在其它实施方式中，所述GPCR靶分子对癌细胞具有细胞毒性。在某些情况下，所述GPCR靶分子可以为选自式(I)的缀合物(conjugate)、可以为SST-14或者可以为SST类似物。例如，所述缀合物可以为COL-SST、CPT-SST或CPT-BN。在一些实施方式中，所述Notch影响分子为VPA，且所述GPCR靶分子为CPL-SST。在其他实施方式中，所述Notch影响分子为VPA，且所述GPCR靶分子为COL-SST。在一些典型的实施方式中，所述Notch影响分子为VPA，VPA的浓度在约0.25mM到约20mM的范围内；且所述GPCR靶分子为CPT-SST，CPT-SST的浓度在约0.01μM到约50μM的范围内。在其它的实施方式中，所述Notch影响分子为VPA，VPA的浓度在约0.25mM到约20mM的范围内；且所述GPCR靶分子为COL-SST，COL-SST的浓度在约0.01μM到约50μM的范围内。
本发明其它的实施方式还包括含有所述多组分组合物的药物组合物。在某些情况下，所述Notch影响分子为VPA，VPA的剂量浓度在约1mg/kg到约50mg/kg的范围内。在另外其它的实施方式中，所述Notch影响分子为SBHA，SBHA的剂量浓度在约0.01mg/kg到约25mg/kg的范围内。在其它的实施方式中，所述GPCR靶分子为CPT-SST、COL-SST或CPT-BN，且所述GPCR靶分子的剂量浓度在约0.01mg/kg到约10mg/kg的范围内。其它的例子包括药物组合物，其中，所述Notch影响分子为VPA，VPA的剂量浓度在约1mg/kg到约50mg/kg的范围内；且所述GPCR靶分子为CPT-SST，CPT-SST的浓度在约0.01mg/kg到约10mg/kg的范围内。在该药物组合物的其它例子中，所述Notch影响分子为VPA，VPA的剂量浓度在约1mg/kg到约50mg/kg的范围内；且所述GPCR靶分子为COL-SST，COL-SST的浓度在约0.01mg/kg到约10mg/kg的范围内。另外，其它的例子包括药物组合物，其中，所述Notch影响分子为SBHA，SBHA的剂量浓度在约0.01mg/kg到约25mg/kg的范围内；且所述GPCR靶分子为CPT-SST、COL-SST或CPT-BN，所述GPCR靶分子的浓度在约0.01mg/kg到约10mg/kg的范围内。
本发明的其它实施方式包括对至少一种细胞进行所述多组分组合物给药的方法。在某些情况下，所述多组分组合物为药物组合物。在该方法的一些实施方式中，所述细胞为癌细胞，其中，所述癌细胞可以为来自宫颈癌、胰腺癌、胰腺类癌、肺癌、小细胞肺癌(SCLC)、皮肤癌、甲状腺髓样癌(MTC)、皮肤鳞状细胞癌、结直肠癌、骨肉瘤、肝癌、白血病、卵巢癌、肿瘤或内分泌肿瘤的细胞。在另外的其它实施方式中，所述给药针对生物体，例如，动物(例如，人或啮齿动物)。所述给药的方法可以为，例如，口服给药、鼻内给药，或通过注射给药(例如，通过静脉注射、腹腔注射、肌肉注射或皮下注射)。
本发明的其他实施方式包括用于在动物中治疗癌症的方法，该方法包括对动物进行所述多组分组合物的给药。在某些情况下，所述多组分组合物为药物组合物。所述动物可以为，例如，哺乳动物(例如，人或啮齿动物)。所述给药可以通过，例如，口服给药、鼻内给药，或通过注射给药(例如，通过静脉注射、通过腹腔注射、通过肌肉注射或通过皮下注射)而进行。在一些实施方式中，待治疗的癌症可以为宫颈癌、胰腺癌、胰腺类癌、肺癌、小细胞肺癌(SCLC)、皮肤癌、甲状腺髓样癌(MTC)、皮肤鳞状细胞癌、结直肠癌、骨肉瘤、肝癌、白血病、卵巢癌、肿瘤或内分泌肿瘤。在某些情况下，所述治疗抑制癌细胞中的上皮-间质转化。
本发明其它的实施方式包括含有所述多组分组合物的试剂盒。
附图说明
以下附图来自说明书的一部分，以进一步证明本发明特定方面。在本文中，通过参考这些附图中的一幅或多幅，并结合本文中示出的具体实施方式的描述可以更好的理解本发明。
图1，在正常的Hela细胞中，4种Notch受体表达的RT-PCR检测。Notch1和Notch2发生表达，Notch3和Notch4没有发生表达或微量表达。
图2，在正常的Hela细胞中，5种Notch配体表达的RT-PCR检测。Notch配体JAG1发生表达。
图3，具有Notch1信号激活的稳定细胞系Hela-ICN1的建立。抗-Notch1抗体(sc-6014-R)用于蛋白免疫印迹。
图4，通过细胞增殖试验(MTT)，Notch信号的激活抑制Hela细胞增殖(Hela-ICN)。
图5，通过肿瘤重量的测定，Notch信号的激活抑制肿瘤生长。在体内，与对照Hela-GFP肿瘤相比，Hela-ICN1肿瘤显示出较低的肿瘤重量。
图6，通过肿瘤生长曲线的绘制，Notch信号的激活抑制Hela肿瘤生长(Hela-ICN1)。
图7，Notch1信号激活对cAMP产生的影响。在Hela-GFP和Hela-ICN1细胞中，毛喉素均刺激cAMP产生，但Notch1激活(在Hela-ICN1细胞中)促进cAMP产生，并且是剂量依赖的。
图8，使用实时定量PCR，在Notch激活的Hela-ICN1细胞中，检测到SST表达在mRNA水平上上调。在Hela-ICN1细胞中，SST比在Hela-GFP细胞中增加了2200倍以上。
图9，使用ELISA，与对照Hela-GFP细胞相比，在来自Notch激活的Hela-ICN1细胞的培养基中检测到了SST在蛋白水平上的增加。
图10，使用蛋白免疫印迹，在Notch激活的Hela-ICN1细胞中检测到了SSTR2表达的增强。
图11，受体结合试验证明，在Hela-ICN1中，通过Notch1激活，SSTR2的密度增加。
图12，原生SST-14以剂量依赖的方式抑制Hela-GFP细胞增殖，在20μM下，产生约40％的抑制率。SST-14加强了Notch1激活的Hela-ICN1细胞生长的抑制，在20μM下，产生了12％的抑制率。
图13，Notch激活抑制宫颈癌Hela细胞克隆的形成。平板B1显示了Hela-GFP克隆，平板B2显示了呈现激活的Notch信号的Hela-ICN克隆。Hela-ICN证明了比Hela-GFP对照细胞克隆更低的细胞增殖。
图14，Hela-GFP对照没有显示细胞凋亡。
图15，箭头显示了Hela-ICN细胞的细胞凋亡。与对照Hela-GFP相比，显示在图14中的这些结果证明了激活Notch信号会诱导肿瘤细胞凋亡。
图16，以β-肌动蛋白作为对照，在宫颈癌Hela细胞中，不同浓度的Notch激活剂VPA对Notch1、SST和SSTR2表达的影响。VPA激活Notch1、SST和SSTR2的表达。
图17，以β-肌动蛋白作为对照，在胰腺类癌BON细胞中，不同浓度的VPA对Notch1、SST和SSTR2表达的影响。在BON细胞中，VPA激活Notch1、SST和SSTR2的表达。
图18，小分子Notch激活剂VPA和SBHA抑制宫颈癌Hela细胞的生长。
图19，VPA和CPT-SST缀合物(JF-10-81)对宫颈癌Hela细胞生长的结合治疗结果。可见，2.5mM的VPA加强了CPT-SST缀合物(JF-10-81)对Hela细胞生长的抑制。
图20，VPA/SBHA和CPT-SST缀合物(JF-10-81)对胰腺类癌BON细胞生长的结合治疗结果。2.5mM的VPA或10uM的SBHA加强了CPT-SST缀合物(JF-10-81)对BON细胞生长的抑制。
图21，VPA/SBHA和CPT-SST缀合物(JF-10-81)对肺癌DMS-53细胞生长的结合治疗结果。2.5mM的VPA或10uM的SBHA加强了CPT-SST缀合物(JF-10-81)对DMS-53细胞生长的抑制。
图22，VPA和秋水仙素-SST缀合物(JF-16-87)对宫颈癌Hela细胞生长的结合治疗结果。2.5mM的VPA加强了秋水仙素-SST缀合物(JF-16-87)对Hela细胞生长的抑制。
图23，VPA和秋水仙素-SST缀合物(JF-16-87)对胰腺类癌BON细胞生长的结合治疗结果。2.5mM的VPA加强了秋水仙素-SST缀合物(JF-16-87)对BON细胞生长的抑制。
图24，VPA和秋水仙素-SST缀合物(JF-16-87)对肺癌DMS-53细胞生长的结合治疗结果。2.5mM的VPA加强了秋水仙素-SST缀合物(JF-16-87)对DMS-53细胞生长的抑制。
图25，使用8mM的VPA处理后Hela细胞的形态学变化，表明可能的上皮-间质转化(EMT)。
图26，在原生Hela细胞中SSTR亚型的表达。存在大量的SSTR2和SSTR5，少量的SSTR1，没有或微量的SSTR3和SSTR4。
图27，Notch信号的激活(Hela-ICN1)上调SST的表达。在Hela-GFP对照中，SST没有表达或微量表达。
图28，在Hela-ICN1细胞中，Notch信号的激活诱导SSTR1和SSTR2的上调，SSTR3的下调，而SSTR4和SSTR5没有变化。GFP表示Hela-GFP，ICN1表示Hela-ICN1。
图29，SST通过SST siRNA而发生基因沉默(knockdown)。使用5μl(泳道1)、15μl(泳道2)、30μl(泳道3)的SST siRNA、15μl的对照siRNA(泳道4)处理的过表达SST的Hela-ICN1细胞。泳道5和泳道6分别为对照Hela-ICN1细胞和Hela-GFP细胞。
图30，在Hela-ICN1细胞中，通过SST siRNA的SST基因沉默对特定基因表达的影响。通过Notch1激活的抗细胞凋亡基因BCL-2的基因沉默通过SST siRNA得到逆转，表明Notch1介导的细胞凋亡通过SST信号通路。对照siRNA(15μl)，SST siRNA(15μl)。
图31，SST-14抑制Hela-GFP细胞增殖，DC-53-22加强所述抑制。
图32，缀合物JF-10-81和DC-53-22均加强了通过在Hela-ICN1细胞中激活Notch1诱导的抑制。
图33，SST-14抑制Hela-GFP细胞增殖，缀合物CPT-SST(JF-10-81)加强所述抑制。
图34，缀合物JF-10-81对胰腺类癌BON肿瘤生长的影响。在该实验中，使用2mg/kg的JF-10-81处理BON肿瘤，每天1次，每周5次，总共进行21次注射。所述缀合物JF-10-81抑制胰腺类癌BON细胞的生长。
图35，缀合物JF-10-81和/或Notch/SSTR2诱导物VPA对胰腺类癌BON肿瘤生长的影响。对携带BON肿瘤的裸鼠进行隔一天一次，每周3次，总共21次注射的治疗。低剂量的VPA(50mg/kg)和缀合物JF-10-81(0.5mg/kg)的结合治疗比较高剂量的单独的VPA(200mg/kg，高4倍)或单独的JF-10-81(1mg/kg，高2倍)显示出更有效地抗肿瘤能力。VPA和SSTR2特异性缀合物JF-10-81的结合治疗加强了对胰腺类癌BON肿瘤生长的抑制。
图36，细胞增殖试验显示了单独的VPA和缀合物CPT-SST以剂量依赖的方式抑制宫颈癌Hela细胞的生长，但在一起的结合处理加强了所述抑制。
图37，用VPA和CPT-SST处理来自宫颈癌Hela细胞生长的肿瘤。由200mg/kg剂量的VPA和1mg/kg剂量的CPT-SST诱导的肿瘤抑制率分别为46％和57％。VPA和CPT-SST结合处理的抑制效果增加为85％。
图38，VPA诱导了胰腺类癌BON细胞的生长停滞，并加强了缀合物COL-SST(秋水仙素-SST)对BON细胞的抑制。
图39，VPA诱导了宫颈癌Hela细胞的生长停滞，并加强了缀合物COL-SST(秋水仙素-SST)对Hela细胞的抑制。
图40，SBHA(辛二酰双羟肟酸，Suberoyl Bis-hydroxamic Acid)诱导了胰腺类癌BON细胞的生长抑制，并加强了缀合物CPT-SST对BON细胞生长的抑制。
图41，SBHA诱导了小细胞肺癌(SCLC)DMS53细胞的生长抑制，并加强了缀合物CPT-SST对DMS-53细胞生长的抑制。
图42，在裸鼠中，VPA诱导了宫颈癌Hela肿瘤的抑制，并加强了缀合物COL-SST对Hela肿瘤的抑制。
图43，在裸鼠中，VPA诱导了胰腺类癌BON肿瘤的抑制，并加强了缀合物COL-SST对BON肿瘤的抑制。
图44，缀合物CPT-SST和Notch抑制剂DBZ(二苯并氮卓，dibenzazepine)以及NLE对卵巢癌OVCAR8细胞生长的影响，与使用CPT-SST及DBZ和CPT-SST及Nle的结合处理的加强效果。
图45，缀合物CPT-SST和Notch抑制剂DBZ和NLE对胰腺癌CFPAC-1细胞生长的影响，与使用CPT-SST及DBZ和CPT-SST及Nle的结合处理的加强效果。
图46，缀合物CPT-SST和Notch抑制剂DBZ和NLE对结直肠癌HT-29细胞生长的影响，与使用CPT-SST及DBZ和CPT-SST及Nle的结合处理的加强效果。
图47，细胞增殖试验。在胰腺类癌BON细胞和宫颈癌Hela细胞中，VPA加强了缀合物COL-SST的抗增殖能力。
图48，VPA抑制胰腺类癌BON细胞的生长，并加强CPT-BN诱导的抑制。
图49，VPA抑制CNDT2细胞的生长，并加强CPT-BN诱导的抑制。
图50，VPA抑制白血病MOLT-4细胞的生长，并加强CPT-BN诱导的抑制。
图51，细胞增殖试验。显示的是使用VPA测试的选自16种不同类型的癌细胞的6株典型的癌细胞系。在白血病MOLT-4细胞、前列腺癌DU-145细胞、前列腺癌PC-3细胞、结肠癌HT-29细胞、卵巢癌OVCAR8、SKOV3和NCI/ADR-RES细胞中，VPA显示了其抗增殖的能力，但在肺癌A549细胞中不明显。
图52，在宫颈癌Hela、胰腺类癌BON、SCLC DMS-53、MTC TT细胞和肝癌HTB-52细胞中，VPA介导的Notch表达的RT-PCR检测。
图53，在Hela细胞中，VPA介导的特定癌相关基因(BCL-2、COX2、MMP2、PCNA、p53、p21和p63)的表达的RT-PCR检测。在Hela细胞(Hela-ICN1)中，还研究了ICN1激活对这些基因的影响。
图54，VPA和ICN1诱导的Hela细胞的形态学改变。(A)Hela-GFP细胞(对照)，(B)Hela-ICN1细胞(Notch1由ICN1激活)，(C)和(D)显示了0(C)和8mM(D)的VPA处理的Hela细胞。
图55，在宫颈癌Hela细胞、胰腺类癌BON、SCLC DMS-53、MTC TT和肝癌HTB-52细胞中以及在具有Notch1激活的宫颈癌Hela-ICN1细胞中，VPA介导的特定GPCR成员和生长激素抑制素(SST)的表达的RT-PCR检测。测试的GPCRs包括SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、GRPR、BRS3、NMBR、PAC1、VPAC1和VPAC2。
具体实施方式
本发明的一些实施方式包括含有两种组分(第一组分和第二组分)的多组分组合物。
所述第一组分含有第一组合物，该第一组合物可以含有Notch影响分子。所述Notch-影响分子可以包括，但并不限于Notch配体(例如，Jagged1、Jagged2、Delta1、类Delta1(Dll1)、Dll3和Dll4)、Notch受体(例如，Notch1、Notch2、Notch3和Notch4)、激活Notch信号的分子(例如，丙戊酸(valproic acid，VPA)和辛二酰双羟肟酸(SBHA))或抑制Notch信号的分子(例如，Z-Leu-Leu-Nle-CHO(Nle＝正亮氨酸)(NLE)和二苯并氮卓(DBZ))。在一些实施方式中，所述Notch影响分子为组蛋白脱乙酰酶抑制剂，所述组蛋白脱乙酰酶抑制剂可以为但并不限于，羧化物(例如，丁酸钠、丙戊酸、苯丁酸钠和丁酸新戊酰氧甲酯(pivaloyloxymethyl butyrate))、异羟肟酸(例如，辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid)(SAHA)、曲古抑菌素A(7-[4-(二甲氨基)苯基]-N-羟基-4,6-二甲基-7-氧代-2,4-二酰胺(7-[4-(dimethylamino)phenyl]–N–hydroxy-4,6–dimethyl-7-oxohepta-2,4-dienamide)、SBHA)、苯甲酰胺(例如，CI-994(4-乙酰氨基-N-(2'-氨基苯基)-苯甲酰胺))和MS-275(N-(2-氨基苯基)4[N-(吡啶-3-基-甲氧基-羰基)氨甲基]苯甲酰胺)、环氧酮(例如，Trapoxin B和2-氨基-8-氧代-9,10-环氧癸酸)、环肽(例如，Apicidin(环(N-O-甲基-L-色氨酸-L-异亮氨酸-D-甲基哌啶-L-2-氨基-8-氧癸基)，cyclo(N-O-methyl-L-tryptophanyl-L-isoleucinyl-D-pipecolinyl-L-2-amino-8-oxodecanoyl))和缩肽类)、杂分子(例如，CHAP31和CHAP50)、环海洋生物碱(cyclostellettamines)和卡马西平(carbamazepines)。在其它实施方式中，所述Notch影响分子可以为Notch抑制剂，例如，但并不限于，Z-Leu-Leu-Nle-CHO(Nle＝正亮氨酸)(NLE)、二苯并氮卓(DBZ)、γ-分泌酶抑制剂(例如，MRK003)、苯甲基羰基氧化酶-Leu-Leu-Nle-CHO(Benzyloxicarbonyl-Leu-Leu-Nle-CHO，LLNle)、N-[N-(3,5-双氟酚内氨酰)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸叔丁基酯(N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester，DAPT)和L685458((5S)-(t-丁氧基羰基氨基)-6-苯基-(4R)羟基-(2R)苯甲己酰)-L-leu-L-phe-氨基，(5S)-(t-Butoxycarbonylamino)-6-phenyl-(4R)hydroxy-(2R)benzylhexanoyl)-L-leu-L-phe-amide)。在一些实施方式中，组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂，可以为，但并不限于，丙戊酸(VPA)或辛二酰双羟肟酸(SBHA)。
在一些实施方式中，所述Notch影响分子靶向Notch受体。在一些实施方式中，所述Notch影响分子导致SST表达的增强、一种或多种SSTRs表达的增强、SST信号的上调、GPCR表达的改变，或它们的组合。在某些情况下，所述GPCR可以为SSTR(例如，SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4或SSTR5)、胃泌素-释放肽受体(GRPR)、BRS3、NMBR、PAC1、VPAC1和VPAC2。在一些实施方式中，所述Notch影响分子增强Notch的胞内域(ICN)的表达、增加ICN的胞内量、或增加ICN的胞外量。
在一些实施方式中，所述Notch影响分子为VPA，且VPA的浓度范围为约0.1mM到约50mM，约1mM到约10mM，可以为，例如，约0.1mM、约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约10mM或约25mM。在一些实施方式中，所述Notch影响分子为SBHA、DBZ或NLE，且Notch影响分子的浓度范围为约0.1μM到约100μM，约0.1μM到约50μM，或者约1μM至约10μM，并且可以为，例如，约0.1μM、约0.2μM、约0.3μM、约0.4μM、约0.5μM、约0.6μM、约0.7μM、约0.8μM、约0.9μM、约10μM、约20μM、约30μM、约40μM或约50μM。
所述多组分组合物的第二组分含有第二组合物，该第二组合物可以含有GPCR靶分子。在某些情况下，GPCR靶分子可以为缀合物或多肽(例如，SST-14、SST-28或SST类似物)。在一些实施方式中，GPCR靶分子对细胞具有细胞毒性。在其它实施方式中，GPCR靶分子对癌细胞具有细胞毒性。在一些情况下，靶向的GPCR可以为SSTR(例如，SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4或SSTR5)、胃泌素-释放肽受体(GRPR)、BRS3、NMBR、PAC1、VPAC1或VPAC2。在其它实施方式中，GPCR靶分子能够导致SST表达的增强、一种或多种SSTRs表达的增强、SST信号的上调，或它们的组合。在另外的其它实施方式中，所述Notch影响分子能够增强GPCR(例如，SSTR)的表达，随后能够加强GPCR靶分子的作用。所述GPCR靶分子的加强能够，例如，产生加强的癌症治疗，包括但并不限于癌细胞生长抑制或肿瘤生长抑制。
在一些实施方式中，当GPCR靶分子为多肽时，其可以为SST-14或SST类似物。SST-14为Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(SEQ ID NO:1)。本文中，SST-14也被称为DC-53-99。在特定的实施方式中，SST类似物可以为与SST-14序列相似但仍然靶向GPCR的多肽。在某些情况下，SST类似物包括一个或多个来自SST-14的保守突变。在某些情况下，SST类似物含有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个与SST-14相同的氨基酸(例如，在相同的相对位置上)。在某些情况下，SST类似物含有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。在某些情况下，SST类似物可以为生长激素抑制素类似物。在特定的实施方式中，SST类似物可以是环形的或者含有至少一个环形结构；例如，可以通过在两个半胱氨酸之间形成二硫键而发生环化。在一些实施方式中，SST类似物可以为奥曲肽(octreotide)、奥曲盐(octreotate)、兰瑞肽(lanreotide)或帕瑞肽(pasireotide)。
在一些实施方式中，当GPCR靶分子为缀合物时，所述缀合物可以为
X-Y-Z-Q (式I)
其中，X为单价部分(univalent moiety)，Y为键(bond)或二价的第一连结物，Z为键或二价的第二连结物，Q为单价的氨基酸链。在一些实施方式中，X具有细胞毒性。在其它实施方式中，X为抗癌部分。在另外的其它实施方式中，Q可以含有D-氨基酸、L-氨基酸，或两种均含有。Q可以，例如，含有环形的氨基酸结构(例如，由两个半胱氨酸之间的二硫键形成的环形结构)。
在一些实施方式中，X可以为
在一些实施方式中，Y可以为键，或
其中，A1可以为-CH2-CH2-NH2、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N-(CH3)2、-CH2-CH2-CH2-NH2或-CH2-CH2-OH。
在一些实施方式中，Z可以为键，
{连接到Y}-NMeAmEtGly-Gaba-{连接到Q}，
{连接到Y}-Gly-(Gaba)-{连接到Q}，
{连接到Y}-(Gaba)-{连接到Q}，
{连接到Y}-(D-Lys)-(D-Tyr)-Lys-(D-Tyr)-(D-Lys)-{连接到Q}，或者
{连接到Y}-(D-Ser)-(Nle)-(D-Tyr)-(D-Ser)-{连接到Q}，Nle为正亮氨酸。
在一些实施方式中，Q可以为
(D-Ser)-(D-Lys)-Gln-Trp-Ala-Val-(β-Ala)-His-Phe-Nle-NH2.
(D-，L-Ser)14-(D-Ser)-(D-Lys)-Gln-Trp-Ala-Val-(β-Ala)-His-Phe-Nle-NH2.
(D-Ser)-(D-Tyr)-Gln-Trp-Ala-Val-(β-Ala)-His-Phe-Nle-NH2，
Gly-(D-Ser)-(D-Tyr)-Gln-Trp-Ala-Val-(β-Ala)-His-Phe-Nle-NH2.
His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-NH2，或者
His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Asn-Lys-NH2。
上述Q的环形结构通过半胱氨酸之间的二硫键形成，图强调连接，但连接的硫来自半胱氨酸；没有使用额外的硫原子形成那些环形部分。
在一些实施方式中，X直接与Q连接。在一些实施方式中，Z为键，Y不为键。在一些实施方式中，Y为键，Z不为键。在一些实施方式中，式I为
本文中，式(I-1)被称为CPT-SST或JF-10-81。本文中，式(I-2)被称为COL-SST或JF-16-87。本文中，式(I-3)被称为CA-SST。本文中，式(I-4)被称为MTX-SST。本文中，式(I-5)被称为CPT-BN。本文中，式(I-12)被称为DC-53-22。在一些实施方式中，所述缀合物可以为，但并不限于COL-SST、CPT-SST、CPT-BN、CA-SST或MTX-SST。式(I-1)-(I-4)和(I-6)的Q部分通过半胱氨酸之间的二硫化物连接而形成；图强调连接，但连接的硫来自半胱氨酸，没有使用额外的硫原子形成那些环形部分。
在一些实施方式中，所述GPCR靶分子浓度范围为约0.1μM至约100μM，约0.1μM至约50μM，或者约1μM至约10μM，并且可以为，例如，约0.1μM、约0.2μM、约0.3μM、约0.4μM、约0.5μM、约0.6μM、约0.7μM、约0.8μM、约0.9μM、约10μM、约20μM、约30μM、约40μM或约50μM。
在一些实施方式中，所述GPCR靶分子为COL-SST或CST-SST，且所述GPCR靶分子浓度范围为约0.1μM至约100μM，约0.1μM至约50μM，或者约1μM至约10μM，并且可以为，例如，约0.1μM、约0.2μM、约0.3μM、约0.4μM、约0.5μM、约0.6μM、约0.7μM、约0.8μM、约0.9μM、约10μM、约20μM、约30μM、约40μM或约50μM。
在一些实施方式中，所述多组分组合物不含有顺铂-抑拓扑酶素、肼苯哒嗪(hydralazine)或抑拓扑酶素中的一种或多种。在一些实施方式中，所述Notch影响分子与GPCR靶分子不相同(例如，它们在单一种类的多组分组合物中不同时使用)。在一些实施方式中，表示Notch影响分子的种类(genus)与表示GPCR靶分子的种类不重叠。
本发明的一些实施方式包括对至少一种或多种细胞进行所述多组分组合物给药的方法。在某些情况下，所述一种或多种细胞可以为癌细胞。在特定的实施方式中，所述细胞可以为人胰腺类癌BON细胞(例如，加尔维斯顿德克萨斯大学的Courtney Townsend博士的实验室的人胰腺类癌BON细胞)、人T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)HPB-ALL细胞、骨肉瘤U2OS细胞、淋巴瘤Jurkat细胞、宫颈癌HeLa细胞、小细胞肺癌(SCLC)DMS-53、甲状腺髓样癌(medullary thyroid cancer，MTC)TT细胞、肝癌HB-8064(Hep3B)、HTB-52细胞、卵巢癌OVCAR8、SKOV3、NCI/ADR-RES细胞、前列腺癌DU-145细胞、前列腺癌PC-3细胞、胰腺癌CFPAC-1细胞、肺癌A549、白血病Molt-4细胞和结肠癌HT-29细胞。在一些实施方式中，所述细胞能够正常地表达、有限地表达、或不表达SST/SSTR(s)。在一些实施方式中，所述细胞为能够正常地表达、有限地表达、或不表达SST/SSTR(s)的癌细胞。
本发明的一些实施方式包括对生物体(例如，动物)进行所述组合物给药的方法。在某些情况下，所述动物是哺乳动物，例如，但并不限于，人、啮齿动物(例如，大鼠或小鼠)、马、犬、猫、猪、牛或羊。
在本发明的其它实施方式中，还包括使用所述组合物用于治疗动物的方法。在特定的实施方式中，可以使用所述方法治疗癌症。例如，可以使用所述方法治疗宫颈癌、胰腺癌、胰腺类癌、肺癌、小细胞肺癌(SCLC)、皮肤癌、甲状腺髓样癌(MTC)、皮肤鳞状细胞癌、结直肠癌、骨肉瘤、肝癌、白血病、卵巢癌、肿瘤和内分泌肿瘤。在另外的其它实施方式中，所述治疗能够在癌细胞中抑制上皮-间质转化(EMT)。在一些实施方式中，所述癌症类型为胶质瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肝癌、子宫内膜癌、神经外胚层癌、黑色素瘤、畸胎癌、成髓细胞瘤(meduloblastoma)、胸部肿瘤(例如，肺、食道(esopagheal)或间皮瘤)、膀胱癌、EBV-相关肿瘤、良性肿瘤(例如，例如，胃肠道或肺)或纤维肉瘤。在一些实施方式中，以下对癌症的一种或多种治疗结果：抑制癌症的增殖、抑制肿瘤的生长、癌细胞凋亡、抗血管生成、抗转移作用、化疗敏感(chemo-sensitation)、放射敏感(radio-sensitation)、对肿瘤免疫应答的促进作用、癌细胞的生长停滞、或肿瘤的停滞。
在一些实施方式中，所述哺乳动物为需要治疗疾病、状况或紊乱的人。例如，需要癌症治疗的哺乳动物(例如，人)，包括本文述及的那些类型中的任何一种。
对生物体进行给药或治疗的方法可以以任何方式进行，包括，但并不限于，口服治疗、鼻内治疗或注射。例如，注射可以包括，但并不限于，静脉注射、腹腔注射、肌肉注射或皮下注射。
在一些实施方式中，治疗生物体的方法将涉及使用第一组分和第二组分的结合的治疗。在多组分组合物中的Notch影响分子的量依赖多种因素，包括，例如，生物体的疾病状态、具体的生物体、生物体的重量、生物体的成熟状态以及缀合物的量和特性。所述GPCR靶分子的量依赖多种因素，包括，例如，生物体的疾病状态、具体的生物体、生物体的重量、生物体的成熟状态和Notch影响分子的量和特性。在一些实施方式中，多组分组合物中的Notch影响分子的量为约0.05到约1000mg/kg体重、约0.2到约500mg/kg体重、约0.5到约200mg/kg体重、约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约0.8mg/kg、约0.9mg/kg、约1.0mg/kg、约1.2mg/kg、约1.4mg/kg、约1.6mg/kg、约1.8mg/kg、约2.0mg/kg、约5.0mg/kg、约10.0mg/kg、约20.0mg/kg、约50.0mg/kg、约75.0mg/kg、约100.0mg/kg、约200.0mg/kg、约300.0mg/kg、约500.0mg/kg、约750.0mg/kg、约1000.0mg/kg、约1500.0mg/kg或约2000.0mg/kg。一些情况下，多组分组合物中Notch影响分子的量约为100mg/kg体重。在一些实施方式中，多组分组合物中的GPCR靶分子的量为约0.05到约1000mg/kg体重、约0.2到约500mg/kg体重、约0.5到约200mg/kg体重、约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约0.8mg/kg、约0.9mg/kg、约1.0mg/kg、约1.2mg/kg、约1.4mg/kg、约1.6mg/kg、约1.8mg/kg、约2.0mg/kg、约5.0mg/kg、约10.0mg/kg、约20.0mg/kg、约50.0mg/kg、约75.0mg/kg、约100.0mg/kg、约200.0mg/kg、约300.0mg/kg、约500.0mg/kg、约750.0mg/kg、约1000.0mg/kg、约1500.0mg/kg或约2000.0mg/kg。一些情况下，多组分组合物中GPCR靶分子的量约为1mg/kg体重。当然，在本发明的方法中，使用多种浓度是可能的，且可以在特定环境中调节浓度以获得理想的结果。
本发明的一些实施方式包括药物组合物。例如，药物组合物可以含有多组分组合物中的有效量的组分、治疗试剂、或溶解或分散在药学上可接受的载体中的其他试剂。本发明的水性组合物可以含有多组分组合物中的有效量的组分，溶解或分散在药学上可接受的载体或水介质中。短语“药学上或药理上可接受的”是指，当酌情对动物或人进行给药时，不产生副作用、过敏、或其它不良反应的分子实体和组合物。
本文中使用的“药学上可接受的载体”包括任何以及所有的溶剂、分散介质、涂料(coatings)、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂(isotonicagents)、吸收延缓剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶剂、粘结剂、赋形剂(excipients)、裂解剂(disintegration agents)、润滑剂、甜味剂、调味剂、色素，类似的原料以及它们的组合。补充的活性成分也可以加入到所述组合物中。
本发明的一些实施方式包括含有所述多组分组合物的试剂盒。在一些情况下，所述试剂盒含有浓缩形式或干燥形式的多组分组合物，其中，在所述浓缩形式或干燥形式(例如，冻干的)中添加水、缓冲液、或惰性产品以调节用于给药的组分的量。在一些情况下，所述试剂盒包括分离的容器，例如，在试剂盒的一个容器中含有第一组分，在试剂盒的另一个容器中含有第二组分。试剂盒中的所有或部分组分可以为浓缩形式或干燥形式。
实施例
本文中使用的实施例和方法作为教导本领域技术人员以任何适当的方式实施本发明的基础。本文中公开的这些实施例不能被理解为限制。
设计实施例A
材料和方法
丙戊酸(VPA)购自Sigma(圣路易斯，MO)，SBHA购自Santa Cruz(圣克鲁兹，CA)。按照Sun等，Anticancer Drugs,2007,Vol.18,pp.341-348(Sun等，2007)中已描述的方法在我们实验室中合成缀合物COL-SST和CPT-SST。缀合物DC-53-22按照Fuselier等，Bioorg&MedChem Lett.,2003,vol.13,pp.799-803中的描述通过将CPT偶联到DTrp8-SST-14的N末端而制备。DC-50-101，一种SST类似物，按照Rajeswaran等，Bioorg Med Chem.,2002,Vol.10,pp.2023-2029中的描述而制备。
质粒构建体和病毒包装
通过RT-PCR扩增ICN1(Notch1的激活形式)并插入到逆转录病毒载体pMSCV-GFP(pGFP)中。将新的命名为pICN1-GFP的构建体和载体pGFP，与pVSV-G分别共转染到包装的细胞系，以分别获得完整的病毒颗粒。测量所述病毒颗粒的病毒滴度，并转导进HeLa细胞中。
细胞培养
将来自ATCC(弗吉尼亚州，马纳萨斯，美国典型菌种保藏中心)的人宫颈癌HeLa细胞，以及新构建的细胞Hela-GFP和Hela-ICN1保存在含有10％胎牛血清的MEM培养基中，并在37℃、5％CO2的氛围下孵育。
RT-PCR、实时定量PCR和PCR试验
按照试剂盒说明书(Invitrogen，卡尔斯巴德，CA)中的描述，从肿瘤细胞中分离总RNAs。表1中示出了用于RT-PCR的引物和PCR条件。
对于实时定量PCR，引物与表1中示出的相同。在Bio-Rad iCycler(Hercules CA)上进行实时定量PCR试验。使用iScriptTM cDNA合成试剂盒和iQTM SYBR Green Supermix(Bio-Rad)进行试验。cDNA的合成在25℃5min、42℃30min、85℃5min下运行一个循环，并4℃下维持。PCR反应在10μl反应体系中运行。每10μl反应体系含有4μl模板(cDNA、基因组或质粒DNA)、5μl的iQTM SYBR Green Supermix(BioRad)、以及分别为0.25μM的相应的正向和反向引物。进一步在以下条件下运行PCR：1个用于初始变性的循环：95℃5min；以及40个用于引物退火和产物延伸的循环：95℃30s，56℃(SST)、57℃(SSTR2)30s。收集并分析溶解曲线数据，95℃1min和55℃1min，从55℃到95℃，以0.5℃的速率升温下运行1个循环。在恒定的15℃下进行试验。使用β-肌动蛋白作为内标(internal control)。按照Livak等，Methods,2001,Vol.25,pp.402-408中的描述，使用比对2-ΔΔCT方法计算结果。
表1用于PCR扩增的引物序列
Ref 1-在Talora等，Genes&Dev.,2002,Vol.16,pp.22520-2263中记载的引物序列。
Ref.2-在Bellavia等，EMBO J.,2007,Vol.26,pp.1670-1680中记载的引物序列。
按照试剂盒的说明书(SABiosciences公司，Frederick,MD 21703)的描述进行PCR试验。首先，通过按照以下Qiagen RNeasy Mini试剂盒(巴伦西亚，CA 91355)的说明书从Hela细胞中分离总RNA。为了去除基因组DNA，在96-孔板的0.5ml管中加入5μg的总RNA、2μl5×gDNA去除缓冲液以及不含RNase的水至10μl的终体积。轻轻的混合基因组DNA去除混合物，在42℃下孵育5min，立即放在冰上保持至少1min。然后，通过添加4μl 5×RT缓冲液、1μl的引物和外部控制混合物(External Control Mix)、2μl的RT酶混合物以及不含RNase的水至10μl的终体积，以制备反转录(RT)混合物。对于第一链RT反应，将10μl的RT混合物和10μl的基因组DNA去除混合物混合在一起，在42℃下精确孵育15min，通过在95℃下加热5min立即终止cDNA合成反应。在每个20μl的cDNA合成反应体系中加入90μl的ddH2O。在96-孔板格中进行实时定量PCR。通过添加1275μl 2×SABiosciences RT qPCR混合母液、102μl稀释的第一链cDNA合成反应物和1173μl ddH2O制备总体积为2550μl的实验混合物。使用8通道移液器，将25μl的实验混合物添加到96-孔PCR实验板的每个孔中。在BioRad CFX96实时定量系统上进行实时定量PCR检测，条件为：95℃10min的1个循环，和95℃15s、60℃1min的40个循环。按照如上所述的通过使用比对2-ΔΔCT分析结果。
蛋白免疫印迹
使用按照(圣克鲁兹生物技术有限公司，圣克鲁兹，CA.95060)描述的方案。简单地，收获细胞，重悬于含有混合物抑制剂的RIPA缓冲液中，通过穿过21号针(21gaugeneedle)使其分散均匀，与含有新鲜DTT的加样缓冲液(loading buffer)混合，并在95℃下加热5min。在10,000×g下离心后，对上清进行上样以在8-16％的Tris-甘氨酸凝胶中跑样。将蛋白质从凝胶中转移至硝酸纤维膜上，然后使用5％的脱脂奶粉封闭，使用Notch1(sc-6014-R)、SSTR2(sc-11609)抗体(圣克鲁兹)分别进行洗涤和孵育。再次洗涤所述膜并用第二抗体(圣克鲁兹)进行孵育。最终，根据ECL系统说明(Amersham Biosciences，英国)形成薄膜。
ELISA
按照试剂盒说明(Phoenix Pharmaceuticals，伯林盖姆，CA 94010)通过ELISA测定培养基中的SST浓度和细胞内部的SST浓度。简单地，分别在96-孔板中加入50μl的对照、制备的样品、制备的肽标准品。在每个孔中添加25μl再水化的初级抗体，轻轻拍打板以保证彻底混匀，并在4℃下孵育过夜。除了空白孔，在每个孔中加入25μl再水化的生物素化的肽。将板在室温下孵育90min。去除每个孔中的内容物。使用350μl的试验缓冲液将板洗涤4次。在每个孔中添加100μl的链霉亲和素-辣根过氧化物酶(SA-HRP)。将板在室温下孵育1h，洗涤并干燥。在每个孔中加入100μl制备的底物溶液，充分混合，并孵育15-20min。使用VictorReader(PerkinElmer，波士顿，MA)在325/420nm波长(激发或发射)条件下测量荧光。
荧光偏振(FP)cAMP试验
根据制造商的说明书(PerkinElmer，波士顿，MA 02118-2512)进行FP cAMP试验。简单地，在每个孔中加入10μl不同浓度的毛喉素，然后再在每个孔中加入10μl的悬浮在刺激混合液(使用前，通过在刺激缓冲液中混合抗-cAMP抗体新鲜配制)中的细胞。将板在37℃下孵育30min。加入20μl的检测混合物(在检测缓冲液中稀释荧光-cAMP母液)，并在37℃下继续孵育30min。同时，制备标准曲线，进行对照试验。通过Victor Reader(PerkinElmer)测量cAMP。
细胞增殖试验(MTT)
按照Sun等，Bioorg Med Chem Lett,2004,Vol.14,pp.2041-2046中的描述进行细胞增殖试验(Promega，麦迪逊，WI)。简单地，在96-孔板中加入50μl含有或不含有测试组分的培养基。将另外50μl的悬浮在培养基中的测试癌细胞(1×105个细胞/ml)分散在每个孔中。将板在37℃下孵育3天。然后，在板的每个孔中添加15μl的染料溶液。并在37℃下孵育4h。然后在每个孔中添加100μl的溶解溶液，并将板再在37℃下孵育直至每个孔中的内容物变为颜色均一的溶液。通过Victor Reader(PerkinElmer)在570nm下检测板。
在体内肿瘤的生长和治疗
按照Sun等，Drug Deliv.,2004,Vol.11,pp.231-238中的描述，在达到5-7周龄的裸鼠(NCI,Frederick,MD)的两侧的每个侧面皮下植入在指数生长阶段收获并使用冰冷的PBS洗涤3次后的胰腺类癌BON细胞、宫颈癌Hela-GFP和Hela-ICN1细胞(4×106个细胞/100μl/老鼠)。每周对所有的老鼠进行检测，在植入后的第11天测量肿瘤的体积，并且每周称一次体重。在实验结束时，对肿瘤进行称量并拍照。
结果
具有激活的Notch1信号的Hela细胞的产生
我们通过RT-PCR在亲本Hela细胞中研究了Notch1受体和配体的表达水平。我们的结果显示，受体NOTCH1、NOTCH2和配体JAG1很容易被检测到，然而NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL2、DLL4和JAG2很少或没有表达(图1&2)。
为了确定Notch信号对细胞生长的潜在影响。使用表达Notch1受体构成型激活形式的逆转录病毒、表达具有GFP的双顺反子(biscistronic)表达的Notch1(ICN1)的胞内区的逆转录病毒、以及表达GFP的逆转录病毒作为对照转导Hela细胞。通过用于GFP表达的FACS对转导的细胞、Hela-ICN1和Hela-GFP对进行分类，并通过蛋白免疫印迹分析确定ICN1蛋白的表达(图3)。
Notch1信号的激活，在体外抑制细胞增殖，在体内抑制肿瘤生长。
我们通过在体外进行细胞增殖试验(MTT试验)(图4)和体内的肿瘤生长(图5&6)确定了Notch1信号对细胞生长是否有影响。我们发现，与对照细胞相比，Notch1信号的激活产生了50％以上(51.42％)的细胞生长抑制(图4)。对于体内试验，结果显示激活的Notch1信号(Hela-ICN1)显著地抑制了Hela肿瘤生长。在移植后的34天，对照组(Hela-GFP)中的肿瘤体积从91.27±23.46mm3增长到了1445±534.6mm3(图6)。在移植后的34天，Hela-ICN1组中的肿瘤体积从88.56±11.05mm3增长到了294.1±172.5mm3。与Notch1激活相关的抑制率高于80％(肿瘤重量：86.18％，肿瘤体积：84.82％)(图5&6)。
Notch1激活刺激毛喉素诱导的cAMP积累。
G蛋白偶联受体(GPCRs)包括含有SSTRs的跨膜受体的大家族。环腺苷酸(cAMP)为GPCRs的第二信使。为了确定在Hela细胞中，Notch1信号的激活是否影响cAMP的积累，以及进一步确定GPCR是否参与其中，我们进行了cAMP试验。使用毛喉素(一种通过激活腺苷酸环化酶来刺激cAMP产生的受体非依赖性cAMP激活剂)进行研究。我们发现，在Hela-GFP(对照)和Hela-ICN1细胞中，均提高了剂量依赖性的毛喉素刺激的cAMP的产生。1、10和50μM的毛喉素处理，在对照Hela细胞中导致了0.005、0.018和0.024pMol cAMP/103个细胞的产生，在具有激活的Notch1信号的Hela细胞中导致了0.05、0.25和0.46pMol cAMP/103个细胞的产生。由于Hela-ICN1细胞中通过毛喉素刺激的cAMP产量远高于对照Hela-GFP细胞的cAMP产量(图7)，当使用1、10和50μM的毛喉素进行处理时，Hela-ICN1细胞中的cAMP浓度分别比Hela-GFP细胞中的cAMP浓度高10、14和19倍，因此，这些数据是预想之外的。因此，这些结果表明，激活的Notch1信号可以影响cAMP相关的信号通路。
具有Notch1信号激活的Hela细胞中基因表达图谱的建立
随后，基于以上结果，我们测试了参与cAMP和GPCR信号通路的基因是否参与Notch1介导的肿瘤抑制。我们使用了通路特异性的PCR试验以建立参与cAMP/Ca++(PAHS-066A，SABsciences)、GPCR(PAHS-071A)和癌(PAHS-033A)信号通路的基因表达图谱。
我们发现，应答cAMP/Ca2+的一组基因和在它们的启动子中包括CRE、SRE或类SRE增强子序列的一组基因似乎通过Notch1信号介导。例如，上调了一些基因，例如，SST、FOS、COX-2、PIK3R1(PI3K p85α)、THBS1、CDKN1A(p21)和COX-2(表2)。下调了一些基因，例如，RB1、JUNB、PCNA、STAT3、Akt(PKB)和MYC(表2)。这些基因中的一些参与调节细胞功能，例如，DNA修复、转录和细胞周期。另外，我们发现，在Hela-ICN1细胞中，仅显著上调了测试的41个GPCR基因中3个基因(SSTR2、ADRB2和AGTR2)。因此，SST和SSTR2似乎参与Notch1-介导的通路。
表2通过实时定量PCR检测到的Notch信号对基因表达的影响
我们进行了与癌信号通路(PAHS-033A)相关的基因的PCR试验。在Hela-ICN1中除了上述基因，与细胞凋亡、增殖、细胞周期、信号转导和转录因子相关的一些基因(癌通路PCR试验包括基因板中的这些基因)上调了(例如，整合蛋白α1、整合蛋白α4、MMP2、MMP9、TWIST1)，或下调了(例如，MAP2K、RB1、E6/E7)(表2)。然而，例如p53、NFκB、BRCA1的特定基因的表达没有明显改变。这些数据表明，Notch1介导的肿瘤抑制可以通过包括cAMP/Ca++、GPCR组分和癌信号通路的信号通路级联进行调节。
通过Notch1信号激活上调SST和SSTR2的确定
为了确定在Notch1激活的HeLa-ICN1细胞中SST和SSTR2的表达，我们进行了实时定量PCR、ELISA和蛋白免疫印迹分析。
对于SST表达，我们的结果显示，在mRNA水平上，HeLa-ICN1细胞中激活的Notch1信号增加的SST转录比Hela-GFP中的高2200倍以上(图8和表2)。我们进一步做了ELISA分析，并发现了SST在蛋白水平上的增加，与实时定量PCR显示了相同的趋势。HeLa-ICN1培养基中的SST浓度(657pg/ml)比Hela-GFP培养基中的SST浓度(311pg/ml)高2倍以上(图9)，但在细胞中未检测到。
对于SSTR2表达，我们发现，在mRNA水平上，HeLa-ICN1细胞的SSTR2表达量比Hela-GFP细胞中的高21倍，在蛋白水平上，HeLa-ICN1细胞的SSTR蛋白比Hela-GFP细胞中的高70％以上(表2和图10)。另外，我们进一步的结合试验(按照Sun等，Clinical Medicine:Oncology,2008,Vol.2,pp.1-9中的描述)显示，与Hela-GFP细胞相比，在HeLa-ICN1细胞表面上SSTR密度增加了10％以上(图11)。
图12显示了SST-14以剂量依赖的方式抑制Hela-GFP(在图12中为“Hela”)的细胞增殖，在20μM下产生了约40％的抑制率。SST-14加强了Notch1信号激活的Hela-ICN1细胞的生长抑制，在20μM下进一步产生了12％的抑制率，但是对Hela-ICN1细胞几乎没有影响。这表明ICN1的过表达可以导致更大量的通过Notch激活的SST基因表达产生的SST(图12)。
设计实施例B
材料和方法
以下除非另有说明，否则所有的材料和方法均与在设计实施例A中提供的材料和方法相同。
RT-PCR和实时定量PCR
对于实时定量PCR，除SSTR1引物(正向：5’ATC TGC TGG ATG CCT TTC TACG 3’，反向：5’CAG GTG CCA TTA CGG AAG ACG 3’)和SSTR2引物(正向：5’GAG AAG AAG GTC ACCCGA ATG G 3’，反向：5’TTG TCC TGC TTA CTG TCA CTC CGC 3’)外，引物与表1中所示的相同。按照之前的方法进行实时定量PCR试验。使用iScriptTM cDNA合成试剂盒和iQTM SYBRGreen Supermix(Bio-Rad)进行试验。cDNA合成运行条件为：25℃5min、42℃30min、85℃5min的1个循环并在4℃下保持。PCR反应在20μl体系中运行。每个反应体系含有1μl的cDNA、10μl的iQ SYBR Green Supermix(BioRad)和分别为1μl的相应正向和反向引物。PCR进一步在以下条件下运行：1个用于初始变性的循环：95℃5min；以及40个用于引物退火和产物延伸的循环：95℃30s和58℃(SSTR1)、57℃(SSTR2)、65℃(SSTR3和SSTR5)、60℃(SSTR4)和56℃(SST)30s。使用β-肌动蛋白作为内标。采用按照如上所述的比对2-ΔΔC T方法计算结果。
细胞克隆形成试验
分别在6孔板中加入200个Hela-GFP和Hela-ICN1细胞。将板连续孵育7-8天直至细胞克隆可见。在室温下使用100％的甲醇固定克隆15min，并使用PBS进行洗涤。在室温下，进一步使用0.1％的结晶紫对克隆染色1h，用水冲洗，风干后拍照。
细胞周期分析
通过流式细胞术进行细胞周期分析。收获细胞(2×106)，使用PBS洗涤，并于-20℃下在70％的乙醇中固定过夜。离心(5min，200×g)后将细胞重悬于5mL的PBS中，孵育60s，并在200×g条件下离心5min。将细胞沉淀悬浮在1mL含有0.1％Triton-100、20μg碘化丙啶(PI)(Sigma p4864)和200μg不含DNase的RNase A(Sigma R6513)的PBS中。在室温下保持1h，并送至杜兰大学癌症中心(Tulane Cancer Center)进行流式细胞术分析。
结果
Notch1信号的激活诱导了抗细胞增殖
MTT试验显示，Notch1激活抑制Hela细胞(Hela-ICN1)增殖，平均抑制率为46％(表3)。细胞克隆形成试验显示，Notch1信号诱导克隆形成(图13)。发现增殖标记PCNA和p21由Notch1激活调节。改变与Notch1的抗增殖功能是相同的。通过Notch1激活，下调了PCNA，但上调了p21(表2)。
Notch1信号的激活诱导了细胞凋亡和细胞周期停滞
通过FACS对Hela-GFP和Hela-ICN1细胞的细胞凋亡和细胞周期进行了分析。表3、图14和图15中的结果显示，激活的Notch1信号导致细胞周期停滞在DNA损伤经常发生的S期，并诱导了16％的细胞凋亡(图15)。评价了细胞周期和细胞凋亡标志的表达。在Hela-ICN1细胞中，抗细胞凋亡BCL-2下调了，但细胞周期标志p21上调了，p53、MDM2的表达没有明显改变。p21为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，通过p53依赖性和非依赖性机制诱导。p21的诱导可以引起细胞周期停滞。
表3具有Notch1激活的Hela-ICN细胞的细胞周期分析
Notch刺激物抑制细胞生长并诱导SST信号
发现在宫颈癌Hela细胞和胰腺类癌BON细胞中，Notch刺激物VPA诱导Notch1、SST的表达、VPA介导的Notch1、SST和SSTR2的增加(图16和17)。采用MTT试验，VPA还显示了对Hela细胞、BON细胞和小细胞肺癌DMS53细胞(图18、19、20、21、22、23和24)的生长抑制。通过MTT试验，另一个Notch刺激物SBHA也显示了其抗增殖能力(图18、20和21)。
Notch1信号的激活可能参与上皮-间质转化(EMT)
通过VPA诱导的Notch1激活，我们还观察到了细胞形态的改变(图25)。Notch1激活后，研究了Hela细胞中一些上皮特异性标记(例如，E-钙粘蛋白、β-连环蛋白)和间质标记(例如，波形蛋白、N-钙粘蛋白、MMP-2、纤连蛋白)的表达。在Notch1激活的Hela-ICN1细胞中还检测到了转录因子Twist(一种已知的中胚层组织发育的调节剂)、Snail和Slug。Snail和Slug促进EMT。Slug、Snail和Twist为调节肿瘤抑制剂(例如，E-钙粘蛋白)表达的转录因子。我们发现，E-钙粘蛋白下调了。通过Notch1激活，Slug、Snail和Twist上调了。然而，β-连环蛋白、波形蛋白、N-钙粘蛋白和纤连蛋白的表达没有明显改变。这些发现表明Notch1激活可以促进EMT。
Notch介导的SST和SSTRs的上调
在HeLa-GFP和HeLa-ICN1细胞中，使用RT-PCR和实时定量PCR研究SST和所有5个SSTR亚型的表达。首先，我们研究了在HeLa细胞中SST和所有SSTRs的背景。我们发现，在原生Hela细胞中，SSTR2和SSTR5高度表达，SSTR1和SSTR3少量表达，SSTR4没有表达或微量表达(图26)。来自RT-PCR的结果显示，在Hela-ICN1细胞中，SST(图27)、SSTR1和SSTR2的表达增加了；SSTR3显示出表达的下降，且SSTR4和SSTR5(图28)没有明显的改变。另外，使用实时定量PCR，我们发现了与在RT-PCR中SST、SSTR1和SSTR2增加的相同的趋势。激活的Notch信号激活SST转录，在Hela-ICN1中比在Hela-GFP中高2200倍以上(图8&10)，并且增加了SSTR1(16倍)和SSTR2(21倍)，降低了SSTR3(4倍)，SSTR4和SSTR5没有明显改变(小于2倍)。这些数据表明，在Hela肿瘤生长中的Notch信号的抑制可能与SST和SSTR1/2的激活相关。
SST和SST缀合物的抗细胞增殖
我们通过使用不同浓度(20、10和1μM)的SST-14处理Hela细胞进行细胞增殖试验，发现SST-14以剂量依赖的方式抑制Hela细胞增殖，20μM下40％的抑制、10μM下28％的抑制，但在1μM下没有影响。在Hela-ICN1细胞中的SST处理显示了如在Hela-GFP细胞中的有限的抑制。在20、10和1μM下，SST对Hela-ICN1细胞的抑制率分别为12、8和2％，比在Hela-GFP中的低(图12)。
SST基因沉默对Notch1诱导的BCL-2基因表达下降的逆转
Notch1激活降低了抗细胞凋亡BCL-2的表达。将SST siRNA转染到上述Notch1激活的细胞中，沉默了SST(图29)，并恢复了通过Notch1激活而降低的BCL-2(图30)。这些发现表明SST信号参与Notch1诱导的Hela细胞凋亡。
SST信号激活在癌症治疗中的结合应用
DC-53-22缀合物抑制Hela-GFP细胞的细胞生长，在1、5和10μM的缀合物处理时，生长抑制率分别为32、40和73％(图31&32)。缀合物JF-10-81也显示了抗增殖能力(图32&33)。
我们使用Notch激活剂和SSTR靶细胞毒素SST缀合物在体外和体内进行了试验。Notch激活剂VPA和SBHA与缀合物CPT-SST(JF-10-81)或秋水仙素-SST(JF-16-87)结合使用。从体外试验我们发现，VPA/JF-10-81或VPA/JF-16-87的结合加强了宫颈癌Hela细胞(图19&22)、胰腺类癌BON细胞(图20&23)和小细胞肺癌DMS-53细胞(图21&24)的生长抑制。通过体内试验，我们证明了单独的缀合物JF-10-81能够抑制类癌BON肿瘤生长(图34)。另外，我们发现VPA(50mg/kg)和CPT-SST缀合物(JF-10-81)(0.5mg/kg)的结合治疗比单独的较高剂量的VPA(200mg/kg，高4倍)或CPT-SST(1mg/kg，高2倍)显示了更有效的抗肿瘤能力(图35)。
SSTR2靶向的CPT-SST缀合物的VPA加强的抗肿瘤效果
我们利用体外的MTT试验研究了VPA对Hela细胞增殖的影响。我们发现，VPA本身以剂量依赖的方式抑制细胞增殖(0-5mM)(图36)。另外，缀合物CPT-SST也以剂量依赖的方式诱导Hela细胞的生长停滞(0-10μM)。并且，观察到了VPA和CPT-SST的结合处理加强了细胞生长的抑制(图36)。
我们在体内进行了抗肿瘤试验，证明VPA和CPT-SST的结合治疗比单独治疗在更大程度上抑制了宫颈癌Hela肿瘤的生长。如图37所示，200mg/kg的VPA和1mg/kg的CPT-SST的抑制效果分别为46％和57％。然而，200mg/kg的VPA和1mg/kg的CPT-SST的结合治疗的抑制效果为85％。结合治疗比单独的通过VPA或CPT-SST的抑制能力要好(图37)，这些体内结果表明，VPA介导的SSTR2上调能够增加SSTR2靶向缀合物(例如，CPT-SST)的吸收和抗肿瘤效果。
设计实施例C
材料和方法
以下除非另有说明，否则所有的材料和方法均与在设计实施例A中提供的那些相同。
细胞培养
在37℃、5％CO2氛围下，于补充有10％FBS的培养中培养人骨肉瘤U2OS细胞、胰腺类癌BON细胞、宫颈癌Hela和Hela-ICN1细胞(Notch1激活，用ICN1转导的Hela细胞)、卵巢癌OVCAR8细胞、胰腺癌CFPAC-1细胞和结直肠癌HT-29细胞。
细胞增殖试验(MTT)
按照Sun等，Bioorg Med Chem Lett,2004,Vol.14,pp.2041-2046中的描述进行细胞增殖试验。简单地，将50μl具有不同浓度组分的培养基加入到96-孔板中。所有组分的浓度均测试3次。将另外50μl的细胞母液(1×105个细胞/ml培养基)分散在每个测试孔中，并将板在37℃下、CO2培养箱中孵育3天。孵育后，将15μl的染料溶液加入每个孔中，并将板在37℃下孵育4h，随后往每个孔中加入100μl的溶解溶液。将板在37℃下孵育直至每个孔中的内容物变为颜色均一的溶液。通过Victor Plate Reader，在570nm下测量并记录吸光度。
体内的肿瘤生长和治疗
在指数生长阶段收获并使用冰冷的PBS洗涤细胞3次后，以4×107个细胞/ml的细胞密度重悬于冰冷的PBS中。按照Sun等，Drug Deliv.,2004,Vol.11,pp.231-238中的描述，将100μl等分的细胞悬浮液皮下移植到5-7周龄的裸鼠(NCI,Frederick,MD)的两侧。将携带肿瘤的小鼠分为4组(n＝8-10)，在肿瘤相反的侧面进行s.c注射以进行进一步的治疗。对照组注射PBS，3个测试组使用组分治疗。一组接受缀合物COL-SST(2mg/kg)，一组接受200mg/kg的VPA。最后一组进行100mg/kg的VPA与1mg/kg的COL-SST的结合治疗。所有的小鼠每天注射一次，一周5次。每周测量1次肿瘤体积并称体重。
VPA抑制细胞增殖并加强受体靶向的细胞毒性肽缀合物的抗增殖
VPA诱导胰腺类癌BON细胞(图38)、小细胞肺癌(SCLC)DMS53细胞、甲状腺髓样癌(MTC)TT细胞和宫颈癌Hela细胞(图39)的生长停滞。这些癌细胞被认为具有作为肿瘤抑制剂的Notch信号。我们通过体外MTT试验进一步研究了VPA与SSTR2靶向细胞毒素SST缀合物的结合对上述测试的癌细胞的增殖的影响。VPA以剂量依赖的方式(0-5mM)抑制这些癌细胞的生长。缀合物CPT-SST和COL-SST也以剂量依赖的方式(0-10uM)诱导这些癌细胞的生长停滞。还观察到，与每种单独试剂相比，VPA与CPT-SST和VPA与COL-SST(图38和39)的结合处理加强了测试的癌细胞的生长抑制(例如，图39中的Hela细胞和图38中的BON细胞)。我们还观察到，VPA和CPT-BN缀合物加强了处理的特定癌细胞的抗细胞增殖(图48-50)。
使用SBHA处理，在具有作为肿瘤抑制剂的Notch的许多测试癌细胞中观察到了生长停滞。SBHA还加强了缀合物CPT-SST对癌细胞(例如，胰腺类癌BON细胞(图40)和小细胞肺癌DMS-53细胞(图41))的抗细胞增殖。
HDAC抑制剂VPA在体内加强SST缀合物COL-SST的抗肿瘤作用
VPA和细胞毒素SST缀合物COL-SST的结合治疗比单独使用每种均能够更好的抑制宫颈癌Hela肿瘤生长。如图42所示，使用200mg/kg的VPA或使用2mg/kg的COL-SST的治疗的抑制率分别为36.7％和72.9％。然而，100mg/kg的VPA和1mg/kg的COL-SST的低剂量的结合治疗的抑制为85.8％(图42)。在使用VPA和COL-SST治疗胰腺类癌BON肿瘤中观察到了相似的结果(图43)。200mg/kg的VPA、2mg/kg的COL-SST、100mg/kg的VPA和1mg/kg的COL-SST的结合的治疗的抑制率分别为47.9％、31.6％和48.5％(图43)。
Notch抑制剂抑制细胞增殖并加强缀合物的抗增殖
我们还研究了一些Notch抑制剂(例如，Z-Leu-Leu-Nle-CHO(Nle＝正亮氨酸)(NLE)和二苯并氮卓(DBZ))对癌细胞增殖的影响。这些抑制剂诱导细胞生长停滞并在体外加强卵巢癌OVCAR8细胞(图44)、胰腺癌CFPAC-1细胞(图45)和结直肠癌HT-29细胞(图46)中的ted缀合物CPT-SST的抗增殖作用。
设计实施例D
材料和方法
以下除非另有说明，否则所有的材料和方法均与在设计实施例A中提供的材料和方法相同。
细胞培养
人胰腺类癌BON细胞由Courtney Townsend博士(加尔维斯敦德州大学)惠赠，并按照Sun等，2007中的描述进行培养。宫颈癌Hela-ICN1细胞(Notch1激活，用ICN1转化的Hela细胞)由Lizi Wu博士(弗罗里达大学)惠赠，并按照Sun等，2007中的描述进行培养。人T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)HPB-ALL细胞保存在RPMI-1640培养基中。骨肉瘤U2OS细胞培养在McCoy’s 5A培养基中培养。淋巴瘤Jurkat细胞在RPMI-1640培养基中培养。宫颈癌Hela细胞培养在含有10％FBS的F-12培养基中。小细胞肺癌(SCLC)DMS53在Waymouth’s培养基中保存。甲状腺髓样癌(MTC)TT细胞保存在F-12培养基中。肝癌HB-8064(Hep3B)和HTB-52细胞保存在MEM培养基中。卵巢癌OVCAR8、SKOV3和NCI/ADR-RES细胞保存在RPMI-1640培养基中。所有培养基均补充有10％的FBS。其它癌细胞，包括前列腺癌DU-145细胞、前列腺癌PC-3细胞、前列腺癌CFPAC-1细胞、肺癌A549、白血病MOLT-4细胞和结肠癌HT-29细胞均按照Sun等，2007和Sun等，J Drug Target,2011,Vol.19,pp.719-30(Sun等，2011)中的描述进行培养。
RT-PCR、实时定量PCR
对按照说明书(Invitrogen,Carlsbad,CA)中的描述从肿瘤细胞分离的总RNA进行RT-PCR。用于SST、BN和PACAP受体的所有引物均来自之前公开的报道(例如，Sun等，2011)。表4示出了用于RT-PCR分析的其它引物和条件。PCR扩增为常规的35个循环，由于这些研究的基因的RNA丰度的差异增加或减少循环数。用于实时定量PCR试验的引物与以上描述的引物相同。按照Sun等，2011中的描述进行实时定量PCR试验。使用β-肌动蛋白作为内标，使用如上所述的2-ΔΔCT方法计算结果。
表4用于基因扩增的引物序列和PCR条件
Ref 1-在Talora等，Genes&Dev.,2002,Vol.16,pp.22520-2263中记载的引物序列。
Ref.2-在Bellavia等，EMBO J.,2007,Vol.26,pp.1670-1680中记载的引物序列。
VPA诱导的细胞形态改变
通过在96-孔板的每个孔中加入50μl的细胞(1×105个细胞/ml)和50μl的培养基，培养基含有或不含有测试组分VPA，以进行用于VPA诱导的细胞形态改变的试验。在10×放大倍数下使用倒置光学显微镜对癌细胞进行观察并拍照。
细胞增殖试验(MTT)
按照Sun等，Bioorg Med Chem Lett,2004,Vol.14,pp.2041-2046中的描述进行细胞增殖试验(Promega，麦迪逊，WI)。使用Victor Plate Reader(PerkinElmer，波士顿，MA)在570nm下测量并记录吸光度。
体内的肿瘤生长和治疗
在指数生长阶段收获并使用冰冷的PBS洗涤细胞3次后，以4×107个细胞/ml的细胞密度重悬于冰冷的PBS中。按照Sun等，Clin Med Oncol,2008；Vol.2,pp.491-9中的描述，将100μl等分的细胞悬浮液皮下移植到5-7周龄的裸鼠(NCI,Frederick,MD)的两侧。将携带肿瘤的小鼠分为4组(n＝8-10)，在肿瘤相反的侧面进行s.c注射以进行进一步的治疗。对照组注射PBS，3个测试组使用组分治疗。一组接受缀合物COL-SST(2mg/kg)，一组接受200mg/kg的VPA。最后一组进行100mg/kg的VPA与1mg/kg的COL-SST的结合治疗。所有的小鼠每天注射一次，一周5次。每周测量1次肿瘤体积并称体重。
结果
VPA抑制细胞增殖和肿瘤生长
VPA诱导胰腺类癌BON细胞(图47)、SCLC DMS-53细胞、MTC TT细胞和宫颈癌Hela细胞(图47)的生长停滞。这些癌细胞被认为具有作为肿瘤抑制剂的Notch信号。另外，通过下述的体内抗肿瘤试验我们发现，VPA抑制Hela和BON肿瘤的生长，抑制率分别为36.7％和47.9％(图42和43)。VPA还在许多其它癌细胞(例如，肝癌HB-8064、HTB-52、卵巢癌OVCAR8、SKOV3和NCI/ADR-RES细胞、前列腺癌DU-145和PC-3细胞、胰腺癌CFPAC-1细胞、T-ALL HPB-ALL细胞、白血病MOLT-4和Jurkat细胞、骨肉瘤U2OS细胞和结肠癌HT-29细胞)中显示了其抗增殖能力。这些细胞中的一些细胞已经被报道具有作为致癌基因的Notch信号。图51显示的是许多这些VPA处理的癌细胞的部分结果。然而，VPA对肺癌A549细胞的增殖几乎没有影响。
在癌细胞中VPA可能调节Notch表达
我们发现，在胰腺类癌BON细胞中Notch2是可检测的，TT、DMS-53和HTB-52基因几乎不表达。在SCLC DMS53细胞中，检测到了Notch1、Notch2和Notch4；没有检测到Notch3。在MTC TT细胞中，所有Notch基因均可检测到低量的表达。在肝癌HTB-52细胞中，与Notch3和Notch4的微量或检测不到的表达相比，Notch1和Notch2受体以较高水平的表达(数据未示出)。
我们研究了在这些细胞中VPA对Notch受体表达的影响。以系列浓度的VPA处理癌细胞，然后通过RT-PCR分析Notch表达。我们发现，在Hela细胞中，VPA增强了Notch1表达，而其它Notch基因的表达没有明显的改变。对于胰腺类癌BON细胞，VPA处理增强了Notch1、Notch2和Notch3的表达，没有检测到Notch4。在DMS-53中，VPA增强了Notch1和Notch2的表达，其它细胞中表达的没有明显改变。实时定量PCR分析进一步证实了VPA诱导Notch1增加(>2倍)。在TT细胞中，发现，VPA处理显著地增强了Notch1、Notch2和Notch3表达，而降低了Notch4的表达。但在HTB-52细胞中，我们观察到，VPA处理降低了Notch1和Notch2，而检测不到Notch3和Notch4(图52)。我们的发现表明，在4种类型的Notch信号被报道作为肿瘤抑制剂的癌细胞中，VPA增强了Notch1的表达。然而，在VPA作为Notch抑制剂或Notch信号可能作为致癌基因的HTB-52细胞中，VPA降低了Notch信号。
VPA介导的信号通路的参与
通过RT-PCR和实时定量PCR研究了包括COX2(预后标记，prognostic marker)、MMP2(细胞攻击和转移标记)、BCL-2(抗细胞凋亡标记)、p53(肿瘤抑制剂)、p21(肿瘤抑制剂)、p63(肿瘤抑制剂)、PCNA(增殖标记)和SST(生长激素释放抑制因子)的一些基因的ICN1和VPA对Hela细胞的影响。
VPA介导的肿瘤相关标记的表达
通过实时定量PCR证实，在Hela细胞中，ICN1诱导了COX2(11.8倍)、MMP2(47.6倍)和SST(342倍)的增加，BCL-2(4.5倍)和PCNA(2.2倍)的下降。在Hela细胞中，VPA同样如此(图53和54)，诱导了COX2(3.7倍)、MMP2(25倍)和SST(1.4倍)的增加，BCL-2(42.2倍)和PCNA(476倍)的下降。在BON、TT、DMS53和HTB-52癌细胞中，我们也观察到了COX2、MMP、SST的增加以及BCL-2和PCNA的下降(数据未示出)。
VPA介导的p53家族信号
还研究了VPA和ICN1对p53和p53家族的影响。通过RT-PCR和实时定量PCR分析显示，在Hela细胞中，ICN1和VPA上调了两种基因p21和p63。ICN1诱导的p21和p63的增加分别比对照高7.4和9.0倍。VPA诱导的p21和p63的增加分别为18和12。然而，由ICN1和VPA诱导的p53的改变不同。p53被ICN1增加了(1.6倍)，但被VPA降低了(3.1倍)。在BON、TT、DMS53和HTB-52癌细胞中观察到了由VPA诱导的p53、p21和p63相同的变化趋势(数据未示出)。
VPA介导的pTEN/PI3K/Akt信号
在Hela细胞中，我们比较了ICN1和VPA对pTEN/PI3K/Akt信号的影响(表2和5)。我们观察到了由ICN1(6.7倍)和VPA(2倍)处理均导致了PI3K的增加，而两种处理中具有不同的Akt和pTEN的表达。Akt和pTEN被ICN1下调了(分别为3.44和1.8倍)，被VPA上调了(分别为2.1和1.9倍)(表5和图53)。在Hela细胞中，VPA和ICN1介导的PI3K/Akt信号可以通过不同的信号通路级联。我们还研究了基因相关信号的表达和某些GPCR成员的表达(讨论如下)。
表5宫颈癌Hela细胞中某些基因表达的实时定量PCR
在宫颈癌细胞中VPA诱导的上皮-间质转化/转变(EMT)
我们在Notch1激活的Hela-ICN1细胞中观察到了形态学改变(图54)。我们还发现，VPA能够诱导宫颈癌Hela(图54)、骨肉瘤U2OS、肝癌HTB-52和胰腺类癌BON细胞的形态学改变，对测试的其它癌细胞(包括肺癌A549、SCLC DMS53、胰腺癌DU-145、白血病MOLT-4、Jurkat和HPB-ALL、卵巢癌NCI/ADR-RES和MTC TT)没有影响。
选择宫颈癌Hela细胞以比较ICN1和VPA诱导的EMT中基因表达之间的差异。我们最初研究了ICN1对EMT的影响和EMT相关基因的表达的影响，并发现在Hela-ICN1细胞中(表5)，上调了Snail(1.4倍)、Slug(1.2倍)、Twist(2267倍)、纤连蛋白(3411)和N-钙粘蛋白(150倍)，下调了E-钙粘蛋白(2.8倍)。如上所述，在宫颈癌Hela-ICN1细胞中MMP2也增加了(47.6倍)。这些Twist基因可能起始由ICN1诱导的EMT程序。这些发现支持了在宫颈癌Hela细胞中通过ICN1的Notch1激活诱导了EMT。我们进一步研究了在Hela细胞中，VPA对这些EMT-相关基因的表达的影响。我们发现VPA介导这些基因(包括Snail(53倍)、Slug(35倍)、Twist(3.4倍)、N-钙粘蛋白(14倍)、纤连蛋白(39倍)和MMP2(如上所述的25倍))的上调。另外，我们发现了VPA诱导的E-钙粘蛋白的增加(25倍)(表5)，不同于ICN1诱导的降低。由VPA诱导的基因Snail、Slug和Twist的表达水平不同于ICN1诱导的Hela细胞(Hela-ICN1)，尽管ICN1和VPA均介导这些基因的增加(表5)。这些表明VPA可能通过Snail和Slug诱导EMT。
VPA诱导特定GPCRs的表达
我们研究了在Hela-ICN1细胞中Notch1激活和在5种癌细胞系(Hela、BON、TT、DMS53和HTB-52)中VPA对SST、BN和PACAP受体(SSTR1-5、GRPR、BRS3、NMBR、PAC1、VPAC1和VPAC2)的表达的影响。
首先，我们使用RT-PCR和实时定量PCR证实了在Hela-ICN1细胞中SSTR1和SSTR2的增加。我们还发现，在Hela-ICN1细胞中，受体GRPR、BRS3、NMBR、VPAC1和VPAC2上调了，SSTR3、SSTR4和SSTR5下调了(图55)。进一步研究了VPA对5种测试的癌细胞中这些受体的影响。
宫颈癌Hela细胞对于VPA处理，我们发现，在Hela细胞中，SSTR2(20倍，通过实时定量PCR证实)、SSTR3、SSTR5、PAC1、GRPR和BRS3上调了，SSTR1和VPAC2下调了，VPAC没有变化。在Hela-ICN1细胞中和VPA处理的Hela细胞中，SSTR1、SSTR3、SSTR5、VPAC2和VPAC1的变化是不同的(图55)。
胰腺类癌BON细胞在BON细胞中，VPA以剂量依赖的方式诱导SSTR2(25倍，通过实时定量PCR证实)、SSTR4、BRS3、GRPR和VPAC2的表达，并抑制SSTR1，其它的均没有变化(图55)。在这些细胞中，SSTR5高度表达，但使用VPA处理的并没有变化。实时定量PCR进一步显示了SSTR5的轻微下降(0.9倍)。
小细胞肺癌DMS-53细胞我们在VPA处理的DMS53细胞中研究了这些受体的表达，并发现，SSTR2(5.4倍，通过实时定量PCR证实)、SSTR3、GRPR和PAC1增加了，SSTR1、SSTR2、VPAC1、NMBR和BRS3没有明显变化，然而在原生DMS-53细胞中，未检测到SSTR4、SSTR5、PAC1和VPAC2(图55)。
甲状腺髓样癌TT细胞使用VPA处理，我们发现SSTR2(2.2倍，通过实时定量PCR证实)、BRS3、NMBR和VPAC2增加了，SSTR3和VPAC1下降了，其它均没有明显变化(图55)。
肝癌HTB-52细胞我们发现在HTB-52癌细胞中，VPA增强了SSTR2(19.8倍，通过实时定量PCR证实)、SSTR3、SSTR5、GRPR、BRS3和VPAC1的表达。其它受体没有被检测到，并且不受VPA处理的影响(图55)。
在体内VPA加强缀合物的抗肿瘤效果
我们的体外试验显示，在上述的各种肿瘤细胞中，VPA诱导生长停滞，并且在许多癌细胞中，VPA还上调SSTR2的表达。我们的体外试验显示，在11种测试的癌细胞中，例如，Hela(图42)、BON(图43)、TT、HTB-52、DU-145、PC-3、OVCAR8、HT-29、CFPAC-1、SKOV3和DMS-53，与每一单独的试剂相比，VPA与CPT-SST和VPA与COL-SST的结合治疗能够显著加强生长抑制(数据未示出)。通过使用MTT增殖试验测定，我们还观察到，在处理的BON癌细胞(图48)、CNDT2癌细胞(图49)和MOLT-4癌细胞(图50)中，VPA和CPT-BN缀合物加强了抗细胞增殖(图48)。
VPA和COL-SST的结合治疗比单独使用能够更好的抑制Hela肿瘤生长。如图42和图43所示，使用200mg/kg的VPA或2mg/kg的COL-SST的抑制率分别为36.7％和72.9％。然而，低剂量的100mg/kg的VPA和1mg/kg的COL-SST的结合治疗的抑制为85.8％(图42和43)。在使用VPA和COL-SST治疗的胰腺类癌BON肿瘤中观查到了相似的结果。200mg/kg的VPA、2mg/kg的COL-SST以及100mg/kg的VPA和1mg/kg的COL-SST的结合的抑制率分别为47.9％、31.6％和48.5％(图42和43)。体内实验均表明VPA介导的SSTR2上调能够增加缀合物COL-SST的吸收和抗肿瘤效果。
需要注意的是，本文中采用的术语，例如，“优选地”、“通常地”和“典型地”并不用来限制本发明权利要求的范围，或暗示某些特征对于本发明的权利要求的结构或功能是关键的、必须的或甚至重要的。相反，这些术语仅仅意在突出在本发明的特定实施方式中可以或不可以使用的可选的或额外的特征。
本文中提供了一种或多种实施方式的详细描述。然而，需要理解的是，本发明可以呈现为各种形式。因此，不应理解为受限于本文中公开的具体细节(即使设计为优选的或有利的)，而是用于作为权利要求的基础，并作为教导本领域技术人员以任何适当的方式实施本发明的代表性基础。
已经描述了大量的实施方式。然而，应当理解的是，在不背离本发明精神和范围的情况下，可以做出各种变型。因此，其它的实施方式将也被纳入本发明的一部分，并包括在随附的权利要求中。另外，各种实施方式的上述描述并不一定意味着排除。例如，在本发明的范围内，“一些”实施方式，“典型的”实施方式，或“其他”实施方式可以包括全部或部分“一些”、“其它”和“另外”的实施方式。
序列表
<110> 杜兰教育基金委员会(The Administrators of the Tulane EducationalFund)
<120> 多组分组合物以及它们的用途
<130> P26804CHG
<150> US 61/463,482
<151> 2011-02-17
<150> US 61/558,227
<151> 2011-11-10
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 哺乳动物(Mammal)
<400> 1
Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys
1 5 10
Claims (46)
1.一种多组分组合物，该多组分组合物含有第一组分和第二组分，其中，所述第一组分为含有Notch影响分子的组合物，所述第二组分为含有GPCR靶分子的组合物。
2.根据权利要求1所述的多组分组合物，其中，所述Notch影响分子选自由Notch配体、Notch受体、激活Notch信号的分子和抑制Notch信号的分子所组成的组中。
3.根据权利要求1所述的多组分组合物，其中，所述Notch影响分子选自由VPA、SBHA、DBZ和NLE所组成的组中。
4.根据权利要求1所述的多组分组合物，其中，所述GPCR靶分子选自由式(I)、SST-14和SST类似物所组成的组中。
5.根据权利要求1所述的多组分组合物，其中，所述GPCR靶分子选自由COL-SST、CPT-SST和CPT-BN所组成的组中。
6.根据权利要求1所述的多组分组合物，其中，所述Notch影响分子为VPA，且所述GPCR靶分子为CPT-SST。
7.根据权利要求1所述的多组分组合物，其中，所述Notch影响分子为VPA，且所述GPCR靶分子为COL-SST。
8.根据权利要求1所述的多组分组合物，其中，所述Notch影响分子为VPA，VPA的浓度在约0.25mM到约20mM的范围内；且所述GPCR靶分子为CPT-SST，CPT-SST的浓度在约0.01μM到约50μM的范围内。
9.根据权利要求1所述的多组分组合物，其中，Notch影响分子为VPA，VPA的浓度在约0.25mM到约20mM的范围内；且所述GPCR靶分子为COL-SST，COL-SST的浓度在约0.01μM到约50μM的范围内。
10.一种药物组合物，该药物组合物含有权利要求1所述的多组分组合物。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中，所述Notch影响分子为VPA，VPA的剂量浓度在约1mg/kg到约50mg/kg的范围内。
12.根据权利要求10所述的药物组合物，其中，所述Notch影响分子为SBHA，SBHA的剂量浓度在约0.01mg/kg到约25mg/kg的范围内。
13.根据权利要求10所述的药物组合物，其中，所述GPCR靶分子为CPT-SST、COL-SST或CPT-BN，所述GPCR靶分子的剂量浓度在约0.01mg/kg到约10mg/kg的范围内。
14.根据权利要求10所述的药物组合物，其中，所述Notch影响分子为VPA，VPA的剂量浓度在约1mg/kg到约50mg/kg的范围内；且所述GPCR靶分子为CPT-SST，CPT-SST的浓度在约0.01mg/kg到约10mg/kg的范围内。
15.根据权利要求10所述的药物组合物，其中，所述Notch影响分子为VPA，VPA的剂量浓度在约1mg/kg到约50mg/kg的范围内；且所述GPCR靶分子为COL-SST，COL-SST的浓度在约0.01mg/kg到约10mg/kg的范围内。
16.根据权利要求10所述的药物组合物，其中，所述Notch影响分子为SBHA，SBHA的剂量浓度在约0.01mg/kg到约25mg/kg的范围内；且所述GPCR靶分子为CPT-SST、COL-SST或CPT-BN，且所述GPCR靶分子的浓度在约0.01mg/kg到约10mg/kg的范围内。
17.一种方法，该方法包括对至少一种细胞进行权利要求1所述的多组分组合物的给药。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述Notch影响分子选自由Notch配体、Notch受体、激活Notch信号的分子和抑制Notch信号的分子所组成的组中。
19.根据权利要求17所述的方法，其中，所述Notch影响分子选自由VPA、SBHA、DBZ和NLE所组成的组中。
20.根据权利要求17所述的方法，其中，所述GPCR靶分子选自由式(I)、SST-14和SST类似物所组成的组中。
21.根据权利要求17所述的方法，其中，所述GPCR靶分子为COL-SST、CPT-SST或CPT-BN。
22.根据权利要求17所述的方法，其中，所述Notch影响分子为VPA，且缀合物为CPT-SST。
23.根据权利要求17所述的方法，其中，所述Notch影响分子为VPA，且缀合物为COL-SST。
24.根据权利要求17所述的方法，其中，所述Notch影响分子为VPA，VPA的浓度在约0.25mM到约20mM的范围内；且缀合物为CPT-SST，CPT-SST的浓度在约0.01μM到约50μM的范围内。
25.根据权利要求17所述的方法，其中，所述Notch影响分子为VPA，VPA的浓度在约0.25mM到约20mM的范围内；且缀合物为COL-SST，COL-SST的浓度在约0.01μM到约50μM的范围内。
26.根据权利要求17所述的方法，其中，所述细胞为癌症细胞。
27.根据权利要求17所述的方法，其中，所述细胞为癌症细胞，且癌症选自由宫颈癌、胰腺癌、胰腺类癌、肺癌、小细胞肺癌(SCLC)、皮肤癌、甲状腺髓样癌(MTC)、皮肤鳞状细胞癌、结直肠癌、骨肉瘤、肝癌、白血病、卵巢癌、肿瘤和内分泌肿瘤所组成的组中。
28.根据权利要求17所述的方法，其中，所述给药是针对生物体的。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述给药通过口服给药、鼻内给药或通过注射给药而进行。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述给药通过静脉注射、通过腹腔注射、通过肌肉注射或通过皮下注射而进行。
31.根据权利要求28所述的方法，其中，所述生物体为哺乳动物。
32.根据权利要求28所述的方法，其中，所述生物体为人或啮齿动物。
33.一种用于在动物中治疗癌症的方法，该方法包括：对动物进行权利要求1所述的多组分组合物的给药。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述Notch影响分子选自由Notch配体、Notch受体、激活Notch信号的分子和抑制Notch信号的分子所组成的组中。
35.根据权利要求33所述的方法，其中，所述Notch影响分子选自由VPA、SBHA、DBZ和NLE所组成的组中。
36.根据权利要求33所述的方法，其中，所述GPCR靶分子选自由式(I)、SST-14和SST类似物所组成的组中。
37.根据权利要求33所述的方法，其中，所述GPCR靶分子选自由COL-SST、CPT-SST和CPT-BN所组成的组中。
38.根据权利要求33所述的方法，其中，所述Notch影响分子为VPA，且缀合物为CPT-SST。
39.根据权利要求33所述的方法，其中，所述Notch影响分子为VPA，且缀合物为COL-SST。
40.根据权利要求33所述的方法，其中，所述给药通过口服给药、鼻内给药或通过注射给药而进行。
41.根据权利要求33所述的方法，其中，所述给药通过静脉注射、通过腹腔注射、通过肌肉注射或通过皮下注射而进行。
42.根据权利要求33所述的方法，其中，所述动物为哺乳动物。
43.根据权利要求33所述的方法，其中，所述动物为人或啮齿动物。
44.根据权利要求33所述的方法，其中，所述癌症选自由宫颈癌、胰腺癌、胰腺类癌、肺癌、小细胞肺癌(SCLC)、皮肤癌、甲状腺髓样癌(MTC)、皮肤鳞状细胞癌、结直肠癌、骨肉瘤、肝癌、白血病、卵巢癌、肿瘤和内分泌肿瘤所组成的组中。
45.根据权利要求33所述的方法，其中，所述治疗抑制癌症细胞中的上皮-间质转化。
46.一种试剂盒，该试剂盒含有权利要求1所述的多组分组合物。
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