CN108504755A

CN108504755A - 梭菌属微生物特异性探针及其用途

Info

Publication number: CN108504755A
Application number: CN201810296666.4A
Authority: CN
Inventors: 周荣清; 胡林涛; 黄钧; 李慧
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2018-04-03
Filing date: 2018-04-03
Publication date: 2018-09-07
Also published as: US20190300938A1

Abstract

本发明属于微生物学和分子生物学交叉技术领域，具体涉及一种梭菌属特异性探针及其用于检测窖泥中梭菌属含量的用途和方法。针对现有技术中还未见有采用荧光原位杂交检测梭菌属微生物数量的方法的问题，本发明提供了一种基于梭菌属16S rRNA保守端序列设计特异性的互补核酸探针，命名CLZ，序列如SEQ ID NO：1所示。应用本发明的CLZ探针，可特异性的检测酿酒窖泥等样品中的梭菌属微生物，为准确剖析浓香型白酒窖池中梭菌属微生物随窖龄变迁的规律提供了一种准确，快速的分析手段。

Description

梭菌属微生物特异性探针及其用途

技术领域

本发明属于微生物学和分子生物学交叉技术领域，具体涉及一种梭菌属微生物特异性探针及其用于检测窖泥中梭菌属微生物含量的用途和方法。

背景技术

浓香型白酒酿造窖池中微生物群落复杂多样，多种群落间的相互作用使浓香型白酒具有独特的风味特征。浓香型白酒主要香味成分为酯类，其中己酸乙酯是白酒的主体香。窖池中代谢产生己酸和己酸乙酯等香味组分的微生物对浓香型白酒影响极大。梭菌属(Clostridium)，为革兰氏阳性菌，严格厌氧微生物，广泛地存在自然界中，同时，在浓香型白酒的窖池中也广泛存在。梭菌属包含典型的发酵细菌，梭菌属是重要的产己酸细菌之一，也是浓香型白酒发酵过程中重要的产香功能菌。所以常将梭菌属在窖泥及发酵醅中的丰度视为衡量窖泥质量的生物活性参数。然而窖泥中仅有很少的一部分梭菌属菌株可以通过纯培养法从窖泥中筛选出来，进行梭菌属定量分析时其结果往往是局限的，不能准确的反应梭菌属在窖泥中的含量及组成。对于一些培养条件苛刻或未被培养的梭菌属往往不能达到预期效果。为了实现对浓香型白酒酿造窖池中梭菌属群落结构更加准确和快速的定量分析，急需开发更加有效的针对梭菌属的免培养定量分析方法。

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)是一种特异性的微生物图像检测方法。荧光标记的核酸探针与微生物胞内高度相似的核酸位点杂交，并在激发光照射下发射荧光，可用于微生物的检测和定位。

现有技术中还未见有采用荧光原位杂交检测梭菌属微生物数量的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题为：现有技术中还未见有采用荧光原位杂交检测梭菌属微生物数量的方法的问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供了一种梭菌属微生物特异性探针及其用于检测窖泥中梭菌属微生物含量的用途和方法。

本发明提供了一种梭菌属微生物特异性探针，命名为CLZ，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

SEQ ID NO：1梭菌属微生物特异性探针的核苷酸序列

5’-3’：ggctaccttgttacgacttcacccca。

特别的，上述梭菌属微生物特异性探针中，在探针的5’端还连接有花青染料荧光素CY3。

其中，上述梭菌属微生物特异性探针的制备方法为：下载NCBI数据库中梭菌科所有微生物的16S rRNA中的全长序列，并进行16S rRNA比对，找出属内保守，属间特异的一段寡核苷酸序列SEQ ID NO：2，根据SEQ ID NO：2进行设计合成。

SEQ ID NO：2设计探针CLZ的核苷酸序列

5’-3’：agcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgat。

本发明还提供了上述梭菌属微生物特异性探针在检测梭菌属微生物含量中的用途。

进一步的，上述用途中，所述梭菌包括科氏梭菌、丁酸梭菌或产气荚膜梭菌中的至少一种。

本发明还提供了一种采用上述梭菌属微生物特异性探针检测酿酒窖泥中梭菌属微生物的方法，包括以下步骤：

a、样品处理

将待测样品用焦磷酸钠溶液稀释后，涂于载玻片上，35～40℃保温1.5～2h，脱水、风干，再取溶菌酶溶液涂于载玻片上，孵育0.5～2h；

b、探针杂交

将步骤a得到的载玻片脱水、风干，将梭菌属微生物特异性探针溶液滴加至载玻片上，40～45℃避光杂交1.5～2.5h，在45～50℃的清洗缓冲溶液中洗涤0.5～1h，干燥，采用抗荧光淬灭剂封片，-20℃避光存放；

c、荧光显微镜观察

采用绿光作为激发光，荧光显微镜下观察，计算得到梭菌属微生物的含量。

其中，上述方法中，步骤a中所述待测样品稀释前，先采用多聚甲醛溶液对所收集菌体细胞进行固定，离心，弃上清后，加入pH 7.0～8.0的PBS缓冲液定容。

多聚甲醛能与蛋白的氨基发生反应，使蛋白质凝固，PBS缓冲液也可以对菌体细胞起保护作用，本发明通过上述操作，可使菌体细胞分散更均匀，便于计数。

进一步的，所述的离心为4℃下10000r/min离心5～10min。

其中，上述方法中，步骤a中所述稀释后的菌体浓度为10⁶～10⁷个细胞/mL。

其中，上述方法中，步骤a中所述脱水为采用50％、80％和96％乙醇溶液梯度分别脱水2～3min。

其中，上述方法中，步骤a中所述溶菌酶的浓度为8～12mg/mL。

其中，上述方法中，步骤b中所述的梭菌属特异性探针溶液是指20～30ng/μL的探针与杂交缓冲溶液按体积比1︰9混合而成的溶液；所述的探针核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，每L杂交缓冲溶液中含有2.42g Tris-HCl，1.46g EDTA，0.1g SDS，52.65g NaCl，0.3L甲酰胺，余量为水。所述杂交缓冲溶液pH值为7.2。

其中，上述方法中，步骤b中所述洗涤采用清洗缓冲溶液，所述清洗缓冲溶液组成为：每L清洗缓冲溶液中含有2.42g Tris-HCl，2.92g EDTA，0.1g SDS和18.02g NaCl，余量为水。所述清洗缓冲溶液的pH值为7.2。

特别的，上述方法的具体操作步骤为：

(1)样品前处理：将待测样品制成4％多聚甲醛菌悬液，置于4℃过夜固定，4℃10000r/min离心10min，弃上清液，用pH 7.2的PBS缓冲液将重悬菌液并定容至10ml，用0.1％焦磷酸钠溶液稀释至菌体浓度为10⁶～10⁷个细胞/mL,取100μL菌悬液均匀涂于孔板载玻片上，37℃保温2h，50％、80％和96％乙醇溶液中梯度脱水3min，风干，吸取10mg/mL的溶菌酶100μL涂至孔板载玻片上，孵育1h；

(2)探针杂交：将涂有溶菌酶的孔板载玻片依次置于50％、80％和96％乙醇溶液中梯度脱水3min，自然风干，在避光条件下，取100μL探针溶液滴加至孔板载玻片上；于42℃湿盒避光杂交2h，采用48℃的清洗缓冲溶液清洗30min，无菌水洗涤3次，避光风干，抗荧光淬灭剂封片，-20℃避光存放；

(3)荧光显微镜观察

将封片后的孔板载玻片倒置于荧光显微镜载物台，调整绿光534nm～558nm作为激发光，100倍物镜观察玻片，计算得到梭菌属微生物的含量。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种梭菌属特异性探针，该探针是基于16S rRNA序列中发现的梭菌属微生物特异的探针结合位点而设计合成的。该探针特异性高，能够有效的同科氏梭菌、丁酸梭菌或产气荚膜梭菌等梭菌有效杂交，测定结果准确；本发明还利用荧光原位杂交技术，提供了一种利用该探针检测窖泥中梭菌属微生物的方法。该检测方法简单快速，结果易分析，检测范围广，可以广泛应用于土壤样，水样及浓香型白酒窖池样品中梭菌的检测，具有重要的意义。

附图说明

图1使用荧光原位杂交检测方法验证探针CLZ的特异性(科氏梭菌(CICC 8022)，丁酸梭菌(CICC10350)，产气荚膜梭菌(CICC22949)显微镜下的形态)；

图2使用荧光原位杂交检测方法验证探针CLZ的特异性(枯草芽孢杆菌(CICC20633)，干酪乳酸杆菌(ATCC 393)显微镜下的形态)；

图3使用荧光原位杂交检测方法检测窖泥样品中的梭菌属。

具体实施方式

为了准确检测梭菌属微生物的含量，本发明采用荧光原位杂交的方法，设计并合成了一种梭菌属特异性探针，该探针的设计原则为：

(1)探针太长可能造成内部错误配对杂交，所以序列较短，其特异性较强，因此可在杂交时区分家族基因。因此，为了保证特异性，避免探针的DNA折叠和产生稳定的二级结构，本发明选择的探针长度为15bp～45bp，优选为20～30bp；

(2)为了确保探针在杂交时优先与目的片段结合，使其在单一杂交条件下的杂交信号能反映杂交结果，本发明探针的Tm值为65～70℃；

(3)为了减少非特异性杂交并保证杂交的特异性，本发明探针的GC含量应在40～70％，整条探针的碱基C的含量要明显高于G的含量，以免降低反应效率；

(4)为了在激发光下，杂交成功的菌体细胞散发荧光，增强杂交信号，将探针5’端由荧光染料Cy3标记。

根据上述探针设计原则，应用Primer Premier 6.0进行梭菌属(Clostridium)探针ClZ的设计和评估。用于探针设计的微生物16S rRNA序列来源于NCBI数据库，通过MEGA5.2软件对序列进行比对，选取目标属间特异且目标属内保守的序列SEQ ID NO：2进行探针设计。交由上海生工生物技术公司合成，合成的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。

实施例1寡核苷酸探针合成

根据NCBI中梭菌属的特异性序列设计探针，交由上海生工生物技术公司合成并标记。探针的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，并且在5’连接花青染料荧光素CY3。

以无菌TE缓冲溶液溶解，配制成浓度25ng/μL，-20℃储存。所述的TE缓冲溶液为12.11g/LTris-HCl(pH 7.5),1.46g/L EDTA。

实施例2采用本发明探针检测标准样品中的梭菌

1、溶液配制

杂交缓冲溶液：包含：2.42g/L Tris-HCl(pH 7.2)，1.46g/L EDTA，0.01(w/v)％SDS，52.65g/LNaCl，30(v/v)％甲酰胺。

清洗缓冲溶液：包含：2.42g/L Tris-HCl(pH 7.2)，2.92g/L EDTA，0.01(w/v)％SDS，18.02g/LNaCl。

阳性对照：标准株：科氏梭菌(CICC 8022)，丁酸梭菌(CICC10350)，产气荚膜梭菌(CICC22949)，分别5mL 1×10⁶cfu/mL培养液。

阴性对照：标准株：枯草芽孢杆菌(CICC 20633)，干酪乳酸杆菌(ATCC 393)标准株，分别5mL 1×10⁶cfu/mL培养液。

2、样品处理

用移液器吸取5mL待测标准菌株培养液于50mL离心管，添加20mL PBS缓冲溶液混匀，4℃12000r/min离心收集菌体。制成4％多聚甲醛菌悬液，置于4℃过夜固定，4℃10000r/min离心10min，弃上清液，PBS缓冲液(pH 7.2)定容重悬菌液至10ml，用0.1％焦磷酸钠溶液梯度稀释至菌体浓度为10⁶～10⁷cells/mL,取100μL菌悬液均匀涂于孔板载玻片上，37℃保温2h。50％、80％和96％乙醇溶液中梯度脱水3min，风干。吸取100μL(10mg/mL)溶菌酶涂至孔板载玻片上，孵育1h。

3、探针杂交

将涂有溶菌酶的孔板玻片依次置于50％、80％和96％乙醇溶液中梯度脱水3min，自然风干。在避光条件下，取100μL的探针溶液(实施例1制备的探针与杂交缓冲溶液按体积比为1︰9配制而成)滴加至孔板载玻片上。置于42℃湿盒避光杂交2h，之后将置于预热的清洗缓冲溶液48℃清洗30min洗去未杂交的探针，无菌水洗涤3次，避光风干，抗荧光淬灭剂封片-20℃避光存放，待观察。

4、荧光显微镜观察

将封片后的孔板载玻片倒置于荧光显微镜载物台，调整绿光(534nm～558nm)作为激发光，100倍物镜观察玻片。(结果见图1，图2)

由实验结果可知：探针CLZ能与所选梭菌属(Clostridium)中三个不同种的菌株有效杂交，具有非特异性染色较少、目标物荧光信号较强、菌体清晰、背景信号弱的特点。探针CLZ与枯草芽孢杆菌、干酪乳酸杆菌杂交结果表明，探针CLZ基本不与枯草芽孢杆菌、干酪乳酸杆菌杂交，杂交结果仅检测出少量培养基中杂质的自发荧光，而未检测到菌体所发荧光及清晰的菌体形状。

结果表明：探针CLZ能够特异性的与梭菌属微生物杂交，进而准确检测梭菌属微生物的含量。

实施例3采用本发明探针检测酿酒窖泥中的梭菌

1、溶液配制同实施例2。

2、样品处理

称取1g窖泥，加入25mL无菌PBS缓冲溶液，涡旋混匀，充分混匀后800r/min离心，收集上清液。重复3次洗涤沉淀并合并上清液，4℃12000r/min，弃上清液，收集菌体。制成4％多聚甲醛菌悬液，置于4℃过夜固定，4℃10000r/min离心10min，弃上清液，PBS缓冲液(pH7.2)定容重悬菌液至10ml，用0.1％焦磷酸钠溶液梯度稀释至菌体浓度为10⁶～10⁷cells/mL,取100μL菌悬液均匀涂于孔板载玻片上，37℃保温2h。50％、80％和96％乙醇溶液中梯度脱水3min，风干。吸取100μL(10mg/mL)溶菌酶涂至孔板载玻片上，孵育1h。

3、探针杂交

将涂有溶菌酶的孔板玻片依次置于50％、80％和96％乙醇溶液中梯度脱水3min，自然风干。在避光条件下，取100μL的CLZ探针溶液(实施例1制备的探针与杂交缓冲溶液按体积比为1︰9配制而成)滴加至孔板载玻片上，另外取100μL EUB338探针溶液(核苷酸序列为SEQ ID NO：3的探针与杂交缓冲溶液按体积比1︰9配制成的溶液)滴加至另外的孔板载玻片上。分别置于42℃湿盒避光杂交2h，之后将置于预热的清洗缓冲溶液48℃清洗30min洗去未杂交的探针，无菌水洗涤3次，避光风干，抗荧光淬灭剂封片，-20℃避光存放，待观察。

SEQ ID NO：3探针EUB338的核苷酸序列

5’-3’：gctgcctcccgtaggagt。

4、荧光显微镜观察

将封片后的孔板载玻片倒置于荧光显微镜载物台，调整绿光(534nm～558nm)作为激发光，100倍物镜观察玻片。(结果见图3)

5、对出窖糟醅和入窖糟醅样品进行检测，重复步骤1～4，得到出窖糟醅和入窖糟醅中的总细菌和梭菌属微生物含量，结果如下表1所示。

表1采用本发明方法检测总细菌和梭菌属微生物含量表

探针	窖泥(×10⁷cells/g)	出窖糟醅(×10⁷cells/g)	入窖糟醅(×10⁷cells/g)
				CLZ	106±9	0.28±0.03	0.31±0.05
EUB338	181±41	0.53±0.03	0.74±0.07

由实验结果可知：采用本发明的CLZ探针能特异性的与窖泥、出窖糟醅和入窖糟醅等产品中的梭菌属微生物进行有效杂交，进而检测该样品中的梭菌属微生物含量，测定结果准确，适用范围广，为酿酒行业检测梭菌属微生物提供了一种全新的方法。

序列表

<110> 四川大学

<120> 梭菌属微生物特异性探针及其用途

<130> A180202K(序)

<141> 2018-04-03

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggctaccttg ttacgacttc acccca 26

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgat 44

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctgcctccc gtaggagt 18

Claims

1.梭菌属微生物特异性探针，其特征在于：探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的梭菌属微生物特异性探针，其特征在于：在探针的5’端还连接有花青染料荧光素CY3。

3.权利要求1或2所述的梭菌属微生物特异性探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：下载NCBI数据库中梭菌科所有微生物的16S rRNA中的全长序列，并进行16S rRNA比对，找出属内保守，属间特异的一段寡核苷酸序列SEQ ID NO：2，根据SEQ ID NO：2进行设计合成。

4.权利要求1或2所述的梭菌属微生物特异性探针在检测梭菌属微生物含量中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述梭菌包括科氏梭菌、丁酸梭菌或产气荚膜梭菌中的至少一种。

6.采用权利要求1或2所述的梭菌属微生物特异性探针检测酿酒窖泥中梭菌属微生物的方法，包括以下步骤：

a、样品处理

b、探针杂交

将步骤a得到的载玻片脱水、风干，将梭菌属微生物特异性探针溶液滴加至载玻片上，40～45℃避光杂交1.5～2.5h，在提前预热至45～50℃的清洗缓冲溶液中洗涤0.5～1h，干燥，采用抗荧光淬灭剂封片，-20℃避光存放；

c、荧光显微镜观察

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤a中所述待测样品稀释前，先采用多聚甲醛溶液对所收集菌体细胞进行固定，离心，弃上清后，加入pH 7.0～8.0的PBS缓冲液定容。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤a中所述稀释后的菌体浓度为10⁶～10⁷个细胞/mL。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤b中所述的梭菌属微生物特异性探针溶液是指20～30ng/μL的探针与杂交缓冲溶液按体积比1︰9混合而成的溶液；所述杂交缓冲溶液组成为：每L杂交缓冲溶液中含有2.42g Tris-HCl，1.46g EDTA，0.1g SDS，52.65gNaCl，0.3L甲酰胺，余量为水。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤b中所述洗涤采用清洗缓冲溶液，所述清洗缓冲溶液组成为：每L清洗缓冲溶液中含有2.42g Tris-HCl，2.92g EDTA，0.1g SDS和18.02g NaCl，余量为水。