CN108498499A - 缺血性脑损伤动物模型的抗神经损伤方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种缺血性脑损伤动物模型的抗神经损伤方法，包括以下步骤：步骤1、缺血性脑损伤动物模型的建立方法；步骤2、进行地龙素给药实验；步骤3、进行行为学测试、梗死体积的测量，观察地龙素对缺血性脑损伤小鼠缺血半影区组织与血管新生相关的VEGF、CD34表达的影响；观察地龙素对局部脑缺血损伤小鼠PI3K‑AKT信号通路的相关因子VEGF、PI3K、AKT蛋白表达的影响。本发明通过动物实验确定了地龙素对缺血性脑损伤动物的神经保护效果的最佳剂量，通过可靠的测试指标确定了地龙素可用于缺血性脑损伤的神经保护。
Description
技术领域
本发明属于抗神经损伤技术领域，尤其涉及一种缺血性脑损伤动物模型的抗神经损伤方法。
背景技术
中风是一种常见病，多发病，死亡率和致残率都很高，目前临床上还未发现理想的治疗方法。抗血栓西药虽疗效确切，但不良反应明显，作用靶点单一且病情易反复。中药地龙具有毒副作用小，作用靶点多元等优点。目前缺血性脑损伤引起的神经损伤的治疗药物或方法并没有取得令人满意的疗效，针对这一现状，本发明提出了一种中药地龙素作为缺血性脑损伤的抗神经损伤药物，疗效好，克服使用西药的弊端，并能为后期研究应用多功效多靶点的药物提供科学基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种缺血性脑损伤动物模型的抗神经损伤方法，旨在解决上述背景技术中提出的问题。
本发明是这样实现的，
一种缺血性脑损伤动物模型的抗神经损伤方法，包括以下步骤：
步骤1、缺血性脑损伤动物模型的建立方法
以6-8周龄小鼠为实验动物，实验小鼠经麻醉后，正中剪开头皮，暴露颅骨，将双面刀片黏在颅骨上，拧紧螺丝将头骨固定在自制的钢板上，以Bregma点后1mm，侧2mm为中心，将2×2mm颅骨区域磨薄头骨直至有小血管可见，尾静脉注射孟加拉红溶液，立即用绿色光束照射磨薄区域的小血管4min 15sec，然后缝合头皮，用带有反馈控制的加热板保温至苏醒，放回鼠笼；
步骤2、给药方法
a.假手术组：给予生理盐水，每天一次，连续4周；
b.经步骤1处理的模型组：给予生理盐水，每天一次，连续4周；
c.经步骤1处理的模型小鼠给药组：每只小鼠以地龙素40-80mg/mL，灌胃，每天一次，连续4周；
步骤3、观测指标
a.观察经步骤2处理的小鼠的运动平衡能力，进行行为学测试，包括疲劳转移棒测试和前肢抓力测试；
b.梗死体积的测量:将做完行为学测试的小鼠在术后72h进行腹腔麻醉，断头取脑进行TTC染色后测量梗死体积；
c.观察地龙素对缺血性脑损伤小鼠缺血半影区组织与血管新生相关的VEGF、CD34表达的影响；
d.观察地龙素对局部脑缺血损伤小鼠PI3K-AKT信号通路的相关因子VEGF、PI3K、AKT蛋白表达的影响。
优选地，步骤2c中，所述经步骤1处理的模型小鼠给药组：每只小鼠以地龙素80mg/mL，灌胃，每天一次，连续4周。
优选地，步骤3b中，所述腹腔麻醉时使用的麻醉剂为15％的氨基甲酸乙酯0.4ml。
优选地，步骤3b中，所述梗死体积的计算公式为梗死体积＝对侧大脑的体积-同侧未损伤大脑的体积。
本发明还提供了地龙素用于缺血性脑损伤的神经保护的用途。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：
本发明通过建立缺血性脑损伤动物模型，并通过给药地龙素，观察地龙素对局部缺血性脑损伤小鼠行为学、脑部梗死体积的影响，分析了地龙素对局部缺血性脑损伤小鼠半影区血管密度及血管新生相关因子VEGF的影响；探讨基于血管新生信号通路VEGF/PI3K-AKT，地龙素干预后对神经细胞保护作用与VEGF、PI3K、AKT蛋白表达的相关性，本发明通过动物试验确定了地龙素对缺血性脑损伤动物的神经保护效果的最佳剂量，为地龙素防治中风提供实验依据。
附图说明
图1是本发明实施例提供的实验小鼠的光栓模型图。
图2是本发明实施例提供的不同剂量的地龙素促进了实验小鼠缺血后1周内行为学功能的恢复图；图中，Sham：假手术组；Model：模型组；Lum40：40mg/mL地龙素治疗组；Lum60：60mg/mL地龙素治疗组；Lum80：80mg/mL地龙素治疗组。
图3是本发明实施例提供的利用TTC染色评价实验小鼠缺血3天后脑组织损伤区域的大小图；图中，Sham：假手术组；Model：模型组；Lum40：40mg/mL地龙素治疗组；Lum60：60mg/mL地龙素治疗组；Lum80：80mg/mL地龙素治疗组。
图4是本发明实施例提供的地龙素对实验小鼠局灶性脑缺血组织中VEGF和CD34表达的影响(免疫组化染色，×400)图；图中，Sham：假手术组；Model：模型组；Lum：80mg/mL地龙素治疗组。
图5是本发明实施例提供的地龙素对PI3K-Akt信号通路的调节作用图；图中，Sham：假手术组；Model：模型组；Lum：80mg/mL地龙素治疗组。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一种缺血性脑损伤动物模型的抗神经损伤方法，包括以下步骤：
步骤1、缺血性脑损伤动物模型的建立方法
以6-8周龄小鼠为实验动物，实验小鼠经氯胺酮/甲苯噻嗪(100mg/kg，15mg/mg，腹腔注射)麻醉，所用氯胺酮/甲苯噻嗪的剂量为100mg/kg，15mg/mg，采用腹腔注射麻醉，然后正中剪开头皮，暴露颅骨，将双面刀片黏在颅骨上，拧紧螺丝将头骨固定在自制的钢板上，以Bregma点后1mm，侧2mm为中心，将2×2mm颅骨区域用高速牙科转磨薄头骨直至有小血管可见，尾静脉注射孟加拉红溶液，该溶液浓度为10mg/ml，剂量按小鼠体重计为3μl/g，再立即用绿色光束照射磨薄区域的小血管4min 15sec，即10x光圈的3/4，然后缝合头皮，用带有反馈控制的加热板保温至苏醒，放回鼠笼；除了未进行绿光照射外，假手术组操作过程与手术组相似。
步骤2、给药方法
将50只实验小鼠随机分为5组，每组10只进行如下给药实验：
a.假手术组：给予生理盐水，每天一次，连续4周；
b.经步骤1处理的模型组：给予生理盐水，每天一次，连续4周；
c.经步骤1处理的模型小鼠给药组：每只小鼠以地龙素40mg/mL，灌胃，每天一次，连续4周；
d.经步骤1处理的模型小鼠给药组：每只小鼠以地龙素60mg/mL，灌胃，每天一次，连续4周；
e.经步骤1处理的模型小鼠给药组：每只小鼠以地龙素80mg/mL，灌胃，每天一次，连续4周；
步骤3、观测指标
a.观察经步骤2处理的小鼠的运动平衡能力，进行行为学测试，包括疲劳转移棒测试和前肢抓力测试；
b.梗死体积的测量:将做完行为学测试的小鼠在术后72h用15％的氨基甲酸乙酯0.4ml进行腹腔麻醉，断头取脑进行TTC染色后测量梗死体积，红色为正常组织，白色为梗死区域，为了减少水肿对梗死体积的影响，梗死体积的计算公式为梗死体积＝对侧大脑的体积-同侧未损伤大脑的体积；
c.用免疫组化法观察地龙素对缺血性脑损伤小鼠缺血半影区组织与血管新生相关的VEGF、CD34表达的影响；
d.应用Western-blotting方法观察地龙素对局部脑缺血损伤小鼠PI3K-AKT信号通路的相关因子VEGF、PI3K、AKT蛋白表达的影响。
4、结果分析
a、缺血性脑损伤动物模型
尾静脉注射孟加拉红染料后绿光照射右侧感觉运动皮层区4min 15sec.，通过光激活孟加拉红后造成运动皮层区4.0×4.0mm损伤区，如图1所示，图1A为用牙科钻磨薄颅骨后显出的血管进行光照的部位；图1B为注射Rose bengal后图1A被绿光照射时显示血液凝固的图。
损伤的位置分布在额部和顶部皮层。TTC染色中白色的部位是光化学栓塞诱导的梗死区域。TTC染料能够与正常细胞线粒体中的脱氢酶结合起变色反应，呈粉红色，而神经细胞功能受损后脱氢酶活性降低或失活则不能发生变色反应，显示白色，因此，TTC染色能够反映神经细胞的功能，目前被作为一种反映缺血后3天内梗死大小的可靠指标。缺血后3天，未经干预的动物显示出比较大的梗死区，区域面积为19.73±1.02mm3，n＝6，如图3所示，图3A为TTC染色后脑缺血组织的冠状切片。缺血后72h取脑，未染色区域为梗死部位。与模型组相比，地龙素治疗降低了梗死的面积；图3B为缺血后3天的梗死体积，与模型组相比，三种剂量的地龙素治疗组均显著降低了梗死体积(n＝7，P<0.01)。神经缺失功能的评分和行为学测试能够评价运动皮层损伤后引起神经功能缺失的程度。缺血后4h大多数小鼠的神经缺失功能评分达到了3分，属于重度中风的范围。缺血后1天的行为学测试结果也表明运动功能受损的程度是非常明显的。测试结果表明，在前肢抓力测试中，缺血小鼠前肢的抓力显著低于假手术组，如图2B所示，三种不同剂量的地龙素均显著提高了缺血小鼠的前肢抓力，不管是缺血后3天还是7天，地龙素剂量为80mg/mL的效果明显好于40mg/mL和60mg/mL(P<0.05)。这有力地说明了重度缺血模型的制备是成功的。
b、不同剂量地龙素对缺血性中风后行为学结果的影响
本发明采用了疲劳转移棒和前肢抓力测试两种行为学测试方法评价运动功能的恢复程度。疲劳转移棒主要用来评估动物的运动功能以及平衡协调能力；前肢抓力测试主要是评价动物前肢的肌力。在疲劳转移棒测试中，小鼠从转棒上掉落的时间明显低于假手术组，如图2A所示，实验结果表明在缺血后一周内的任意时间点动物在转棒上保持的时间均明显低于假手术组，三种不同剂量的地龙素在缺血后3天均显著增加了小鼠保留在转棒上的能力，与手术前相比，地龙素剂量为40mg/mL，60mg/mL和80mg/mL给药组小鼠从转棒上掉落的时间分别下降了14.91％，24.08％和35.10％，剂量之间有较为明显的差异，效果依次为80mg/mL>60mg/mL>40mg/mL(P<0.01)；缺血后7天，40mg/mL和60mg/mL的作用差异较小。在前肢抓力测试中，缺血小鼠前肢的抓力显著低于假手术组，如图2B所示，在缺血后一周内各个时间点缺血诱导了前肢抓力的降低，而三种不同剂量的地龙素在缺血后3天均显著增加了前肢的抓力，效果依次为40mg/mL>60mg/mL>80mg/mL(P<0.05)；缺血后7天，与手术前相比，地龙素剂量为40mg/mL，60mg/mL和80mg/mL给药组小鼠的前肢抓力分别下降了20.76％，15.45％和8.57％，地龙素剂量为80mg/mL明显好于60mg/mL和40mg/mL。以上结果说明80mg/mL和60mg/mL的地龙素促进脑缺血损伤后运动功能的恢复要优于40mg/mL。
c、不同剂量地龙素对缺血性中风后梗死体积的影响
为评价地龙素对缺血性中风的影响，并进一步确定地龙素的最佳剂量，选择40mg/mL、60mg/mL和80mg/mL的地龙素，观察这三种剂量的地龙素对脑缺血后梗死体积的影响。缺血3天后TTC染色结果表明，三种剂量的地龙素均显著降低了缺血诱导的梗死体积，如图3所示，40mg/mL地龙素使梗死体积降低了36.29％，60mg/mL的地龙素使梗死体积降低了56.91％，80mg/mL的地龙素使梗死体积降低了68.32％，实验说明80mg/mL的地龙素在梗死体积的降低上明显优于40mg/mL和60mg/mL(P<0.01，如图3B)。综合行为学和组织学结果，在本研究中地龙素的最佳剂量选为80mg/mL。
d、地龙素增加脑缺血中风小鼠脑组织中VEGF、CD34的表达
如图4所示，免疫组化结果显示，与假手术组相比，模型组和地龙素治疗组实验小鼠脑组织中VEGF、CD34的表达水平较高(地龙素80mg/mL，P＜0.01或P＜0.05)。与模型组相比，在地龙素治疗组实验小鼠脑组织中VEGF、CD34的表达水平明显升高(P＜0.01或P＜0.05)，这暗示着脑缺血损伤刺激微血管增生。
e、地龙素对PI3K-AKT信号通路的调节作用
在局部脑缺血中风28天，取小鼠缺血半影区的脑组织分离总蛋白，用Western印迹法定量分析VEGF、PI3K、AKT蛋白表达量。结果如图5所示，图5A为VEGF、PI3K与Akt蛋白印迹杂交的代表性图像；图5B为缺血半影区脑组织中VEGF、PI3K与Akt的表达量，GAPDH作为对照。局灶性脑缺血小鼠VEGF水平明显高于假手术组(p＜0.05)。而且，地龙素治疗组VEGF蛋白水平明显高于模型组和假手术组(P＜0.01)。与假手术组和模型组相比，地龙素明显增加缺血半暗带PI3K、AKT的表达量(P＜0.05)。模型组与假手术组的PI3K、AKT蛋白水平无显著性差异(P＞0.05)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种缺血性脑损伤动物模型的抗神经损伤方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1、缺血性脑损伤动物模型的建立方法
以6-8周龄小鼠为实验动物，实验小鼠经麻醉后，正中剪开头皮，暴露颅骨，将双面刀片黏在颅骨上，拧紧螺丝将头骨固定在自制的钢板上，以Bregma点后1mm，侧2mm为中心，将2×2mm颅骨区域磨薄头骨直至有小血管可见，尾静脉注射孟加拉红溶液，立即用绿色光束照射磨薄区域的小血管4min 15sec，然后缝合头皮，用带有反馈控制的加热板保温至苏醒，放回鼠笼；
步骤2、给药方法
a.假手术组：给予生理盐水，每天一次，连续4周；
b.经步骤1处理的模型组：给予生理盐水，每天一次，连续4周；
c.经步骤1处理的模型小鼠给药组：每只小鼠以地龙素40-80mg/mL，灌胃，每天一次，连续4周；
步骤3、观测指标
a.观察经步骤2处理的小鼠的运动平衡能力，进行行为学测试，包括疲劳转移棒测试和前肢抓力测试；
b.梗死体积的测量:将做完行为学测试的小鼠在术后72h进行腹腔麻醉，断头取脑进行TTC染色后测量梗死体积；
c.观察地龙素对缺血性脑损伤小鼠缺血半影区组织与血管新生相关的VEGF、CD34表达的影响；
d.观察地龙素对局部脑缺血损伤小鼠PI3K-AKT信号通路的相关因子VEGF、PI3K、AKT蛋白表达的影响。
2.如权利要求1所述的缺血性脑损伤动物模型的抗神经损伤方法，其特征在于，所述步骤2c中，所述经步骤1处理的模型小鼠给药组：每只小鼠以地龙素80mg/mL，灌胃，每天一次，连续4周。
3.如权利要求1所述的缺血性脑损伤动物模型的抗神经损伤方法，其特征在于，所述步骤3b中，所述腹腔麻醉时使用的麻醉剂为15％的氨基甲酸乙酯0.4ml。
4.如权利要求1所述的缺血性脑损伤动物模型的抗神经损伤方法，其特征在于，所述步骤3b中，所述梗死体积的计算公式为梗死体积＝对侧大脑的体积-同侧未损伤大脑的体积。
5.地龙素用于缺血性脑损伤的神经保护的用途。
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