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CN108486186A - 一种氧化酶制备具有抗肿瘤活性的靛玉红的方法 - Google Patents

一种氧化酶制备具有抗肿瘤活性的靛玉红的方法 Download PDF

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罗学才
王林
尹若春
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Hefei Shixiandu Biotechnology Co., Ltd.
Original Assignee
Hefei Anhui Biological Technology Co Ltd
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    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
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Abstract

本发明涉及一种氧化酶制备具有抗肿瘤活性的靛玉红的方法，通过将吲哚溶于双水相体系，以氧化酶为催化剂进行合成反应；合成反应结束后用乙醇复溶，过滤后即得具有抗肿瘤活性的靛玉红。该方法在常温常压下反应，具有工艺操作简单易行、成本低、环保、靛玉红产率高等优点。

Description

一种氧化酶制备具有抗肿瘤活性的靛玉红的方法
技术领域
本发明涉及一种氧化酶制备具有抗肿瘤活性的靛玉红的方法，属于生物医药技术领域。
背景技术
吲哚，是一个芳香杂环有机化合物，分子式为：C8H7N；分子量为：117.15；结构式如下：
吲哚是一种重要的有机原料和精细化工产品，它的同系物和衍生物广泛存在于自然界，主要存在于天然花油，如茉莉花、甜橙、白柠檬、柚皮、柑橘、苦橙花、水仙花、香罗兰等中。可广泛用于制造茉莉、紫丁香、橙花、栀子、忍冬、荷花、水仙、依兰、草兰、白兰等花香型香精。也常与甲基吲哚共用来拟配人造灵猫香，极微量可用于巧克力、悬钩子、草莓、苦橙、咖啡、坚果、乳酪、葡萄及果香复方等香精中。在很多有机化合物中能发现吲哚结构，比如动物的一个必需氨基酸色氨酸及含色氨酸的蛋白质，植物生长素(吲哚-3-乙酸)、抗炎药物消炎痛(茚甲新)、血管舒张药物心得乐、生物碱及色素中也包含有吲哚结构，吲哚类生物碱是自然界广泛存在的天然生物碱，具有抗菌、抗肿瘤和抗病毒等广泛的生物活性。
靛玉红又名炮弹树碱B，分子量为：262.26；结构式如下：
靛玉红为一种双吲哚类生物碱，对多种移植性动物肿瘤有抑制效果，能破坏白血病细胞，在其作用下，变性的细胞多呈肿胀、溶解性坏死。靛玉红还具有抗菌消炎、神经保护和抗病毒等药理作用，并且它作为中药具有作用广泛、低毒、无或低残留等优势，防治临床疾病潜力巨大。
靛玉红的生产主要有3种方法：植物提取、化学合成及微生物转化。植物提取工艺繁琐，产量低；化学合成法具有效率高、产品纯度高、过程简单等优点，是目前靛玉红制备的主要方法。但是，化学合成使用的催化剂、物料以及副产物具有一定的毒性对人和环境带来危害。微生物合成法具有环保、安全等优点，但仍存在产率低、纯度低、底物昂贵等问题。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提供了一种氧化酶制备具有抗肿瘤活性的靛玉红的方法，具体技术方案如下：
一种氧化酶制备具有抗肿瘤活性的靛玉红的方法，包括以下步骤：
步骤(a)、将吲哚溶于双水相体系，以氧化酶为催化剂进行合成反应；
步骤(b)、合成反应结束后用乙醇复溶，过滤后即得具有抗肿瘤活性的靛玉红。
作为上述技术方案的改进，步骤(a)中所述的氧化酶是葡萄糖氧化酶、血浆铜蓝蛋白中的一种或数种。
作为上述技术方案的改进，步骤(a)中所述双水相为有机相-水相，所述有机相是乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、乙腈中的一种。
作为上述技术方案的改进，步骤(a)中所述的反应条件为反应温度是20～60℃，加入介体钙离子，反应时间是6～36h。
作为上述技术方案的改进，步骤(b)中加入的乙醇与步骤(a)中的底物吲哚按照体积质量比以mL/mg计为2:25。
作为上述技术方案的改进，所述葡萄糖氧化酶采用如下方法制备得到，以黑曲霉A9为发酵菌株，采用10L发酵罐生产葡萄糖氧化酶，发酵四天，得菌丝体，经过破壁，缓冲液提取，获得胞内葡萄糖氧化酶的粗酶液，然后经超滤浓缩、硫酸铵盐析、Sephadex G-25脱盐、DEAE-纤维素离子交换层析及Sephadex G-100凝胶层析进行分离纯化，以PAGE电泳检测其纯度，获得电泳纯的葡萄糖氧化酶。
作为上述技术方案的改进，所述血浆铜蓝蛋白采用如下方法制备得到，以人血清为原材料，经稀释、正丁醇脱脂、超滤、硫酸铵分级沉淀获得粗酶液，进一步经过DEAE-琼脂糖离子交换柱层析，羟基磷灰石层析，Superdex-200凝胶过滤纯化，以SDS-PAGE和等电聚焦电泳检测其纯度，获得电泳纯的铜蓝蛋白。
本发明的有益效果：本发明所述合成靛玉红的方法，在常温常压下反应，具有工艺操作简单易行、成本低、环保、靛玉红产率高等优点。
附图说明
图1是吲哚标样的HPLC图谱；
图2是靛玉红标样的HPLC图谱；
图3是实施例3催化吲哚生成靛玉红的HPLC图谱；
图4是靛玉红标样的一级质谱图；
图5是实施例3催化吲哚生成靛玉红的一级质谱图；
图6是靛玉红的二级质谱图；
图7是实施例3催化吲哚生成靛玉红的二级质谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
1)、以黑曲霉A9为发酵菌株，采用10L发酵罐生产葡萄糖氧化酶，发酵四天，得菌丝体，经过破壁，缓冲液提取，获得胞内葡萄糖氧化酶的粗酶液，然后经超滤浓缩、硫酸铵盐析、Sephadex G-25脱盐、DEAE-纤维素离子交换层析及Sephadex G-100凝胶层析进行分离纯化，以PAGE电泳检测其纯度，获得电泳纯的葡萄糖氧化酶。
2)、葡萄糖氧化酶酶活检测：
①、样品稀释液的制备
称取样品1g(精确到0.0001g)置研钵中，加入磷酸缓冲液研磨10min(研磨至无大颗粒)，移入100ml容量瓶中，用磷酸缓冲液磨洗研钵，保证样品全部移入容量瓶中，定容，摇匀(使酶液浓度控制在3U/ml)，待测样液在加入磷酸缓冲液后三小时内测定。
②、样品测定
取2％葡萄糖磷酸缓冲溶液25.00ml置250ml锥形瓶中，置于水浴锅中35℃预热5分钟，准确加入上述测定液3.00ml，立即置恒温水浴中，接入恒定压力大氧气管(管口通入液面下)，反应20分钟取出，取出氧气管，用5ml水冲洗管口处，立即准确加入0.1mol/L氢氧化钠溶液50.00ml，振摇终止反应，把反应液移入300ml烧杯，用10～20ml无CO2蒸馏水清洗锥形瓶两次，并把清洗液全部倒入烧杯中，磁力搅拌摇匀(不可用其他材料搅拌，例如玻棒)，用0.1mol/L盐酸滴定到溶液PH值至8.0，记录所消耗的盐酸毫升数。
③、空白对照
准确移取0.1mol/L氢氧化钠溶液50.00ml置300ml烧杯中，准确加入磷酸缓冲溶液25.00ml及3.00ml酶液，磁力搅拌摇匀，用0.1mol/L盐酸滴定其PH值至8.0，记录所消耗的盐酸毫升数(空白测定不加底物，不加氧，不加温)。
实施例2
1)、以人血清为原材料，经稀释、正丁醇脱脂、超滤、硫酸铵分级沉淀获得粗酶液，进一步经过DEAE-琼脂糖离子交换柱层析，羟基磷灰石层析，Superdex-200凝胶过滤纯化，以SDS-PAGE和等电聚焦电泳检测其纯度，获得电泳纯的铜蓝蛋白。
2)、血浆铜蓝蛋白活力检测：
取血浆铜蓝蛋白50ul及醋酸盐缓冲液850ul置30℃水浴8分钟后加入基质液900ul，倒置混均，立即吸入Gilford仪器中。试验前仪器用蒸馏水校正零点。实验温度30℃，分析波长550nm，光路1cm，延迟时间30秒，读数间隔30秒，读数点7，因数K4932，以上数字按要求输入syva Clinieal Processor 5000。以2分钟△A值为测定结果。用1U/L表示，即反应在最合适的pH值和基质溶液下，每升血浆铜蓝蛋白每分钟能催化转变1ug分子基质的酶量为一个国际单位(U)。
其中基质液：精取DPPD(CH3)2NC6H4NH2·2HCl 69.08g，放入100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，室温下置20分钟后使用。须新鲜配制。该溶液室温下可保留6-8小时)。仪器：Gilford Staster System Ⅲ interfaced with a Syva Clinieal Processor5000。
实施例3
取实施例1制备的电泳纯葡萄糖氧化酶12.5mg，称取吲哚25mg，将葡萄糖氧化酶和吲哚一起加入到23ml乙酸乙酯与2ml超纯水的混合溶液中进行合成反应，反应温度为30℃，加入介体钙离子，使用磁力搅拌器在转速150r/min下搅拌反应，反应时间是24h。反应结束后，反应体系已经变干，加入2mL乙醇复溶，震荡摇匀，过滤后即得到成品。成品用HPLC检测，鉴定为靛玉红，如图1～7所示。所述靛玉红的产率为73.6％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种氧化酶制备具有抗肿瘤活性的靛玉红的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤(a)、将吲哚溶于双水相体系，以氧化酶为催化剂进行合成反应；
步骤(b)、合成反应结束后用乙醇复溶，过滤后即得具有抗肿瘤活性的靛玉红。
2.根据权利要求1所述的一种氧化酶制备具有抗肿瘤活性的靛玉红的方法，其特征在于：步骤(a)中所述的氧化酶是葡萄糖氧化酶、血浆铜蓝蛋白中的一种或数种。
3.根据权利要求1所述的一种氧化酶制备具有抗肿瘤活性的靛玉红的方法，其特征在于：步骤(a)中所述双水相为有机相-水相，所述有机相是乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、乙腈中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种氧化酶制备具有抗肿瘤活性的靛玉红的方法，其特征在于：步骤(a)中所述的反应条件为反应温度是20～60℃，加入介体钙离子，反应时间是6～36h。
5.根据权利要求1所述的一种氧化酶制备具有抗肿瘤活性的靛玉红的方法，其特征在于：步骤(b)中加入的乙醇与步骤(a)中的底物吲哚按照体积质量比以mL/mg计为2:25。
6.根据权利要求2所述的一种氧化酶制备具有抗肿瘤活性的靛玉红的方法，其特征在于：所述葡萄糖氧化酶采用如下方法制备得到，以黑曲霉A9为发酵菌株，采用10L发酵罐生产葡萄糖氧化酶，发酵四天，得菌丝体，经过破壁，缓冲液提取，获得胞内葡萄糖氧化酶的粗酶液，然后经超滤浓缩、硫酸铵盐析、Sephadex G-25脱盐、DEAE-纤维素离子交换层析及Sephadex G-100凝胶层析进行分离纯化，以PAGE电泳检测其纯度，获得电泳纯的葡萄糖氧化酶。
7.根据权利要求2所述的一种氧化酶制备具有抗肿瘤活性的靛玉红的方法，其特征在于：所述血浆铜蓝蛋白采用如下方法制备得到，以人血清为原材料，经稀释、正丁醇脱脂、超滤、硫酸铵分级沉淀获得粗酶液，进一步经过DEAE-琼脂糖离子交换柱层析，羟基磷灰石层析，Superdex-200凝胶过滤纯化，以SDS-PAGE和等电聚焦电泳检测其纯度，获得电泳纯的铜蓝蛋白。
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