CN108486023B

CN108486023B - 一种产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株及其构建方法与应用

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Publication number: CN108486023B
Application number: CN201810191388.6A
Authority: CN
Inventors: 汪仁; 李宜奎; 钱彬彬; 李洁; 李晓丹; 徐晟�; 夏冰
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2018-03-08
Filing date: 2018-03-08
Publication date: 2020-12-22
Anticipated expiration: 2038-03-08
Also published as: CN108486023A

Abstract

本发明涉及一种产生p‑羟基肉桂酸的基因工程菌株及其构建方法与应用。所述产生p‑羟基肉桂酸的基因工程菌株可以以葡萄糖为原料发酵生产p‑羟基肉桂酸，工艺简单，效率高，成本低，能够克服植物提取法所面临的植物资源生长周期长、与中草药竞争资源、产物收率低及原生生境含量受环境影响大等问题，能够克服化学合成法所面临的高能耗、低产率及污染环境等问题。利用所述产生p‑羟基肉桂酸的基因工程菌株，p‑羟基肉桂酸的产量达到100‑600mg/L。本发明对p‑羟基肉桂酸的工业化生产和大规模应用具有重大意义。

Description

一种产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程和化合物生物技术生产领域；更具体地，本发明涉及一种产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株及其构建方法与应用。

背景技术

p-羟基肉桂酸(又名:对-羟基肉桂酸、对-香豆酸；CAS号:7400-08-0)是一种具有重要应用价值的芳香型化合物，被广泛用于医药、农业、化妆品、食品、化工和生物新型材料。

在医药领域，p-羟基肉桂酸用于合成祛痰药杜鹃素、冠心病治疗药物可心定、抗肾上腺素药艾司洛尔以及局部麻醉剂、杀菌剂和止血药等；最近研究发现，p-羟基肉桂酸具有抑制结肠癌、抗焦虑、解除镉致肾毒性、保护神经的作用。p-羟基肉桂酸在预防心血管疾病方面也发挥着重要的作用，在糖尿病和高血脂等病症上也有着潜在的治疗活性。

在农业领域，p-羟基肉桂酸用于生产植物生长促进剂、长效杀菌剂和果蔬保鲜防腐剂。

在化妆品领域，p-羟基肉桂酸可以抑制黑色素的生成，用于美白剂。

在化工领域，p-羟基肉桂酸是很重要的香精香料，不仅用于食用香料，而且用于配制日化品香精(如香皂和化妆品)；另外，p-羟基肉桂酸还是一种强效的导电材料，近年已经应用于环境可降解的高性能新型材料工业(如液晶显示器)。

p-羟基肉桂酸还是很多具有重要生物活性的植物次级代谢产物的前体物质，如白藜芦醇、柚皮素、花青素、儿茶素等具有更高附加值的黄酮类、芪类天然产物。

作为一个多功能的药效基团和平台化合物，p-羟基肉桂酸具有广泛的应用和需求。

目前，p-羟基肉桂酸的主要来源是植物提取和化学合成。p-羟基肉桂酸广泛存在于自然界植物中，尤其白花蛇舌草、海金沙草、杜仲叶等中草药中。p-羟基肉桂酸的植物提取面临植物资源生长周期长、与中草药竞争资源、产物收益率低及原生生境含量受环境影响大等问题，而p-羟基肉桂酸的化学合成则面临高能耗、低产率及污染环境等问题，影响了p-羟基肉桂酸的大规模应用。

因此，开发一种新型的p-羟基肉桂酸高产菌株，简化生产工艺，提高合成效率，降低生产成本，对p-羟基肉桂酸的应用具有重要的实践意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株。

所述的产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株具体为包含有下述核苷酸序列：

(1)编码序列表中SEQ ID No.:1所示氨基酸序列的多核苷酸序列；或编码与SEQID No.:1所示氨基酸序列具有90％以上一致性且具有相同功能的蛋白质的多核苷酸序列；

(2)编码序列表中SEQ ID No.:2所示氨基酸序列的多核苷酸序列；或编码与SEQID No.:2所示氨基酸序列具有95％以上一致性且具有相同功能的蛋白质的多核苷酸序列；

(3)编码序列表中SEQ ID No.:3所示氨基酸序列的多核苷酸序列；或编码与SEQID No.:3所示氨基酸序列具有90％以上一致性且具有相同功能的蛋白质的多核苷酸序列；

(4)序列表中SEQ ID No.:4所示的核苷酸序列；

具体的，所述的产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株具有包含有上述核苷酸序列的DNA片段的表达构建物；

所述的表达构建物可以是装配到出发菌株的基因组上，也可以是装配到能够在出发菌株细胞中存在的质粒上；

所述的出发菌株为细菌和真菌；具体的，所述的出发菌株为内源存在苯丙氨酸和(或)其生物合成前体物质的细菌和真菌；

优选的，所述的产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株包含有下述表达构建物：在出发载体pACYC184的多克隆位点装配有包含(1)所述核苷酸序列的DNA片段所得的表达构建物；在出发载体pET29a的多克隆位点装配有包含(2)和(3)所述核苷酸序列的DNA片段所得的表达构建物；在出发载体pCL1920的多克隆位点装配有包含(4)所述核苷酸序列的DNA片段所得的表达构建物。

本发明的又一目的在于提供上述产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株的构建方法，具体方法为：

①以拟南芥cDNA为模板，扩增SEQ ID No.:1(NCBI-Protein ID:NP_181241)的编码基因PAL，装配至出发载体pACYC184，转化出发菌株，构建L-苯丙氨酸生物合成反式肉桂酸的代谢路径，所述基因PAL表达的是苯丙氨酸脱氨酶(phenylalanine ammonia lyase)；

②以拟南芥cDNA为模板，扩增SEQ ID No.:2(NCBI-Protein ID:NP_180607)的编码基因C4H和SEQ ID No.:3(NCBI-Protein ID:NP_194750)的编码基因CPR，装配至出发载体pET29a，转化出发菌株，构建反式肉桂酸生物合成p-羟基肉桂酸的代谢路径，所述基因C4H和基因CPR表达的分别是反式肉桂酸-4-羟化酶(trans-cinnamate-4-hydroxylase)和细胞色素P450还原酶(cytochrome P450reductase)；

③以大肠杆菌基因组为模板，扩增SEQ ID No.:4所示序列，装配至出发载体pCL1920，转化出发菌株，下调吡啶核苷酸转氢酶SthA的表达；

所述出发菌株为带有T7RNA聚合酶的细菌和真菌；

优选的，所述出发菌株为带有T7RNA聚合酶的大肠杆菌。

本发明的又一目的在于提供上述产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株的用途，用于生产p-羟基肉桂酸。

本发明的又一目的在于提供上述产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株生产p-羟基肉桂酸的方法。所述方法包括下述步骤：

(i)种子培养：活化所述产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株，后接种至装有30mL种子培养基的250mL三角瓶中，于36-38℃，100-220rpm摇床培养10-24h；

(ii)发酵培养：以5-10％的接种量将步骤(i)的种子培养物接种至装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，25-38℃，150-250rpm进行发酵培养，通过移液器补加氨水维持pH在6.8-7.2，补加80％(m/v)葡萄糖溶液维持菌株的生长与p-羟基肉桂酸的生产，发酵周期24-72h，即得。

上述步骤(ii)所得p-羟基肉桂酸的产量可达到100-600mg/L。

上述p-羟基肉桂酸的制备方法所得发酵液中p-羟基肉桂酸的检测方法为：取发酵液1mL于4℃冻融，加入等体积的甲醇，振荡混匀。室温下，12000rpm，离心5min。取上清用0.22μm孔径滤膜过滤，滤液上样高效液相色谱仪(HPLC)进行分析测定p-羟基肉桂酸的含量；检测条件为：色谱柱为Shimadzu InertSustain C18(5μm,4.6*250mm)；流动相A为1.3％冰醋酸水溶液，流动相B为乙腈；时间程序(B泵)为0-20min，5％-100％，20-20.5min，100％-5％，20.5-30min，100％；流速为1mL/min；柱温为35℃；进样量为20μL；紫外检测波长为309nm；保留时间为12.109min。

优选的，所述种子培养基成分为(1L)：2-20g酵母蛋白胨，1-10g酵母提取物，1-8gKH₂PO₄，2-10g K₂HPO₄，1-7g(NH₄)₂HPO₄，0.1-2g MgSO₄，10-50g葡萄糖。

优选的，所述种子培养基成分为(1L)：10g酵母蛋白胨，5g酵母提取物，3.5gKH₂PO₄，5g K₂HPO₄，3.5g(NH₄)₂HPO₄，0.6g MgSO₄，20g葡萄糖。

优选的，所述发酵培养基成分为(1L)：2-8g KH₂PO₄，4-10g K₂HPO₄，2-7g(NH₄)₂HPO₄，1-4g柠檬酸，0.1-1.2g MgSO₄，0-10g酵母提取物，20-50g葡萄糖，1-20mL微量元素溶液；其中，微量元素溶液的成分为(1L)：1-10mM HCl，5-20g FeSO₄·7H₂O，1-5g ZnSO₄·7H₂O，0.2-3g CuSO₄·5H₂O，0.1-2g MnSO₄·5H₂O，0.1-1g Na₂B₄O₇·10H₂O，1-5g CaCl₂·2H₂O，0.05-0.2g(NH₄)₆MO₇O₂₄。

优选的，所述发酵培养基成分为(1L)：3.5g KH₂PO₄，5g K₂HPO₄，3.5g(NH₄)₂HPO₄，1.92g柠檬酸，0.6g MgSO₄，1g酵母提取物，30g葡萄糖，10mL微量元素溶液；其中，微量元素溶液的成分为(1L)：5mM HCl，10g FeSO₄·7H₂O，2.25g ZnSO₄·7H₂O，1g CuSO₄·5H₂O，0.5gMnSO₄·5H₂O，0.23g Na₂B₄O₇·10H₂O，2g CaCl₂·2H₂O，0.1g(NH₄)₆MO₇O₂₄。

上述培养基均可采用标准方法制备获得。

本发明的有益效果是：

上述产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株是通过合理的基因工程手段构建得到的一株以葡萄糖为碳源直接发酵生产p-羟基肉桂酸的工程菌株；在常规发酵条件下发酵24-72h，所述产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株发酵液中能够积累大量的p-羟基肉桂酸；与植物提取法和化学合成法相比，所述产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株发酵生产p-羟基肉桂酸的方法成本低、条件简单、操作简便和生产效率较高，且绝大部分产物分泌至胞外，便于产物的下游纯化分离。因此，本发明对p-羟基肉桂酸的工业化生产和大规模应用具有重大意义。

附图说明

图1是p-羟基肉桂酸标准品的液相色谱图。

图2是产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株发酵液的液相色谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例并附图，进一步阐述本发明。

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1、苯丙氨酸脱氨酶表达构建物的获得

(1)合成分别具有序列表中SEQ ID No.:5和SEQ ID No.:6核苷酸序列的两条引物，以拟南芥的cDNA为模板进行PCR扩增，获得具有包含编码SEQ ID No.:1所示序列的核苷酸序列的DNA片段。DNA聚合酶选用南京诺唯赞生物科技有限公司的

Super-Fidelity DNA聚合酶。PCR扩增程序为：95℃5min；94℃45s,56℃45s，72℃3.5min，共30个循环；72℃10min，降至10℃。

(2)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测、分离。在紫外灯照射下，切下目标DNA条带。然后采用多功能DNA纯化试剂盒(离心柱型)(北京百泰克生物技术有限公司)从琼脂糖凝胶中回收扩增出的具有含有编码SEQ ID No.:1所示序列的多核苷酸序列的DNA片段。

(3)回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pACYC184载体NcoI和EcoRI酶切位点两侧同源的序列。利用NcoI和EcoRI限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pACYC184载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将所得的DNA片段导入pACYC184载体的NcoI和EcoRI酶切位点之间，通过菌落PCR验证获得阳性转化子。通过测序进一步验证所得的表达构建物pACYC-PAL构建成功，并具有含有编码SEQ ID No.:1所示序列的多核苷酸序列的DNA片段。

实施例2、反式肉桂酸-4-羟化酶表达构建物的获得

(1)合成分别具有序列表中SEQ ID No.:7和SEQ ID No.:8核苷酸序列的两条引物。在合成的引物SEQ ID No.:7和SEQ ID No.:8的5’-端分别设置NdeI和XhoI两个酶切位点及其保护碱基序列，以拟南芥的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增程序同实施例1。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、分离、切胶回收后经NdeI和XhoI双酶切，利用宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)的T4 DNA连接酶连接同样经NdeI和XhoI双酶切的pET29a载体(Novagen)中。连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)感受态细胞，并涂布于添加25μg/mL卡那霉素的LB平板上。通过菌落PCR验证获得阳性转化子。通过测序进一步验证所得的表达构建物pET29a-NdeI-AtC4H-XhoI构建成功，并在NdeI和XhoI酶切位点之间具有含有编码SEQ ID No.:2所示序列的多核苷酸序列的DNA片段。所获得的表达构建物命名为pET-AtC4H。

(2)合成分别具有序列表中SEQ ID No.:9和SEQ ID No.:10核苷酸序列的两条引物。在合成的引物SEQ ID No.:9和SEQ ID No.:10的5’-端分别设置NdeI和XhoI两个酶切位点及其保护碱基序列，以拟南芥的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增程序同实施例1。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、分离、切胶回收后经NdeI和XhoI双酶切，利用T4 DNA连接酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))连接同样经NdeI和XhoI双酶切的pET29a载体(Novagen)中。连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)感受态细胞，并涂布于添加卡那霉素(终浓度为25μg/mL)的LB平板上。通过菌落PCR验证获得阳性转化子。测序进一步验证所得的表达构建物pET29a-NdeI-AtC4H(ΔN28)-XhoI构建成功，并在NdeI和XhoI酶切位点之间具有含有编码SEQ ID No.:2所示序列中29-505位氨基酸序列的多核苷酸序列的DNA片段。所获得的表达构建物命名为pET-AtC4H(ΔN28)。

(3)合成分别具有序列表中SEQ ID No.:11和SEQ ID No.:12核苷酸序列的两条引物，以拟南芥的cDNA为模板进行PCR扩增，获得具有包含编码SEQ ID No.:3所示序列的核苷酸序列的DNA片段。PCR扩增程序同实施例1。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-AtC4H载体NdeI酶切位点两侧同源的序列。利用NdeI限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-AtC4H载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将所得的DNA片段导入pET-AtC4H载体的NdeI酶切位点中，通过菌落PCR验证获得阳性转化子。通过测序进一步验证所得的表达构建物pET-CPR-AtC4H构建成功，并具有含有编码SEQ ID No.:2和SEQ ID No.:3所示序列的多核苷酸序列的DNA片段。

(4)合成分别具有序列表中SEQ ID No.:13和SEQ ID No.:14核苷酸序列的两条引物，以拟南芥的cDNA为模板进行PCR扩增，获得具有包含编码SEQ ID No.:3所示序列中75-711位氨基酸序列的核苷酸序列的DNA片段。PCR扩增程序同实施例1。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET-AtC4H(ΔN28)载体NdeI酶切位点两侧同源的序列。利用NdeI限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pET-AtC4H(ΔN28)载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将所得的DNA片段导入pET-AtC4H(ΔN28)载体的NdeI酶切位点中，通过菌落PCR验证获得阳性转化子。通过测序进一步验证所得的表达构建物pET-CPR(ΔN74)-AtC4H(ΔN28)构建成功，并具有含有编码SEQ ID No.:2所示序列中29-505位氨基酸序列和SEQ ID No.:3所示序列中75-711位氨基酸序列的多核苷酸序列的DNA片段。

实施例3、下调吡啶核苷酸转氢酶SthA表达的表达构建物的获得

(1)合成分别具有序列表中SEQ ID No.:15和SEQ ID No.:16核苷酸序列的两条引物。以大肠杆菌基因组为模板进行PCR扩增，获得具有包含SEQ ID No.:4所示多核苷酸序列的DNA片段。PCR扩增程序同实施例1。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收。回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pCL1920载体EcoRI酶切位点两侧同源的序列。

(2)利用EcoRI限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa))将pCL1920载体线性化。利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将所得的DNA片段导入pCL1920载体的EcoRI酶切位点中，通过菌落PCR验证获得阳性转化子。通过测序进一步验证所得的表达构建物pCL-anti(sthA)构建成功，并具有包含SEQ ID No.:4所示多核苷酸序列的DNA片段。

实施例4、产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株的构建

将表达构建物pACYC-PAL、pET-CPR(ΔN74)-AtC4H(ΔN28)和pCL-anti(sthA)共同转化进入大肠杆菌BL21(DE3)细胞，获得产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株。

实施例5、产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株发酵生产p-羟基肉桂酸

(1)用完全培养基活化产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株，37℃培养24h；

(2)挑取单克隆接种至装有30mL种子培养基的250mL三角瓶中，于37℃，200rpm振荡培养20h；

(3)按8％的接种量接种至装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，于37℃、240rpm进行培养；待菌株生长至600nm波长下吸光度为0.6-0.8时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(终浓度为0.1mmol/L)进行蛋白的诱导和p-羟基肉桂酸的生产，温度为25℃；

(4)利用移液器向发酵液中补加氨水维持其pH在6.8-7.2，补加80％(m/v)葡萄糖溶液维持菌株的生长与p-羟基肉桂酸的生产，发酵周期48h；

(5)移取发酵液1mL，加入等体积的甲醇，振荡混匀，并于室温下12000rpm离心5min，取上清用0.22μm孔径滤膜过滤；

(6)滤液用去离子水稀释后上样Shimadzu 20AT高效液相色谱仪(HPLC)进行分析测定p-羟基肉桂酸的含量，检测条件为：色谱柱为Shimadzu InertSustain C18(5μm,4.6*250mm)；流动相A为1.3％冰醋酸水溶液，流动相B为乙腈；时间程序(B泵)为0-20min，5％-100％，20-20.5min，100％-5％，20.5-30min，100％；流速为1mL/min；柱温为35℃；进样量为20μL；紫外检测波长为309nm；保留时间为12.109min。

(7)p-羟基肉桂酸标准品和发酵液的检测结果分别如图1和图2所示，发酵液中的p-羟基肉桂酸含量为500mg/L。

种子培养基成分为：10g酵母蛋白胨，5g酵母提取物，3.5g KH₂PO₄，5g K₂HPO₄，3.5g(NH₄)₂HPO₄，0.6g MgSO₄，20g葡萄糖，用去离子水定容到1L。

发酵培养基成分为：3.5g KH₂PO₄，5g K₂HPO₄，3.5g(NH₄)₂HPO₄，1.92g柠檬酸，0.6gMgSO₄，1g酵母提取物，30g葡萄糖，10mL微量元素溶液，用去离子水定容到1L；其中，微量元素溶液的成分为(1L)：5mM HCl，10g FeSO₄·7H₂O，2.25g ZnSO₄·7H₂O，1g CuSO₄·5H₂O，0.5g MnSO₄·5H₂O，0.23g Na₂B₄O₇·10H₂O，2g CaCl₂·2H₂O，0.1g(NH₄)₆MO₇O₂₄。

实施例6、产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株发酵生产p-羟基肉桂酸

(2)挑取单克隆接种至装有30mL种子培养基的250mL三角瓶中，于36℃，100rpm振荡培养10h；

(3)按5％的接种量接种至装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，于25℃、150rpm进行培养；待菌株生长至600nm波长下吸光度为0.6-0.8时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(终浓度为0.1mmol/L)进行蛋白的诱导和p-羟基肉桂酸的生产，温度为25℃；

(4)利用移液器向发酵液中补加氨水维持其pH在6.8-7.2，补加80％(m/v)葡萄糖溶液维持菌株的生长与p-羟基肉桂酸的生产，发酵周期24h；

(6)滤液用去离子水稀释后上样Shimadzu 20AT高效液相色谱仪(HPLC)进行分析测定p-羟基肉桂酸的含量，检测条件为：色谱柱为Shimadzu InertSustain C18(5μm,4.6*250mm)；流动相A为1.3％冰醋酸水溶液，流动相B为乙腈；时间程序(B泵)为0-20min，5％-100％，20-20.5min，100％-5％，20.5-30min，100％；流速为1mL/min；柱温为35℃；进样量为20μL；紫外检测波长为309nm；保留时间为11.87min。

(7)发酵液中的p-羟基肉桂酸含量为100mg/L。

种子培养基成分为：2g酵母蛋白胨，1g酵母提取物，1g KH₂PO₄，2g K₂HPO₄，1g(NH₄)₂HPO₄，0.1g MgSO₄，10g葡萄糖，用去离子水定容到1L。

发酵培养基成分为：2g KH₂PO₄，4g K₂HPO₄，2g(NH₄)₂HPO₄，1g柠檬酸，0.1g MgSO₄，20g葡萄糖，1mL微量元素溶液，用去离子水定容到1L；其中，微量元素溶液的成分为(1L)：1mM HCl，5g FeSO₄·7H₂O，1g ZnSO₄·7H₂O，0.2g CuSO₄·5H₂O，0.1g MnSO₄·5H₂O，0.1gNa₂B₄O₇·10H₂O，1g CaCl₂·2H₂O，0.05g(NH₄)₆MO₇O₂₄。

实施例7、产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株发酵生产p-羟基肉桂酸

(2)挑取单克隆接种至装有30mL种子培养基的250mL三角瓶中，于38℃，220rpm振荡培养24h；

(3)按10％的接种量接种至装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，于38℃、250rpm进行培养；待菌株生长至600nm波长下吸光度为0.6-0.8时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(终浓度为0.1mmol/L)进行蛋白的诱导和p-羟基肉桂酸的生产，温度为38℃；

(4)利用移液器向发酵液中补加氨水维持其pH在6.8-7.2，补加80％(m/v)葡萄糖溶液维持菌株的生长与p-羟基肉桂酸的生产，发酵周期72h；

(7)发酵液中的p-羟基肉桂酸含量为600mg/L。

种子培养基成分为：20g酵母蛋白胨，10g酵母提取物，8g KH₂PO₄，10g K₂HPO₄，7g(NH₄)₂HPO₄，2g MgSO₄，50g葡萄糖，用去离子水定容到1L。

发酵培养基成分为：8g KH₂PO₄，10g K₂HPO₄，7g(NH₄)₂HPO₄，4g柠檬酸，1.2gMgSO₄，10g酵母提取物，50g葡萄糖，20mL微量元素溶液，用去离子水定容到1L；其中，微量元素溶液的成分为(1L)：10mM HCl，20g FeSO₄·7H₂O，5g ZnSO₄·7H₂O，3g CuSO₄·5H₂O，2g MnSO₄·5H₂O，1g Na₂B₄O₇·10H₂O，5g CaCl₂·2H₂O，0.2g(NH₄)₆MO₇O₂₄。

可见，针对背景技术中所述问题，本发明提供了一种能够产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株；所述基因工程菌株是具有包含编码来源于拟南芥的苯丙氨酸脱氨酶、反式肉桂酸-4-羟化酶和细胞色素P450还原酶的多核苷酸序列的DNA片段，具有包含SEQ ID No.:4所示的多核苷酸序列的DNA片段。在上述基因型的共同作用下，该产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株可以以葡萄糖为原料发酵生产p-羟基肉桂酸，工艺简单，效率高，成本低，能够克服植物提取法所面临的植物资源生长周期长、与中草药竞争资源、产物收率低及原生生境含量受环境影响大等问题，能够克服化学合成法所面临的高能耗、低产率及污染环境等问题。

应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏好性，本领域技术人员可以根据需要使用合适特定物种表达的密码子组合，合成具有包含编码SEQ ID No.:1、SEQID No.:2和SEQ ID No.:3的多核苷酸序列和包含SEQ ID No.:4所示的多核苷酸序列的DNA片段，构建相应的表达构建物，获得产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株。

上述参照具体实施方式是对该一种产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株及其构建方法与应用所进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例；因此，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修饰，在不脱离本发明总体构思下的变化和修改同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 江苏省中国科学院植物研究所

<120> 一种产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株及其构建方法与应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 725

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

Met Glu Ile Asn Gly Ala His Lys Ser Asn Gly Gly Gly Val Asp Ala

1 5 10 15

Met Leu Cys Gly Gly Asp Ile Lys Thr Lys Asn Met Val Ile Asn Ala

20 25 30

Glu Asp Pro Leu Asn Trp Gly Ala Ala Ala Glu Gln Met Lys Gly Ser

35 40 45

His Leu Asp Glu Val Lys Arg Met Val Ala Glu Phe Arg Lys Pro Val

50 55 60

Val Asn Leu Gly Gly Glu Thr Leu Thr Ile Gly Gln Val Ala Ala Ile

65 70 75 80

Ser Thr Ile Gly Asn Ser Val Lys Val Glu Leu Ser Glu Thr Ala Arg

85 90 95

Ala Gly Val Asn Ala Ser Ser Asp Trp Val Met Glu Ser Met Asn Lys

100 105 110

Gly Thr Asp Ser Tyr Gly Val Thr Thr Gly Phe Gly Ala Thr Ser His

115 120 125

Arg Arg Thr Lys Asn Gly Val Ala Leu Gln Lys Glu Leu Ile Arg Phe

130 135 140

Leu Asn Ala Gly Ile Phe Gly Ser Thr Lys Glu Thr Ser His Thr Leu

145 150 155 160

Pro His Ser Ala Thr Arg Ala Ala Met Leu Val Arg Ile Asn Thr Leu

165 170 175

Leu Gln Gly Phe Ser Gly Ile Arg Phe Glu Ile Leu Glu Ala Ile Thr

180 185 190

Ser Phe Leu Asn Asn Asn Ile Thr Pro Ser Leu Pro Leu Arg Gly Thr

195 200 205

Ile Thr Ala Ser Gly Asp Leu Val Pro Leu Ser Tyr Ile Ala Gly Leu

210 215 220

Leu Thr Gly Arg Pro Asn Ser Lys Ala Thr Gly Pro Asn Gly Glu Ala

225 230 235 240

Leu Thr Ala Glu Glu Ala Phe Lys Leu Ala Gly Ile Ser Ser Gly Phe

245 250 255

Phe Asp Leu Gln Pro Lys Glu Gly Leu Ala Leu Val Asn Gly Thr Ala

260 265 270

Val Gly Ser Gly Met Ala Ser Met Val Leu Phe Glu Thr Asn Val Leu

275 280 285

Ser Val Leu Ala Glu Ile Leu Ser Ala Val Phe Ala Glu Val Met Ser

290 295 300

Gly Lys Pro Glu Phe Thr Asp His Leu Thr His Arg Leu Lys His His

305 310 315 320

Pro Gly Gln Ile Glu Ala Ala Ala Ile Met Glu His Ile Leu Asp Gly

325 330 335

Ser Ser Tyr Met Lys Leu Ala Gln Lys Leu His Glu Met Asp Pro Leu

340 345 350

Gln Lys Pro Lys Gln Asp Arg Tyr Ala Leu Arg Thr Ser Pro Gln Trp

355 360 365

Leu Gly Pro Gln Ile Glu Val Ile Arg Tyr Ala Thr Lys Ser Ile Glu

370 375 380

Arg Glu Ile Asn Ser Val Asn Asp Asn Pro Leu Ile Asp Val Ser Arg

385 390 395 400

Asn Lys Ala Ile His Gly Gly Asn Phe Gln Gly Thr Pro Ile Gly Val

405 410 415

Ser Met Asp Asn Thr Arg Leu Ala Ile Ala Ala Ile Gly Lys Leu Met

420 425 430

Phe Ala Gln Phe Ser Glu Leu Val Asn Asp Phe Tyr Asn Asn Gly Leu

435 440 445

Pro Ser Asn Leu Thr Ala Ser Arg Asn Pro Ser Leu Asp Tyr Gly Phe

450 455 460

Lys Gly Ala Glu Ile Ala Met Ala Ser Tyr Cys Ser Glu Leu Gln Tyr

465 470 475 480

Leu Ala Asn Pro Val Thr Ser His Val Gln Ser Ala Glu Gln His Asn

485 490 495

Gln Asp Val Asn Ser Leu Gly Leu Ile Ser Ser Arg Lys Thr Ser Glu

500 505 510

Ala Val Asp Ile Leu Lys Leu Met Ser Thr Thr Phe Leu Val Ala Ile

515 520 525

Cys Gln Ala Val Asp Leu Arg His Leu Glu Glu Asn Leu Arg Gln Thr

530 535 540

Val Lys Asn Thr Val Ser Gln Val Ala Lys Lys Val Leu Thr Thr Gly

545 550 555 560

Val Asn Gly Glu Leu His Pro Ser Arg Phe Cys Glu Lys Asp Leu Leu

565 570 575

Lys Val Val Asp Arg Glu Gln Val Tyr Thr Tyr Ala Asp Asp Pro Cys

580 585 590

Ser Ala Thr Tyr Pro Leu Ile Gln Lys Leu Arg Gln Val Ile Val Asp

595 600 605

His Ala Leu Ile Asn Gly Glu Ser Glu Lys Asn Ala Val Thr Ser Ile

610 615 620

Phe His Lys Ile Gly Ala Phe Glu Glu Glu Leu Lys Ala Val Leu Pro

625 630 635 640

Lys Glu Val Glu Ala Ala Arg Ala Ala Tyr Asp Asn Gly Thr Ser Ala

645 650 655

Ile Pro Asn Arg Ile Lys Glu Cys Arg Ser Tyr Pro Leu Tyr Arg Phe

660 665 670

Val Arg Glu Glu Leu Gly Thr Glu Leu Leu Thr Gly Glu Lys Val Thr

675 680 685

Ser Pro Gly Glu Glu Phe Asp Lys Val Phe Thr Ala Ile Cys Glu Gly

690 695 700

Lys Ile Ile Asp Pro Met Met Glu Cys Leu Asn Glu Trp Asn Gly Ala

705 710 715 720

Pro Ile Pro Ile Cys

725

<210> 2

<211> 505

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 2

Met Asp Leu Leu Leu Leu Glu Lys Ser Leu Ile Ala Val Phe Val Ala

1 5 10 15

Val Ile Leu Ala Thr Val Ile Ser Lys Leu Arg Gly Lys Lys Leu Lys

20 25 30

Leu Pro Pro Gly Pro Ile Pro Ile Pro Ile Phe Gly Asn Trp Leu Gln

35 40 45

Val Gly Asp Asp Leu Asn His Arg Asn Leu Val Asp Tyr Ala Lys Lys

50 55 60

Phe Gly Asp Leu Phe Leu Leu Arg Met Gly Gln Arg Asn Leu Val Val

65 70 75 80

Val Ser Ser Pro Asp Leu Thr Lys Glu Val Leu Leu Thr Gln Gly Val

85 90 95

Glu Phe Gly Ser Arg Thr Arg Asn Val Val Phe Asp Ile Phe Thr Gly

100 105 110

Lys Gly Gln Asp Met Val Phe Thr Val Tyr Gly Glu His Trp Arg Lys

115 120 125

Met Arg Arg Ile Met Thr Val Pro Phe Phe Thr Asn Lys Val Val Gln

130 135 140

Gln Asn Arg Glu Gly Trp Glu Phe Glu Ala Ala Ser Val Val Glu Asp

145 150 155 160

Val Lys Lys Asn Pro Asp Ser Ala Thr Lys Gly Ile Val Leu Arg Lys

165 170 175

Arg Leu Gln Leu Met Met Tyr Asn Asn Met Phe Arg Ile Met Phe Asp

180 185 190

Arg Arg Phe Glu Ser Glu Asp Asp Pro Leu Phe Leu Arg Leu Lys Ala

195 200 205

Leu Asn Gly Glu Arg Ser Arg Leu Ala Gln Ser Phe Glu Tyr Asn Tyr

210 215 220

Gly Asp Phe Ile Pro Ile Leu Arg Pro Phe Leu Arg Gly Tyr Leu Lys

225 230 235 240

Ile Cys Gln Asp Val Lys Asp Arg Arg Ile Ala Leu Phe Lys Lys Tyr

245 250 255

Phe Val Asp Glu Arg Lys Gln Ile Ala Ser Ser Lys Pro Thr Gly Ser

260 265 270

Glu Gly Leu Lys Cys Ala Ile Asp His Ile Leu Glu Ala Glu Gln Lys

275 280 285

Gly Glu Ile Asn Glu Asp Asn Val Leu Tyr Ile Val Glu Asn Ile Asn

290 295 300

Val Ala Ala Ile Glu Thr Thr Leu Trp Ser Ile Glu Trp Gly Ile Ala

305 310 315 320

Glu Leu Val Asn His Pro Glu Ile Gln Ser Lys Leu Arg Asn Glu Leu

325 330 335

Asp Thr Val Leu Gly Pro Gly Val Gln Val Thr Glu Pro Asp Leu His

340 345 350

Lys Leu Pro Tyr Leu Gln Ala Val Val Lys Glu Thr Leu Arg Leu Arg

355 360 365

Met Ala Ile Pro Leu Leu Val Pro His Met Asn Leu His Asp Ala Lys

370 375 380

Leu Ala Gly Tyr Asp Ile Pro Ala Glu Ser Lys Ile Leu Val Asn Ala

385 390 395 400

Trp Trp Leu Ala Asn Asn Pro Asn Ser Trp Lys Lys Pro Glu Glu Phe

405 410 415

Arg Pro Glu Arg Phe Phe Glu Glu Glu Ser His Val Glu Ala Asn Gly

420 425 430

Asn Asp Phe Arg Tyr Val Pro Phe Gly Val Gly Arg Arg Ser Cys Pro

435 440 445

Gly Ile Ile Leu Ala Leu Pro Ile Leu Gly Ile Thr Ile Gly Arg Met

450 455 460

Val Gln Asn Phe Glu Leu Leu Pro Pro Pro Gly Gln Ser Lys Val Asp

465 470 475 480

Thr Ser Glu Lys Gly Gly Gln Phe Ser Leu His Ile Leu Asn His Ser

485 490 495

Ile Ile Val Met Lys Pro Arg Asn Cys

500 505

<210> 3

<211> 711

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 3

Met Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ser Met Ile Asp Leu Met Ala

1 5 10 15

Ala Ile Ile Lys Gly Glu Pro Val Ile Val Ser Asp Pro Ala Asn Ala

20 25 30

Ser Ala Tyr Glu Ser Val Ala Ala Glu Leu Ser Ser Met Leu Ile Glu

35 40 45

Asn Arg Gln Phe Ala Met Ile Val Thr Thr Ser Ile Ala Val Leu Ile

50 55 60

Gly Cys Ile Val Met Leu Val Trp Arg Arg Ser Gly Ser Gly Asn Ser

65 70 75 80

Lys Arg Val Glu Pro Leu Lys Pro Leu Val Ile Lys Pro Arg Glu Glu

85 90 95

Glu Ile Asp Asp Gly Arg Lys Lys Val Thr Ile Phe Phe Gly Thr Gln

100 105 110

Thr Gly Thr Ala Glu Gly Phe Ala Lys Ala Leu Gly Glu Glu Ala Lys

115 120 125

Ala Arg Tyr Glu Lys Thr Arg Phe Lys Ile Val Asp Leu Asp Asp Tyr

130 135 140

Ala Ala Asp Asp Asp Glu Tyr Glu Glu Lys Leu Lys Lys Glu Asp Val

145 150 155 160

Ala Phe Phe Phe Leu Ala Thr Tyr Gly Asp Gly Glu Pro Thr Asp Asn

165 170 175

Ala Ala Arg Phe Tyr Lys Trp Phe Thr Glu Gly Asn Asp Arg Gly Glu

180 185 190

Trp Leu Lys Asn Leu Lys Tyr Gly Val Phe Gly Leu Gly Asn Arg Gln

195 200 205

Tyr Glu His Phe Asn Lys Val Ala Lys Val Val Asp Asp Ile Leu Val

210 215 220

Glu Gln Gly Ala Gln Arg Leu Val Gln Val Gly Leu Gly Asp Asp Asp

225 230 235 240

Gln Cys Ile Glu Asp Asp Phe Thr Ala Trp Arg Glu Ala Leu Trp Pro

245 250 255

Glu Leu Asp Thr Ile Leu Arg Glu Glu Gly Asp Thr Ala Val Ala Thr

260 265 270

Pro Tyr Thr Ala Ala Val Leu Glu Tyr Arg Val Ser Ile His Asp Ser

275 280 285

Glu Asp Ala Lys Phe Asn Asp Ile Asn Met Ala Asn Gly Asn Gly Tyr

290 295 300

Thr Val Phe Asp Ala Gln His Pro Tyr Lys Ala Asn Val Ala Val Lys

305 310 315 320

Arg Glu Leu His Thr Pro Glu Ser Asp Arg Ser Cys Ile His Leu Glu

325 330 335

Phe Asp Ile Ala Gly Ser Gly Leu Thr Tyr Glu Thr Gly Asp His Val

340 345 350

Gly Val Leu Cys Asp Asn Leu Ser Glu Thr Val Asp Glu Ala Leu Arg

355 360 365

Leu Leu Asp Met Ser Pro Asp Thr Tyr Phe Ser Leu His Ala Glu Lys

370 375 380

Glu Asp Gly Thr Pro Ile Ser Ser Ser Leu Pro Pro Pro Phe Pro Pro

385 390 395 400

Cys Asn Leu Arg Thr Ala Leu Thr Arg Tyr Ala Cys Leu Leu Ser Ser

405 410 415

Pro Lys Lys Ser Ala Leu Val Ala Leu Ala Ala His Ala Ser Asp Pro

420 425 430

Thr Glu Ala Glu Arg Leu Lys His Leu Ala Ser Pro Ala Gly Lys Asp

435 440 445

Glu Tyr Ser Lys Trp Val Val Glu Ser Gln Arg Ser Leu Leu Glu Val

450 455 460

Met Ala Glu Phe Pro Ser Ala Lys Pro Pro Leu Gly Val Phe Phe Ala

465 470 475 480

Gly Val Ala Pro Arg Leu Gln Pro Arg Phe Tyr Ser Ile Ser Ser Ser

485 490 495

Pro Lys Ile Ala Glu Thr Arg Ile His Val Thr Cys Ala Leu Val Tyr

500 505 510

Glu Lys Met Pro Thr Gly Arg Ile His Lys Gly Val Cys Ser Thr Trp

515 520 525

Met Lys Asn Ala Val Pro Tyr Glu Lys Ser Glu Asn Cys Ser Ser Ala

530 535 540

Pro Ile Phe Val Arg Gln Ser Asn Phe Lys Leu Pro Ser Asp Ser Lys

545 550 555 560

Val Pro Ile Ile Met Ile Gly Pro Gly Thr Gly Leu Ala Pro Phe Arg

565 570 575

Gly Phe Leu Gln Glu Arg Leu Ala Leu Val Glu Ser Gly Val Glu Leu

580 585 590

Gly Pro Ser Val Leu Phe Phe Gly Cys Arg Asn Arg Arg Met Asp Phe

595 600 605

Ile Tyr Glu Glu Glu Leu Gln Arg Phe Val Glu Ser Gly Ala Leu Ala

610 615 620

Glu Leu Ser Val Ala Phe Ser Arg Glu Gly Pro Thr Lys Glu Tyr Val

625 630 635 640

Gln His Lys Met Met Asp Lys Ala Ser Asp Ile Trp Asn Met Ile Ser

645 650 655

Gln Gly Ala Tyr Leu Tyr Val Cys Gly Asp Ala Lys Gly Met Ala Arg

660 665 670

Asp Val His Arg Ser Leu His Thr Ile Ala Gln Glu Gln Gly Ser Met

675 680 685

Asp Ser Thr Lys Ala Glu Gly Phe Val Lys Asn Leu Gln Thr Ser Gly

690 695 700

Arg Tyr Leu Arg Asp Val Trp

705 710

<210> 4

<211> 299

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 4

gaattctaac accgtgcgtg ttgactattt tacctctggc ggtgataatg gttgcatcgt 60

aatcgtagga atgtggcatt ttctgttggg ccattgcatt gccactgatt ttccaacata 120

taaaaagaca agcccgaaca gtcgtccggg ctttttttct cgagccaggc atcaaataaa 180

acgataggct cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc 240

tctctactag agtcacactg gctcaccttc gggtgggcct ttctgcgttt ataggtacc 299

<210> 5

<211> 129

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (107)..(129)

<400> 5

ccttgcgtat aatatttgcc catggttgac aattaatcat ccggctcgta taatgtgtgg 60

aattgtgagc ggataacaat tccagatcta aagaggagaa atacatatgg agattaacgg 120

ggcacacaa 129

<210> 6

<211> 191

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (164)..(191)

<400> 6

cctgatgaat gctcatccgg aattctataa acgcagaaag gcccacccga aggtgagcca 60

gtgtgactct agtagagagc gttcaccgac aaacaacaga taaaacgaaa ggcccagtct 120

ttcgactgag cctttcgttt tatttgatgc ctggttactc gagactttat ggtaagaaaa 180

aaacagagga c 191

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (11)..(36)

<400> 7

ggaattccat atggacctcc tcttgctgga gaagtc 36

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (10)..(37)

<400> 8

ccgctcgagt taacagttcc ttggtttcat aacgatt 37

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (11)..(36)

<400> 9

ggaattccat atgaagaaat tgaagctacc tccagg 36

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (10)..(37)

<400> 10

ccgctcgagt taacagttcc ttggtttcat aacgatt 37

<210> 11

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (26)..(49)

<400> 11

actttaagaa ggagatatac atatgtcctc ttcttcttct tcgtcaacc 49

<210> 12

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (50)..(73)

<400> 12

aagacttctc cagcaagagg aggtcaccag aaccagaaga ggtagaaccc catacatctc 60

taagatatct tcc 73

<210> 13

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (26)..(46)

<400> 13

actttaagaa ggagatatac atatgtccgg ttctgggaat tcaaaa 46

<210> 14

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (50)..(73)

<400> 14

aagacttctc cagcaagagg aggtcaccag aaccagaaga ggtagaaccc catacatctc 60

taagatatct tcc 73

<210> 15

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (99)..(120)

<400> 15

ttacccgtct tactgtcggg aattctaaca ccgtgcgtgt tgactatttt acctctggcg 60

gtgataatgg ttgcatcgta atcgtaggaa tgtggcattt tctgttgggc cattgcattg 120

<210> 16

<211> 186

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> primer_bind

<222> (167)..(186)

<400> 16

acgacgttgt aaaacgacgg ccagtggtac ctataaacgc agaaaggccc acccgaaggt 60

gagccagtgt gactctagta gagagcgttc accgacaaac aacagataaa acgaaaggcc 120

cagtctttcg actgagccta tcgttttatt tgatgcctgg ctcgagaaaa aaagcccgga 180

cgactg 186

Claims

1.一种产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株，其特征在于具有包含下述核苷酸序列的DNA片段的表达构建物；

(1)编码序列表中SEQ ID No:1所示氨基酸序列的多核苷酸序列；

(2)编码序列表中SEQ ID No:2所示氨基酸序列的多核苷酸序列；

(3)编码序列表中SEQ ID No:3所示氨基酸序列的多核苷酸序列；

(4)序列表中SEQ ID No:4所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株，其特征在于：所述的表达构建物是装配到出发菌株的基因组上，或是装配到能够在出发菌株细胞中存在的质粒上。

3.权利要求1所述的产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株，其特征在于：所述的出发菌株为内源存在苯丙氨酸和/或苯丙氨酸生物合成前体物质的大肠杆菌。

4.权利要求1所述的产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株，其特征在于包含有下述表达构建物：在出发载体pACYC184的多克隆位点装配有包含(1)所述核苷酸序列的DNA片段所得的表达构建物；在出发载体pET29a的多克隆位点装配有包含(2)和(3)所述核苷酸序列的DNA片段所得的表达构建物；在出发载体pCL1920的多克隆位点装配有包含(4)所述核苷酸序列的DNA片段所得的表达构建物。

5.权利要求4所述的产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株的构建方法，所述的方法包括：

①以拟南芥cDNA为模板，扩增SEQ ID No:1的编码基因PAL，装配至出发载体pACYC184，转化出发菌株，构建L-苯丙氨酸生物合成反式肉桂酸的代谢路径，所述基因PAL表达的是苯丙氨酸脱氨酶(phenylalanine ammonia lyase)；

②以拟南芥cDNA为模板，扩增SEQ ID No:2的编码基因C4H和SEQ ID No:3的编码基因CPR，装配至出发载体pET29a，转化出发菌株，构建反式肉桂酸生物合成p-羟基肉桂酸的代谢路径，所述基因C4H和基因CPR表达的分别是反式肉桂酸-4-羟化酶(trans-cinnamate-4-hydroxylase)和细胞色素P450还原酶(cytochrome P450reductase)；

③以大肠杆菌基因组为模板，扩增SEQ ID No:4所示序列，装配至出发载体pCL1920，转化出发菌株，下调吡啶核苷酸转氢酶SthA的表达；

所述出发菌株为带有T7RNA聚合酶的大肠杆菌。

6.权利要求1所述的产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株的用途，用于生产p-羟基肉桂酸。

7.一种p-羟基肉桂酸生产方法，其特征在于：应用权利要求1所述的产生p-羟基肉桂酸的基因工程菌株生产p-羟基肉桂酸；所述的方法包括：

(ii)发酵培养：以5-10%的接种量将步骤(i)的种子培养物接种至装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，25-38℃，150-250rpm进行发酵培养，通过移液器补加氨水维持pH在6.8-7.2，补加80%(m/v)葡萄糖溶液维持菌株的生长与p-羟基肉桂酸的生产，发酵周期24-72h，即得。

8.权利要求7所述的p-羟基肉桂酸生产方法，其特征在于：所述步骤(i)中的种子培养基成分为：2-20g酵母蛋白胨，1-10g酵母提取物，1-8g KH₂PO₄，2-10g K₂HPO₄，1-7g(NH₄)₂HPO₄，0.1-2g MgSO₄，10-50g葡萄糖，用去离子水定容至1L。

9.权利要求7所述的p-羟基肉桂酸生产方法，其特征在于：所述步骤(ii)中的发酵培养基成分为：2-8g KH₂PO₄，4-10g K₂HPO₄，2-7g (NH₄)₂HPO₄，1-4g柠檬酸，0.1-1.2g MgSO₄，0-10g酵母提取物，20-50g葡萄糖，1-20mL微量元素溶液，用去离子水定容至1L；其中，微量元素溶液的成分为：1-10mM HCl，5-20g FeSO₄·7H₂O，1-5g ZnSO₄·7H₂O，0.2-3g CuSO₄·5H₂O，0.1-2g MnSO₄·5H₂O，0.1-1g Na₂B₄O₇·10H₂O，1-5g CaCl₂·2H₂O，0.05-0.2g (NH₄)₆MO₇O₂₄，用去离子水定容至1L。

10.权利要求7所述的p-羟基肉桂酸生产方法，其特征在于：步骤(ii)中最终p-羟基肉桂酸的产量达到100-600mg/L。