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CN108478880A - 一种纳米羟基磷灰石/壳聚糖多孔复合支架材料及其仿生透析矿化制备方法与应用 - Google Patents

一种纳米羟基磷灰石/壳聚糖多孔复合支架材料及其仿生透析矿化制备方法与应用 Download PDF

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CN108478880A
CN108478880A CN201810315836.9A CN201810315836A CN108478880A CN 108478880 A CN108478880 A CN 108478880A CN 201810315836 A CN201810315836 A CN 201810315836A CN 108478880 A CN108478880 A CN 108478880A
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chitosan
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nano
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CN201810315836.9A
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李立华
李娜
张舒昀
周长忍
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Jinan University
Original Assignee
Jinan University
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Abstract

本发明属于骨组织工程技术领域，公开了一种纳米羟基磷灰石/壳聚糖多孔复合支架材料及其仿生透析矿化制备方法与应用。本发明方法包括以下步骤：(1)将壳聚糖溶于乙酸溶液中，得到壳聚糖溶液；将壳聚糖溶液置于容器中冷冻后，冷冻干燥，得到前期壳聚糖多孔支架；(2)前期壳聚糖多孔支架浸泡于碱液中，水洗至pH7‑8，冷冻干燥，得到壳聚糖多孔支架；(3)把壳聚糖多孔支架浸泡到碱性磷酸酶溶液中，再将壳聚糖多孔支架连同碱性磷酸酶溶液装入透析袋中，置于甘油磷酸钙和CaCl2的混合溶液中，恒温恒速搅拌进行矿化，取出，洗涤，冷冻干燥，得到纳米羟基磷灰石/壳聚糖多孔复合支架材料；可应用于骨组织工程领域中，特别是骨缺损修复中。

Description

一种纳米羟基磷灰石/壳聚糖多孔复合支架材料及其仿生透 析矿化制备方法与应用
技术领域
本发明属于骨组织工程技术领域，特别涉及一种纳米羟基磷灰石/壳聚糖(n-HAP/CS)多孔复合支架材料及其仿生透析矿化制备方法与应用。
背景技术
骨是具备高硬度和一定柔韧性的人体硬器官，由骨膜、骨组织和骨髓组成，具有丰富的血管和神经分布。骨组织的特点是由大量无机钙盐在细胞外基质沉积和有序排列，赋予骨骼一个强有力的组织结构基础。骨是整个人体的支撑体，具有协同身体运动，保护内脏器官的作用，同时也是维持人体内部新陈代谢所需钙磷离子的主要供给库。骨组织中钙含量高达99％，又称钙库。骨内的骨髓还具有强大的造血能力。
骨组织工程支架材料是一种替代医治骨修复和再生的新策略，它是骨组织工程的核心。生物医用材料支架可通过引导细胞行为及功能来促进组织的修复和再生。将骨组织工程技术取代传统的自体骨移植技术、异体骨移植技术和人工骨替代材料技术，适用于大面积的骨损伤和缺损治疗，可以克服供体不足、疾病传播、免疫排斥反应、与宿主骨性能不匹配等缺点。骨组织工程支架材料通常是一种多孔、可降解的生物医用材料
骨基质中的无机矿物成分主要有羟基磷灰石(HAP)和碳氢磷灰石(CHAP)，HAP晶体以针状或片状的形态平行于胶原原纤维的长轴而堆积着。此外，还发现了一定量的无定形磷酸钙(ACP)、磷酸八钙(OCP)和磷酸氢钙(DCP)等其余钙磷盐矿物，这些一般被认为是HAP晶体的前驱体相。天然骨把跨越微米至纳米水平等不同尺度范围内的羟基磷灰石纳米粒子与骨胶原纤维蛋白严密的排列组合成具有多级层次构造和功能不同的骨组织单元。而天然骨能具备如此理想的精细结构和优良的性能，是由骨形成时的生物矿化过程决定的。因此，从生物矿化的角度去合成作为骨组织修复再生材料的人工复合生物医用材料的基本原理就是：将纳米级的钙磷盐均匀的分散到生物大分子基质中，从而合成一种理想的有机-无机复合材料。
生物矿化是指由于生物体(从细胞到有机机体)的介入而生成那些具备特殊结构和组装方式的生物矿物的过程。生物矿化与普通矿化相比，最分明的特征是：在正常条件下，生物矿化过程全程都受到有机基质大分子或超分子来调控，经过有机基质分子和无机物离子在界面处的互相作用，然后从分子水平来调控无机矿物的析出和积淀，最终得到平常矿物无法比拟的生物矿化产物。
生物矿化根据其被生物体调控的形式，可将其分为两种；即：生物控制矿化(Controlled Biomineralization)和生物诱导矿化(Induced Biomineralization)。一种是生物体通过生理活动引起和严格的生物化学过程所控制，在体内结晶生成无机矿物的矿化过程，称为“生物控制矿化”，生物控制矿化作用与生物细胞的新陈代谢和基因控制密切相关；另一种是生物体通过与周围微环境的相互作用，引发生物体外的无机矿物发生二次沉积的过程，称为“生物诱导矿化”。
碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)是一类非特异性磷酸单酯酶，在碱性环境中可水解磷酸单酯化合物，广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织中。成骨细胞内也富含碱性磷酸酶，主要存在于成骨细胞的胞浆中。据报道，碱性磷酸酶能作用于骨的钙化，矿化成核和生长过程中，ALP可通过水解磷酸胆碱和磷酸乙醇胺等产生磷酸盐离子，增加局部磷脂的浓度，由于磷脂与Ca2+有很强的亲和力，使得磷脂和钙离子的浓度同步增加共同沉积于类骨质中，为类骨质钙化成骨提供充足的钙磷盐。可见，ALP在促进类骨质矿化过程中起着重要的作用。
壳聚糖(CS)具有良好的生物相容性、生物安全性、无毒性、无免疫抗原性、无刺激性、可控的降解性和抗菌抑制炎症性等优良性能被广泛关注，在生物医学、化妆品、材料等诸多领域的应用硏究取得了重大进展。壳聚糖在临床上经常被用于制备骨组织工程支架材料，大量的实验研究也证实，CS支架复合细胞或者和细胞因子构建的支架材料在体内具有很好的成骨能力，但壳聚糖用于骨缺损修复时仍有不可忽视的缺点：如(1)机械强度和韧性低；(2)壳聚糖在体内的降解吸收速率与再生组织的生长速率匹配度比较低；(3)与宿主的键合能力较差等等。这些不良因素限制了它在骨组织修复与再生中的应用，常须与其他无机材料复合使用。HAP作为骨组织的主要无机成分，自然而然的成为研究热门方向。
基于以上的研究背景，本发明技术将透析过程引入到体外模拟生物矿化中，利用慢速、温和且深度矿化的矿化方法，发展了一种与以往传统的生物矿化方法不同的全新技术，利用特殊的透析方法以CS作为有机模板，ALP作为诱导剂，以甘油磷酸钙(CGP/Ca-GP)和CaCl2为矿化过程中钙磷源，仿生生物矿化形成具有活性的三维多孔复合支架材料，简称“透析矿化法”。
研究表明，利用“透析矿化法”制备的n-HAP/CS三维多孔复合支架材料与单纯的CS支架相比具有很好的孔洞结构和表面活性，能够有效的促进前前成骨细胞在材料上的粘附和增殖，通过对兔子的股骨缺损动物模型的实验数据得知，通过“透析矿化法”制备的n-HAP/CS多孔复合支架能够有效的促进缺损处的骨愈合情况，是一种较为理想的骨组织工程材料。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的首要目的在于提供一种纳米羟基磷灰石/壳聚糖(n-HAP/CS)多孔复合支架材料的仿生透析矿化制备方法。
本发明另一目的在于提供上述方法制备的纳米羟基磷灰石/壳聚糖多孔复合支架材料。
本发明再一目的在于提供上述纳米羟基磷灰石/壳聚糖(n-HAP/CS)多孔复合支架材料在骨组织工程领域中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种纳米羟基磷灰石/壳聚糖(n-HAP/CS)多孔复合支架材料的仿生透析矿化制备方法，包括以下步骤：
(1)将壳聚糖溶于乙酸溶液中，得到壳聚糖溶液；将壳聚糖溶液置于容器中冷冻后，冷冻干燥，得到前期壳聚糖多孔支架；
(2)前期壳聚糖多孔支架浸泡于碱液中，水洗至pH7-8，冷冻干燥，得到壳聚糖多孔支架；
(3)把壳聚糖多孔支架浸泡到碱性磷酸酶(ALP)溶液中，再将壳聚糖多孔支架连同碱性磷酸酶(ALP)溶液装入透析袋中，置于甘油磷酸钙(CGP)和CaCl2的混合溶液中，恒温恒速搅拌进行矿化，取出，洗涤，冷冻干燥，得到纳米羟基磷灰石/壳聚糖(n-HAP/CS)多孔复合支架材料。
步骤(1)中，所述壳聚糖溶液的浓度优选为3～6wt％，更优选为5wt％。
步骤(1)中，所述乙酸溶液的浓度优选为1～4v/v％，更优选为3v/v％。
步骤(1)中，所述冷冻前优选先静置，待溶液中无气泡再进行冷冻。优选在70℃下冷冻。
步骤(1)中，所述将壳聚糖溶于乙酸溶液中优选为将壳聚糖加入乙酸溶液中，搅拌至均匀；更优选为匀速搅拌，搅拌24h。
步骤(2)中，所述碱液可为碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液或氢氧化钠溶液，优选为氢氧化钠溶液，更优选为5wt％的氢氧化钠溶液。
步骤(2)中，所述浸泡的时间优选为12～72h，更优选为24h。
步骤(3)中，所述碱性磷酸酶溶液的浓度优选为0.2～0.8mg/mL，更优选为0.4mg/mL。
步骤(3)中，所述甘油磷酸钙(CGP)和CaCl2的混合溶液中，GPC和CaCl2溶液的浓度分别为：80～150mmol/L和60～100mmol/L；更优选的，GPC和CaCl2溶液的浓度分别为：110mmol/L和78.8mmol/L。
所述甘油磷酸钙(CGP)和CaCl2的混合溶液中，优选nCa：P＝1.67。本发明以CGP和CaCl2作为外源性的钙磷盐加入，优选控制外源性钙磷盐中的钙磷比为1.67:1，这个比例也是人体骨中钙磷的比例。
所用碱性磷酸酶溶液和，甘油磷酸钙(CGP)和CaCl2的混合溶液的体积比为1:2～1:10，优选为1:5。
步骤(3)中，所述浸泡的时间优选为5～50min，更优选为30min。
步骤(3)中，所述恒温的温度优选为37℃。本发明的透析矿化步骤选择在37℃下进行，以进一步模拟体内环境优化矿化。
步骤(3)中，所述洗涤优选用水和PBA洗涤多次。
步骤(3)中，所述矿化的时间优选为12～72h，更优选为48h。
本发明还提供上述方法制备得到的纳米羟基磷灰石/壳聚糖(n-HAP/CS)多孔复合支架材料。本发明支架材料的机械性能最大压缩模量为0.25～0.44MPa，具有互相连通的孔洞结构，孔径直径为2～500μm，支架材料内部空洞表面均匀分布着大量的羟基磷灰石纳米颗粒。本发明复合材料具有较高的结晶性、较好的生物学性能、降解速率可调、合适的力学性能，具有类似人体骨的内部孔洞结构，能够起到促进骨组织再生的作用，可应用于骨组织工程领域中，特别是骨缺损修复中。
本发明的机理为：
CS作为一种天然生物大分子材料，具有良好的生物相容性、生物安全性、无毒性、无免疫抗原性、无刺激性、可控的降解性和抗菌抑制炎症性等优良性能，在生物医学、化妆品、材料等诸多领域的应用硏究取得了重大进展，同时因其优良的骨引导性，在骨组织工程领域也受到了强烈的关注。但单纯的CS支架也面临着强度和韧性差、降解速率与组织部匹配，与宿主键合能力强稍弱的窘境。本发明，利用“透析矿化法”这种缓慢、温和的矿化方法来模拟体内生物矿化的过程，通过ALP诱导体内钙磷离子在CS有机模板上，原位生成纳米羟基磷灰石颗粒制备了n-HAP/CS多孔复合支架材料。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
(1)单纯的CS支架材料虽然具备CS与生俱来的良好生物学性能，但因其缺乏较好的力学支撑，在组织工程领域中的发展极为受限。本发明将力学性能较好的HAP引入到支架中，能够明显的增强支架材料的机械性能。
(2)单纯的CS支架，降解速率较快，若将其引入到骨缺损治疗中，很容易出现新骨组织未长成而材料过早降解完全，而导致骨缺损愈合重新塌陷的问题，本发明中HAP的引入能够降低材料整体的降解速率，以达到较长时间的支撑。
(3)ALP广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织中，并且能作用于骨的钙化、矿化成核和生长过程中。利用ALP作为诱导来模拟体内的生物矿化具有重要的意义。
(4)“透析矿化法”是一种缓慢、温和且深度的矿化方法，有利于ALP更为完全的诱导环境中的钙磷源以HAP纳米粒子的形式成核、生长并在CS有机模板上聚合。
(5)本发明中以CS作为生物矿化的有机质模板，并添加CaCl2作为额外的钙源，增加了钙磷的摩尔比，更有利于n-HAP的形成。
(6)本发明中选用CS支架为有机模板，不仅是利用了其良好的生物学性能，同时也因为CS支架具有非常高的孔隙度，在深度矿化后n-HAP的沉积虽然会使整体的孔隙率有所下降，但依旧能够保持在95％以上，这一点组织工程支架来说也是非常重要的。
(7)深度矿化后，n-HAP通过TEM表征分析发现HAP晶体呈现纤细的纳米级梭状或者针状，与天然骨质中的纳米羟基磷灰石的结构基本相似。
(8)透析矿化后，与单纯的CS支架相比，材料的表面均匀分布着n-HAP粒子，能够进一步促进细胞的粘附和骨组织的长入。
(9)本发明复合材料制备工艺简单，原料来源丰富，功能全面。
附图说明
图1是n-HAP/CS宏观图。
图2是n-HAP/CS XRD图谱。
图3是n-HAP/CS支架材料SEM图。
图4是n-HAP/CS细胞形态SEM图。
图5是n-HAP/CS细胞增殖图。
图6是动物模型建立流程图。
图7是实验动物的CT扫描图。
图8是组织切片的HE染色显微镜图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。如无特别说明，本发明中所有原料和试剂均为市购常规原料、试剂。
本发明的纳米羟基磷灰石/壳聚糖(n-HAP/CS)多孔复合支架材料其压缩弹性模量0.25-0.44MPa，多孔复合支架材料具有有序和无序纵横交错的小孔结构，所述孔之间有一定的连通性，孔隙率高达95％。
本发明实施例所制备材料的红外谱图，如图1所示；本发明实施例所制备材料的XRD图谱，如图2所示；本发明实施例红外谱图由Equinox 55(德国Bruker公司)测得，XRD图谱由MiniFlex 600(美国Rigaku公司)测得。
实施例1
一种n-HAP多孔复合支架材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取2.5g的壳聚糖粉末溶于50mL 3％(v/v)的乙酸溶液中，匀速搅拌24h，待壳聚糖完全溶解后，得到壳聚糖的最终浓度为5％(Wt)。将壳聚糖溶液用2.5mL的无针注射器加入到96孔板中，每个孔加0.5mL，静置一段时间后，待每个孔中无气泡存在后，将孔板放入70℃冰箱中冷冻结冰，最后低温冷冻干燥，得到前期的壳聚糖多孔支架。将干燥后的支架连同孔板一起浸泡在质量分数为5％的NaOH溶液中24h，用蒸馏水浸泡反复清洗支架多次，直至pH＝7-8左右，再次低温冷冻干燥，得到最后本实验所需的壳聚糖多孔支架。
(2)将上述步骤(1)中得到的CS基体支架材料浸泡在一定浓度的ALP溶液中30min，然后将CS支架和ALP溶液装入透析袋中，密封透析袋两端后，将其放进GPC和CaCl2溶液的混合溶液中，在37℃恒温条件下匀速搅拌，并矿化72h后，完整取出支架，用蒸馏水和PBS洗涤三次后装入96孔板中，重新将孔板放入70℃冰箱中冷冻结冰，经低温冷冻干燥后，得到壳聚糖仿生多孔复合支架。放在干燥环境中，以备后续表征所需。
其中在透析矿化过程中，ALP溶液的浓度分别为0.4mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.01mg/mL，且ALP溶液总量约为25mL。
其中，在矿化过程中CGP和CaCl2作为外源性的钙磷盐引入，其浓度分别为GPC溶液(110mmol/L)和CaCl2(78.8mmol/L)使溶液中的nCa：P＝1.67。
本实施例得到的n-HAP多孔复合支架材料的外观图如图1所示，XRD图谱如图2所示。从矿化支架的宏观图可以看出，矿化后的支架与纯的CS支架在外观上并无太大区别，均呈现乳白色的圆柱体。从图2中可知，矿化72h后样品的晶相组成成分基本相同，随着ALP浓度的的增加，图中26。和32。附近的峰越来越强，在ALP浓度为0.4mg/mL时，对比羟基磷灰石的标准卡片，知其主要为HAP的特征峰；从而可知，此矿化体系能生成HAP晶体与ALP的浓度有关，且当ALP浓度达到0.4mg/mL时，对HAP的形成最为有利。
实施例2
一种n-HAP多孔复合支架材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取2.5g的壳聚糖粉末溶于50mL 3％(v/v)的乙酸溶液中，匀速搅拌24h，待壳聚糖完全溶解后，得到壳聚糖的最终浓度为5％(Wt)。将壳聚糖溶液用2.5mL的无针注射器加入到96孔板中，每个孔加0.5mL，静置一段时间后，待每个孔中无气泡存在后，将孔板放入70℃冰箱中冷冻结冰，最后低温冷冻干燥，得到前期的CS支架。将干燥后的CS支架连同孔板一起浸泡在质量分数为5％的NaOH溶液中24h，用蒸馏水浸泡反复清洗支架多次，直至pH＝7-8左右，再次低温冷冻干燥，得到最后本实验所需的得到矿化的有机模板CS基体支架。
(2)将上述步骤(1)中得到的CS基体支架材料浸泡在浓度为0.4mg/mL的ALP溶液中30min，然后将CS支架和ALP溶液装入透析袋中，密封透析袋两端后，将其放进GPC和CaCl2溶液的混合溶液中，GPC和CaCl2溶液的浓度分别为：110mmol/L和78.8mmol/L，保证混合溶液总体积为250mL,并使溶液中的nCa：P＝1.67。在37℃恒温条件下匀速搅拌，并分别透析24、48、72h后，取出支架，洗涤后将孔板放入70℃冰箱中冷冻结冰，经低温冷冻干燥后，得到n-HAP/CS多孔复合支架材料n-HAP/CS多孔复合支架材料，材料置于干燥环境中，以备后续表征所需。
其中在透析过程中，ALP溶液与外源性的钙磷盐溶液体积比为1：5，以保证透析过程中充足的钙磷盐补充。
其中，对于CS基体支架在37℃下进行孵育的时间不同，以探究不同的透析时间对于CS基体支架材料上的生成与沉积情况。
其中，ALP溶液的浓度为0.4mg/mL是由上述实施例1中得出的最佳浓度。
本实施例得到的n-HAP多孔复合支架材料的SEM观察结果如图3所示。从矿化支架的宏观图可以看出，单纯的CS支架材料呈现内部贯通的多孔结构，有利于细胞及营养物质的迁移和运输。通过深度透析矿化得到的n-HAP多孔复合支架材料具有单纯CS支架原有的三维多孔贯通结构，但支架孔洞更为致密，孔壁变厚且变得粗糙，随着矿化时间的延长，支架的规整性也变差。在高倍的扫描电镜下观察支架材料内部形貌可以发现，CS基体支架表面分布着大量颗粒状的羟基磷灰石纳米颗粒，颗粒分布均匀并呈出现针状或者短棒状，这与天然骨中的羟基磷灰石的存在形态极为相似。同时，观察透析不同时间的n-HAP复合支架材料可以发现，不同透析时间羟基磷灰石纳米粒子呈现不同的存在方式：在透析矿化24h后，羟基磷灰石纳米颗粒在孔道的表面呈花瓣状；透析48h后，呈现毛球状；而矿化72h时，针状的羟基磷灰石纳米网络结构在支架表面出现。虽然不同透析时间，矿化材料中n-HAP的沉积形态不同但总的来说都是连续、均匀、致密的分布在壳聚糖支架的孔壁上。同时矿化时间越长，矿化程度越深入，从表面沿着孔隙慢慢的进入支架内部沉积，说明以壳聚糖为模板和矿化时间都有利于纳米HAP的生成与生长。
实施例3
一种n-HAP多孔复合支架材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)按照上述实施例2中的材料制备方法制备n-HAP/CS复合支架材料，并根据透析时间的不同标记材料为透析24h，透析48h和透析72h。
(2)选取矿化后的支架材料和纯CS支架作为细胞培养实验的研究对象，将支架材料经钴60(辐射强度为15k gy)灭菌后，在超净台上用75％的酒精浸泡30min，PBS冲洗三次待用，取第三代MC3T3-E1细胞，待其密度达到90％以上后，0.25％胰酶消化3分钟后，用2倍体积的完全培养基中止消化，1000r/min离心5min收集细胞后重悬于完全培养基中。将上述处理细胞悬液按1×104细胞/支架的密度接种于每个孔板中各材料上，待细胞粘附30分钟后补充完全培养基，并将其转移至细胞培养箱中。在培养2、4、6、8天后用CCK8测定其OD值，以完成对细胞增殖的检测。
(3)将透析48h矿化支架材料和单纯的CS支架材料制成□6mm×8mm圆柱形，全部单个独立包装，经辐照强度为15k gy的钴60辐照灭菌后，室温干燥密封保存
实验对象选择为新西兰大白兔，将其以侧卧位摆放后肢大腿膝盖上3cm处刮开一道2-3cm的伤口，切开内部筋膜、肌肉钝性，撑开肌肉完全露出股骨后，用6mm的颅骨钻在股骨上快速钻一个6×8mm的孔洞，将材料完整的轻轻的塞进孔洞中，使其跟骨头完美的粘合。
对实验动物在手术后4、8、12周分别进行CT及组织切片的HE染色观察。
本实施例中所用的n-HAP/CS支架材料的宏观形貌如图1所示，其压缩强度透析24h(0.29MPa)，透析48h(0.42MPa)，透析72h(0.44MPa)CS(0.26MPa)。
本实施例中，在动物模型建立与研究中，所选取的材料分别为透析矿化48h的n-HAP/CS复合支架，单纯的CS支架，同时设置只做骨缺损不填充任何材料的空白对照组。
本实施例中，所进行的细胞培养实验研究中，细胞在材料上的粘附和生长状态如图4所示，细胞增值的CCK8测试结果如图5所示。
本实施例中，动物模型建立过程中，对实验对象的手术操作过程如图6所示，对实验研究对象术后观察的CT图如图7所示，组织切片的HE染色如图8所示。
通过对本实施例中，细胞在材料上粘附形态的观察(图4)可知，与单纯的CS支架材料相比，细胞在n-HAP/CS复合支架材料上具有更好的粘附状态，并且与细胞只在CS支架材料表面生长不同的是，细胞在n-HAP/CS复合支架有向材料内部长入的趋势，并且沿着孔洞结构具有一定的趋向性生长。在对细胞的增值探究中(图5)，与纯CS支架材料组相比，随着培养时间的增加，n-HAP/CS符合材料组的细胞活性在一定程度上是增加的；在培养第二天时，材料上细胞的增值情况差异不大，这主要是因为在细胞的种植和培养过程中会有部分细胞未粘附到材料上，导致三组材料总体上粘附细胞的差值很小，当培养至地4天以后，透析组与纯CS组相比，细胞活性显示出明显增加的，但是透析48h和透析72h组与透析24h组相比细胞浓度也显示出一定的差异，说明细胞在n-HAP/CS符合支架上的增值明显忧郁在单纯的CS支架上，同时透析48h和透析72h组与透析24h组相比，细胞的增值要明显高出很多，这主要是因为羟基磷灰石纳米粒子在CS基体支架材料表面的沉积和分布，能够进一步改善多孔支架材料表面的微观结构，构造出孔洞表面上的三维纳米网络结构，有研究表明这种那么密网络结构的存在能够在很大程度上增强细胞在材料上的锚定，更有利于细胞的粘附和增长，同时羟基磷灰石本身就是一种促骨细胞生长的材料。观察透析48h和透析72h两个组分，细胞的增值没有显著差异，这说明，随着矿化时间的增加纳米羟基磷灰石在基体支架材料表面的沉积具有一定的提升，但当透析矿化48h后，矿化时间对材料的影响不大，同时此现象也与图3SEM的电镜结果以及材料的力学性能数据相吻合。
通过对实验研究对象在术后4，8，12周的CT扫描结果来看(图7)，可见透析48h组随着手术时间的延长，骨缺损逐渐愈合，在术后12周，缺损处表面光滑完整，骨质连续性很好，说明骨缺损已完美愈合；纯CS组在术后12周，骨缺损处可见明显的凹陷，骨未愈，但相对于4周时，缺陷有所减小，说明纯CS组在一定程度上也对骨缺损的愈合有帮助；而空白组中，在12week时尚未愈合而且有很明显的缺陷存在，缺陷大小几乎未见骨性联结的出现，这进一步说明了此次动物模型建立的可行性。为了进一步研究n-HAP/CS复合支架材料对股骨骨缺损的修复能力和对诱导新生骨生成的能力，本研究对其进行了进一步的组织学分析(图8)，术后4周，n-HAP/CS与CS组能够清晰的看到材料与宿主结构的界面，这时植入的材料还未降解完全，同时在材料和宿主结构的界面情况来看，透析组与宿主结构的链接更为紧密一点，骨细胞在界面存在的数量也明显较多，这主要是因为HAP的存在不仅能很好的促进骨细胞的生长同时还能够起到比单纯的CS材料更好的支撑作用以达到与缺损边缘的宿主结构更好的紧密连接。术后8周，仍有少量的材料未降解，CS组宿主结构与缺损处存在一定的空隙，而n-HAP/CS组缺损出分布着均匀的骨细胞等其他细胞，这主要是因为羟基磷灰石纳米颗粒在材料表面的均匀分布能够起到降低整个材料讲解速率的作用，同时加固了细胞在材料上的锚定。术后12周，CS组缺损出与宿主结构的空隙依旧存在，但缺损出也表现出明显的骨小梁等新生骨组织的生成，并且与缺损出具有了一定的骨性联结；而n-HAP/CS组缺损出大量的骨小梁等新生骨组织新生成，与宿主结构具有了非常明显的骨性连结，这也与图7中的CT结果相吻合。这是属于正常组织反应，证明了材料具有很好生物相容性。而对于未加任何材料的空白对照组，术后4周可以看到骨缺损出具有一定的塌陷，这是由于缺少支撑导致的，在术后8周和12周，缺损处课件新生组织的长成，但以纤维组织为主，只有很小数量疑似新生骨的组织出现在纤维组织中间，但缺损处与宿主结构的界面之间明显的不存在骨性连结。
本实施例中动物模型的建立，能够进一步的证实通过透析矿化法，不仅能够促进羟基磷灰石纳米粒子在材料内部的均匀沉积和分布，还的的确确能够起到促进骨缺损愈合的作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种纳米羟基磷灰石/壳聚糖多孔复合支架材料的仿生透析矿化制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将壳聚糖溶于乙酸溶液中，得到壳聚糖溶液；将壳聚糖溶液置于容器中冷冻后，冷冻干燥，得到前期壳聚糖多孔支架；
(2)前期壳聚糖多孔支架浸泡于碱液中，水洗至pH7-8，冷冻干燥，得到壳聚糖多孔支架；
(3)把壳聚糖多孔支架浸泡到碱性磷酸酶溶液中，再将壳聚糖多孔支架连同碱性磷酸酶溶液装入透析袋中，置于甘油磷酸钙和CaCl2的混合溶液中，恒温恒速搅拌进行矿化，取出，洗涤，冷冻干燥，得到纳米羟基磷灰石/壳聚糖多孔复合支架材料。
2.根据权利要求1所述的纳米羟基磷灰石/壳聚糖多孔复合支架材料的仿生透析矿化制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述壳聚糖溶液的浓度为3～6wt％；所述乙酸溶液的浓度为1～4v/v％。
3.根据权利要求1所述的纳米羟基磷灰石/壳聚糖多孔复合支架材料的仿生透析矿化制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述壳聚糖溶液的浓度为5wt％；所述乙酸溶液的浓度为3v/v％。
4.根据权利要求1所述的纳米羟基磷灰石/壳聚糖多孔复合支架材料的仿生透析矿化制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述碱液为碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液或氢氧化钠溶液；所述浸泡的时间为12～72h。
5.根据权利要求1所述的纳米羟基磷灰石/壳聚糖多孔复合支架材料的仿生透析矿化制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述碱液为氢氧化钠溶液；所述浸泡的时间为24h。
6.根据权利要求1所述的纳米羟基磷灰石/壳聚糖多孔复合支架材料的仿生透析矿化制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述碱性磷酸酶溶液的浓度为0.2～0.8mg/mL；
所述甘油磷酸钙和CaCl2的混合溶液中，甘油磷酸钙和CaCl2溶液的浓度分别为：80～150mmol/L和60～100mmol/L；
所用碱性磷酸酶溶液和，甘油磷酸钙和CaCl2的混合溶液的体积比为1:2～1:10。
7.根据权利要求1所述的纳米羟基磷灰石/壳聚糖多孔复合支架材料的仿生透析矿化制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述碱性磷酸酶溶液的浓度为0.4mg/mL；
所述甘油磷酸钙和CaCl2的混合溶液中，甘油磷酸钙和CaCl2溶液的浓度分别为：110mmol/L和78.8mmol/L；
所用碱性磷酸酶溶液和，甘油磷酸钙和CaCl2的混合溶液的体积比为1:5。
8.根据权利要求1所述的纳米羟基磷灰石/壳聚糖多孔复合支架材料的仿生透析矿化制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述浸泡的时间为5～50min；所述恒温的温度为37℃；所述矿化的时间为12～72h。
9.一种纳米羟基磷灰石/壳聚糖多孔复合支架材料，其特征在于根据权利要求1～8任一项所述的仿生透析矿化制备方法得到。
10.权利要求9所述的纳米羟基磷灰石/壳聚糖多孔复合支架材料在骨组织工程领域中的应用。
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