CN108414749A - 一种h-fabp高效检测试纸制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种H‑FABP高效检测试纸的制备方法，包括设在固定板上依次相连的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫；在硝酸纤维素膜上设有检测线抗体和质控线抗体；在金标垫上设有金标抗体，所述的样品垫为玻璃纤维棉制成的垫，所述的金标垫为羧化纤维素膜制成的垫，所述的金标抗体为显色抗体，检测线抗体为捕捉抗体，显色抗体与捕捉抗体为2株可互相配对形成夹心的抗人H‑FABP单克隆抗体，所述的金标抗体用40nm纳米金壳标记，所述金标垫上设有功能层。本发明通过特制的含有特定功能层的金标垫，使得金标释放速度放缓，得到缓冲，从而使样本中被分析物与金标抗体的浓度比值增大，从而提高了试纸条检测的灵敏度。

Description

一种H-FABP高效检测试纸制备方法

技术领域

本发明属于生物技术应用领域，具体涉及一种心型脂肪酸结合蛋白H-FABP(Heart-typeFattyAcidBindingProtein，H-FABP)高效检测试纸的制备方法。

背景技术

H-FABP存在于心肌细胞胞浆内，含量丰富。心肌受损早期，心肌细胞膜完整性被破坏，H-FABP进入血液。H-FABP在心肌受损后1-2h即可在血液中检测到。由于H-FABP心肌特异性高于目前临床常用的肌红蛋白，因此H-FABP可成为一种重要的检测急性心肌组织损伤的早期特异性标志物。目前，生化标志物的检测已广泛应用于急性心肌梗死、不稳定型心绞痛、急性心衰、心肌炎、心脏手术损伤评估、窒息新生儿心肌损伤等心肌损伤疾病的诊断、危险度分层和预后评判。美国每年因怀疑性冠状动脉综合征急诊就医病人达8000万，其中45％左右与心脏相关，15％诊断为急性冠脉综合征。我国急性冠状动脉综合征的发病率约50/10万，每年死于急性心肌梗死的人数超过100万。因此，H-FABP检测的应用具有重要的社会和经济效益。

在公告号为CN102298055B文件中，在检测样本时，试纸条表面的不干胶因刀片两边的受力不同，导致试金标垫因厚度不同而导致样本在金标垫上的流速不同，导致带有金标的抗体与样本中的被分析物结合不均匀，最终会导致检测结果的显示—检测线或控制线产生断线，即线条显示不完全的现象。此外，样品中样品添加集中添加量集中，液体流速快，样本很快的冲到金标垫上，即有大量的标记物被带到了金标垫，反而使金标垫的检测灵敏度降低。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种心型脂肪酸结合蛋白H-FABP高效检测试纸，使其具有操作简便、灵敏度＜3ng/mL、结果稳定等优点。

发明内容：本发明提供了一种心型脂肪酸结合蛋白H-FABP高效检测试纸，包括设在固定板上依次相连的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫；在硝酸纤维素膜上设有检测线抗体和质控线抗体；在金标垫上设有金标抗体，所述的样品垫为玻璃纤维棉制成的垫，所述的金标垫为羧化纤维素膜制成的垫，所述的金标抗体为显色抗体，检测线抗体为捕捉抗体，显色抗体与捕捉抗体为2株可互相配对形成夹心的抗人H-FABP单克隆抗体，所述的金标抗体用40nm纳米金壳标记，所述样品垫上设有功能层；所述功能层以质量分数计由18％纯硝酸银、70％明胶、8％的司本80以及4％的环糊精组成。

上述心型脂肪酸结合蛋白H-FABP高效检测试纸的制备方法，包括以下步骤：

(1)采用“种子”生长法，以柠檬酸三钠为稳定剂和还原剂，制备出单分散的银纳米颗粒作为牺牲模板，通过置换反应获得胶体级、高分散的40nm金纳米壳；具体步骤如下：以柠檬酸三钠为稳定剂和还原剂，制备单分散的银纳米颗粒作为“种子”：在70℃的水浴下将80mL去离子水加热至恒温，加入20mL重量百分比为1％的柠檬酸三钠溶液，搅拌均匀，加入1.7mL10mg/mL的AgNO₃溶液，剧烈搅拌下加入2mL1％NaHB4溶液，然后持续加热和搅拌1h，室温冷却后定容至100mL；银纳米颗粒的“种子”生长：向80mL去离子水中加入2mL1％柠檬酸三钠溶液并加热到沸腾状态，然后加入一定体积的银种子溶液，在剧烈搅拌过程中，加入1.7mL10mg/mL的AgNO₃溶液，继续保持搅拌和加热30min，室温冷却后定容到100mL；以银纳米颗粒为牺牲模板，通过置换反应制备胶体级、高单分散的金纳米壳：取30mL银纳米颗粒溶液，在12500g下离心20min，倒出上清液，再以去离子水定容到100mL，将此100mL的银纳米颗粒溶液加热到沸腾状态，在剧烈搅拌下加入2mM HAuCl₄溶液2mL，反应液颜色逐渐由黄色转变为墨绿色，室温冷却；

(2)调节纳米金壳溶液pH8.0～8.5，加入显色抗体与纳米金壳溶液反应，离心得沉淀，重悬沉淀，得金标抗体溶液；

(3)将羧化纤维素膜预处理后，烘干，通过真空环境中通过红外喷涂设备分别将配制好的18％纯硝酸银、70％明胶、8％的司本80以及4％的环糊精喷涂至羧化纤维素膜好形成金标垫，然后用金标抗体溶液喷印；通过本发明中特定的红外喷涂方法能够较好的将组分嵌入金标垫中而不影响其性能；

(4)用捕捉抗体在已活化硝酸纤维素膜上喷划检测线，真空干燥；然后用羊抗鼠IgG在已活化硝酸纤维膜上喷划质控线，真空干燥；

(5)按样品垫、金标垫、硝酸纤维膜、吸收垫顺序粘贴在单面压敏胶的塑料板上，切割，装入塑料卡，包装；其中，显色抗体与捕捉抗体为2株可互相形成夹心配对的抗人H-FABP抗体。

上述H-FABP纳米金标检测试纸条在检测人血液中H-FABP的应用。

有益效果：本发明的心型脂肪酸结合蛋白H-FABP高效检测试纸，使用中空的金纳米壳代替目前胶体金试纸条常用的球形纳米颗粒。应用于人H-FABP检测，特异性高，由于中空金纳米壳所呈现的颜色(墨绿色)，在基于白色背景下能比球形金纳米颗粒(暗红色)产生更好的分辨光信号。

本发明通过特制的含有特定功能层的金标垫，使得金标释放速度放缓，得到缓冲，从而使样本中被分析物与金标抗体的浓度比值增大，从而提高了试纸条检测的灵敏度。

此外，通过特定功能层的金标垫，通过特定比例的明胶、纯硝酸银、司本80以及环糊精的作用，避免了金标垫因厚度不同而导致样本在金标垫上的流速不同，导致带有金标的抗体与样本中的被分析物结合不均匀，最终会导致检测结果的显示—检测线或控制线产生断线，即线条显示不完全的现象。

附图说明

图1是试纸条的结构示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

下面实施例制备的均是心型脂肪酸结合蛋白H-FABP高效检测试纸，包括设在固定板上依次相连的样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3和吸收垫4；在硝酸纤维素膜3上设有检测线抗体5和质控线抗体6；在金标垫2上设有金标抗体，所述的样品垫1为玻璃纤维棉制成的垫，所述的金标垫2为羧化纤维素膜制成的垫，所述的金标抗体为显色抗体，检测线抗体为捕捉抗体，显色抗体与捕捉抗体为2株可互相配对形成夹心的抗人H-FABP单克隆抗体，所述的金标抗体用40nm纳米金壳标记，所述金标垫上设有功能层；所述功能层以质量分数计由18％纯硝酸银、70％明胶、8％的司本80以及4％的环糊精组成；所述明胶为明胶。

(1)纳米金壳溶液的制备：

以柠檬酸三钠为稳定剂和还原剂，制备单分散的银纳米颗粒作为“种子”：在70℃的水浴下将80mL去离子水加热至恒温，加入20mL1％(wt)的柠檬酸三钠溶液，搅拌均匀，加入1.7mL10mg/mL的AgNO₃溶液，剧烈搅拌下加入2mL1％NaHB₄溶液，然后持续加热和搅拌1h，室温冷却后定容至100mL。

银纳米颗粒的“种子”生长：向80mL去离子水中加入2mL1％柠檬酸钠溶液并加热到沸腾状态，然后加入一定体积的银种子溶液，在剧烈搅拌过程中，加入1.7mL10mg/mL的AgNO₃溶液，继续保持搅拌和加热30min，室温冷却后定容到100mL。

以银纳米颗粒为牺牲模板，通过置换反应制备胶体级、高单分散的金纳米壳：取30mL银纳米颗粒溶液，在12500g下离心20min，倒出上清液，再以去离子水定容到100mL。将此100mL的银纳米颗粒溶液加热到沸腾状态，在剧烈搅拌下加入2mM HAuCl₄溶液2mL，反应液颜色逐渐由黄色转变为墨绿色，室温冷却。

(2)显色抗体的金标记：

调节纳米金壳溶液pH8.0～8.5，加入显色抗体与纳米金壳溶液反应，离心得沉淀，重悬沉淀，得金标抗体溶液。

(3)金标垫制备及喷垫：

将羧化纤维素膜预处理后，烘干，通过真空环境中通过红外喷涂设备分别将配制好的18％纯硝酸银、70％明胶、8％的司本80以及4％的环糊精喷涂至羧化纤维素膜好形成金标垫，然后用金标抗体溶液喷印。

(4)检测线制备：

取1株抗人H-FABP单克隆抗体BT01做检测线抗体，以缓冲液(10％海藻糖，6％甲醇)稀释为1mg/mL；用划膜仪将抗体划在硝酸纤维素膜上，浓度为1ul/cm形成检测线，真空干燥。

(5)质控线制备：

羊抗鼠IgG用缓冲液(10％海藻糖，6％甲醇)稀释为0.5mg/mL；用划膜仪将抗体划在硝酸纤维素膜上，浓度为0.5ul/cm形成质控线，真空干燥。

(6)试纸条装配：

将样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3和吸水纸4按顺序粘贴在单面压敏胶的塑料板上，如图1所示，在硝酸纤维素膜3上设有检测线抗体5和质控线抗体6；切割6cm宽度粘贴后的塑料板，装入检测卡；用带有干燥剂的热封锡箔袋包装，室温保存。

(7)检测：

将样品10000μl平均分成100组分别滴加入加样孔，15min时观察，判读试纸条检测结果的标准为：阳性，检测线处和质控线处均有显色条带；阴性，检测线处无显色条带，质控线处有显色条带；且显色灵敏度＜3ng/mL，无断线现象。

参照标准样品检测的方法，对300例体检正常人血浆标本进行检测，其中299例30min内检测线不出现墨绿色线，且显色灵敏度＜3ng/mL，无断线现象。

(1)人心肌H-FABP的纯化：

取人左心室肌在缓冲液中匀浆，多步骤离心后以(NH₄)₂SO₄进行盐析→离心→沉淀缓冲液重悬透析得蛋白粗提液→SephadexG-75凝胶过滤→电泳确定主要蛋白条带的收集管号合并收集→QSepharoseFastFlow阴离子交换层析→聚乙二醇浓缩→缓冲液透析得人心脏型脂肪酸结合蛋白。纯化品以SIGMA公司人心脏型脂肪酸结合蛋白为对照标准品，以Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定相对分子质量15KD，纯度达90％以上，并经质谱确认。

(2)H-FABP单克隆抗体制备

免疫动物：选8-12周龄与骨髓瘤细胞同种系的Balb/c小鼠，以经典法纯化的120μLH-FABP(含蛋白质100μg)与120μL福氏完全佐剂充分混匀，注入小鼠腹腔内，每隔2周100μg/只的H-FABP与等量福氏不完全佐剂充分混匀，注入小鼠腹腔内加强免疫，共3～4次。

采用间接ELISA法检测免疫小鼠尾静脉血抗体。

细胞融合：选滴度较高的-Balb/C小鼠准备融合，融合前3d经小鼠腹腔内再次加强免疫，剂量为50μgH-FABP。

取40mLHAT培养液，15mLDMEM无血清培养液和1mL50％PEG(分子量：2000)分别置于37℃水浴中预温。准备盛37℃水的500mL烧杯1只。

分别取骨髓瘤细胞2.4×107/10mL，脾细胞1.8×108/10mL加入灭菌50mL离心管中，混匀，并加DMEM无血清培养液至40mL。

将两种细胞悬液充分混匀后，1000rpm离心10min，倒尽上清液，用手指弹击管底，使两种细胞混匀成糊状。

将离心管置于37℃预温的盛水烧杯中，用吸管吸取0.8mL预温的50％PEG溶液，1min内加完，静置90s。

立即滴加37℃15mL预温的无血清培养液，使PEG稀释而停止作用。滴加方法是前30s加1mL；后30s加3mL；然后在3min内加完15mL。

补加DMEM无血清培养液至40mL，1000rpm离心10min，倒尽上清液。

在离心收集的细胞中加40mL含15％-20％胎牛血清的HAT培养液。用吸管轻轻混匀，滴加到已含有饲养细胞的4块96孔细胞培养板的小孔中，每孔2滴，置37℃，7％CO₂的培养箱中培养。

杂交瘤细胞的克隆及筛选：细胞融合后HAT培养液中进行选择培养。

采用间接ELISA检测培养孔上清特异性抗体。

杂交瘤细胞的克隆化：选阳性最高孔采用有限稀释法亚克隆克隆筛选细胞株，阳性细胞株液氮冻存。

(3)单克隆抗体的制备：

在接种杂交瘤细胞前，Balb/c小鼠腹腔内注射0.5mL降植烷或液体石蜡，然后每只小鼠腹腔内注射5×105～106个杂交瘤细胞。接种杂交瘤细胞约7～10日后，小鼠腹部明显涨大，用75％乙醇消毒其腹部，再于小鼠下方放置一支试管，将灭菌的注射针头刺入小鼠下腹部，让腹水滴入管内。间隔2～3d后，待腹水再积累后，同法再取腹水，共取2-3次，通常每只小鼠可收获腹水5～10mL，4℃保存。收集的腹水，1500rpm离心10min，吸取上清液，加入0.02％叠氮钠。间接ELISA法检测腹水抗体浓度，ProteinA-Sepharose柱纯化。制得鼠抗人H-FABP抗体BT02。

抗人H-FABP单克隆抗体BT01的制备方法同鼠抗人H-FABP抗体BT02的制备方法。选取可以配对形成夹心的抗人H-FABP单克隆抗体BT01和鼠抗人H-FABP抗体BT02来使用即可。

羊抗鼠IgG免疫动物：选取成年健康羊，以经典法纯化的小鼠IgG2ml与2ml福氏完全佐剂充分混匀，注入羊静脉内，每隔2周2ml/只的小鼠IgG与等量福氏不完全佐剂充分混匀，注入羊静脉内加强免疫，共3～4次。收集羊血，间接ELISA法检测羊血抗体浓度，ProteinA-Sepharose柱纯化。制得羊抗鼠IgG。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种H-FABP高效检测试纸的制备方法，其特征在于，包括检测试纸，所述检测试纸包括设在固定板上依次相连的样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸收垫(4)；在硝酸纤维素膜(3)上设有检测线抗体(5)和质控线抗体(6)；在金标垫(2)上设有金标抗体，所述的样品垫(1)为玻璃纤维棉制成的垫，所述的金标垫(2)为羧化纤维素膜制成的垫，所述的金标抗体为显色抗体，检测线抗体为捕捉抗体，显色抗体与捕捉抗体为2株可互相配对形成夹心的抗人H-FABP单克隆抗体，所述的金标抗体用40nm纳米金壳标记，所述金标垫上设有功能层；所述功能层以质量分数计由18％纯硝酸银、70％明胶、8％的司本80以及4％的环糊精组成。

包括以下步骤：

(1)采用“种子”生长法，以柠檬酸三钠为稳定剂和还原剂，制备出单分散的银纳米颗粒作为牺牲模板，通过置换反应获得胶体级、高分散的40nm金纳米壳；具体步骤如下：以柠檬酸三钠为稳定剂和还原剂，制备单分散的银纳米颗粒作为“种子”：在70℃的水浴下将80mL去离子水加热至恒温，加入20mL重量百分比为1％的柠檬酸三钠溶液，搅拌均匀，加入1.7mL10mg/mL的AgNO3溶液，剧烈搅拌下加入2mL1％NaHB4溶液，然后持续加热和搅拌1h，室温冷却后定容至100mL；银纳米颗粒的“种子”生长：向80mL去离子水中加入2mL1％柠檬酸三钠溶液并加热到沸腾状态，然后加入一定体积的银种子溶液，在剧烈搅拌过程中，加入1.7mL10mg/mL的AgNO3溶液，继续保持搅拌和加热30min，室温冷却后定容到100mL；以银纳米颗粒为牺牲模板，通过置换反应制备胶体级、高单分散的金纳米壳：取30mL银纳米颗粒溶液，在12500g下离心20min，倒出上清液，再以去离子水定容到100mL，将此100mL的银纳米颗粒溶液加热到沸腾状态，在剧烈搅拌下加入2mMHAuCl4溶液2mL，反应液颜色逐渐由黄色转变为墨绿色，室温冷却；

(2)调节纳米金壳溶液pH8.0～8.5，加入显色抗体与纳米金壳溶液反应，离心得沉淀，重悬沉淀，得金标抗体溶液；

(3)将羧化纤维素膜预处理后，烘干，通过真空环境中通过红外喷涂设备分别将配制好的18％纯硝酸银、70％明胶、8％的司本80以及4％的环糊精喷涂至羧化纤维素膜好形成金标垫，然后用金标抗体溶液喷印；

(4)用捕捉抗体在已活化硝酸纤维素膜上喷划检测线，真空干燥；然后用羊抗鼠IgG在已活化硝酸纤维膜上喷划质控线，真空干燥；

(5)按样品垫、金标垫、硝酸纤维膜、吸收垫顺序粘贴在单面压敏胶的塑料板上，切割，装入塑料卡，包装；其中，显色抗体与捕捉抗体为2株可互相形成夹心配对的抗人H-FABP抗体。

2.权利要求1所述的H-FABP纳米金标检测试纸条在检测人血液中H-FABP的应用。