CN108410908B - 一种利用植物激素ga及小分子物质pac调节细胞通路的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用植物激素GA及小分子物质PAC调节细胞通路的方法，实现了人细胞内信号通路的调控开关。将拟南芥内GA受体蛋白GID1及GAI构建在人细胞表达载体上，然后一起转入HEK293T细胞，加入GA，诱导两个蛋白相互作用，加入抑制剂PAC后，互作程度会减弱。利用这种方式，将人细胞信号通路中的关键蛋白与这两个受体蛋白融合表达，两个受体蛋白在GA诱导下互作，导致融合的信号通路也受GA的诱导。本发明选择了人Wnt通路上的关键蛋白LRP6。融合表达GA受体以及LRP6以后，LRP6会在GA诱导下聚集，进而促进β‑连环蛋白的产生，打开细胞内的信号通路，加入PAC抑制后，β‑连环蛋白产生量减少，细胞通路关闭。

Description

一种利用植物激素GA及小分子物质PAC调节细胞通路的方法

技术领域

本发明涉及生物方法发明领域，具体的说，是一种利用植物激素GA以及小分子物质PAC调节细胞通路的方法。

背景技术

光遗传学是一种将光控技术与遗传学相结合以进行细胞生物学研究的新技术，即将光敏感的离子通道蛋白表达于可兴奋的靶细胞或靶器官上，利用相应波长的光照激活光敏感通道以实现对细胞、组织、器官及动物生理功能的精细调控，到目前为止，许多光受体被改良，用于融合信号通路上的关键蛋白，来调控和控制生物体内的众多通路，如受体酪氨酸激酶Ras-MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路和Wnt信号通路。在基因水平上, 研究者利用CRY2-CIB1、FKF1-GI、UVR8-COP1和LOV蛋白等元件来调控哺乳动物细胞中特定基因的转录表达。有研究将拟南芥蓝光受体CRY2与Wnt信号通路内的LRP6蛋白融合表达，实验证明，蓝光诱导下CRY2的聚集同样使融合表达的LRP6发生聚集作用。从而调控了下游β-catenin信号通路。

麻省理工大学的张峰实验室利用免疫抑制因子雷帕霉素（Rapamycin）控制其受体蛋白并与dCas9构成了一个转录激活系统。张峰将受体蛋白FKBP与dCas9的C端以及转录激活子VP64融合表达；FRB与dCas9的N端融合表达。将这两个载体以及sgRNA共同转入细胞内，雷帕霉素处理后，靶基因的转录被激活。然而，此方法和光遗传学都有一定限制。雷帕霉素是免疫抑制子，对免疫系统有一定伤害；光遗传学的系统不适合于细胞内的光信号通路的调控。

受到光遗传学（optogenetics）中利用光受体进而调控相关细胞信号通路的启发，我们设想利用化学小分子物质植物激素GA来诱导受体蛋白的互作，从而来调控细胞信号转导。

赤霉素（Gibberellic Acid，GA）作为植物激素的地位是在20世纪50年代确立的。GA的典型生理作用就是显著地促进植物茎节的伸长生长，并在从种子萌发到开花结果等植物的各种生理活动中扮演重要的角色。GA是一种双萜酸化合物，无毒性，对人的健康不会造成任何危害。相反曾有报道说服用适量的赤霉素可以治疗胃溃疡，胃粘膜受损等疾病。GA信号通路依赖传导需要受体蛋白GID1（GA INSENSITIVE DWARF1），GA结合GID1促进GID1N端构像的变化，GA-GID1复合物可以结合GA信号抑制子DELLA蛋白家族。促进DELLA蛋白被26s蛋白酶体降解从而激活GA的信号通路。GAI就是DELLA蛋白的其中一员。多效唑(Paclobutrazol)PAC是一种植物生长的抑制剂，PAC可以通过抑制GA的生物活性对GA产生拮抗作用。

利用GA诱导GID1与GAI蛋白互作，PAC抑制这个过程的特性，以及光遗传学的原理，我们试着研发一种以无毒害的天然植物激素为诱导剂，调控细胞内信号通路的系统。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用植物激素GA以及小分子物质PAC调节细胞通路的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用植物激素GA以及小分子物质PAC调节细胞通路的方法，包括以下方法：

（1）载体设计以及构建：

首先利用所述的引物，以拟南芥cDNA和HEK293T细胞cDNA为模板，利用pcr技术将各基因片段扩增出来，然后利用对应引物，用两段片段为模板，进行overlap PCR；此时将拟南芥DELLA蛋白GAI及GA受体GID1与Wnt信号通路内的关键蛋白质LRP6的C端，融合到一起，利用琼脂糖凝胶回收GAI、GID1、GAI-LRP6C、GID1-LRP6C等PCR产物，用内切酶XbaI XmaI双酶切线性化的pCI 4xmyc、pCI egfp以及pCI mcherry载体，利用Infusion的方法连接，转化DH5a，菌落pcr验证，挑取克隆送测序，测序正确的保菌；利用以上操作，构建好了动物表达载体pCI-neo egfp GAI、 pCI-neo 4xMYC GID1，pCI-neo mcherry GID-LRP6C，pCI-neo4xMYC GID-LRP6C，pCI-neo egfp GAI-LRP6C；

（2）动物细胞的培养以及转染：

将冻存的HEK293T细胞从液氮中取出，37℃水浴迅速复苏细胞，接着放入离心机，800g离心5min，弃上清，加入1ml DMEM高糖细胞培养液重悬细胞，将细胞悬液加入含有预热过的10mlDMEM培养基的细胞培养瓶中，24h后更换培养基，待细胞的生长率到90%，将细胞重悬并且转移至6孔板内，转移24h后，进行磷酸钙法细胞转染，在六孔板每孔转染pCI-neoegfp GAI、 pCI-neo 4xMYC GID两种质粒或pCI-neo 4xMYC GID-LRP6C、pCI-neo egfpGAI-LRP6C两种质粒各2微克；

（3）GA以及PAC的给药

转染24h后，加入终浓度为10μM的GA，和细胞在37℃，5%CO₂中共同孵育12h，再加入终浓度为100nM的抑制剂PAC，孵育3h；孵育完成后，重悬细胞，利用细胞裂解液裂解，利用Western进行检测。

所述的pci 4xmyc以及pci mcherry载体构建方法为：分别设计PCR引物如下：

Myc F :ctagcctcgagaattcatggggttaattaacggtg；

Myc R: TACCACGCGTGAATTCGCTACCGTTCAAGTCTTCC；

mcherry F： ctagcctcgagaattcatggtgagcaagggcgagg；

mcherry R： TACCACGCGTGAATTCCTACTTGTACAGCTCGTCCA；

以4xmyc（SEQ ID NO.19）、mcherry（SEQ ID NO.20）为模板，扩增出来myc，mcherry片段，然后利用EcoRI酶单酶切pci neo载体，将其分别和线性化载体连接，构建成pci 4xmyc以及pci mcherry。

Pci Egfp载体：设计Egfp引物如下：

Egfp F‘ cagcctcgagaattcatggtgagcaagggcgagga

Egfp R‘：TACCACGCGTGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATG

pcr扩增出egfp产物，然后和EcoRI线性化的PCI（neo）载体连接构建成pci egfp载体。

本发明的优点在于：植物激素是一种安全无毒，经济实惠的化合物，所以本发明利用了植物激素来调控人细胞中的通路是很有前景的，GA赤霉素是一种重要的植物激素， 所以本发明利用GA施加时GA受体GID1和DELLA蛋白GAI互作引导人细胞通路中通过互作才可以行使功能的蛋白可以形成一个有效的开关来调控这些蛋白的下游。从而可以通过GA来诱导基因的表达来分析基因的功能。

附图说明

图1 pCI-neo 4xMYC GID1相关载体设计图。

图2 pCI-neo egfp GAI相关载体设计图。

图3 pCI-neo 4xMYC GID1-LRP6C相关载体设计图。

图4 pCI-neo egfp GAI-LRP6C相关载体设计图。

图5 受体蛋白CoIP图，其中 GAI与GID1转染细胞后加入GA（终浓度10μΜ），12h后加入抑制剂PAC(终浓度100nM), 3h后wenstern检测蛋白，发现GA可以促进GAI和GID1在293T细胞中的相互作用，加入抑制剂后互作减少。

图6受体蛋白BiFC图，其中将GAI与GID1各自和荧光蛋白YFP的两部分CYFP以及NYFP相连，转染293T细胞后，GA以及PAC处理后，进行BiFC实验，荧光倒置显微镜检测荧光强度。

图7融合表达蛋白CoIP图，其中将GAI与GID1和LRP6C融合表达后，共同转入HEK293T细胞中，GAI与GID1处理后进行CoIP检验，发现融合之后的蛋白一样能在GA诱导下进行互作，而抑制剂可以减弱互作。

图8融合表达蛋白BiFC图，其中将GFP-GAI-LRP6C以及mcherry-GID1-LRP6C共同转入HEK293T细胞中，GA以及PAC处理之后，放于荧光倒置显微镜中观测荧光情况。GA诱导下，GAI-LRP6C与GID1-LRP6C产生聚集，而加入抑制剂后，聚集减少。

具体实施方式

实施例1

一种利用植物激素GA以及小分子物质PAC调节细胞通路的方法，包括以下方法：

（1）载体设计以及构建：

首先利用所述的引物，以拟南芥cDNA和HEK293T细胞cDNA为模板，利用pcr技术将各基因片段扩增出来，然后利用对应引物，用两段片段为模板，进行overlap PCR；此时将拟南芥DELLA蛋白GAI及GA受体GID1与Wnt信号通路内的关键蛋白质LRP6的C端，融合到一起，利用琼脂糖凝胶回收GAI、GID1、GAI-LRP6C、GID1-LRP6C等PCR产物，用内切酶XbaI XmaI双酶切线性化的pCI 4xmyc、pCI egfp以及pCI mcherry载体，利用Infusion的方法连接，转化DH5a，菌落pcr验证，挑取克隆送测序，测序正确的保菌；利用以上操作，构建好了动物表达载体pCI-neo egfp GAI、 pCI-neo 4xMYC GID1，pCI-neo mcherry GID-LRP6C，pCI-neo4xMYC GID-LRP6C，pCI-neo egfp GAI-LRP6C；

（4）动物细胞的培养以及转染：

将冻存的HEK293T细胞从液氮中取出，37℃水浴迅速复苏细胞，接着放入离心机，800g离心5min，弃上清，加入1ml DMEM高糖细胞培养液重悬细胞，将细胞悬液加入含有预热过的10mlDMEM培养基的细胞培养瓶中，24h后更换培养基，待细胞的生长率到90%，将细胞重悬并且转移至6孔板内，转移24h后，进行磷酸钙法细胞转染，在六孔板每孔转染pCI-neoegfp GAI、 pCI-neo 4xMYC GID两种质粒各2微克；

（3）GA以及PAC的给药

转染24h后，加入终浓度为10μM的GA，和细胞在37℃，5%CO₂中共同孵育12h，再加入终浓度为100nM的抑制剂PAC，孵育3h；孵育完成后，重悬细胞，利用细胞裂解液裂解，利用Western进行检测。

所述的pci 4xmyc以及pci mcherry载体构建方法为：分别设计PCR引物如下：

Myc F :ctagcctcgagaattcatggggttaattaacggtg；

Myc R: TACCACGCGTGAATTCGCTACCGTTCAAGTCTTCC；

mcherry F： ctagcctcgagaattcatggtgagcaagggcgagg；

mcherry R： TACCACGCGTGAATTCCTACTTGTACAGCTCGTCCA；

以4xmyc（SEQ ID NO.19）、mcherry（SEQ ID NO.20）为模板，扩增出来myc，mcherry片段，然后利用EcoRI酶单酶切pci neo载体，将其分别和线性化载体连接，构建成pci 4xmyc以及pci mcherry。

Pci Egfp载体：设计Egfp引物如下：

Egfp F‘ cagcctcgagaattcatggtgagcaagggcgagga

Egfp R‘：TACCACGCGTGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATG

pcr扩增出egfp产物，然后和EcoRI线性化的PCI（neo）载体连接构建成pci egfp载体。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林大学

<120> 一种利用植物激素GA及小分子物质PAC调节细胞通路的方法

<130> 20

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcgtggtacc tctagaatgg ctgcgagcga tgaagt 36

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaagcggccg cccgggttaa cattccgcgt ttacaa 36

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcgtggtacc tctagaatgg ctgcgagcga tgaagt 36

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cccgagccac cgccggaacc gccaccttaa cattccgcgt ttacaa 46

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggcggtggct cgggaggtgg ctcaaggatg ttgtgtccac gtat 44

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaagcggccg cccgggtcag gaggagtctg tacagg 36

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcgtggtacc tctagaatga agagagatca tcatca 36

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gaagcggccg cccgggattg gtggagagtt tccaag 36

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcgtggtacc tctagaatga agagagatca tcatca 36

<210> 10

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cccgagccac cgccggaacc gccaccattg gtggagagtt tccaag 46

<210> 11

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggcggtggct cgggaggtgg ctcaaggatg ttgtgtccac gtat 44

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gaagcggccg cccgggtcag gaggagtctg tacagg 36

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ctagcctcga gaattcatgg ggttaattaa cggtg 35

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

taccacgcgt gaattcgcta ccgttcaagt cttcc 35

<210> 15

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ctagcctcga gaattcatgg tgagcaaggg cgagg 35

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

taccacgcgt gaattcctac ttgtacagct cgtcca 36

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cagcctcgag aattcatggt gagcaagggc gagga 35

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

taccacgcgt gaattccttg tacagctcgt ccatg 35

<210> 19

<211> 174

<212> DNA

<213> 4xmyc

<400> 19

atggggttaa ttaacggtga acaaaagcta atctccgagg aagacttgaa cggtgaacaa 60

aaattaatct cagaagaaga cttgaacgga ctcgacggtg aacaaaagtt gatttctgaa 120

gaagatttga acggtgaaca aaagctaatc tccgaggaag acttgaacgg tagc 174

<210> 20

<211> 708

<212> DNA

<213> mcherry

<400> 20

atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600

aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaag 708

Claims (1)

1.一种利用植物激素GA及小分子物质PAC调节细胞通路的方法，其特征在于：采用以下引物：

GID1-F：GCGTGGTACCTCTAGAATGGCTGCGAGCGATGAAGT，

GID1-R：GAAGCGGCCGCCCGGGTTAACATTCCGCGTTTACAA；

GID1-F：GCGTGGTACCTCTAGAATGGCTGCGAGCGATGAAGT，

GID1-LRP6C-R：CCCGAGCCACCGCCGGAACCGCCACCTTAACATTCCGCGTTTACAA；

LRP6C-F：GGCGGTGGCTCGGGAGGTGGCTCAAGGATGTTGTGTCCACGTAT，

LRP6C-R：GAAGCGGCCGCCCGGGTCAGGAGGAGTCTGTACAGG；

GAI-F：GCGTGGTACCTCTAGAATGAAGAGAGATCATCATCA，

GAI-R：GAAGCGGCCGCCCGGGATTGGTGGAGAGTTTCCAAG；

GAI-F：GCGTGGTACCTCTAGAATGAAGAGAGATCATCATCA，

GAI-LRP6C-R：CCCGAGCCACCGCCGGAACCGCCACCATTGGTGGAGAGTTTCCAAG；

LRP6C-F：GGCGGTGGCTCGGGAGGTGGCTCAAGGATGTTGTGTCCACGTAT，

LRP6C-R：GAAGCGGCCGCCCGGGTCAGGAGGAGTCTGTACAGG；

包括以下步骤：

（1）载体设计以及构建：

首先利用所述的引物，以拟南芥和HEK293T细胞反转录的cDNA为模板，利用pcr技术将各基因片段扩增出来，然后利用对应引物，用两段片段为模板，进行overlap PCR，将拟南芥DELLA蛋白GAI及GA受体GID1与Wnt信号通路内的关键蛋白质LRP6的C端，融合到一起，利用琼脂糖凝胶回收PCR产物GAI、GID1、GAI-LRP6C、GID1-LRP6C，用内切酶XbaI XmaI双酶切线性化的pCI 4xmyc、pCI egfp以及pCI mcherry载体，利用Infusion的方法连接，转化DH5a，菌落pcr验证，挑取克隆送测序，测序正确的保菌；利用以上操作，构建获得动物表达载体pCI-neo egfp GAI、 pCI-neo 4xMYC GID，pCI-neo mcherry GID-LRP6C，pCI-neo 4xMYCGID-LRP6C，pCI-neo egfp GAI-LRP6C；

（2）动物细胞的培养以及转染：

将冻存的HEK293T细胞从液氮中取出，37℃水浴迅速复苏细胞，接着放入离心机，800g离心5min，弃上清，加入1ml DMEM高糖细胞培养液重悬细胞，将细胞悬液加入含有预热过的10mlDMEM培养基的细胞培养瓶中，24h后更换培养基，待细胞的生长率到90%，将细胞重悬并且转移至6孔板内，转移24h后，进行磷酸钙法细胞转染，在六孔板每孔转染pCI-neo egfpGAI、 pCI-neo 4xMYC GID两种质粒或者pCI-neo 4xMYC GID-LRP6C、pCI-neo egfp GAI-LRP6C两种质粒各2微克；

（3）GA以及PAC的给药

转染24h后，加入终浓度为10μM的GA，和细胞在37℃，5%CO₂中共同孵育12h，再加入终浓度为100nM的抑制剂PAC，孵育3h；孵育完成后，重悬细胞，利用细胞裂解液裂解，利用Western进行检测。

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