CN108409839B - 一种MDM2与p53相互作用的多肽抑制剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种MDM2与p53相互作用的多肽抑制剂及其应用。本发明保护的多肽，如序列表的序列1所示。所述多肽来源于寨卡病毒，具有p53蛋白‑MDM2蛋白相互作用抑制剂的作用，即这段多肽可以有效地与生物体内的MDM2蛋白相结合，进而使体内的抑癌蛋白p53蛋白的浓度得到提高，之后体内积累较多的p53蛋白就可以有效地抑制肿瘤细胞的形成或生长，最终实现抑癌的目的。本发明对于肿瘤的治疗有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种MDM2与p53相互作用的多肽抑制剂及其应用。
背景技术
在人类的各种疾病中，恶性肿瘤导致的死亡率一直高居前列，是危害人类健康的最主要疾病之一。所以，肿瘤的形成机制尤其是肿瘤的治疗方法研究已成为生物学、物理学、化学和医学等多学科交叉的一个非常重要的领域。
在人类的癌症中，要么是抑癌基因p53发生突变或完全缺失，无法合成有功能的p53蛋白，要么是MDM2蛋白与p53蛋白结合抑制了p53的活性。于是设计一种药物分子能够通过阻断MDM2蛋白与p53蛋白的结合而达到治疗癌症的目的是目前癌症治疗的一个首选途径。这样的药物分子既可以特异性的结合MDM2蛋白治疗肿瘤，还不会有毒副作用。
p53基因是在1976年被发现的，当时人们都认为p53基因是SV病毒的癌变基因。之后经过深入研究发现，p53基因是一种强有效的抑癌基因。p53基因是广泛研究的肿瘤抑制基因，p53基因普遍存在于人类肿瘤中，例如，在脑瘤、肉瘤、肺癌、直肠癌、乳腺癌、小头畸形等常见的人类肿瘤中都存在着p53抑癌基因。p53基因的表达能够促使细胞周期进入停滞阶段，在此之后，细胞会进一步地衰老或者凋亡。p53基因的失活或异常都会导致肿瘤形成或加速肿瘤细胞的生长。p53蛋白是细胞防御DNA损伤的主要“堡垒”，常常被称为“基因监护者”。
MDM2蛋白是p53蛋白的一个重要的负调节抑制蛋白，并且在大多数的肿瘤细胞中常常是过量表达的。p53蛋白的表达能够促进MDM2蛋白的表达，但是MDM2蛋白的过表达就会抑制p53蛋白的表达和功能，两者之间形成了负反馈回路。当p53蛋白与MDM2蛋白发生相互作用相结合时，就会导致p53蛋白活性降低或导致p53蛋白降解，进而抑癌作用就会减弱或致使肿瘤形成。所以，可以通过借助p53蛋白-MDM2蛋白的相互作用抑制剂结合到MDM2蛋白的结合腔的方法来释放p53蛋白分子，进而达到抑制肿瘤形成或减弱肿瘤细胞生长的目的。
寨卡病毒和登革热病毒及西尼罗河病毒都属于黄病毒属，寨卡病毒是通过蚊虫为媒介进行传播的，曾经威胁到全球的各个地方。最为突出的是寨卡病毒会引起小头畸形症，对幼儿造成严重的影响。寨卡病毒会导致婴儿出生后存在严重脑损伤，但人们或可利用这种病毒抵抗成年人脑瘤。
发明内容
本发明的目的是提供一种MDM2与p53相互作用的多肽抑制剂及其应用。
本发明提供了一种多肽，来源于寨卡病毒，如序列表的序列1所示。
本发明保护所述多肽在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：
(a1)结合细胞中的MDM2蛋白；
(a2)降低细胞中游离MDM2蛋白的含量；
(a3)提高细胞中p53蛋白的表达量和/或活性；
(a4)抑制细胞中MDM2蛋白和p53蛋白结合。
所述细胞具体为肿瘤细胞。
本发明还保护所述多肽在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(b1)或(b2)：
(b1)诱导肿瘤细胞凋亡；
(b2)降低肿瘤细胞活性。
本发明还保护所述多肽在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(c1)或(c2)：
(c1)抑制肿瘤生长；
(c2)治疗肿瘤。
本发明还保护一种产品，其活性成分为所述多肽；所述产品的用途为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：
(a1)结合细胞中的MDM2蛋白；
(a2)降低细胞中游离MDM2蛋白的含量；
(a3)提高细胞中p53蛋白的表达量和/或活性；
(a4)抑制细胞中MDM2蛋白和p53蛋白结合。
所述细胞具体为肿瘤细胞。
本发明还保护一种产品，其活性成分为所述多肽；所述产品的用途为(b1)或(b2)：
(b1)诱导肿瘤细胞凋亡；
(b2)降低肿瘤细胞活性。
本发明还保护一种产品，其活性成分为所述多肽；所述产品的用途为如下(c1)或(c2)：
(c1)抑制肿瘤生长；
(c2)治疗肿瘤。
以上任一所述产品具体可为药物。
本发明还保护多肽的应用，为如下(1)-(8)中的任一种：
(1)结合细胞中的MDM2蛋白；
(2)降低细胞中游离MDM2蛋白的含量；
(3)提高细胞中p53蛋白的表达量和/或活性；
(4)抑制细胞中MDM2蛋白和p53蛋白结合。
(5)诱导肿瘤细胞凋亡；
(6)降低肿瘤细胞活性。
(7)抑制肿瘤生长；
(8)治疗肿瘤。
上述(1)-(4)中，所述细胞具体为肿瘤细胞。
以上任一所述肿瘤细胞具体可为脑肿瘤细胞，更具体可为脑胶质瘤细胞(例如U87细胞)。
以上任一所述肿瘤可为实体肿瘤或血液肿瘤。所述肿瘤具体可为脑肿瘤。
本发明的发明人通过发现了一段多肽，来源于寨卡病毒，具有p53蛋白-MDM2蛋白相互作用抑制剂的作用，即这段多肽可以有效地与生物体内的MDM2蛋白相结合，进而使体内的抑癌蛋白p53蛋白的浓度得到提高，之后体内积累较多的p53蛋白就可以有效地抑制肿瘤细胞的形成或生长，最终实现抑癌的目的。本发明对于肿瘤的治疗有重要意义。
附图说明
图1为实验多肽可与MDM2蛋白紧密结合。
图2为对照多肽不能与MDM2蛋白紧密结合。
图3为实验多肽处理后U87细胞中游离MDM2蛋白的浓度变化。
图4为实验多肽处理后U87细胞中p53蛋白及凋亡相关蛋白的浓度变化。
图5为实验多肽处理后细胞存活率统计结果。
图6为实验多肽处理后细胞数量形态变化。
图7为实验多肽处理后细胞凋亡情况变化。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
U87细胞：ATCC，编号：
实施例1、多肽的发现
通过大量序列分析、功能研究，筛选出一个多肽(来源于寨卡病毒)，如序列表的序列1所示。经过分子对接动力学计算，该多肽可以与MDM2蛋白的p53蛋白的结合位点结合，且相当长的时间内都与MDM2蛋白结合完好(图1)，相互作用能较强，而其他对照多肽(例如LKRLPAGLLLGHGPIRMVLAILAF)则不能与MDM2蛋白结合完好(图2)。这说明这段多肽有特定的功能，即与MDM2蛋白可以有较强且完好的结合，于是就阻止了p53蛋白与MDM2蛋白的结合，进一步促使了细胞内p53蛋白的积累，最终达到恢复p53蛋白抑制肿瘤细胞形成和生长的目的。
实施例2、多肽的功能研究
实验多肽序列如下：KKEAMEIIGGGGGGLAAMLRIINA(序列表的序列1)。
对照多肽序列如下：LKRLPAGLLLGHGPIRMVLAILAF。
待测多肽为实验多肽或对照多肽。
一、多肽可以有效地减少U87细胞中游离MDM2蛋白的浓度
1、将U87细胞接种至6孔板(每孔2×106个细胞)，采用含10％(体积百分含量)胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养液，5％CO2，37℃静置培养24h。
2、完成步骤1后，取所述6孔板，加入待测多肽并使其在体系中的浓度为80μM、40μM、20μM、10μM、5μM或2.5μM(每个浓度设置3个复孔；同时设置不加入待测多肽的空白对照，空白对照设置3个复孔)，5％CO2，37℃静置2小时，然后采用商用试剂盒(human totalMDM2/HDM2 DuoSet IC ELISA kit(R&D Systems))，按照试剂盒说明书操作，检测U87细胞中游离MDM2蛋白的浓度。
实验多肽护理后的结果如图3所示。结果表明，实验多肽可以通过与细胞内MDM2结合，从而剂量依赖性减少U87细胞中游离MDM2蛋白的浓度。对照多肽不能达到相同效果。
二、多肽可以有效地提高U87细胞中p53蛋白及凋亡相关蛋白浓度
1、将U87细胞接种至6孔板(每孔5×105个细胞)，采用含10％(体积百分含量)胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养液，5％CO2，37℃静置培养24h。
2、完成步骤1后，取所述6孔板，加入待测多肽并使其在体系中的浓度为0μM、5μM或10μM(每个浓度设置3个复孔；同时设置不加入待测多肽的空白对照，空白对照设置3个复孔)，2h后收集细胞，裂解后提取总蛋白，通过westernblot检测p53蛋白(Santa Cruze)、Caspase-3蛋白(Cell Signaling Technology)和Caspase-9蛋白(Cell SignalingTechnology)的表达情况，采用Tubulin蛋白(Sigma)作为内参蛋白。
实验多肽处理后的结果如图4所示。结果表明，实验多肽作用后，细胞中p53蛋白及凋亡相关蛋白的水平增加。对照多肽不能达到相同效果。
三、多肽诱导U87细胞凋亡
1、将U87细胞接种至6孔板(每孔5×105个细胞)，采用含10％(体积百分含量)胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养液，5％CO2，37℃静置培养24h。
2、完成步骤1后，取所述6孔板，加入待测多肽并使其在体系中的浓度为0μM、5μM或10μM(每个浓度设置5个复孔；同时设置不加入待测多肽的空白对照，空白对照设置3个复孔)，6h后采用CCK8试剂盒(Dojindo Molecular Technologies，Inc.，Kunamoto，Japan)检测细胞存活情况。实验多肽处理后的结果如图5所示。
3、完成步骤1后，取所述6孔板，加入待测多肽并使其在体系中的浓度为0μM、5μM或10μM(每个浓度设置3个复孔；同时设置不加入待测多肽的空白对照，空白对照设置3个复孔)，6h后观察细胞数量形态，并通过细胞凋亡芯片试剂盒(Annexin V-FITC/propidiumiodide Apoptosis Detection kit；Dojindo Molecular Technologies，Inc.，Kunamoto，Japan)，按照试剂盒说明书检测U87细胞凋亡情况变化。
结果如图6和图7所示。图6位实验多肽处理后细胞形态数量形态观察结果。图7为实验多肽处理后细胞凋亡情况观察结果。图7中，携带绿色荧光的凋亡细胞数量随多肽浓度的增加而增加。结果表明，实验多肽处理后的U87细胞的活性明显降低，多肽可以诱导细胞凋亡。对照多肽不能达到相同效果。
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种MDM2与p53相互作用的多肽抑制剂及其应用
<160> 1
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
Lys Lys Glu Ala Met Glu Ile Ile Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Ala
1 5 10 15
Ala Met Leu Arg Ile Ile Asn Ala
20
Claims (6)
1.多肽，如序列表的序列1所示。
2.权利要求1所述的多肽在制备产品中的应用；所述产品的用途为抑制细胞中MDM2蛋白和p53蛋白结合。
3.权利要求1所述的多肽在制备产品中的应用；所述产品的用途为提高细胞中p53蛋白的表达量。
4.权利要求1所述的多肽在制备产品中的应用；所述产品的用途为诱导肿瘤细胞凋亡。
5.权利要求1所述的多肽在制备产品中的应用；所述产品的用途为治疗肿瘤。
6.一种药物，其活性成分为权利要求1所述的多肽。
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