CN108359664B - 固定化含淀粉蔗糖酶细胞的制备方法及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种固定化含淀粉蔗糖酶细胞的制备方法及其使用方法；包括如下步骤：(1)向含淀粉蔗糖酶菌体中加入缓冲液和蒸馏水，制成菌悬液，然后加入载体，搅拌均匀；(2)加入海藻酸钠和聚乙烯醇，搅拌均匀，得到混合溶液；(3)将混合溶液滴入CaCl2的硼酸溶液中，固化5～15h，得到球形固定化含淀粉蔗糖酶细胞；本发明所提供的制备方法具有固定化材料成本低，操作简单，重复使用性好等优势，制备的含淀粉蔗糖酶细胞用于催化蔗糖和氢醌生产α‑熊果苷，连续转化20批次后，固定化细胞酶活仍保持为游离细胞酶活50％以上，具有良好的工业化应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种固定化含淀粉蔗糖酶细胞的制备方法及其使用方法。
背景技术
α-熊果苷是β-熊果苷的差向异构体，其化学名为4-羟苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷。研究表明，α-熊果苷较β-熊果苷而言性质更稳定，具有更好的抗炎、修复和美白功效，常作为增白剂应用于高端护肤品和化妆品中。
目前，α-熊果苷的主要制备方法是游离细胞催化法，其主要的问题在于：利用游离细胞催化生产α-熊果苷产物后续处理工艺复杂，设备投资及操作费用较大；催化剂对环境耐受力差，并且不能反复利用，提高了生产的成本。例如专利CN201210508199.X，介绍了利用野油菜黄单胞菌转化合成α-熊果苷的方法，转化效率低，转化液中α-熊果苷含量约10g/L。又如专利CN201610130457.3，介绍了利用酶蛋白催化合成α-熊果苷以及反复重结晶的提纯工艺，需要制取酶蛋白进行反应，纯化时需要利用纯水反复重结晶，生产成本高，转化效率低。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种提高细胞活性和稳定性的固定化含淀粉蔗糖酶细胞的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种固定化含淀粉蔗糖酶细胞的制备方法，包括如下步骤：
(1)向含淀粉蔗糖酶菌体中加入缓冲液和蒸馏水，制成菌悬液，然后加入载体，搅拌均匀；
(2)加入海藻酸钠和聚乙烯醇，搅拌均匀，得到混合溶液；
(3)将混合溶液滴入CaCl2的硼酸溶液中，固化5～15h，得到球形固定化含淀粉蔗糖酶细胞。
上述技术发的有益效果在于：本发明所提供的制备方法具有固定化材料成本低，操作简单，重复使用性好等优势，制备的含淀粉蔗糖酶细胞用于催化蔗糖和氢醌生产α-熊果苷，连续转化20批次后，固定化细胞酶活仍保持为游离细胞酶活50％以上，具有良好的工业化应用前景。
本发明的另一个目的在于提供一种利用上述固定化含淀粉蔗糖酶细胞的使用方法，能提高α-熊果苷的产率，缩短生产周期。
步骤如下：向蔗糖和氢醌中加入球形固定化含淀粉蔗糖酶细胞，混合液在28～35℃下转化3～6h，得到α-熊果苷；
所述混合液中各物质的浓度为：蔗糖180～300g/L，氢醌5～20g/L；球形固定化含淀粉蔗糖酶细胞260～300g/L。
附图说明
图1为固定化细胞(由实施例2制备得到)和游离细胞(由实施例1制备得到)重复使用批次产率对比图。
具体实施方式
以下通过3个实施例来进一步公开本发明，以下实施例中，硅藻土分子式为SiO2，分子量为60.08，中位粒径19.6μm，比重0.32能吸收大于本身4倍的水；溶于浓碱和氢氟酸，不溶于水、酸或稀碱，购自阿拉丁公司。珍珠岩，化学组成SiO2：70～75％，Al2O3：12～16％，Na2O：1.0％～4.0％，K2O：1.0％～4.0％，外观白色颗粒，比重0.09，熔点：1280～1350℃，购自杭州锦大绿产业技术有限公司。活性炭，分子式为C，分子量为12.01，比重1.8，对有机色素和含氮碱有高容量的吸附能力，购自阿拉丁公司。
实施例1：含淀粉蔗糖酶菌体的制备及性能测定
将含淀粉蔗糖酶基因的重组基因工程菌接种至斜面培养基，37℃培养12h，获得斜面菌体；斜面培养基组成为：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，20g/L琼脂，溶剂为水，pH自然；
将斜面菌体接种至种子培养基，37℃培养12h，获得种子液；种子培养基组成：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，溶剂为水，pH自然；
将种子液以体积浓度3.3％接种量接种至发酵培养基，37℃、150rpm条件下培养2h，然后加入10g/L乳糖诱导剂，28℃，150rpm条件下诱导12h，取发酵液离心，收集湿菌体，获得含淀粉蔗糖酶菌体；
发酵培养基组成：磷酸二氢钾1％、磷酸氢二钾1％、硫酸铵0.5％、硫酸镁0.1％、一水柠檬酸0.1％、富马酸0.1％、谷氨酸钠0.1％、柠檬酸铁铵0.05％、磷酸二氢钠0.1％、磷酸氢二钠0.1％、甘油1％、七水硫酸亚铁0.005％、无水氯化钙0.005％，五水硫酸铜0.001％、六水氯化钴0.001％、七水硫酸锌0.001％、一水硫酸锰0.005％、二水钼酸钠0.005％、六水氯化镍0.005％、硼酸0.005％、消泡剂0.002％。
需要说明的是，上述含淀粉蔗糖酶基因的重组基因工程菌是按照中国发明专利申请公布号CN106148256A公开的产α-熊果苷的基因工程菌的构建方法获得。
游离细胞酶活及重复使用性能测定：
取收集的湿菌体于10ml pH7.0磷酸盐缓冲液中，使菌体终浓度为10OD，加入2.4g蔗糖和0.132g氢醌，30℃反应10min，取样，HPLC检测产物α-熊果苷的浓度，根据酶活定义计算游离细胞酶活。
取步骤(1)制备的游离细胞于250mL装有100mL磷酸盐缓冲液(pH＝7.0，100mM)的三口烧瓶中，细胞浓度为10OD，加入24g底物蔗糖和1.32g氢醌，30℃，200rpm搅拌转速，反应4h，真空抽滤进行固液分离后，转化液用HPLC检测产物浓度，计算产率。游离细胞经三次洗涤后，进行下一批转化，计算每一批次的产率，计算酶活。
酶活定义：30℃，pH＝7.0条件下，单位OD细胞每小时催化生成1mmol的α-熊果苷所需的酶量定义为1U。
HPLC条件：柱子：WondaSil C18反相柱，4.6*150mm。进样量：10uL。柱温：35℃。流动相：5％甲醇水溶液。流速：1.0mL/min。检测波长：280nm。α-Arbutin出峰时间：4.8min；Hydroquinone出峰时间：6.0min；
根据上述方法，所得游离细胞性能如下：含蔗糖磷酸化酶游离细胞酶活为29.5U，240g/L蔗糖和13.2g/L氢醌浓度下连续操作3批后酶活为11.5％，结果如附图1。
实施例2：固定化含淀粉蔗糖酶细胞的制备
(1)取实施例1中的含淀粉蔗糖酶菌体，向其中加入0.05mol/L的Tris-HCl溶液(pH＝7.0，100mM)和蒸馏水，制成100ml菌悬液，菌浓度为OD 20，然后加入40g硅藻土，搅拌均匀；
(2)加入100ml 6wt％海藻酸钠和20wt％聚乙烯醇，搅拌均匀，得到混合溶液，混合溶液中含淀粉蔗糖酶菌体10OD，载体20g/L，海藻酸钠3wt％，聚乙烯醇10wt％；
(3)以100滴/min的滴加速度将混合溶液滴入10g/L的CaCl2的10g/L的硼酸溶液(pH为7.0)中，25℃下固化10h，得到直径为2～5mm的球形固定化含淀粉蔗糖酶细胞，细胞在4℃下储存。
实施例3：α-熊果苷的合成及性能测定
取实施例2制得的球形固定化含淀粉蔗糖酶细胞3.4g于10ml pH7.0磷酸盐缓冲液中，加入2.4g蔗糖和0.132g氢醌，30℃反应10min，取样，HPLC检测产物α-熊果苷的浓度，根据酶活定义计算固定化细胞酶活；固定化细胞酶活测试方法同实施例1。固定化细胞酶活除以游离细胞酶活计算出固定化细胞酶活回收率。
取实施例2制得的球形固定化含淀粉蔗糖酶细胞34g于250mL装有100mL磷酸盐缓冲液(pH＝7.0，100mM)的三口烧瓶中，加入24g蔗糖和1.32g氢醌，30℃，200rpm搅拌转速，反应4h，真空抽滤进行固液分离后，转化液用HPLC检测产物浓度，计算产率。固定化细胞经三次洗涤后，进行下一批转化，计算每一批次的产率。
结果表明：固定化细胞性能如下：固定化细胞酶活为27U，酶活回收率为91.5％，连续操作20批次酶活保留53.0％，结果如附图1。
实施例4：固定化含淀粉蔗糖酶细胞的制备
制备方法同实施例2，不同之处在于，步骤(1)中载体为活性炭，步骤(2)中海藻酸钠浓度为4wt％，聚乙烯醇浓度为16wt％。
经测定，所得固定化细胞性能如下：固定化细胞酶活为26.11U，酶活回收率为88.5％，连续操作20批次酶活保留52.0％。
实施例5：固定化含淀粉蔗糖酶细胞的制备
制备方法同实施例2，不同之处在于，步骤(1)中载体为珍珠岩，步骤(2)中海藻酸钠浓度为8wt％，聚乙烯醇浓度为12.4wt％。
经测定，所得固定化细胞性能如下：固定化细胞酶活为24.6U，酶活回收率为83.5％，连续操作20批次酶活保留50.5％。
实施例6：固定化含淀粉蔗糖酶细胞的制备
制备方法同实施例2，不同之处在于，步骤(1)中载体为珍珠岩，步骤(3)中CaCl2浓度为8g/L、硼酸浓度为15g/L。
经测定，所得固定化细胞性能如下：固定化细胞酶活为23.6U，酶活回收率为80％，连续操作20批次酶活保留50％。
Claims (1)
1.一种使用固定化含淀粉蔗糖酶细胞合成α-熊果苷的方法，其特征在于，步骤如下：向蔗糖和氢醌中加入球形固定化含淀粉蔗糖酶细胞，混合液在28～35℃下转化3～6h，得到α-熊果苷；所述混合液中各物质的浓度为：蔗糖180～300g/L，氢醌5～20g/L；球形固定化含淀粉蔗糖酶细胞260～300g/L；
所述球形固定化含淀粉蔗糖酶细胞的制备方法，包括如下步骤：
(1)向含淀粉蔗糖酶菌体中加入缓冲液和蒸馏水，制成菌悬液，然后加入载体，搅拌均匀；
(2)加入海藻酸钠和聚乙烯醇，搅拌均匀，得到混合溶液；
(3)将混合溶液滴入CaCl2的硼酸溶液中，固化5～15h，得到球形固定化含淀粉蔗糖酶细胞；
含淀粉蔗糖酶菌体由含有淀粉蔗糖酶编码基因的重组工程菌经斜面培养、种子培养、发酵培养后获得；
步骤(1)中的缓冲液为0.01～1mol/L的Tris-HCl溶液；
步骤(1)中的载体为硅藻土、活性炭、珍珠岩中的一种；
步骤(2)的混合溶液中各物质的浓度为：含淀粉蔗糖酶菌体8～12OD，载体15～25g/L，海藻酸钠2～5wt％，聚乙烯醇8～15wt％；
步骤(3)的CaCl2的硼酸溶液中，CaCl2的浓度为5～15g/L，硼酸的浓度为8～12g/L，溶液pH为6.5～7.5；
步骤(3)中混合溶液的滴加速度为70～120滴/min；
步骤(3)中的球形固定化含淀粉蔗糖酶细胞直径为2～5mm，酶活回收率为80～91.5％。
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