CN108330092A - 一株具有促生功能的沙福芽孢杆菌及其菌剂与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株具有促生功能的沙福芽孢杆菌及其菌剂与应用。一株沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)AMCC101030，已于2017年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15071。本发明首次筛选获得了一株沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)AMCC101030菌株，该菌株具有明显促生效果，将该菌株掺混到育苗基质中，功能菌株分泌促生物质，从而促进了番茄幼苗的生长。
Description
技术领域
本发明涉及一株具有促生功能的沙福芽孢杆菌及其菌剂与应用，属于微生物技术领域。
背景技术
化肥在现代农业生产中发挥着巨大作用，但是随着化肥使用量的增加，其利用率逐年降低。农药和化肥的残留，向环境释放了大量的有害物质，污染了土壤、水源和食品，对人类健康及生存环境构成了极大威胁，要求保护生态环境和生产安全食品的呼声日益强烈。高产、优质、高效农业的发展，要求进一步重视和加强土壤改良与科学施肥，努力提高土壤肥力和施肥效益；加强土壤肥料新技术的研究、开发及推广，从而提高农田的综合生产力，为农业的持续稳定发展发挥积极作用。因此，开发利用替代化学肥料的新肥源，以适应发展绿色农业和绿色食品的需要已是当务之急。
近年根际微生物的研究已成一个新的发展趋势。植物根际促生菌(Plant growthpromotingrhizobacteria，PGPR)是一类能够自由生长或定殖于植物根系，并显著地促进植物生长发育和新陈代谢以及防止病害的有益菌。随着21世纪生物技术的兴起,根际促生菌的开发与应用对创造良好的根际生态环境、改善土坡理化性质、提高土坡的供肥能力和对环境资源的有效利用、降低作物对化肥的依赖、抑制病虫害的发生及减少农药污染等具有重要作用。
虽然根际促生菌受到越来越多的重视，但在应用上，研究成果仅停留在试验水平，加之，对以促生菌的主要活性成分的高效发酵工艺和剂型研发相对滞后，导致实现工业化生产并大面积推广应用的促生菌菌剂产品数量不多。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一株具有促生功能的沙福芽孢杆菌及其菌剂与应用，可用于番茄育苗阶段。
一株沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)AMCC101030，已于2017年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.15071。
AMCC101030菌株的主要生物学特性为：菌落形状呈不规则圆形，边缘不整齐，表面粗糙有较多褶皱，不透明，菌落颜色为乳白色，培养基颜色未见明显变化。革兰氏染色镜检观察，阳性，细胞杆状，芽孢椭圆形。其接触酶、酪蛋白水解、明胶水解、柠檬酸盐利用、D-葡萄糖产酸、L-阿拉伯糖产酸、丙酸盐利用实验呈阳性，淀粉水解、苯丙氨酸脱氢酶实验呈阴性。
沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)AMCC101030的培养方法，步骤如下：
(1)将沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)AMCC101030划线接种于LB固体培养基平板上活化培养，制得活化菌株；
(2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于LB液体培养基中，进行种子培养，制得种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液按体积百分比5～8％的接种量接种到液体培养基中，进行液体培养，制得初级发酵液；
(4)将步骤(3)制得的初级发酵液按体积百分比5～8％的接种量接种到发酵培养基中，进行发酵培养，制得发酵液。经检测，制得的发酵液中AMCC101030菌株的菌液浓度为7.0×109～1.0×1010CFU/mL。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，活化条件为37℃活化培养24h。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，种子培养条件为37℃、180rpm振荡培养18h。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，液体培养条件为37℃培养8h。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，液体培养基每升组分如下：
玉米粉2％，豆饼粉3％，麸皮2％，柠檬酸钠0.5％，KH2PO4 0.03％，K2HPO4 0.01％，CaCl2 0.01％，pH7.0～7.2。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，发酵培养条件为37℃培养24h。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，发酵培养基每升组分如下：
玉米粉2％，豆饼粉3％，麸皮2％，柠檬酸钠0.5％，KH2PO4 0.03％，K2HPO4 0.01％，CaCl2 0.01％，pH7.0～7.2。
一种微生物菌剂，含有有效活菌数为5.0×1010～8.0×1010CFU/g的权利要求1所述的沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)AMCC101030。
上述微生物菌剂的制备方法，将上述发酵液经喷雾干燥后，即得。
上述沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)AMCC101030或微生物菌剂在育苗期促进番茄生长中的应用。
有益效果
本发明首次筛选获得了一株沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)AMCC101030菌株，该菌株具有明显促生效果，将该菌株掺混到育苗基质中，功能菌株分泌促生物质，从而促进了番茄幼苗的生长；经检测，相比于空白对照，使用该菌的番茄株高增加了60.84％；茎粗增加19.35％；地上鲜重增加128.8％；根表面积增加192％；根系体积增加472％。
附图说明
图1、沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)AMCC101030菌株的菌落形态及显微形态照片；
其中，左图为显微照片，右图为菌落形态照片；
图2、沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)AMCC101030菌株对番茄幼苗地上部促生效果照片；
其中，图左三为菌剂处理照片，图右三为空白对照照片；
图3、沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)AMCC101030菌株对番茄幼苗根系的促生效果照片；
其中，左图为空白对照照片，右图为菌剂处理照片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1菌株的分离、鉴定及保藏
一、AMCC101030菌株的分离
从植物根际土壤中筛选出一株促生菌株，命名为AMCC101030菌株。
AMCC101030菌株的菌落形态及显微形态见图1。其中图1中的左图为显微照片，图1中的右图为菌落形态照片；
由图1中的右图可以看出，菌落形状呈不规则圆形，边缘不整齐，表面粗糙有较多褶皱，不透明，菌落颜色为乳白色，培养基颜色未见明显变化。革兰氏染色镜检观察，阳性，细胞杆状，芽孢椭圆形。其接触酶、酪蛋白水解、明胶水解、柠檬酸盐利用、D-葡萄糖产酸、L-阿拉伯糖产酸、丙酸盐利用实验呈阳性，淀粉水解、苯丙氨酸脱氢酶实验呈阴性。
AMCC101030菌株的16Sr DNA序列如Sequence ID No.1所示。
二、AMCC101030菌株的保藏
经鉴定，AMCC101030菌株属沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)，已于2017年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.15071。
实施例2AMCC101030菌株产IAA能力测定
用接种环挑取斜面保存的AMCC101030菌株划线于LB(酵母膏0.5％，蛋白胨1％，氯化钠1％，琼脂1.6％，pH7.0，121℃，20min高压灭菌，均为质量百分比)平板上活化；将活化好的菌种接种于King培养液(蛋白胨20g，甘油15.0g，K2HPO4 1.15g，MgSO4·7H2O 1.5g，蒸馏水1 000mL，pH 7.2，添加0.05％的L型色氨酸，121℃，20min高压灭菌)中，37℃，200rpm摇床培养6天后，9000转离心10min，收集上清液，每毫升上清液加2ml比色液(Fe-HClO4成分：1ml 0.5M FeCl3溶液加上50ml的35％的HClO4溶液，混合)，暗处反应30min，测定OD530的值。
标准曲线的制作：称取吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)的标准品，用双蒸水分别配制浓度为2、3、4、5、6mg/L的标准溶液，每毫升上清液加2ml，暗处反应30min，比色液测定OD530nm的值，得标准曲线
结果表明：AMCC101030菌株在KING氏培养基中培养6d后，可产生6.08mg/L的IAA。
KING氏培养基组分如下：
蛋白胨20.0g/L磷酸氢二钾1.5g/L硫酸镁1.5g/L。
实施例3AMCC101030菌剂的制备
沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)AMCC101030的培养方法，步骤如下：
(1)将超低温冻存的沙福芽孢杆菌AMCC101030划线接种于LB固体培养基平板上，于37℃培养24h，制得活化菌株；
(2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于装有LB液体培养基的三角瓶中，于恒温振荡器中37℃，180rpm振荡培养18h，制得种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液以8％的接种量接种到液体培养基中，于37℃培养8h，制得初级发酵液；
(4)将步骤(3)制得的初级发酵液以5％的接种量接种到发酵培养基中，37℃培养24h，制得发酵液。
经检测，沙福芽孢杆菌AMCC101030发酵液的浓度为7.0×109～1.0×1010CFU/mL。
一种微生物菌剂的制备方法，将上述发酵液经喷雾干燥后，即得。经检测，菌剂浓度为达5.0×1010～8.0×1010CFU/g。
实施例4AMCC101030菌剂的促生长实验
将育苗基质放入盖有八层纱布的搪瓷托盘中，127℃灭菌1h后70℃烘干。待冷却至室温后称取AMCC101030菌剂以一定比例掺入到灭菌基质中，使基质中AMCC101030的菌浓度达到1.0×107CFU/g。将混有菌剂的育苗基质均匀的平铺于育苗穴盘中，以未掺入菌剂的灭菌基质为空白对照。
选大小一致的番茄种子浸种8h，用质量百分比浓度1％的次氯酸钠冲洗进行表面消毒，再用无菌水冲洗3次，均匀放置在3层纱布上并覆盖一层纱布，然后置于28℃培养箱恒温催芽2d，挑选出芽一致的种子点播于育苗穴盘中，培养。
结果表明：沙福芽孢杆菌AMCC101030菌对番茄育苗期具有明显的促生效果，相比于空白对照，使用该菌的番茄株高增加了60.84％；茎粗增加19.35％；地上鲜重增加128.8％；根表面积增加192％；根系体积增加472％，其他的植株指标也有显著差异，具体结果如表1和表2所示。
表1 AMCC101030菌剂对番茄植株促生效果
表2 AMCC101030菌剂对番茄根系促生效果
SEQUENCE LISTING
<110> 刘若晗
<120> 一株具有促生功能的沙福芽孢杆菌及其菌剂与应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1411
<212> DNA
<213> Bacillus safensis
<400> 1
tcgagcggac agaagggagc ttgctcccgg atgttagcgg cggacgggtg agtaacacgt 60
gggtaacctg cctgtaagac tgggataact ccgggaaacc ggagctaata ccggatagtt 120
ccttgaaccg catggttcaa ggatgaaaga cggtttcggc tgtcacttac agatggaccc 180
gcggcgcatt agctagttgg tggggtaatg gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc 240
tgagagggtg atcggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc 300
agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa 360
ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttag ggaagaacaa gtgcgagagt aactgctcgc 420
accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata 480
cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag ggctcgcagg cggtttctta 540
agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg gggagggtca ttggaaactg ggaaacttga 600
gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga 660
acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg 720
gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta 780
gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta acgcattaag cactccgcct ggggagtacg 840
gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg 900
tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga catcctctga caaccctaga 960
gatagggctt tcccttcggg gacagagtga caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg 1020
tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat 1080
tcagttgggc actctaaggt gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc 1140
aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatggaca gaacaaaggg 1200
ctgcaagacc gcaaggttta gccaatccca taaatctgtt ctcagttcgg atcgcagtct 1260
gcaactcgac tgcgtgaagc tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa 1320
tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccacg agagtttgca acacccgaag 1380
tcggtgaggt aacctttatg gagccagccg c 1411
Claims (10)
1.一株沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)AMCC101030，已于2017年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.15071。
2.沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)AMCC101030的培养方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)AMCC101030划线接种于LB固体培养基平板上活化培养，制得活化菌株；
(2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于LB液体培养基中，进行种子培养，制得种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液按体积百分比5～8％的接种量接种到液体培养基中，进行液体培养，制得初级发酵液；
(4)将步骤(3)制得的初级发酵液按体积百分比5～8％的接种量接种到发酵培养基中，进行发酵培养，制得发酵液。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中，活化条件为37℃活化培养24h。
4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中，种子培养条件为37℃、180rpm振荡培养18h。
5.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中，液体培养条件为37℃培养8h。
6.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中，液体培养基每升组分如下：
玉米粉2％，豆饼粉3％，麸皮2％，柠檬酸钠0.5％，KH2PO4 0.03％，K2HPO4 0.01％，CaCl20.01％，pH7.0～7.2。
7.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(4)中，发酵培养条件为37℃培养24h；
优选的，所述步骤(4)中，发酵培养基每升组分如下：
玉米粉2％，豆饼粉3％，麸皮2％，柠檬酸钠0.5％，KH2PO4 0.03％，K2HPO4 0.01％，CaCl20.01％，pH7.0～7.2。
8.一种微生物菌剂，其特征在于，含有有效活菌数为5.0×1010～8.0×1010CFU/g的权利要求1所述的沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)AMCC101030。
9.权利要求8所述微生物菌剂的制备方法，其特征在于，将权利要求2所述的发酵液经喷雾干燥后，即得。
10.权利要求1所述沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)AMCC101030或权利要求8所述微生物菌剂在育苗期促进番茄生长中的应用。
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