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CN108315330B - CRISPR-Cas9系统特异性靶向人RSPO2基因的sgRNA及敲除方法和应用 - Google Patents

CRISPR-Cas9系统特异性靶向人RSPO2基因的sgRNA及敲除方法和应用 Download PDF

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CN108315330B CN201711288951.3A CN201711288951A CN108315330B CN 108315330 B CN108315330 B CN 108315330B CN 201711288951 A CN201711288951 A CN 201711288951A CN 108315330 B CN108315330 B CN 108315330B
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Abstract

本发明公开了一种CRISPR‑Cas9系统特异性靶向人RSPO2基因的sgRNA及敲除方法和应用，属于生物技术领域。本发明的目的应用CRISPR‑Cas9系统特异性敲除人RSPO2基因，抑制Wnt/β‑catenin信号通路并使活化的肝星状细胞回退到静止状态或凋亡，从而有效促进肝纤维化的恢复过程。本发明设计、合成了一组特异性靶向RSPO2基因的sgRNA，将该sgRNA连接至慢病毒载体，并包装成慢病毒，能在细胞内稳定的转录生产sgRNA，可以发挥长期抑制靶基因表达的作用。

Description

CRISPR-Cas9系统特异性靶向人RSPO2基因的sgRNA及敲除方 法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及CRISPR-Cas9系统中特异性靶向人RSPO2基因的sgRNA及敲除方法和应用。
背景技术
规律成簇间隔短回文重复系统(CRISPR-Cas9)广泛存在于细菌和古细菌中，是由RNA介导、可遗传的获得性免疫系统。CRISPR(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats)由高度保守的重复序列(repeats)和多个不同的间隔序列(spacer)顺序排列组成，重复序列长度通常21～48bp，重复序列之间被26～72bp的间隔序列隔开。Cas9(CRISPR associated)是一种双链DNA核酸酶，拥有两个结构域：①HNH-like结构域切割与crRNA(CRISPR RNA)互补的DNA链，②RuvC-like结构域切割非互补链。CRISPR-Cas9的基本机制为：①CRISPR序列转录并加工成crRNA，②tracrRNA(trans-activating crRNA)招募Cas9蛋白，③crRNA的间隔序列与与目标序列的PAM(Protospacer Adjacent Motif)邻近靶序列配对，Cas9蛋白双酶切活性被激活从而在靶位点处引起双链断裂(double-strandedbreaks DSB)，断裂的双链DNA通过非同源末端直接连接(nonhomologous end joining，NHEJ)或者同源重组(homology-directedrepair，HDR)进行修复。修复后的DNA由于碱基的随机插入或删除引起移码突变从而抑制基因的表达，这就实现了在DNA水平上对基因进行定向敲除
CRISPR特异性编辑靶序列是通过crRNA和tracrRNA和靶序列互补识别实现的。现已将tracrRNA与crRNA表达为一条嵌合的向导RNA(single guide RNA，sgRNA)，将CRISPR-Cas9系统简化为Cas9蛋白和sgRNA两个组分，使得CRISPR-Cas9系统具有构建简单、效率高、成本低廉等优点，是基因组编辑技术最合适的选择。为防止脱靶和错误靶向，设计精准靶向目标序列的sgRNA是CRISPR-Cas9系统的关键技术。
肝纤维化是肝脏对各种原因所致慢性肝损伤的创伤愈合反应，导致肝小叶内和汇管区大量纤维组织增生和沉淀，病理学特点是以胶原蛋白为主的细胞外基质各种成分合成增多，降解相对不足，但并未形成小叶内间隔，如进一步发展则进入肝硬化。肝纤维化是可逆的过程，对肝纤维化的预防和早期干预是稳定病情、阻止肝纤维化向肝硬化和肝癌发展的最佳措施。
肝星状细胞是肝脏合成细胞外基质的主要细胞，其激活发生肌成纤维细胞的表型转换是肝纤维化发生的中心环节。肝星状细胞的激活受众多信号通路的调控，现有研究结果证实Wnt信号通路影响肝星状细胞的活化，阻断Wnt信号通路可抑制肝星状细胞的增殖及诱导其凋亡。但Wnt信号通路参与了多种生物学过程，包括细胞形态与功能的分化及维持、免疫、细胞癌变与凋亡，直接阻断该信号通路可能具有广泛的不良生物学效应。R-脊椎蛋白2(RSPO2)是新发现的Wnt信号通路的重要调控因子，RSPO2可以激活并增强Wnt/β-catenin信号通路，在生物体的组织分化、器官形成以及疾病发生过程中发挥重要作用。
在肝纤维化治疗的研究中，如何不直接阻断Wnt等重要信号通路而达到调控的肝星状细胞活化的目的，是一个亟待解决的重要问题。
现已有技术方案应用RSPO2抗体治疗纤维化(专利201580049993.4)。但应用RSPO抗体进行靶基因治疗受到很多技术因素的限制：(1)抗体只能起到暂时阻断的作用；(2)不易研发出有效的抗体；(3)无法同时阻断多种抑制性受体；(4)只针对细胞外靶点。
发明内容
本发明的目的应用CRISPR-Cas9系统特异性敲除人RSPO2基因，抑制Wnt/β-catenin信号通路并使活化的肝星状细胞回退到静止状态或凋亡，从而有效促进肝纤维化的恢复过程。本发明设计、合成了一组特异性靶向RSPO2基因的sgRNA，将该sgRNA连接至慢病毒载体，并包装成慢病毒，能在细胞内稳定的转录生产sgRNA，可以发挥长期抑制靶基因表达的作用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种CRISPR-Cas9系统中特异性靶向人RSPO2基因的sgRNA，所述sgRNA对应的DNA序列如SEQ ID NO：1、3、5、7、9中任意一条的第1～20位所示。
进一步的，上述SEQ ID NO：1、3、5、7、9中任意一条的第21～23位为该靶序列对应的PAM序列。
根据上述DNA序列，该CRISPR-Cas9系统中靶向人RSPO2基因的sgRNA即如SEQIDNO：2、4、6、8、10中任意一条所示。
第二方面，本发明提供了一种含有上述第一方面的各方案中任一sgRNA对应的DNA序列的载体，所述的载体为病毒表达载体或非病毒表达载体，所述的DNA序列与载体相连。
进一步的，第二方面中所述的载体可为CRISPR-Cas9重组慢病毒载体，其制备方法如下：首先合成寡核苷酸序列，寡核苷酸序列中：正义链：5`-CACC-G-(20N)-3`，反义链：5`-AAAC-(20N的互补序列)-C-3`，其中所述的20N为第一方面的各方案中中任一sgRNA对应的DNA序列；将所述正义链和反义链磷酸化和退火，形成带有BsmBI粘性末端的片段，然后将其连接至经过BmsBI酶切线性化的载体lenti CRISPR上，得到CRISPR-Cas9重组慢病毒载体。
第三方面，本发明提供了一种由第二方面所述载体或其优选方式所述慢病毒载体包装的特异性敲除RSPO2基因的CRISPR-Cas9系统。
第四方面，本发明提供了一种利用第三方面所述CRISPR-Cas9系统特异性敲除人RSPO2基因的方法，其做法为：将所述的CRISPR-Cas9系统感染人肝星状细胞LX2，特异性敲除人RSPO2基因。该方法可以用于非诊断或治疗目的，例如为科学研究提供商业化服务，也可以用于与RSPO2基因相关的疾病治疗。
第五方面，本发明还提供了第三方面所述CRISPR-Cas9系统在制备肝纤维化治疗药物或试剂盒中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明公开了一种应用CRISPR-Cas9特异性敲除人RSPO2基因的方法及其在肝纤维化研究中的应用，该CRISPR-Cas9系统能特异性抑制人RSPO2基因的表达，导入人肝星状细胞后能降低Wnt信号通路的活性，使肝纤维化的标志物α-SMA和Collagen I的表达显著下调。表明本发明设计的针对RSPO2基因靶点的CRISPR-Cas9系统能有效抑制肝星状细胞活化，从而为肝纤维化治疗提供一种有效途径。
同时，本发明公开了一种应用CRISPR-Cas9高效、特异性敲除RSPO2基因的方法，有效地解决了利用RSPO抗体治疗纤维化存在的问题：(1)直接敲除RSPO2基因，可以实现长期抑制靶基因的效果；(2)通过慢病毒或腺病毒载体，能在细胞内稳定的转录生产sgRNA，可以发挥长期抑制靶基因表达的作用。(3)可以针对RSPO2的多个编码序列进行同时敲除，甚至可以针对多个靶基因进行同时敲除；(4)可以同时针对细胞外靶点和细胞内靶点。
附图说明
图1为本发明中CRISPR-Cas9特异性敲除人RSPO2基因的原理图；
图2为本发明中sgRNA示意图，图中序列GGG为PAM，最下方序列为sgRNA；
图3为针对RSPO2基因设计的1、2、3、4、5靶点的慢病毒载体质粒转化大肠杆菌DH5a的测序结果；
图4为293FT细胞转染针对RSPO2基因设计的1、2、3、4、5靶点的慢病毒载体质粒，48小时后收集细胞，PCR扩增RSPO2基因，产物经T7EI酶切电泳检测结果图；
图5为QPCR验证CRISPR-Cas9特异性敲除人肝星状细胞中的RSPO2基因，结果表明下调了RSPO2的mRNA水平；
图6为Western Blot验证CRISPR-Cas9体系敲除人肝星状细胞中的RSPO2基因，结果表明下调了RSPO2蛋白水平；
图7为免疫荧光验证CRISPR-Cas9体系敲除人肝星状细胞中的RSPO2基因的靶点1，结果表明抑制肝星状细胞纤维化；
图8为MTT增殖检测验证CRISPR-Cas9体系敲除人肝星状细胞中的RSPO2基因的靶点1，结果表明抑制肝星状细胞的增殖。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明，但其仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的范围。
首先，构建CRISPR-Cas9特异性敲除人RSPO2基因的方法包括以下步骤：
一、设计特异性靶向人RSPO2基因的sgRNA
1.靶向人RSPO2基因的sgRNA设计，应满足以下要求：
(1)sgRNA序列长度为20个碱基序列；
(2)sgRNA在RSPO2基因上的靶点位于基因的外显子；
(3)sgRNA在RSPO2基因上的靶点位于基因的功能结构域中为佳；
(4)选择靶序列的PAM为5'-NGG；
(5)为使载体的U6启动子有效，sgRNA的靶序列起始为G为佳；
(6)sgRNA靶序列格式为：
5`-G-(19N)-NGG-3`(靶序列起始为G)
或5`-(20N)-NGG-3`(靶序列起始不为G)
上述靶序列格式中，19N或20N表示靶位点的19或20个碱基序列
2.靶向人RSPO2基因的sgRNA选择，应满足以下要求：
(1)在NCBI数据库中用BLAST，确定sgRNA的靶序列唯一且不会与人RSPO2基因之外的其他基因序列同源；
(2)sgRNA靶点位于DNA酶I超敏感位点(DNase I hypersensitive sites,DHSs)；
(3)sgRNA靶点不能离起始密码子(ATG)太近；
(4)脱靶(Off-Target)率低。
最终选择出5条靶序列，如表1所示。
表1、针对不同位点的靶向人RSPO2基因的靶序列
靶编号 靶序列 PAM
1 5`-TTGTCTTGTTCAAAGGACAA-3` TGG
2 5`-TGTCTTGTTCAAAGGACAAT-3` GGG
3 5`-GGTGTCCATAGTACCCGGAT-3` GGG
4 5`-CGGTGTCCATAGTACCCGGA-3` TGG
5 5`-GGCTCGGTGTCCATAGTACC-3` CGG
二、构建特异性敲除RSPO2基因的CRISPR-Cas9重组慢病毒载体
1.sgRNA的寡核苷酸构建
(1)根据选择的sgRNA，在其对应的DNA序列的5`端加上CACC(BsmBI酶切位点粘性末端的互补序列)和G(确保U6启动子有效)，得到正向寡核苷酸(Forward oligo)；
(2)根据选择的sgRNA，获得其对应DNA的互补链，在其对应的DNA序列的5`端加上AAAC(BsmBI酶切位点粘性末端的互补序列)，在3`端加上C，得到反向寡核苷酸(Reverseoligo)；
(3)得到的寡核苷酸序列格式为：
正义链：5`-CACC-G-(20N)-3`
反义链：5`-AAAC-(20N的互补序列)-C-3`
(4)分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，如表2所示。
表2、包含特异性激活人RSPO2基因的sgRNA的寡核苷酸序列
Figure BDA0001499025020000051
Figure BDA0001499025020000061
2.载体线性化及回收
慢病毒载体选用lentiCRISPR V2(Feng Zhang,Nature Methods,2014)，该载体含有Cas9和sgRAN骨架，并含有一个U6启动子来控制sgRNA的表达，在用BsmBI酶切后可以插入含BsmBI粘性末端的sgRNA片段。
采用BmsBI酶切载体lentiCRISPR，并采用DNA纯化产物试剂盒纯化回收酶切产物。
3.寡聚核苷酸磷酸化、退火、连接至载体lenti CRISPR
(1)将正义链、反义链磷酸化产物退火，形成带有BsmBI粘性末端的片段
(2)将以上片段分别连接上述酶切后的载体lentiCRISPR，形成CRISPR-Cas9重组慢病毒载体。
4.转化及测序
转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆并测序鉴定。
5.转染293FT细胞，PCR扩增RSPO2基因，T7EI酶切鉴定。
三、特异性敲除人RSPO2基因的CRISPR-Cas9系统的有效性验证
将上述构建的特异性敲除人RSPO2基因的CRISPR-Cas9重组慢病毒载体转染293FT细胞，回收细胞，通过对比GFP荧光表达验证RSPO2基因的表达情况。
四、慢病毒包装特异性敲除RSPO2基因的CRISPR-Cas9系统
慢病毒病毒包装系统为四质粒系统(上海吉玛基因)，包括穿梭载体，PG-p1-VSVG，PG-P2-REV,PG-P3-RRE。其中穿梭载体能表达目的基因；PG-p1-VSVG、PG-P2-REV、PG-P3-RRE含有病毒包装所必须的元件。上述构建的慢病毒载体和慢病毒包装系统(PG-P1-VSVG、PG-P2-REV、PG-P3-RRE)转染293FT细胞，收集转染后的细胞，离心浓缩并过滤，慢病毒滴度试剂盒检测慢病毒滴度。
五、含特异性敲除人RSPO2基因的CRISRP/Cas9系统的慢病毒的有效性验证
上述构建的特异性敲除RSPO2基因的CRISPR-Cas9慢病毒感染人肝星状细胞LX2。收集细胞进行QPCR检测，结果表明验证RSPO2基因的表达显著下调。同时应用Western Blot检测RSPO2蛋白水平，结果表明RSPO2蛋白水平显著下调。免疫荧光和MTT增殖检测均表明本发明所设计的CRISPR-Cas9系统抑制了RSPO2基因的表达，从而缓解了人肝星状细胞LX2的纤维化进程。
需要说明的是，本发明提供的各个sgRNA可以联合使用，可以是任意两种或多种sgRNA的联合使用，通过联合使用，CRISPR-Cas9系统可以靶向多个位点，从而能够更有效地敲除人RSPO2基因。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述，需要注意的是，下述实施例间并非独立进行的，而是依次连续的实施过程。以下实施例中所涉及的技术，包括细胞培养、载体构建、细胞转染、克隆、基因测序、Western blot检测、PCR扩增与检测、免疫荧光等分子生物学技术，除非特别说明，均为本领域内的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂、质粒、细胞株等，除非特别注明，均为一般本领域的技术人员可以通过公共途径获得。
实施例1sgRNA序列设计
根据我们的前期工作和经验，本发明对sgRNA序列的设计方案如下：(1)sgRNA长度为20个碱基序列；(2)sgRNA在RSPO2基因上的靶点位于基因的外显子，易引起基因片段的缺失或移框突变，从而达到基因完全失活的目的；(3)sgRNA在RSPO2基因上的靶点位于基因的功能结构域中为佳，从而更以达到基因完全失活的目的；(4)在NCBI数据库中使用Blast以确定sgRNA靶序列为唯一，减少潜在的脱靶位点；(5)选择PAM为5'-NGG；(6)为使载体的U6启动子有效，确保sgRNA靶序列起始为G；(7)sgRNA靶序列格式为：
正义链：5`-G-(19N)-NGG-3`
反义链：5`-CCN-(19N)-C-3`(19N表示靶位点的19个碱基序列)
或：
正义链：5`-(20N)-NGG-3`
反义链：5`-CCN-(20N)-3`
根据上述方法设计靶向人RSPO2基因的sgRNA序列，本实施例选择其中20条靶向人RSPO2基因的sgRNA序列为例说明本发明的具体实现，20条sgRNA序列如序列表SEQ IDNO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40所示，其对应的DNA靶序列如序列表中单数序数的序列SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39所示(其中1～20位为靶序列，最后三位为PAM序列)。
实施例2sgRNA序列选择
使用Blast(www.ncbi.nlm.nig.gov/Blast)将候选sgRNA序列和基因组数据库进行同源分析，保证设计的sgRNA的靶序列唯一且不会与人RSPO2基因之外的其他基因序列同源。同时，根据以下原则筛选sgRNA，以得到高效、特异性敲除人RSPO2基因的sgRNA序列：(1)sgRNA靶点位于DNA酶超敏感位点；(2)sgRNA靶点不能离起始密码子(ATG)太近；(3)脱靶(Off-Target)率低
根据以上方法，在20条靶向人RSPO2基因的sgRNA中，仅有5条针对不同位点的靶向人RSPO2基因的sgRNA序列满足要求(序列表SEQ ID NO.2、4、6、8、10)，其余15条均不满足要求。这5条sgRNA的靶序列和对应的PAM序列如表1(对应序列表中的SEQ ID NO.1、3、5、7、9)。
实施例3sgRNA的寡核苷酸的合成
对上述靶向人RSPO2基因的sgRNA靶序列，两端分别加上BsmBI酶切位点和PAM序列：(1)根据选择的sgRNA靶序列，在5`端加上CACC(BsmBI酶切位点粘性末端的互补序列)和G(确保U6启动子有效)，得到正向寡核苷酸；(2)根据选择的sgRNA，获得其对应DNA的互补链，在其5`端加上AAAC(BsmBI酶切位点粘性末端的互补序列)，在3`端加上C，得到反向寡核苷酸。
应用化学合成法分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，得到的寡聚核苷酸序列如表2所示。
实施例4慢病毒载体构建
将上述五对合成的寡核苷酸单链片段(表2)退火并分别连接至慢病毒载体，该载体将在细胞内转录出特异性靶向RSPO2基因的sgRNA。退火及连接过程如下：
1.载体线性化及回收
慢病毒载体选用lentiCRISPR V2(Feng Zhang,Nature Methods,2014)，该载体含有Cas9和sgRAN骨架序列，并含有U6启动子来控制sgRNA的表达，以及EFS-NS启动子来控制Cas9的表达。在用BsmBI酶切后可以插入含BsmBI粘性末端的sgRNA片段。
1)lentiCRISPR质粒用BmsBI酶切，酶切体系为：
Figure BDA0001499025020000081
2)37℃孵育3～4小时
3)采用DNA纯化产物试剂盒纯化回收酶切产物。
2.寡核苷酸磷酸化
采用T4多聚磷酸酶(Takara)将合成的寡核苷酸磷酸化。
3.寡核苷酸退火
1)在无菌离心管中建立以下退火反应体系(室温)：
Figure BDA0001499025020000091
2)95℃温育4分钟，70℃温育10分钟；
3)取出离心管，室温放置5-10分钟，冷却至室温；
4)短暂离心，混匀。
4.连接至载体
1)将退火产物连接着载体lentiCRISPR，连接体系如下：
Figure BDA0001499025020000092
2)16℃温育1小时，，最终得到慢病毒载体质粒：①lenti_sgRNA_RSPO2_1、②lenti_sgRNA_RSPO2_2、③lenti_sgRNA_RSPO2_3、④lenti_sgRNA_RSPO2_4和⑤lenti_sgRNA_RSPO2_5。
5.转化大肠杆菌DH5a
1)取连接产物(①lenti_sgRNA_RSPO2_1、②lenti_sgRNA_RSPO2_2、③lenti_sgRNA_RSPO2_3、④lenti_sgRNA_RSPO2_4和⑤lenti_sgRNA_RSPO2_5)各10ul，加入100ulDH5a感受态细胞中吹匀，放置冰中静置20min，再放入42℃水浴90s，迅速置于冰浴中3min，加入500ul LB液体培养基，放置摇床180rpm 37℃1小时；
2)取菌液100ul均匀涂布于LB固体培养基(含1/1000氨苄青霉素)，37℃培养过夜；
6.筛选阳性克隆并测序鉴定
1)挑选菌落PCR初步鉴定阳性克隆
引物序列为：
上游引物：5`-GAGGGCCTATTCCCATGATTCCTTCATAT-3`
下游引物：5`-CATAGCGTAAAAGGAGCAAC-3`
PCR体系如下：
Figure BDA0001499025020000101
扩增条件：94℃10分钟，1个循环；94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃6分钟，1个循环。
2)筛选的阳性克隆进一步做测序分析。结果表明(参见图3)：慢病毒载体构建成功。
实施例5sgRNA靶点内源活性验证
上述合成的慢病毒载体转染293FT细胞，PCR扩增RSPO2基因，T7EI酶切鉴定sgRNA靶点内源性活性。
1.上述构建的慢病毒载体质粒转染293FT细胞
1)293FT细胞以2×104细胞/孔接种于96孔板中，加入含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，37℃5％CO2培养箱培养；
2)感染前2h，将细胞培养基更换为无血清培养基；
3)待细胞融合度达70％时，转染慢病毒载体，共分六组：①lenti_sgRNA_RSPO2_1、②lenti_sgRNA_RSPO2_2、③lenti_sgRNA_RSPO2_3、④lenti_sgRNA_RSPO2_4、⑤lenti_sgRNA_RSPO2_5、⑥阴性对照组，反应体系如下：
慢病毒载体质粒 0.1μg/孔
Lipofectamine 2000 0.6μl/孔
4)转染48小时回收细胞；
2.流式分选转染阳性细胞；
3.提取分选阳性细胞的DNA，PCR扩增RSPO2基因
引物序列为：
上游引物：5`-GTTTCCTCAGGGCATTGCTT-3`
下游引物：5`-TGCATTATTTCCCTGGCTGA-3`
扩增条件：95℃3分钟，1个循环；94℃30秒，55℃30秒，30个循环；72℃6分钟，1个循环。
4.T7EI酶切鉴定
回收的PCR产物经T7Endonuclease I酶切鉴定，酶切体系：
Figure BDA0001499025020000111
37℃水浴45分钟，随后取10μl酶切产物采用琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明(参见图4)：针对RSPO2基因的各个靶位点均有不同程度的突变。
实施例6慢病毒载体有效性验证
1.293FT细胞以2×104细胞/孔接种于96孔板中，加入含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，37℃5％CO2培养箱培养；
2.感染前2h，将细胞培养基更换为无血清培养基；
3.待细胞融合度达70％时，转染慢病毒载体，共分六组：①lenti_sgRNA_RSPO2_1、②lenti_sgRNA_RSPO2_2、③lenti_sgRNA_RSPO2_3、④lenti_sgRNA_RSPO2_4、⑤lenti_sgRNA_RSPO2_5、⑥阴性对照组，反应体系如下：
慢病毒载体质粒 0.1μg/孔
Lipofectamine 2000 0.6μl/孔
4.转染48小时收，回收细胞；
5.酶标仪在在激发光为485nm，发射光为533nm条件下检测样品的荧光强度；
6.计算荧光强度：
荧光强度＝(转染组荧光强度-非转染组荧光强度)/非转染组荧光强度
结果显示含特异性敲除RSPO2的CRISPR-Cas9系统的慢病毒载体(lenti_sgRNA_RSPO2_1、lenti_sgRNA_RSPO2_2和lenti_sgRNA_RSPO2_3)能有效地抑制RSPO2基因表达。
实施例7慢病毒包装
慢病毒病毒包装系统为四质粒系统(上海吉玛基因)，包括穿梭载体，PG-p1-VSVG，PG-P2-REV,PG-P3-RRE。其中穿梭载体能表达目的基因；PG-p1-VSVG、PG-P2-REV、PG-P3-RRE含有病毒包装所必须的元件。
1.细胞株
用0.25％胰酶消化生长状态良好的293T细胞，并于感染前一天接种到10cm培养皿(每个培养皿接种细胞约为2-2.5×106)，37℃，CO2培养箱内培养；
2.慢病毒包装
上述构建的慢病毒载体(①lenti_sgRNA_RSPO2_1、②lenti_sgRNA_RSPO2_2、③lenti_sgRNA_RSPO2_3、④lenti_sgRNA_RSPO2_4、⑤lenti_sgRNA_RSPO2_5)按以下方法准备：
1)该慢病毒包装系统的反应体系如下：
Figure BDA0001499025020000121
调整总体积为2.5ml，室温下温育5分钟；
2)取100μl Lipofectamine2000试剂在另一管中与2.4ml Opti-MEM混合，在室温下温育5分钟。把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine2000进行混合，轻轻颠倒混匀5分钟。室温下温育20分钟；
3)将DNA与Lipofectamine2000混合液转移至细胞密度达70％-80％的293T细胞培养液中，混匀，培养4-6小时后更换DMEM(+10％FBS)培养基，于37℃，CO2培养箱继续培养48小时；
3.病毒收集与浓缩
1)收集转染后48-72小时(转染即可为0小时计起)293FT细胞上清液；
2)于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；
3)以0.45um滤器上过滤上清液于40ml超速离心管中；
4)把病毒粗提液样品加入到过滤杯中(最多19ml)，将过滤杯插到滤过液收集管中；
5)在4000×g离心，至需要的病毒浓缩体积。通常时间为10-15分钟；
6)离心结束后，取出装置，将过滤杯和下面的液收集分开；
7)离心力不超过1000g,时间为2分钟；
8)样品收集杯中的即为病毒浓缩液，获得病毒LV_RSPO2_1、LV_RSPO2_2、LV-RSPO2_3、LV-RSPO2_4和LV-RSPO2-5；
9)将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80℃长期保存。
4.病毒滴度测定
采用quickTiter慢病毒滴度试剂盒检测慢病毒滴度
1)使用前按照试剂盒说明书准备好所有试剂并混合均匀；
2)每个慢病毒样品，标准病毒液，空白和对照培养基准备两个复孔；
3)添加100ul灭活的慢病毒样品、p24抗原标准品到p24抗体包被板；
4)用封闭膜将96孔板密封，置37℃孵育4小时；
5)去除封闭膜，弃去96孔板内液体，加入250ul 1x洗涤液洗涤，去除洗涤液，重复洗版3次，控干板子；
6)每空加入100ul稀释后的FITC标记的抗p24的单克隆抗体；
7)用板膜将96孔板密封，放置到摇床上，室温孵育1小时；
8)去除封板膜，弃去96孔板内液体，洗板3次；
9)每孔加入100ul稀释后的HRP标记的抗FITC的单克隆抗体。用封板膜将96孔板密封，放置摇床上，室温孵育1小时；
10)去除封板膜，弃去孔板内液体，洗涤3次，立即进行下一步；
11)将底物液平衡到室温，每孔加入100ul底物液，包括空白板。放置摇床上，室温孵育20-3分钟；
12)每孔加入100ul终止液终止反应，迅速读板。用酶标仪在450nm波长处，检测各孔吸光度值；
计算出慢病毒p24蛋白的量，一个慢病毒颗粒(LP)中大概有2000个p24分子，根据公式：
1ng p24＝1.25x107LP
得到慢病毒滴度。
表3.慢病毒滴度
Figure BDA0001499025020000131
Figure BDA0001499025020000141
实施例8转染人肝星状细胞株
1)培养人肝星状细胞LX2，将细胞悬液接种于12孔板中，37℃5％CO2培养箱培养；
2)待细胞融合度达30％至40％时，将细胞分组：①阴性对照组：阴性对照慢病毒颗粒感染细胞；②RSPO2_1实验组：使用上述构建的LV_RSPO2_1慢病毒载体感染细胞；③RSPO2_2实验组：使用上述构建的LV_RSPO2_2慢病毒载体感染细胞；④RSPO2_3实验组：使用上述构建的LV_RSPO2_3慢病毒载体感染细胞；④RSPO2_4实验组：使用上述构建的LV_RSPO2_4慢病毒载体感染细胞；⑤RSPO2_5实验组：使用上述构建的LV_RSPO2_5慢病毒载体感染细胞。
3)取出4℃保存的病毒，使用台式离心机离心20秒；将按照MOI为0.2的慢病毒稀释到培养基中，并尽可总能保证所获得的含有慢病毒的培养基的体积为最小体积，以期获得最佳的感染效率；
4)细胞融合度为70％时，进行病毒感染：
a.使用移液器吸取准确体积的病毒液加入准备好的培养基
b.吸去原细胞培养器皿中的培养基(如果细胞生长良好，密度适宜，则不用换液)
c.在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液
d.混匀后放于二氧化碳培养箱(37℃、5％CO2)孵育过夜
5)12小时后观察细胞状态，未出现明显细胞毒性作用，继续培养48小时后更换培养基；若有明显细胞毒性，立即更换培养基；
6)感染4至5天后观察慢病毒报告基因GFP表达情况，感染效率低于50％者，重新进行感染；感染效率大于50％者继续培养，然后收集细胞作进一步检测。
实施例9QPCR检测
如实施例8所述，将构建的慢病毒转染人肝星状细胞LX2，QPCR检测人肝星状细胞中RSPO2和肝纤维化标志物α-SMA、Collagen-I的mRNA水平。
1)PCR引物如下所示：
表4.QPCR引物
Figure BDA0001499025020000151
2)Trizol法提取总RNA，-80℃保存；
3)紫外分光光度计测定260nm和280nm波长处的吸光度值，计算提取的总RNA浓度；4)用逆转录试剂盒逆转录合成cDNA，反应体系如下：
Figure BDA0001499025020000152
25℃10分钟，42℃50分钟，85℃5分钟；-20℃保存；
5)PCR反应体系为：
Figure BDA0001499025020000153
在ABI 7500PCR仪上进行反应；
6)PCR条件：94℃4分钟，1个循环；94℃20秒，60℃30秒，72℃30秒，共35个循环；72℃延伸5分钟；
7)用SDS软件进行数据分析，用比较Ct值的方法分析结果，目的基因的表达量由β-actin进行标准化。
QPCR检测显示，与对照组相比，LV_RSPO2_1、LV_RSPO2_2、LV_RSPO2_3、LV_RSPO2_4、LVRSPO2_5显著下调人肝星状细胞中的RSPO2和肝纤维化标志物α-SMA、Collagen-I(参见图5)的mRNA水平。表明本发明所设计的CRISPR-Cas9系统沉默了RSPO2靶基因的表达，从而抑制了肝星状细胞的激活。
实施例10Western blot检测
如实施例8所述，将构建的慢病毒转染人肝星状细胞LX2，Western blot法检测人肝星状细胞中RSPO2蛋白的表达。
1)RIPA裂解液提取人肝星状细胞的总蛋白；
2)用酶标仪测定562nm波长处各孔的吸光度，最后根据标准曲线计算蛋白浓度；
3)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜、5％脱脂奶粉封闭后，分别加入RSPO2抗体(1:1000)、α-SMA抗体(1:300)和Collagen I抗体(1:1000)，4℃孵育过夜；
4)洗膜后加入二抗(1:2000)，室温孵育2小时后电化学发光试剂检测；
5)β-actin蛋白为内参照，凝胶扫描成像系统(美国Bio-Rad公司)对各条带的灰度值进行分析。
Western blot法检测显示，与对照组相比，LV_RSPO2_1、LV_RSPO2_2、LV_RSPO2_3、LV_RSPO2_4、LVRSPO2_5显著下调人肝星状细胞LX2中的RSPO2蛋白(参见图6)的表达。表明本发明所设计的CRISPR-Cas9系统沉默了RSPO2靶基因的表达，从而有效抑制了肝星状细胞的激活。
实施例11免疫荧光检测
如实施例8所述，将构建的慢病毒转染人肝星状细胞LX2，免疫荧光法检测人肝星状细胞中RSPO2蛋白和肝纤维化标志物α-SMA的表达。
1)对慢病毒LV_RSPO2_1转染的人肝星状细胞，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10分钟，然后用4％多聚甲醛在室温条件下固定细胞15分钟；
2)PBS冲洗细胞2次，每次10分钟，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15分钟；
3)PBS冲洗细胞2次，每次10分钟，然后在室温条件下，用4％BSA封闭细胞30分钟；
4)按1:100的比例分别稀释各一抗(RSPO2和α-SMA)，然后将其放在4℃冰箱中
孵育过夜；
5)PBS冲洗细胞3次，每次10分钟，按1：100的比例稀释相应二抗，37℃条件下
放置1小时；
6)用PBS冲洗3次，每次10分钟，最后DAPI染细胞核并用荧光显微镜拍照。
免疫荧光显示(参见图7)，与对照组相比，LV_RSPO2_1显著下调了人肝星状细胞中RSPO2蛋白和α-SMA蛋白的表达。表明本发明所设计的CRISPR-Cas9系统抑制了RSPO2靶基因的表达，从而缓解了肝星状细胞的肝纤维化发展。
实施例12MTT增殖检测
如实施例8所述，将构建的慢病毒转染人肝星状细胞LX2，MTT法检测人肝星状细胞的增殖情况。
1)人肝星状细胞接种于96孔培养板，每孔细胞密度为4×103；
2)如实施例4所述，转染LV_RSPO2_1对照组慢病毒载体；
3)在转染后24小时、48小时和72小时，每孔加入10μL MTT液体；
4)37℃孵育4小时，每孔加入100μL DMSO，充分摇匀；
5)用酶标仪，以570nm的波长进行吸光度检测，计算细胞存活率。
MTT法检测显示(参见图8)，与对照组相比，LV_RSPO2_1明显下调了人肝星状细胞的增殖。表明本发明所设计的CRISPR-Cas9系统沉默了RSPO2靶基因的表达，从而有效抑制了肝星状细胞的增殖。
从以上实施例可以看出，本发明的CRISPR-Cas9系统能够实现人RSPO2基因的敲除，且敲除效率也较高。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
序列表
<110> 嘉兴市第一医院
<120> CRISPR-Cas9系统特异性靶向人RSPO2基因的sgRNA及敲除方法和应用
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgtcttgtt caaaggacaa tgg 23
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uugucuuguu caaaggacaa 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgtcttgttc aaaggacaat ggg 23
<210> 4
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ugucuuguuc aaaggacaau 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggtgtccata gtacccggat ggg 23
<210> 6
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gguguccaua guacccggau 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cggtgtccat agtacccgga tgg 23
<210> 8
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgguguccau aguacccgga 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggctcggtgt ccatagtacc cgg 23
<210> 10
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggcucggugu ccauaguacc 20
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atctgttcat atctggggct cgg 23
<210> 12
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aucuguucau aucuggggcu 20
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgtatcaaat cccatttgca agg 23
<210> 14
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
uguaucaaau cccauuugca 20
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gtatcaaatc ccatttgcaa ggg 23
<210> 16
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
guaucaaauc ccauuugcaa 20
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agaacaactt ctgttgacat cgg 23
<210> 18
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
agaacaacuu cuguugacau 20
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggcgcatccc ttctcttcga agg 23
<210> 20
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggcgcauccc uucucuucga 20
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tcttcttcct tcgaagagaa ggg 23
<210> 22
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ucuucuuccu ucgaagagaa 20
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gcctgcattc ctgcccatcc ggg 23
<210> 24
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gccugcauuc cugcccaucc 20
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tgcacatctg ttcatatctg ggg 23
<210> 26
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ugcacaucug uucauaucug 20
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cgaaactgca tctgggcggt cgg 23
<210> 28
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cgaaacugca ucugggcggu 20
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
aaggcgaaac tgcatctggg cgg 23
<210> 30
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aaggcgaaac ugcaucuggg 20
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gaaaaggcga aactgcatct ggg 23
<210> 32
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gaaaaggcga aacugcaucu 20
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gttcagaatg atgagggcaa agg 23
<210> 34
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
guucagaaug augagggcaa 20
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
catgcagttc agaatgatga ggg 23
<210> 36
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
caugcaguuc agaaugauga 20
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ccatgcagtt cagaatgatg agg 23
<210> 38
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ccaugcaguu cagaaugaug 20
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
cctcatcatt ctgaactgca tgg 23
<210> 40
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ccucaucauu cugaacugca 20

Claims (6)

1.一种CRISPR-Cas9系统中靶向人RSPO2基因的sgRNA，其特征在于，所述的sgRNA序列如SEQ ID NO：2、4、6、8、10中任意一条所示。
2.一种含有如权利要求1所述sgRNA对应的DNA序列的载体，所述的载体为病毒表达载体或非病毒表达载体，所述的DNA序列与载体相连。
3.一种含有如权利要求1所述sgRNA对应的DNA序列的CRISPR-Cas9重组慢病毒载体，其特征在于，其制备方法如下：首先合成寡核苷酸序列，寡核苷酸序列中：正义链：5`-CACC-G-(20N)-3`，反义链：5`-AAAC-(20N的互补序列)-C-3`，其中所述的20N为权利要求1所述sgRNA对应的DNA序列；将所述正义链和反义链磷酸化和退火，形成带有BsmBI粘性末端的片段，然后将其连接至经过BmsBI酶切线性化的载体lenti CRISPR上，得到CRISPR-Cas9重组慢病毒载体。
4.一种由权利要求3所述慢病毒载体包装的特异性敲除RSPO2基因的CRISPR-Cas9系统。
5.一种在体外利用如权利要求4所述CRISPR-Cas9系统特异性敲除人RSPO2基因的方法，其特征在于，将所述的CRISPR-Cas9系统感染人肝星状细胞LX2，特异性敲除人RSPO2基因。
6.如权利要求4所述CRISPR-Cas9系统在制备肝纤维化治疗药物或试剂盒中的应用。
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