[go: up one dir, main page]

CN108315304A - 一种猪naive胚胎干细胞系的构建方法 - Google Patents

一种猪naive胚胎干细胞系的构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108315304A
CN108315304A CN201710030885.3A CN201710030885A CN108315304A CN 108315304 A CN108315304 A CN 108315304A CN 201710030885 A CN201710030885 A CN 201710030885A CN 108315304 A CN108315304 A CN 108315304A
Authority
CN
China
Prior art keywords
embryonic stem
stem cell
naive
construction method
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710030885.3A
Other languages
English (en)
Inventor
李荣凤
张曼玲
姜海滨
杨宁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Medical University
Original Assignee
Nanjing Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Medical University filed Critical Nanjing Medical University
Priority to CN201710030885.3A priority Critical patent/CN108315304A/zh
Publication of CN108315304A publication Critical patent/CN108315304A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/108—Swine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/235—Leukemia inhibitory factor [LIF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/405—Cell cycle regulated proteins, e.g. cyclins, cyclin-dependant kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/602—Sox-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/603—Oct-3/4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/604—Klf-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/606—Transcription factors c-Myc
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/02—Coculture with; Conditioned medium produced by embryonic cells

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种猪naive胚胎干细胞系的构建方法，属于细胞生物学技术领域。本发明将iPSCs技术与传统胚胎干细胞技术相结合首先建立同时表达mOCT4、mSOX2、mKLF4和mc‑MYC的转基因阳性猪胎儿成纤维细胞系；得到转基因阳性的猪囊胚；将囊胚内细胞团接种于细胞饲养层，启动DOX诱导外源转录因子表达，获得猪胚胎干细胞系，待能够稳定传代后，停止表达外源mOCT4、mSOX2、mKLF4和mc‑MYC，干细胞的干性维持由已经激活的内源pOCT4、pSOX2、pKLF4和pc‑MYC来实现，获得猪naive胚胎干细胞。本发明为转基因克隆猪的研究提供可用于基因遗传修饰和长期培养的干细胞。

Description

一种猪naive胚胎干细胞系的构建方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，具体的，涉及猪naive胚胎干细胞的培养和建系方法。
背景技术
Naive胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)是由囊胚内细胞团(inner cellmass，ICM)而来的真正的全能干细胞，具有无限自我更新和分化能力(Nichols J，2009，Cell stem cell4(6):487-492)，其在细胞分化、发育调控、基因修饰等研究方面及再生医学方面具有极其重要的应用价值。传统胚胎干细胞建系方法即是将植入前囊胚内细胞团接种于特定干细胞液中进行培养，从而获得干细胞克隆。目前，继小鼠之后，大鼠naive胚胎干细胞通过调整培养系统已成功建立(Li P，2008，Cell 135(7):1299-1310)。诱导性多潜能干细胞的获得即是将不同的重编程因子转入成体已分化的细胞内，将成体已分化细胞重编程为具有多能性的干细胞(Takahashi K，2006，cell126(4):663-76)。
有研究显示通过慢病毒载体将重编程因子转染入猪体外受精囊胚内细胞团，然后接种于2i(CHIR99021和KP)的LIF培养体系，可以获得猪类naive胚胎干细胞(Telugu BP，2011，The Journal of biological chemistry286(33):28948-28953)，但因其未进行嵌合体实验，尚不能认定其为真正的naive胚胎干细胞。同时，该研究由于采取转染内胚团的方式，造成不同的卵裂球暴露于外源病毒和基因的不均一性，从而导致内胚团不同细胞之间基因整合的嵌合性，最终影响胚胎干细胞的培养和建系效率。
目前，在使用传统方法建立naive胚胎干细胞系的方面，小鼠和大鼠已成功建立，但猪naive胚胎干细胞目前仍未能建立稳定的细胞系。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种猪naive胚胎干细胞系的构建方法。
本发明提供的一种naive胚胎干细胞系的构建方法，包括以下步骤：
(1)建立同时表达mOCT4、mSOX2、mKLF4和mc-MYC的转基因阳性动物胎儿成纤维细胞系；
(2)得到转基因阳性的囊胚；
(3)将囊胚内细胞团接种于细胞饲养层；
(4)诱导外源转录因子表达，获得动物胚胎干细胞系，待能够稳定传代后，停止表达外源mOCT4、mSOX2、mKLF4和mc-MYC，获得naive胚胎干细胞。
所述动物为有蹄类动物。
优选地，所述有蹄类动物为猪、牛、羊。
步骤(3)所述囊胚为发育5-6天的囊胚。本申请实施例选用发育5.5天的猪囊胚。
步骤(3)所述的细胞饲养层为含DOX的LIF+FGF/3i干细胞培养液的丝裂霉素预处理的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层。
预处理小鼠胎儿成纤维细胞的方法为：38.5℃，5％CO2培养鼠胎儿成纤维细胞至汇合度95％时，向含10％血清(FBS)的DMEM培养液中添加丝裂霉素C处理。
进一步地，预处理小鼠胎儿成纤维细胞的方法是向鼠胎儿成纤维细胞含10％血清(FBS)的DMEM培养液中添加10-15μg/ml丝裂霉素C处理2-3h。
步骤(4)启动DOX诱导外源转录因子表达；动物胚胎干细胞系培养及传代的培养液为含DOX的LIF+FGF/3i干细胞培养液：其100ml培养液中含有：KOSR 50ml，N2B27 50ml，16ng/ml的成纤维细胞生长因子(FGF)32μl，2000U/ml的LIF 10μl，2μg/ml DOX 40μl；
其中，所述KOSR，以50ml计为：替代DMEM的基础培养基：80％38.5ml；血清替代物(KSR):20％,10ml；非必须氨基酸混合液(其中包括：甘氨酸，丙氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，脯氨酸，丝氨酸):1％,0.5ml；L-谷氨酰胺:2mM,0.5ml；
双抗：0.5ml；β-巯基乙醇：0.1mM,50μl；
CHIR99021：3μM,5μl；
PD0325901：1μM,10μl；
SB431542：2μM，5μl；
VC：50ng/ml,5μl；
所述N2B27以50ml计为：DMEM/F12：48％,24ml；神经细胞基础培养基(Neurobasl)：48％,24ml；N2:1％，0.5ml；B27：2％，1ml；BSA：0.25mg/ml，12.5mg；
胰岛素：5μg/ml,25μl；PS：0.5ml；CHIR99021(C22H18Cl2N8)：3μM,5μl；PD0325901(C16H14F3IN2O4)：1μM,10μl；SB431542(C22H16N4O3)：2μM，5μl；VC：50ng/ml,5μl；
其中，PD0325901为非ATP竞争性的MAPK激酶MEK抑制剂，分子式C16H14F3IN2O4，分子结构如式(I)所示：
CHIR99021为GSK3β选择性抑制剂，分子式C22H18Cl2N8，分子结构如式(II)所示：
SB431542为小分子抑制剂，选择性抑制转化生长因子βI型受体活化素受体样激酶ALK5，ALK4和ALK7,分子式C22H16N4O3，分子结构如式(III)所示：
步骤(4)停止表达外源mOCT4、mSOX2、mKLF4和mc-MYC的方法为：动物胚胎干细胞稳定传代后，将培养液中的DOX由2μg/ml经1μg/ml和0.5μg/ml各一代后降至0，每4-5天消化传代一次。
在本发明的实施例中，具体技术方案为：1)将同时表达mOCT4、mSOX2、mKLF4和mc-MYC的载体导入猪胎儿成纤维细胞，经药物筛选获得转基因阳性猪胎儿成纤维细胞；2)使用成熟猪卵母细胞与转基因阳性猪胎儿成纤维细胞进行体细胞核移植；3)培养体细胞核移植的胚胎至囊胚；4)使用免疫外科法去除5.5天囊胚的滋养层细胞从而获得内细胞团(ICM)；5)将获得的ICM接种于预先用丝裂霉素处理2.5h的MEF饲养层上，干细胞培养液采用含DOX的LIF+FGF/3i培养液。6)待ICM贴壁后，每日2/3量换液。7)第10-14天进行消化传代，以后3-4天消化传代。8)第15代后，将培养液中的DOX由2μg/ml经1μg/ml和0.5μg/ml各一代后降至0，每4-5天消化传代。
本发明提供的上述构建方法构建得到的naive胚胎干细胞系属于本发明的保护范围。
本发明提供了上述方法构建得到的naive胚胎干细胞系在转基因动物制备中的应用。
本发明在猪naive胚胎干细胞系的构建过程中，细胞培养采用3i(CHIR99021,PD0325901,SB431542)的培养方法，其中CHIR99021是一种针对于GSK3(glycogen synthasekinase 3)且特性明确的、高效选择性的小分子抑制剂(Murray et al.,2004)。PD0325901是一种改进的、高效的非ATP竞争性的MAPK激酶MEK抑制剂(Mohan S et al.，2015)。SB431542为一种强效的小分子抑制剂，选择性抑制转化生长因子β(TGF-β)I型受体活化素受体样激酶ALK5，ALK4和ALK7(Laping NJ et al.，2002)。LIF通过LIF/STAT3信号通路维持naive胚胎干细胞多能性。DOX为强力霉素，可诱导携带Tet-ON启动子的载体适时表达外源重编程因子。
本发明方法将iPSC(诱导性多潜能干细胞，induced pluripotent stem cells,iPSCs))技术引入传统的胚胎干细胞建系方法中，辅助建立了猪胚胎干细胞建系。本发明已将猪胚胎干细胞传代至第80代，且所建立的猪胚胎干细胞系经鉴定后都接近于naive状态，鉴定方法包括碱性磷酸酶染色、多能因子免疫荧光染色、分子学鉴定、体外分化及不添加DOX后内外源多能因子的表达差异鉴定等。本研究所建立的猪naive胚胎干细胞的建系方法有望在其它大动物naive胚胎干细胞建系和转基因克隆猪培育中得到应用。
附图说明
图1是第0代的猪naive胚胎干细胞显微镜下图；(100×)。
图2是第20代的猪naive胚胎干细胞显微镜下图；(100×)。
图3是第32代的猪naive胚胎干细胞显微镜下图；(100×)。
图4是第50代的猪naive胚胎干细胞显微镜下图；(100×)。
图5是猪naive胚胎干细胞碱性磷酸酶染色图；(100×)。
图6是猪naive胚胎干细胞免疫荧光染色图(40×)。图中所示分别为胚胎干细胞多能因子Oct-4，Nanog，Klf-4，Sox-2，SSEA-1和SSEA-4的免疫荧光染色图及其与DAPI的merge图。
图7是猪naive胚胎干细胞体外分化类胚体图(100×)。a为经悬滴培养后形成的类胚体；b为类胚体置于明胶上分化形成的细胞；c为体外分化细胞三胚层基因反转录PCR；d为体外分化细胞三胚层免疫荧光染色图。
图8A为猪naive胚胎干细胞不添加DOX培养后外源m OSKM的Q-PCR结果。图8B为猪naive胚胎干细胞不添加DOX后内源多能因子表达差异的Q-PCR结果。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中所用的生化试剂均为市售。
同时表达mOCT4、mSOX2、mKLF4和mc-MYC的表达载体购自大连宝生物公司，表达载体有TET-ON诱导系统，以便实现外源转录因子的适时表达。
表1 3i/LIF培养液组分
实施例1 转基因阳性猪胎儿成纤维细胞的获得
复苏冻存的原代猪胎儿成纤维细胞于90mm细胞培养皿中，用细胞培养液(DMEM+20％FBS)培养至细胞长至汇合度90％左右，收集细胞。按核转染说明书，用Lonza公司的核转染仪，按照以U023程序对原代猪胎儿成纤维细胞进行转染。转染后48h，细胞用胰蛋白酶消化后，以3×105个细胞密度接种于100mm培养皿中，加入完全培养液(高糖DMEM+20％FBS)。第二天换液，加入zeocin终浓度300ng/mL的细胞完全培养液继续培养，每2天换一次液，7-10天后，显微镜下察看细胞克隆，标出100个细胞以上克隆。在无菌条件下，用塑料克隆环置于单克隆细胞上，加入胰蛋白酶消化液100μl，消化细胞2min左右，加入200μl含血清培养液终止消化，用移液枪轻轻吹打细胞使其悬浮，吸取细胞悬液转移至48孔中，添加培养液至500μl/孔，培养液为：DMEM+16％FBS+zeosin 150ng/ml(下同)，于38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养细胞。每3天换一次液。
观察细胞生长情况，待细胞生长至80-90％汇合时，用PBS漂洗细胞2次，加入胰蛋白酶消化细胞2min左右，用含血清培养液终止细胞消化，将1/5体积的细胞悬液转至新的48孔中，继续培养至完全汇合后，提取基因组DNA用于PCR法筛选鉴定克隆，PCR引物序列为正向5’-GAGGGAGACCGAGGAGTTCAA-3’，反向5’-GCAGCGTATCCACATAGCGTAA-3’；另4/5的细胞悬液转至12孔板继续扩大培养。待细胞生长至基本汇合时，冷冻保存。
实施例2 转基因阳性的体细胞核移植囊胚的获得
从屠宰场取的新鲜的猪卵巢用灭菌的生理盐水清洗，用注射器从卵泡中抽取卵泡液，加到无菌的10cm培养皿中，用口吸管在体视显微镜下挑选卵子放入猪的卵母细胞成熟液中清洗3次，移到每孔含700μl成熟液，覆盖300μl石蜡油的四孔板中，放入38.5℃,5％CO2的培养箱中培养42-44h。42-44h后挑选出排出第一极体的卵母细胞，并准备好实施例1制得的转基因阳性的猪胎儿成纤维细胞，进行体细胞核移植(SCNT)操作。将融合的重构胚转移到每孔含700μl猪卵母细胞发育液、覆盖300μl矿物油四孔板孔中，每孔放50-80个重构卵母细胞。置于38.5℃、5％CO2和7％N2及饱和湿度培养箱中培养发育约5天，直至囊胚形成。
实施例3 饲养层MEF细胞的制备
将第3代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF细胞)接种到10cm细胞培养皿中，38.5℃5％CO2培养至汇合度95％时，向含10％血清(FBS)的DMEM培养液中添加10μg/ml丝裂霉素-C处理2.5h；PBS洗4遍；常规消化，然后进行细胞计数；按1×105个/cm2的密度铺于预先用明胶处理过的四孔板，然后置于38.5℃、5％CO2培养箱中过夜培养备用。
实施例4 接种ICM
取第5.5天的猪克隆囊胚置于0.5％的链霉蛋白酶中，待透明带变薄后，迅速将囊胚放入含DOX的LIF+FGF/3i干细胞培养液中洗2次，再移入干细胞培养液中用口吸管轻吹，当透明带脱落后，将囊胚先于1:5稀释后的兔抗猪血清中孵育35min，然后在干细胞培养液中洗3遍，再于1:10稀释的豚鼠补体(Sigma)中孵育30min后，在3i/LIF培养液中洗2遍，用口吸管吹吸将弥散的滋养层细胞去除得到ICM。将获得的ICM接入预先处理好的MEF饲养层上，在含DOX的LIF+FGF/3i干细胞培养液培养体系中进行培养，放于38.5℃，5％CO2的培养箱中培养。第3天观察贴壁情况。第6-8天贴壁细胞长出原始克隆，即第0代猪naive胚胎干细胞。见图1。
实施例5 猪naive胚胎干细胞的传代培养
酶消化法传代：移除培养液，PBS洗一遍，加入0.25％-Trypsin消化酶，3min后，加入相应培养液终止消化，收集细胞1000rpm离心5min，去上清，用适量的干细胞培养液重悬细胞后，将细胞悬液加入一个60mm的细胞培养皿中，放入CO2培养箱静置30-60min；吸取60mm细胞培养皿中含干细胞的上清，再次1000rpm离心5min，离心去上清后，加入相应新鲜含DOX的LIF+FGF/3i干细胞培养液进行培养，一般3～4天传一代。第15代后，将培养液中的DOX由2μg/ml经1μg/ml和0.5μg/ml各一代后降至0，每4-5天消化传代。见图2，图3和图4。图2为传代至第20代的猪naive胚胎干细胞，图3为传代至第32代的猪naive胚胎干细胞，图4为传代至第50代的猪naive胚胎干细胞。
实施例6 猪naive胚胎干细胞的碱性磷酸酶(AP)染色
用PBS将猪naive胚胎干细胞洗一遍，加入4％多聚甲醛室温固定10min后，用PBS洗2遍，加入NBT/BCIP显色液，暗处显色15-30min，显色后用PBS终止，本实施例中所用AP染色试剂盒购自Millipore公司(SCR004)。染色结果见图5，图中所示猪naive胚胎干细胞克隆染色呈红色，表明其AP染色为阳性。
实施例7 猪naive胚胎干细胞的免疫荧光染色
先用PBS将猪naive胚胎干细胞克隆洗一遍，5min，加入4％多聚甲醛室温固定10min，再用PBS洗三次，每次5min，用1％TritonX-100室温通透细胞1h后，用PBS洗两次，用10％山羊血清于室温封闭1h后，吸除封闭液，加入用10％山羊血清1：100稀释后的一抗Oct-4(Santa Cruz Biotechnology)，nanog(Santa Cruz Biotechnology)，KLF-4(Santa CruzBiotechnology)，SOX-2，SSEA-1(Chemicon)，SSEA-4(Chemicon)，4℃过夜孵育，用PBS清洗三次后，加入用10％山羊血清1：100稀释后的二抗，驴抗鼠(Molecular Probes A10037)，驴抗兔(Molecular Probes A21206)室温孵育1h，用PBS洗两次后，加入DAPI，用DABCO封片后，激光共聚焦扫描观察。免疫荧光染色图见图6，图中所示猪naive胚胎干细胞多能因子Nanog，Oct-4，Klf-4，Sox-2，SSEA-1和SSEA-4免疫荧光染色结果均为阳性。
实施例8 猪naive胚胎干细胞体外分化形成类胚体实验
将长出的猪naive胚胎干细胞克隆用口吸管吹起，尽量将其吹打成单细胞或小细胞团块，采用悬滴法(30μl)培养于未加干细胞因子的干细胞培养液中，培养皿底部须加入PBS，隔天换液，5天以后形成球状的类胚体，部分回收并将其置于trizol中裂解，提取RNA用于体外分化三胚层基因反转录PCR，部分置于明胶上分化后进行体外分化三胚层免疫荧光染色，即Desmin，keratin及Neurofilament(Millipore)。结果见图7，图中所示猪naive胚胎干细胞经体外分化后可形成类胚体，将类胚体置于明胶上分化可形成体细胞，经反转录PCR鉴定后表明该类胚体表达三胚层相关基因，经免疫荧光染色后发现类胚体分化后的细胞表达三胚层相关marker基因。
实施例9 猪naive胚胎干细胞降DOX后内外源多能因子的表达差异鉴定
将干细胞培养液中的DOX浓度从2μg/ml逐代次降低至1μg/ml、0.5μg/ml、0μg/ml，收取相同代次的细胞，用Trizol法提取细胞的总RNA。分别取上述细胞的总RNA各500ng，用Hi Script II Q RT Super Mix for qPCR(+gDNA Wiper)试剂盒(Vazyme R223-01)按照说明书步骤将其反转录为cDNA，反转体系为10μl，用去离子水将其进行5倍稀释，以降低反转体系中甘油对PCR反应的干扰。配制如下反应体系：16.5μl 2×ChamQ SYBR qPCR MasterMix(Vazyme Q311-02)，3μl引物(10μM)，3μl cDNA以及10.5μl去离子水，之后将其分别加入到96孔板中，每孔10μl，每个样做三个重复，最后将96孔板放入到Roche LightCycler96上进行qPCR反应，测定细胞中内外源OSKM表达差异，结果见图8A和图8B。测定结果用Excel软件进行了数据分析。如图8A所示，将干细胞培养液中的DOX浓度从2μg/ml逐代次降低至1μg/ml、0.5μg/ml、0μg/ml后，猪naive胚胎干细胞中外源多能因子OSKM的表达量显著降低；而内源多能因子Sox-2及c-MYC的表达量显著升高，如图8B所示。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京医科大学
<120> 一种猪naive胚胎干细胞系的构建方法
<130> KHP161119728.6
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gagggagacc gaggagttca a 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcagcgtatc cacatagcgt aa 22

Claims (10)

1.一种naive胚胎干细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)建立同时表达mOCT4、mSOX2、mKLF4和mc-MYC的转基因阳性动物胎儿成纤维细胞系；
(2)得到转基因阳性的囊胚；
(3)将囊胚内细胞团接种于细胞饲养层；
(4)诱导外源转录因子表达，获得动物胚胎干细胞系，待能够稳定传代后，停止表达外源mOCT4、mSOX2、mKLF4和mc-MYC，获得naive胚胎干细胞。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述动物为有蹄类动物。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述囊胚为发育5-6天的囊胚。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述的细胞饲养层为含DOX的LIF+FGF/3i干细胞培养液的丝裂霉素预处理的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，预处理小鼠胎儿成纤维细胞的方法为：38.5℃，5％CO2培养小鼠胎儿成纤维细胞至汇合度95％时，向含10％血清的DMEM培养液中添加丝裂霉素C处理。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，向含10％血清的DMEM培养液中添加10-15μg/ml丝裂霉素C处理2-3h。
7.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)启动DOX诱导外源转录因子表达；动物胚胎干细胞系培养及传代的培养液为含DOX的LIF+FGF/3i干细胞培养液：其100ml培养液中含有：KOSR 50ml，N2B27 50ml，16ng/ml的成纤维细胞生长因子32μl，2000U/ml的LIF 10μl，2μg/ml DOX 40μl；
其中，所述KOSR，以50ml计为：替代DMEM的基础培养基：77％38.5ml；血清替代物:20％,10ml；非必须氨基酸混合液:1％,0.5ml；L-谷氨酰胺:1％2mM,0.5ml；青链霉素双抗：1％,0.5ml；β-巯基乙醇：0.1mM,50μl；CHIR99021：3μM,5μl；PD0325901：1μM,10μl；SB431542：2μM，5μl；抗坏血酸：50ng/ml,5μl；
所述N2B27以50ml计为：DMEM/F12：48％,24ml；神经细胞基础培养基：48％,24ml；N2:1％，0.5ml；B27：2％，1ml；BSA：0.25mg/ml，12.5mg；胰岛素：5μg/ml,25μl；青链霉素双抗：0.5ml；CHIR99021：3μM,5μl；PD0325901：1μM,10μl；SB431542：2μM，5μl；VC：50ng/ml,5μl；
其中，PD0325901为非ATP竞争性的MAPK激酶MEK抑制剂，分子式C16H14F3IN2O4，分子结构如式(I)所示：
CHIR99021为GSK3β选择性抑制剂，分子式C22H18Cl2N8，分子结构如式(II)所示：
SB431542为小分子抑制剂，选择性抑制转化生长因子βI型受体活化素受体样激酶ALK5，ALK4和ALK7,分子式C22H16N4O3，分子结构如式(III)所示：
8.如权利要求1-7任一所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)停止表达外源mOCT4、mSOX2、mKLF4和mc-MYC的方法为：动物胚胎干细胞稳定传代后，将培养液中的DOX由2μg/ml经1μg/ml和0.5μg/ml各一代后降至0，每4-5天消化传代一次。
9.权利要求1-8任一所述的构建方法构建得到的naive胚胎干细胞系。
10.如权利要求9所述的naive胚胎干细胞系在转基因动物制备中的应用。
CN201710030885.3A 2017-01-16 2017-01-16 一种猪naive胚胎干细胞系的构建方法 Pending CN108315304A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710030885.3A CN108315304A (zh) 2017-01-16 2017-01-16 一种猪naive胚胎干细胞系的构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710030885.3A CN108315304A (zh) 2017-01-16 2017-01-16 一种猪naive胚胎干细胞系的构建方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108315304A true CN108315304A (zh) 2018-07-24

Family

ID=62892078

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710030885.3A Pending CN108315304A (zh) 2017-01-16 2017-01-16 一种猪naive胚胎干细胞系的构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108315304A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111718893A (zh) * 2020-07-23 2020-09-29 重庆生命知源科技有限公司 一种干细胞由Primed态向*态转化的方法
CN114032214A (zh) * 2021-11-26 2022-02-11 上海市同济医院 Msi1 c端蛋白短肽在诱导和维持人胚胎干细胞原始态中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100124891A (ko) * 2009-05-20 2010-11-30 황우석 돼지 체세포 복제 배반포 유래의 배아줄기유사세포의 확립과 특성 분석
CN103388008A (zh) * 2012-05-08 2013-11-13 中国科学院上海生命科学研究院 诱导性表达多能性维持基因的有蹄类动物细胞系及其构建

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100124891A (ko) * 2009-05-20 2010-11-30 황우석 돼지 체세포 복제 배반포 유래의 배아줄기유사세포의 확립과 특성 분석
CN103388008A (zh) * 2012-05-08 2013-11-13 中国科学院上海生命科学研究院 诱导性表达多能性维持基因的有蹄类动物细胞系及其构建

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BHANU PRAKASH V L TELUGU, ET AL.: ""Porcine induced pluripotent stem cells analogous to naive and primed embryonic stem cells of the mouse"", 《THE INTERNATIONAL JOURNAL OF DEVELOPMENTAL BIOLOGY》 *
BHANU PRAKASH V. L. TELUGU, ET AL.: ""Leukemia inhibitory factor (LIF)-dependent, pluripotent stem cells establishment from inner cell mass of porcine embryos"", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
EUNHYE KIM, ET AL.: ""Putative embryonic stem cells derived from porcine cloned blastocysts using induced pluripotent stem cells as donors"", 《THERIOGENOLOGY》 *
JUAN DU, ET AL.: ""Mechanism of SB431542 in inhibiting mouse embryonic stem cell differentiation"", 《CELLULAR SIGNALLING》 *
吴璐: ""猪体细胞重编程及胚胎干细胞的建立"", 《道客巴巴》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111718893A (zh) * 2020-07-23 2020-09-29 重庆生命知源科技有限公司 一种干细胞由Primed态向*态转化的方法
CN114032214A (zh) * 2021-11-26 2022-02-11 上海市同济医院 Msi1 c端蛋白短肽在诱导和维持人胚胎干细胞原始态中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Brevini et al. Porcine embryonic stem cells: Facts, challenges and hopes
CA2413275C (en) Somatic pluripotent cells
CN1934245B (zh) 多能干细胞的增殖方法
Luo et al. Three-dimensional hydrogel culture conditions promote the differentiation of human induced pluripotent stem cells into hepatocytes
JP2008017840A (ja) 胚性幹細胞の成長
US20130302887A1 (en) Compositions and methods for growing human embryonic cells
Choi et al. A novel feeder-free culture system for expansion of mouse spermatogonial stem cells
Gao et al. Optimization of culture conditions for maintaining porcine induced pluripotent stem cells
CN115975914A (zh) 利用化学小分子药物重编程诱导多能干细胞的方法
CN104946581B (zh) 一种培养猪滋养层干细胞的专用培养基及方法
JP2014023519A (ja) ヒト多能性幹細胞からの肺及び気道の上皮の産生並びにその使用
CN108315304A (zh) 一种猪naive胚胎干细胞系的构建方法
Van Vranken et al. The differentiation of distal lung epithelium from embryonic stem cells
CN1935984A (zh) 一种禽类精原干细胞的体外培养方法
EP3950933A1 (en) Cell population including pluripotent stem cells and production method thereof
EP3861103A1 (en) Amniotic fluid cell-derived extracellular matrix and uses thereof
Tsukamoto et al. A passage-free, simplified, and scalable novel method for iPSC generation in three-dimensional culture
Saxena et al. Role of stem cell research in therapeutic purpose--a hope for new horizon in medical biotechnology.
Lee et al. Clump-passaging-based efficient 3D culture of human pluripotent stem cells under chemically defined conditions
WO2009148622A1 (en) Compositions and methods for growing embryonic stem cells
Li et al. Bovine male germline stem-like cells cultured in serum-and feeder-free medium
CN103103162B (zh) 一种分离培养人脑膜瘤细胞的方法
CN108707600A (zh) 一种猪鼠细胞单细胞融合方法
CN102268404A (zh) 猪卵丘干细胞的分离方法
Ren et al. Feeder cells treated with ethanol can be used to maintain self‐renewal and pluripotency of human pluripotent stem cells

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180724