CN108310463B - 一种3d打印生物墨水及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种3D打印生物墨水及其制备方法，所述3D打印生物墨水包括如下质量百分含量的原料制成：胞外囊泡混悬液10‑30％、生物大分子材料5‑15％、促溶剂0.1‑1％、余量水；利用胞外囊泡的优点、生物大分子材料与水凝胶本身的特点，更好的模拟细胞外基质成分、结构及生物活性特点。

Description

一种3D打印生物墨水及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及3D生物打印技术领域，尤其涉及一种3D打印生物墨水及其制备方法。

背景技术

3D打印技术用于临床医疗的案例已不再罕见，该技术与医疗的结合方式主要有以下几种：①术前诊断及手术预演模型；②植入物制备(骨骼、牙齿、软组织器官等)；③外用医疗耗材(颌面塑形支具等)。目前硬组织支架如骨、牙齿的打印技术目前已较为成熟，但软组织支架的打印仍有待进一步完善。现有可供软组织打印的生物墨水多为高分子水凝胶，包括人工合成高分子材料及胶原等天然水凝胶：

(1)合成凝胶如聚富马酸二羟丙酯(PPF)、聚D，L-丙交酯(PDLLA)、聚ε-己内酯(PCL)、聚碳酸酯等作为打印墨水使用时成型速度快，但配制时需加入光敏树脂(主要由齐聚物、活性单体、光引发剂及其他助剂)，因此安全性尚需进一步谨慎评估；

(2)包括“(1)”所列高分子在内的合成高分子材料，此外还包括聚氨酯(PU)、聚乙烯(PE)、聚丙烯酸酯(Acrylic)具有安全、易量产等优势，但部分材料存在化学残留，应用于3D打印生物墨水，存在可降解性不佳、或降解产物碎片毒性未知与生物活性并不理想等诸多问题；

(3)天然水凝胶如明胶、明胶-壳聚糖、明胶-藻酸盐、藻酸盐等具有良好的生物相容性以及与人体软组织相似的生物力学性质。

使用这些材料进行3D打印可获得大小在微米级别的彼此连通的孔隙结构。但围绕着这些材料开展的进一步研究结果显示；打印支架对细胞的分化促进作用较弱；接种于打印支架上的细胞在整个培养过程中都仅在原位生长，无法进一步与支架结合并降解支架。这些细胞与生物墨水、支架作用不良的问题，可能是由于现有制造技术(包括3D打印在内)的精度有限，无法重现ECM的拓扑结构所导致的(该结构对细胞的表型、功能具有至关重要的作用)。

为了提高材料的活性仿生，目前的研究大都聚焦在将一或多种活细胞或生子掺入材料这两种策略之上。然而，含细胞材料的制备难度大，稳定性差，推广困难。而长因子对软组织损伤愈合的作用在体内外的表现并不一致，呈现出复杂性以及对浓度、时空协同性的依赖,不同因子可能作用于不同的细胞生长周期,一种生长因子又可以影响其他因子的表达和活性。因此,这种方法最终的效果往往不令人满意。

发明内容

针对以上存在的问题，本发明提供了一种3D打印生物墨水，利用胞外囊泡的优点、天然高分子与水凝胶本身的特点，更好的模拟细胞外基质成分、结构及生物活性特点。

本发明的技术方案如下：

一种3D打印生物墨水，包括如下质量百分含量的原料制成：

胞外囊泡混悬液10-30％；

生物大分子材料5-15％；

促溶剂0.1-1％；

余量水。

所述胞外囊泡混悬液是从异体/自体/异种来源的细胞、体液中提取得到的胞外囊泡悬浮于PBS缓冲液中制得。所述胞外囊泡是通过差速离心法、蔗糖密度梯度离心法、抗体标记的磁珠分选、微孔过滤技术、试剂盒提取法、微流控技术中的任一中方法提取得到。

所述生物大分子材料所述生物大分子材料为动物软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉，优选为猪、牛或羊真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉，其主要成分为Ⅰ型,Ⅲ型以及Ⅴ型胶原，采用超低温粉碎研磨得到平均粒径低于30μm的颗粒。

所述水为蒸馏水或超纯水。所述促溶剂为盐酸、磷酸、醋酸。

所述3D打印生物墨水的制备方法，包括如下步骤：

将生物大分子材料、促溶剂与水混合，搅拌至溶解完全，调节pH为6-7.45，加入胞外囊泡混悬液，混合均匀，离心，得到3D打印生物墨水。

本发明还提供了一种3D打印成型方法，包括如下步骤：

(1)3D生物打印：利用3D打印机将3D打印生物墨水按照建好的数字模型，由10-50℃的墨水注射筒经针头打印到0-10℃的接收平台上；打印后，在0-10℃环境下储存5-120分钟进行加固定型，得到定型的凝胶材料；

(2)交联：定型的凝胶材料进行水洗；然后加入交联剂，于0-10℃的条件下交联反应0.5-48h；最后再进行水洗，洗去残余交联剂；

所述交联剂为戊二醛、京尼平或碳酸二亚胺，所述交联剂的用量为3D打印生物墨水用量的0.1-0.5％。

胞外囊泡是细胞旁分泌产生的一种亚细胞成分，在细胞旁分泌中扮演重要角色。胞外囊泡内含有脂质、蛋白质(生长因子)、核酸(DNA、mRNA及microRNA、lncRNA、circRNA等noncodingRNA),可通过生物合成与内吞作用参与到精确而复杂的膜运输过程。在炎症免疫反应、细胞存活与凋亡、血管新生、血栓形成、自噬等生理状态维持及疾病进程中发挥重要作用。胞外囊泡可于体外长时间保存而不丧失活性(-20～-80℃)，胞外囊泡内携带多种生物活性物质(蛋白及核酸),在细胞功能调控中占重要地位，获取过程较为简单，可大规模制备，低温保存(-20℃保存6个月)仍能保留其生物学功能。将胞外囊泡作为生物活性元件加入生物墨水，可避免含细胞材料的“质量可控”问题，胞外囊泡“集团”化释放多种活性因子促进修复，效果优于只结合一到两种生长因子的传统材料，可实现材料生物性能仿生的目标。

生物墨水的重要成分是猪、牛或羊软组织尤其是真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉，其主要成分为Ⅰ型及Ⅲ型胶原，保留了真皮内天然细胞外基质结构，成分及结构上本已具有仿生性，且这种仿生性无法通过将提纯的Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白混合，电纺、3D打印或其他制备手段实现。

复合了胞外囊泡的生物墨水，可在0-30℃下储存并保持原有成分、微结构及生物活性，仅凭简单的温度调控既能快速成型，不含光敏物质，更为安全，更适用于在日用化工、科研、临床医学、转化医学中应用推广。

本发明的有益效果是：

1、本发明将细胞分泌的胞外囊泡与动物软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉结合形成复合生物墨水，可用于制备成分、结构及活性仿生的3D打印仿生软组织替代物，可为不依赖细胞的皮肤生态微环境重建提供新策略，满足医疗卫生事业的巨大需求。

2、本发明应用于3D打印的复合墨水材料重要原料之一纳米纤维微粉由猪、牛或羊软组织尤其是真皮软组织源性细胞外基质制成，这些材料有多年实验及临床应用经验，免疫原性低，安全性好，其保存了真皮外基质的主要蛋白成分及外基质纤维的拓扑结构，其在成分、结构上的仿生性无法通过将提纯的Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白混合，电纺、3D打印或其他制备手段实现。

3、本发明中的复合墨水材料结合细胞外囊泡的优点，植入体内后可“集团式”释放多种活性因子，更好的促进修复。

4、本发明提供的软组织3D打印生物墨水材料，通过3D打印技术，可以实现个体针对性，为不同的病人可以有不同的设计，符合临床上的需要。

具体实施方式

通过实施例的描述，对发明的具体实施方式作进一步详细的说明，目的是帮助本领域的技术人员对本发明的构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解，并有助于其实施。

实施例1

一种3D打印生物墨水，包括如下质量百分含量的原料制成：

胞外囊泡混悬液10％

猪真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉5％

盐酸1％

超纯水余量。

所述3D打印生物墨水按照如下方法制备：

将猪真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉、盐酸与超纯水混合，搅拌至溶解完全，用碳酸氢钠溶液调节pH为6.5,加入胞外囊泡混悬液，混合均匀，离心，即得生物墨水材料。

3D打印成型方法，包括如下步骤：

(1)3D生物打印：利用3D生物打印机将复合墨水材料按照建好的数字模型，由15℃的墨水注射筒经针头打印到8℃的接收平台上，打印后，在0℃环境下储存5分钟进行加固定型，得到定型的凝胶材料；

(2)交联：在定型的凝胶材料中加入0.1％(基于3D打印生物墨水的质量)的戊二醛，于4℃的条件下交联反应24h；最后进行水洗，洗去残余交联剂。

实施例2

一种3D打印生物墨水，包括如下质量百分含量的原料制成：

胞外囊泡混悬液30％

猪真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉9％

醋酸1％

超纯水余量。

所述3D打印生物墨水按照如下方法制备：

将猪真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉、醋酸与超纯水混合，搅拌至溶解完全，用碳酸氢钠调节pH为6.9,加入胞外囊泡混悬液，混合均匀，进行离心，即得生物墨水材料。

3D打印成型方法，包括如下步骤：

按实施例1的3D打印成型方法进行3D打印，然后水洗、交联以定型。

实施例3

一种3D打印生物墨水，包括如下质量百分含量的原料制成：

胞外囊泡混悬液20％；

牛真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉15％；

磷酸0.1％；

超纯水余量。

所述3D打印生物墨水按照如下方法制备：

将牛真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉、磷酸与超纯水混合，搅拌至溶解完全，用磷酸钠调节pH为6，加入胞外囊泡混悬液，混合均匀,进行离心，即得生物墨水材料。

3D打印成型方法，包括如下步骤：

按实施例1的3D打印成型方法进行3D打印，然后水洗、0.5％(按3D打印生物墨水用量)戊二醛交联以定型。

实施例4

一种3D打印生物墨水，包括如下质量百分含量的原料制成：

胞外囊泡混悬液15％；

羊真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉9％；

盐酸0.5％；

超纯水余量。

按上述生物墨水材料配方进行3D打印，然后将水洗、交联以定型。

所述3D打印生物墨水按照如下方法制备：

将羊真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉、盐酸与超纯水混合，搅拌至溶解完全，用氢氧化钠调节pH为7.45，加入胞外囊泡混悬液，混合均匀，进行离心，得到凝胶，即生物墨水材料。

3D打印成型方法，包括如下步骤：

按实施例1的3D打印成型方法进行3D打印，然后水洗、交联以定型。

实施例5

一种3D打印生物墨水，包括如下质量百分含量的原料制成：

胞外囊泡混悬液10％；

猪真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉8％；

盐酸1％；

蒸馏水余量。

所述3D打印生物墨水按照如下方法制备：

将猪真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉、盐酸与蒸馏水混合，搅拌至溶解完全，用氢氧化钾调节pH为7,加入胞外囊泡混悬液混合均匀，进行离心，得到凝胶，即生物墨水材料。

3D打印成型方法，包括如下步骤：

(1)3D生物打印：利用3D生物打印机将复合墨水材料按照建好的数字模型，由20℃的墨水注射筒经针头打印到4℃的接收平台上，打印后，在4℃环境下储存20分钟进行加固定型，得到定型的凝胶材料；

(2)交联：在定型的凝胶材料中加入京尼平(3D打印生物墨水的0.5％)，于1℃的条件下交联反应24h；最后进行水洗，洗去残余交联剂。

实施例6

一种3D打印生物墨水，包括如下质量百分含量的原料制成：

胞外囊泡混悬液10％；

猪真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉9％；

醋酸1％；

超纯水余量。

所述3D打印生物墨水按照如下方法制备：

将猪真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉、盐酸与超纯水混合，搅拌至溶解完全，用碳酸氢钠调节pH为7.1,加入胞外囊泡混悬液，混合均匀，进行离心，得到凝胶，即生物墨水材料。

3D打印成型方法，包括如下步骤：

按实施例5的3D打印成型方法进行3D打印，然后水洗、交联以定型。

实施例7

一种3D打印生物墨水，包括如下质量百分含量的原料制成：

胞外囊泡混悬液25％；

猪真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉10％；

盐酸1％；

超纯水余量。

所述3D打印生物墨水按照如下方法制备：

将猪真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉、盐酸与超纯水混合，搅拌至溶解完全，用碳酸氢钠调节pH为7.3,加入胞外囊泡混悬液，混合均匀，进行离心，得到凝胶，即生物墨水材料。

3D打印成型方法，包括如下步骤：

(1)3D生物打印：利用3D生物打印机将复合墨水材料按照建好的数字模型，由45℃的墨水注射筒经针头打印到0℃的接收平台上，打印后，在8℃环境下储存120分钟进行加固定型，得到定型的凝胶材料；

(2)交联：在定型的凝胶材料中加入碳酸二亚胺(3D打印生物墨水的0.1％)，于10℃的条件下交联反应0.5h；最后进行水洗，洗去残余交联剂。

对比例1

一种3D打印生物墨水，包括如下质量百分含量的原料制成：

胞外囊泡混悬液30％；

猪真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉10％；

盐酸1％；

超纯水余量。

所述3D打印生物墨水按照如下方法制备：

将猪真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉、盐酸与超纯水混合，搅拌至溶解完全，用碳酸氢钠调节pH为6.5,加入胞外囊泡混悬液混合均匀，进行离心，得到凝胶，即生物墨水材料。

3D打印成型方法，包括如下步骤：

按实施例1的3D打印成型方法进行3D打印，然后水洗。未经交联与定型，直接用于细胞培养与动物实验。

对比例2

一种3D打印生物墨水，包括如下质量百分含量的原料制成：

猪皮细胞外基质纳米纤维微粉9％

盐酸1％

超纯水余量。

将猪真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉、盐酸与超纯水混合，搅拌混合均匀，用碳酸氢钠溶液调节pH为6.5,进行离心，得到凝胶，即生物墨水材料。

3D打印成型方法，包括如下步骤：

按上述实施例1的3D打印成型方法进行3D打印，然后将水洗、交联以定型。

性能测试

经该实施例1-7及对比例1所得3D水凝胶支架在38℃温度下，对弹性模量，损耗模量,断裂伸长率进行测试，并对动物实验过程完整性的保持性能进行测试。具体性能参见表1。

表1 3D水凝胶支架的性能

从以上数据可以看出，所有样品均具有固体属性(弹性模量远大于损耗模量)，具有一定的力学强度、结构稳定性以及耐拉伸性能。不过，各实施例因化学成分或配方量不同，其性能有一定差异；若应用于生物医学，必然产生不同的效果。其中，实施例3与4具有最高的弹性模量与损耗模量，表明其强度最高，但有瑕疵，太硬，手感差，其应用效果并不好。实施例3使用了相对较高的猪皮细胞外基质纳米纤维微粉(15％)，而实施例4使用了羊皮真细胞外基质纳米纤维微粉，表明猪皮细胞外基质材料的力学性能不如羊真皮细胞外基质材料，但提高材料的固含量仍然可以达到相似的力学性能效果。实施例6的弹性模量最低，只有～4kPa，同时损耗因子(损耗模量/弹性模量为0.208)最高，保持尺寸完整性不变形时间最短(仅仅5天)，表明材料力学强度脆弱，这可能是因为醋酸的使用抑制了细胞外基质纳米纤维微粉的溶解效果与材料均匀性。实施例6中的墨水与支架透明度都很差，推测是溶解不彻底、交联导致局部不均匀结构的增大与增多所致。实施例5使用了较低浓度的猪皮细胞外基质纳米纤维微粉，以及胞外囊泡，其力学性能并不突出，不过其耐拉伸性能却最佳，表明调整材料的组成有助于获取延展性或柔韧性好的材料。对比例1在3D打印过程未进行交联和定型，其结构稳定性较差，材料发粘，表面粗糙且易脆。

内皮细胞成管实验

将实施例1的生物墨水和对比例2的生物墨水分别铺于24孔板底部，低温冷冻定型后，PBS缓冲溶液浸洗，以2.5×10⁴每孔的密度接种人脐静脉内皮细胞(HUVEC)后加入EGM-2培养液，37℃培养箱内培养12小时后在光镜下检测内皮细胞成管情况，具体结果见表2。

从表2可以看出，实施例1的生物墨水-HUVEC共培养的成管数目大于对比例2的生物墨水-HUVEC共培养，且平均血管长度高于对比例2的生物墨水-HUVEC共培养的，*p＜0.05。考虑实施例1中所含的胞外囊泡发挥了促血管化效用，提示实施例1的生物活性优于不含胞外囊泡的对比例2生物墨水。

表2内皮细胞成管实验结果对比

Claims (8)

1.一种3D打印生物墨水，其特征在于，包括如下质量百分含量的原料制成：

胞外囊泡混悬液 10-30％；

生物大分子材料 5-15％；

促溶剂 0.1-1％；

余量水。

2.如权利要求1所述的3D打印生物墨水，所述胞外囊泡混悬液是从异体/自体/异种来源的细胞、体液中提取得到的胞外囊泡悬浮于PBS缓冲液中制得。

3.如权利要求1所述的3D打印生物墨水，所述生物大分子材料为动物软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉。

4.如权利要求1所述的3D打印生物墨水，所述生物大分子材料为猪、牛或羊真皮软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉。

5.如权利要求3所述的3D打印生物墨水，所述生物大分子材料的平均粒径低于30μm。

6.如权利要求1所述的3D打印生物墨水，所述水包括蒸馏水或超纯水。

7.如权利要求1所述的3D打印生物墨水，所述促溶剂包括盐酸、磷酸、醋酸。

8.权利要求1所述的3D打印生物墨水的制备方法，包括如下步骤：

将生物大分子材料、促溶剂与水混合，搅拌至溶解完全，调节pH为6-7.45，加入胞外囊泡混悬液，混合均匀，离心，得到3D打印生物墨水。