CN108290953A

CN108290953A - 抗pd-1抗体和组合物

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Publication number: CN108290953A
Application number: CN201680069542.1A
Authority: CN
Inventors: G.加勒; M.加德; K.克福德; I.D.霍拉克; T.布奎因; M.克拉格; M.佩德森
Original assignee: Symphogen AS
Current assignee: Laboratoires Servier SAS
Priority date: 2015-10-02
Filing date: 2016-09-30
Publication date: 2018-07-17
Anticipated expiration: 2036-09-30
Also published as: CY1125327T1; SA518391262B1; EP4105235A1; TWI751981B; HRP20221041T1; ZA201801852B; CO2018003500A2; EP3368572B9; LT3368572T; MY190324A; RS63490B1; NZ740869A; AU2016333517B2; TW201726734A; ES2924402T3; CN108290953B; DK3368572T3; MX2018003936A; WO2017055547A1; IL258214A

Abstract

本发明涉及抗PD‑1抗体以及使用它们治疗与PD‑1活性相关的疾病和病况(例如癌症)的方法。

Description

抗PD-1抗体和组合物

对相关申请的交叉引用

本申请要求2015年10月2日提交的美国专利申请62/236,341的优先权，其公开内容通过引用完整并入本文。

序列表

本申请含有序列表，其已以ASCII格式电子提交且特此通过引用完整掺入。该ASCII副本(于2016年9月28日创造)名称为022675_WO052_SL.txt且大小是65,000字节。

发明背景

PD-1(也称为程序性细胞死亡蛋白质1和CD279)为268个氨基酸的细胞表面受体，其属于免疫球蛋白超家族。PD-1是T细胞调节子的CD28家族的成员且是在T细胞、B细胞和巨噬细胞上表达。其与配体PD-L1(也称为B7同源物)和PD-L2(也称为B7-DC)结合。

PD-1是I型膜蛋白质，其结构包含细胞外IgV域、跨膜区域和含有两个磷酸化位点的细胞内尾部。称为免疫检查点蛋白质，PD-1起可诱导性免疫调节受体的作用，在例如针对抗原刺激的T细胞反应的负调节中起作用。

PD-L1是PD-1的优势配体。PD-L1与PD-1的结合抑制T细胞活性、减少细胞因子生产以及抑制T细胞增殖。表达PD-L1的癌细胞能够利用此机制来经由PD-L1与PD-1受体的结合使T细胞的抗肿瘤活性失活。

考虑到其免疫反应调节特性，已在作为免疫治疗(包含治疗癌症和自身免疫疾病)的潜在靶物的方面研究PD-1。美国和欧洲已批准两种抗PD-1抗体(派姆单抗(pembrolizumab)和纳武单抗(nivolumab))用于治疗某些癌症。

考虑到PD-1作为免疫调节剂的关键角色，存在有对于靶向PD-1以治癌症和某些免疫系统的病症的新的且改善的免疫治疗的需求。

发明概述

本发明针对新颖的靶向PD-1的重组抗体、以及包含这些抗体中的一种或多种的药物组合物、以及抗体和药物组合物用于在患者中增强免疫力的用途，以及用于治疗源自诸如以下的组织的癌症的用途：皮肤、肺、肠、卵巢、脑、前列腺、肾脏、软组织、造血系统、头和颈、肝脏、膀胱、乳房、胃、子宫和胰脏。相较于用于此类癌症的目前可得的治疗(包含抗体治疗)，涵盖本发明的抗体无论单独使用或与另一种癌症疗法(诸如靶向另一个免疫检查点蛋白质的抗体)组合可以提供卓越的临床反应。

在一个实施方案中，本发明提供抗PD-1抗体或其抗原结合部分，其中该抗体和以下的任一者竞争与人类PD-1的结合、或和以下的任一者结合相同的人类PD-1的表位：抗体12819.15384、12748.15381、12748.16124、12865.15377、12892.15378、12796.15376、12777.15382、12760.15375和13112.15380。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含分别包含抗体12819.15384、12748.15381、12748.16124、12865.15377、12892.15378、12796.15376、12777.15382、12760.15375、或13112.15380的H-CDR1-3序列的H-CDR1-3。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体具有氨基酸序列与抗体12819.15384、12748.15381、12748.16124、12865.15377、12892.15378、12796.15376、12777.15382、12760.15375、或13112.15380的重链可变域(V_H)至少90％(例如至少92％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同的V_H域。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体具有包含抗体12819.15384、12748.15381、12748.16124、12865.15377、12892.15378、12796.15376、12777.15382、12760.15375、或13112.15380的V_H氨基酸序列的V_H。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体具有包含抗体12819.15384、12748.15381、12748.16124、12865.15377、12892.15378、12796.15376、12777.15382、12760.15375、或13112.15380的V_H氨基酸序列和SEQ ID No:67的重链恒定区氨基酸序列的重链(HC)。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含分别包含抗体12819.15384、12748.15381、12748.16124、12865.15377、12892.15378、12796.15376、12777.15382、12760.15375、或13112.15380的L-CDR1-3序列的L-CDR1-3。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体具有氨基酸序列与抗体12819.15384、12748.15381、12748.16124、12865.15377、12892.15378、12796.15376、12777.15382、12760.15375、或13112.15380的轻链可变域(V_L)至少90％(例如至少92％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同的V_L域。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体具有包含抗体12819.15384、12748.15381、12748.16124、12865.15377、12892.15378、12796.15376、12777.15382、12760.15375、或13112.15380的V_L氨基酸序列的V_L。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体具有包含抗体12819.15384、12748.15381、12748.16124、12865.15377、12892.15378、12796.15376、12777.15382、12760.15375、或13112.15380的V_L氨基酸序列和SEQ ID No:68的轻链恒定区氨基酸序列的轻链(LC)。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含以上描述的重链序列的任一者和以上轻链序列的任一者。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含抗体12819.15384、12748.15381、12748.16124、12865.15377、12892.15378、12796.15376、12777.15382、12760.15375、或13112.15380的H-CDR3和L-CDR3氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含抗体12819.15384、12748.15381、12748.16124、12865.15377、12892.15378、12796.15376、12777.15382、12760.15375、或13112.15380的H-CDR1-3和L-CDR1-3氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体具有氨基酸序列分别与抗体12819.15384、12748.15381、12748.16124、12865.15377、12892.15378、12796.15376、12777.15382、12760.15375、或13112.15380的V_H和V_L至少90％(例如至少92％、至少95％、至少98％、或至少99％)相同的V_H和V_L。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体具有分别包含抗体12819.15384、12748.15381、12748.16124、12865.15377、12892.15378、12796.15376、12777.15382、12760.15375、或13112.15380的V_H和V_L氨基酸序列或分别由抗体12819.15384、12748.15381、12748.16124、12865.15377、12892.15378、12796.15376、12777.15382、12760.15375、或13112.15380的V_H和V_L氨基酸序列所组成的V_H和V_L。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体具有分别包含抗体12819.15384、12748.15381、12748.16124、12865.15377、12892.15378、12796.15376、12777.15382、12760.15375、或13112.15380的HC和LC氨基酸序列或分别由抗体12819.15384、12748.15381、12748.16124、12865.15377、12892.15378、12796.15376、12777.15382、12760.15375、或13112.15380的HC和LC氨基酸序列所组成的HC和LC。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体具有(1)包含选自由抗体12819.15384、12748.15381、12748.16124、12865.15377、12892.15378、12796.15376、12777.15382、12760.15375、和13112.15380所组成的组的抗体的V_H氨基酸序列和SEQ ID No:67的重链恒定区氨基酸序列的HC；和(2)包含所选抗体的V_L氨基酸序列和SEQ ID No:68的轻链恒定区氨基酸序列的LC。

在一些实施方案中，本发明的抗PD-1抗体或抗原结合部分包含以下的H-CDR1-3和L-CDR1-3氨基酸序列：

a)分别为SEQ ID No:18、19、20、21、22、和23；

b)分别为SEQ ID No:24、25、26、27、28、和29；

c)分别为SEQ ID No:30、31、32、33、34、和35；

d)分别为SEQ ID No:36、37、38、39、40、和41；

e)分别为SEQ ID No:42、43、44、45、46、和47；

f)分别为SEQ ID No:48、49、50、51、52、和53；

g)分别为SEQ ID No:54、55、56、57、58、和59；或

h)分别为SEQ ID No:60、61、62、63、64、和65。

在一些实施方案中，本发明的抗PD-1抗体或抗原结合部分包含具有以下的氨基酸序列的重链可变域和轻链可变域：

a)分别为SEQ ID No:2和3；

b)分别为SEQ ID No:4和5；

c)分别为SEQ ID No:4和66；

d)分别为SEQ ID No:6和7；

e)分别为SEQ ID No:8和9；

f)分别为SEQ ID No:10和11；

g)分别为SEQ ID No:12和13；

h)分别为SEQ ID No:14和15；或

i)分别为SEQ ID No:16和17。

在一些实施方案中，本发明的抗PD-1抗体包含：

a)包含SEQ ID No:2和67的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID No:3和68的氨基酸序列的LC；

b)包含SEQ ID No:4和67的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID No:5和68的氨基酸序列的LC；

c)包含SEQ ID No:4和67的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID No:66和68的氨基酸序列的LC；

d)包含SEQ ID No:6和67的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID No:7和68的氨基酸序列的LC；

e)包含SEQ ID No:8和67的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID No:9和68的氨基酸序列的LC；

f)包含SEQ ID No:10和67的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID No:11和68的氨基酸序列的LC；

g)包含SEQ ID No:12和67的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID No:13和68的氨基酸序列的LC；

h)包含SEQ ID No:14和67的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID No:15和68的氨基酸序列的LC；或

i)包含SEQ ID No:16和67的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID No:17和68的氨基酸序列的LC。

在一些实施方案中，本发明的抗体或抗原结合部分包含H-CDR1-3和L-CDR1-3，所述H-CDR1-3和L-CDR1-3分别包含SEQ ID No:18-20和SEQ ID No:21-23的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含含有SEQ ID No:2的氨基酸序列的V_H和含有SEQ ID No:3的氨基酸序列的V_L。在具体的实施方案中，抗PD-1抗体包含含有SEQ ID No:2和67的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID No:3和68的氨基酸序列的轻链。

本发明还提供与包含氨基酸残基K131的PD-1的表位结合的抗PD-1抗体或其抗原结合部分(例如12819和12865抗体，诸如表1、4-9、和11-14中列出的抗体)。在一些实施方案中，表位进一步包含氨基酸残基P130和A132，且可以另外包含氨基酸残基V64和L128(例如12819抗体)。在一些实施方案中，表位进一步包含氨基酸残基E136(例如12865抗体)。

本发明还提供与包含SEQ ID No:1的氨基酸残基V44和T145的PD-1的表位结合的抗PD-1抗体或其抗原结合部分(例如13112抗体，诸如1、4-7、9、和11-14中列出的抗体)。

在具体的实施方案中，抗体或部分与包含SEQ ID No:1的氨基酸残基V64、L128、P130、K131、和A132的PD-1的表位结合(例如12819抗体)、与包含SEQ ID No:1的氨基酸残基K131和E136的PD-1的表位结合(例如12865抗体)、或与包含SEQ ID No:1的氨基酸残基V44和T145的PD-1的表位结合(例如13112抗体)。

本发明还提供与包含SEQ ID No:1的氨基酸残基69-90和122-140的PD-1的表位结合的单克隆抗体或其抗原结合部分(例如12819或12865抗体)。在一些实施方案中，单克隆抗体或抗原结合部分与包含SEQ ID No:1的氨基酸残基56-64、69-90、和122-140的PD-1的表位结合(例如12819抗体)。在一些实施方案中，抗体或部分与SEQ ID No:1的残基69-75(或其片段)结合(例如12819或12865抗体)。在一些实施方案中，抗体或部分与SEQ ID No:1的残基136-140(或其片段)结合(例如12819或12865抗体)。在一些实施方案中，抗体或部分与SEQ ID No:1的残基69-75(或其片段)及残基136-140(或其片段)结合(例如12819或12865抗体)。

在一些实施方案中，本发明的抗PD-1抗体或抗原结合部分具有以下特性的至少一者：

a)以750pM或更低的K_D与人类PD-1结合；

b)以7nM或更低的K_D与食蟹猴PD-1结合；

c)以1nM或更低的K_D与小鼠PD-1结合；

d)不与大鼠PD-1结合；

e)在SEB全血测定法中增加IL-2分泌；

f)在单向混合淋巴细胞反应测定法中增加IFN-γ分泌；

g)在流式细胞测量竞争测定法中在10μg/ml的浓度下抑制PD-1与PD-L1间的相互作用达至少60％；

h)如由生物膜(Bio-Layer)干涉分析测定的，在10μg/ml的浓度下阻断PD-L1及PD-L2与PD-1的结合达至少90％；以及

i)体内抑制肿瘤生长。

此类抗体的实例包含但不限于12819抗体(具有特性a-i)；12748、12892和12777抗体(具有至少特性a、b、和e-h)；12865和12796抗体(具有至少特性a、b、e、f、和h)以及12760和13112抗体(具有至少特性a、b、e、和f)。在一些实施方案中，本发明的抗PD-1抗体或抗原结合部分具有所有所述特性。在一些实施方案中，抗PD-1抗体或抗原结合部分具有至少特性a、b、和e-h。在一些实施方案中，抗PD-1抗体或抗原结合部分具有至少特性a、b、e、f、和h。在一些实施方案中，抗PD-1抗体或抗原结合部分具有至少特性a、b、e、和f。

除非另外指出，12819、12748、12865、12892、12796、12777、12760和13112各指具有相同的六个CDR且在其十个数字的编号命名中共有前五个数字的一组抗体。例如，12748包含抗体变体12748.15381和12748.16124，其具有相同的六个CDR(如表2所示)。预期各组抗体共有相同的或实质相同的生物特性。

在一些实施方案中，本发明的抗PD-1抗体或抗原结合部分不与派姆单抗或纳武单抗竞争对PD-1的结合。在一些实施方案中，本发明的抗PD-1抗体或抗原结合部分不与派姆单抗或纳武单抗结合相同的表位；例如，本发明的抗体或部分与一或多个不受派姆单抗或纳武单抗结合的PD-1上的残基结合。

在另一个方面，本发明提供包含至少一种如本文中描述的抗PD-1抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

本发明进一步提供包含编码如在本文中描述的抗PD-1抗体的重链或其抗原结合部分的核苷酸序列、编码如在本文中描述的抗PD-1抗体的轻链或其抗原结合部分的核苷酸序列、或两者的分离的核酸分子。

本发明还提供包含此类分离的核酸分子的载体，其中所述载体进一步包含表达控制序列。

本发明还提供包含编码如在本文中描述的抗PD-1抗体的重链或其抗原结合部分的核苷酸序列、编码如在本文中描述的抗PD-1抗体的轻链或其抗原结合部分的核苷酸序列、或两者的宿主细胞。

本发明还提供用于生产如本文中所描述的抗体或其抗原结合部分的方法，其包含提供包含编码如在本文中描述的抗PD-1抗体的重链或其抗原结合部分的核苷酸序列和编码如在本文中描述的抗PD-1抗体的轻链或其抗原结合部分的核苷酸序列的宿主细胞，在适合于表达抗体或部分的条件下培养所述宿主细胞，并且分离所得的抗体或部分。

本发明还提供具有在本文中所描述的抗PD-1抗体的结合特异性和另一个抗PD-1抗体(例如另一个在本文中描述的抗PD-1抗体)或靶向不同的蛋白质(诸如另一个免疫检查点蛋白质、癌症抗原、或另一个其活性介导疾病病况诸如癌症的细胞表面分子)的抗体的结合特异性的双特异性结合分子。

本发明还提供用于在有此需要的患者(例如人类患者)中增强免疫力的方法，其包含将如本文中所描述的抗PD-1抗体或其抗原结合部分、药物组合物、或双特异性结合分子施用于所述患者。

本发明进一步提供用于治疗患者(例如人类患者)中的癌症的方法，其包含将如本文中所描述的抗PD-1抗体或其抗原结合部分、药物组合物、或双特异性结合分子施用于所述患者。在一些实施方案中，癌症源自选自由以下所组成的组的组织中：皮肤、肺、肠、卵巢、脑、前列腺、肾脏、软组织、造血系统、头和颈、肝脏、膀胱、乳房、胃、子宫和胰脏。癌症可以为例如晚期或转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌、头颈鳞状细胞癌、肾细胞癌、或何杰金氏淋巴瘤。在一些实施方案中，方法进一步包含施用化学治疗剂、抗肿瘤剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、或PD-1途径抑制剂。

本发明进一步提供用于上述治疗的本发明的抗体或抗原结合部分以及本发明的抗体或抗原结合部分用于制备用于上述治疗(即治疗有此需要的人类以增强其免疫系统，以及治疗患有癌症(诸如上述癌症之一)的人类)的药物的用途。

附图简述

图1显示含有分别与相对应人类重链IgG1-CH1-CH2-CH3和人类轻链λ恒定片段以符合读码框的方式克隆的抗PD-1抗体AAS-12819的V_H和V_L区域(以黑色显示)的PCR产物。用于此克隆的限制性位点是ApaI和AvrII。限制性位点AscI和NheI是在V_H和V_L 5’末端之间显示。质粒复制起点描绘成pUC ori且赋予氨苄青霉素抗性的基因描绘成AmpR。

图2显示具有在V_H和V_L的5’末端之间使用AscI和NheI限制性位点插入的双重CMV启动子的表达构建体。V_H和V_L序列以黑色描绘，其他有注解的遗传元件是以白色描绘。

图3A-3C显示以下的代表性的流式细胞术点图：(A)与经人类PD-1转染的细胞特异性结合的抗体克隆、(B)与CHO-S细胞非特异性结合的克隆、和(C)不与筛选中使用的细胞群体的任一者结合的克隆。

图4显示在以SEB(葡萄球菌属肠毒素B)刺激之前和之后六个供体(D1-D6)中表达PD-1的淋巴细胞的频率。

图5A-I显示SEB分析中候选抗PD-1抗体的滴定。

图6A-H显示单向MLR测定法中候选抗PD-1抗体的滴定。

图7A-B显示在抗PD-1抗体的存在下PD-L1与PD-1表达性细胞的结合。

图8显示所测试的抗PD-1抗体12866.13188、12807.13177、12819.17149、12865.17150、12892.13195、12777.15382、12760.13169、13112.15380、以及纳武单抗和派姆单抗类似物的所鉴定的表位组(表位仓(epitope bin))的概要。以黑线连接的抗体指示交叉阻断活性。抗体是根据与其他抗PD-1抗体的竞争模式分组。Nivo：纳武单抗类似物；Pembro：派姆单抗类似物。

图9(小图A-G)显示抗体表位在人类PD-1(PDB 4ZQK和2M2D)的结构上的位点。A)人类PD-1细胞外域(ECD)(残基33-150)的草图。GFCC’和ABEDβ片层和C’-D环的位点得到阐明。B)在与(A)中相同的视角的人类PD-1:人类PD-L1复合体的草图。C)以密度图显示的派姆单抗表位的分子模型，颜色较深的区域代表介导较强的结合的区域。黑色的区域代表通过丙氨酸扫描找到的接触残基。D)如(C)中表示的纳武单抗表位的分子模型。E)如(C)中表示的12819抗体表位的分子模型。F)如(C)中表示的12865抗体表位的分子模型。G)如(C)中表示的非配体阻断性13112抗体表位的分子模型。

图10(小图A-D)显示四个同基因肿瘤模型中使用抗PD-1抗体12819、17149或媒剂(vehicle)处理对肿瘤生长的功效。A)CT26(结肠癌)。B)C38(结肠癌)。C)ASB-XIV(肺癌)。D)Sa1N(纤维肉瘤)。灰色的区域表示处理期间。数据是以平均值±SEM呈现。*P<0.001。

图11显示以抗PD-1抗体12819.17149、派姆单抗()、或媒剂处理对经半人源化的异种移植肿瘤模型的肿瘤生长的功效，其中人类黑色素瘤细胞系A375在接种前与经纯化的人类CD8+和CD4+T细胞混合。灰色的区域表示处理期间。数据是以平均值±SEM呈现。*P<0.001。

发明详述

本发明提供新的抗人类PD-1抗体，其可以用于增强人类患者(诸如癌症患者)中的免疫系统。除非另外陈述，如用在本文中，“PD-1”指人类PD-1。人类PD-1多肽序列可于Uniprot登录号Q15116(PDCD1_人类)下获得，在本文以SEQ ID No:1显示。

如用在本文中，术语“抗体”(Ab)或“免疫球蛋白”(Ig)指由二硫键相互连接包含两个重(H)链(约50-70KDa)和两个轻(L)链(约25KDa)的四聚体。各个重链包含重链可变域(V_H)和重链恒定区(CH)。各个轻链由轻链可变域(V_L)和轻链恒定区(CL)构成。V_H和V_L域可以进一步细分成点缀着更保留的区域(称为“框架区”(FR))的高度易变性的区域(称为“互补决定簇”(CDR))。各个V_H和V_L是由三个CDR(H-CDR在本文中表明来自重链的CDR；且L-CDR在本文中表明来自轻链的CDR)和四个FR构成，其由氨基末端至羧基末端以以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链或轻链中的氨基酸编号的分配可以根据定义(Lefranc等人,Dev Comp Immunol 27(1):55-77(2003))；或Kabat的定义，Sequences ofProteins of Immunological Interest(国立卫生研究所，Bethesda，MD(1987和1991))；Chothia&Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；或Chothia等人,Nature 342:878-883(1989)。

术语“重组抗体”指抗体，其是自包含编码该抗体的核苷酸序列的细胞或细胞系表达，其中所述核苷酸序列不与细胞天然关联。

术语“分离的蛋白质”、“分离的多肽”或“分离的抗体”指下述的蛋白质、多肽或抗体，其由于其衍生的起源或来源而(1)不与在其天然状态下伴随其的天然关联组分关联，(2)不含来自相同物种的其他蛋白质，(3)是由来自不同物种的细胞表达，及/或(4)在自然中不存在。因此，化学合成的多肽或在与其天然所源自的细胞不同的细胞系统中合成的多肽会是自其天然关联的组分“分离的”。也可以通过使用本领域中公知的蛋白质纯化技术来分离以使蛋白质实质上不含天然关联的组分。

如用在本文中，术语“种系”指与其经由生殖细胞自亲本传至后代时一样的抗体基因和基因区段的核苷酸和氨基酸序列。种系序列与编码成熟B细胞中的抗体的核苷酸序列(其已经在B细胞成熟的过程期间的重组和超突变事件改变)有区别。“利用”特定种系序列的抗体具有与该种系核苷酸序列比对或与其比起任何其他种系核苷酸或氨基酸序列更接近规定的氨基酸序列比对的核苷酸或氨基酸序列。

术语“亲和力”指抗原与抗体间的吸引的度量。抗体对抗原的固有吸引力典型是以特定抗体-抗原相互作用的结合亲和力平衡常数(K_D)表示。当K_D是≤1mM(优选为≤100nM)时，抗体称为与抗原特异性结合的。K_D结合亲和力常数可以通过例如表面等离振子共振(BIAcore^TM)或生物膜干涉(Bio-Layer Interometry)(例如使用来自Bio-Rad的ProteOn^TMXPR36SPR系统或Octet^TM系统)测量。

术语“k_off”指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。k_off解离速率常数可以通过生物膜干涉(例如使用Octet^TM系统)测量。

如用在本文中，术语“表位”指抗原的部分(决定簇)，其与抗体或相关的分子(诸如双特异性结合分子)特异性结合。表位决定簇一般由诸如氨基酸或碳水化合物或糖侧链的分子的化学上有活性的表面群集所组成且一般具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位可以为“线性”或“构象性”。在线性表位中，蛋白质(例如抗原)与相互作用分子(诸如抗体)间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性地发生。在构象性表位中，相互作用的点遍及蛋白质上一级氨基酸序列中彼此分开的氨基酸残基发生。一旦在抗原上的期望表位得到测定，就有可能使用本领域中公知的技术产生针对该表位的抗体。例如，针对线性表位的抗体可以通过例如以具有该线性表位的氨基酸残基的肽免疫动物来产生。针对构象性表位的抗体可以通过例如以含有构象性表位的有关氨基酸残基的迷你域免疫动物来产生。针对特定表位的抗体也可以通过例如以感兴趣的目标分子或其有关部分(例如PD-1的ECD)免疫动物，然后针对对表位的结合筛选来产生。

可以通过使用本领域中已知的方法(其包含但不限于竞争测定法、表位入仓(epitope binning)、和丙氨酸扫描)测定抗体是否与本发明的抗PD-1抗体结合相同的表位或和本发明的抗PD-1抗体竞争结合。在一些实施方案中，测试抗体及本发明的抗PD-1抗体与至少一个在PD-1上的共同的残基(例如至少两个、三个、四个、或五个共同的残基)结合。在进一步的实施方案中，测试抗体与本发明的抗PD-1抗体间的PD-1上的接触残基是完全相同的。在一个实施方案中，允许本发明的抗PD-1抗体在饱和条件下与PD-1结合并接着测量测试抗体与PD-1结合的能力。若该测试抗体能够与参考抗PD-1抗体同时与PD-1结合，则该测试抗体与该参考抗PD-1抗体结合不同的表位。然而，若该测试抗体无法同时与PD-1结合，则该测试抗体结合由本发明的抗PD-1抗体所结合的表位相同的表位、与本发明的抗PD-1抗体所结合的表位重叠的表位、或接近由本发明的抗PD-1抗体所结合的表位的表位。此实验可以使用ELISA、RIA、BIACORE^TM、生物膜干涉或流式细胞术进行。为测试抗PD-1抗体是否与另一抗PD-1抗体交叉竞争，可以以两个方向使用以上描述的竞争方法，即测定已知抗体是否阻断测试抗体，反之亦然。此类交叉竞争实验可以使用例如IBIS MX96SPR仪器或Octet^TM系统进行。

术语“嵌合抗体”在其最广的意义上指下述抗体，其含有来自一个抗体的一或多个区域和来自一或多个其他抗体的一或多个区域，其典型为部分人类来源且部分为非人类来源(即部分衍生自非人类动物，例如小鼠、大鼠或其他啮齿类动物、或鸟类诸如鸡)的抗体。为了减少人类抗抗体反应(例如在鼠抗体的情况中的人类抗小鼠抗体反应)的风险，相较于非人类抗体，嵌合抗体是优选的。典型嵌合抗体的实例是其中可变域序列为鼠而恒定区序列为人类的嵌合抗体。在嵌合抗体的情况中，非人类部分可以经受进一步的改变以人源化该抗体。在本文中描述的嵌合抗体具有鸡可变域序列和人类恒定区序列。

术语“人源化”指以下事实：在抗体是完全或部分非人类来源(例如，通过以感兴趣的抗原分别免疫小鼠或鸡来获得的鼠或鸡抗体、或基于此类鼠或鸡抗体的嵌合抗体)的情况下，有可能替换氨基酸(特别是在重链和轻链的框架区和恒定区中)以避免或最小化人类中的免疫反应。虽然不可能准确地预测免疫原性以及藉此准确地预测特定抗体的人类抗抗体反应，相较于人类抗体，非人类抗体倾向于在人类中是更为免疫原性的。已显示相较于完全外来来源的抗体，其中外来(例如啮齿类动物或鸟类)恒定区已以人类来源的序列替换的嵌合抗体一般免疫原性较低，且在治疗抗体中的趋势是朝向人源化或完全人类抗体。嵌合抗体或其他非人类来源的抗体因此可以经人源化以减少人类抗抗体反应的风险。

对于嵌合抗体而言，人源化典型地涉及修饰可变域序列的框架区。有关人源化，作为互补决定簇(CDR)的部分的氨基酸残基最常不受改变，虽然在一些情况中改变个别的CDR氨基酸残基可能是期望的，以例如移除糖苷化位点、脱酰胺化位点、天冬氨酸异构化位点或不想要的半胱氨酸或甲硫氨酸残基。N连接的糖苷化通过寡糖链接附至三肽序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr(其中X可以为除了Pro以外的任何氨基酸)中的天冬酰胺残基而发生。移除N-糖苷化位点可以通过将Asn或Ser/Thr残基突变成不同的残基(优选是通过保守性取代的方式)实现。天冬酰胺和谷氨酰胺残基的脱酰胺化可以根据诸如pH和表面暴露等因素而发生。天冬酰胺残基特别易受脱酰胺化影响，主要是当其存在于序列Asn-Gly中且在较小的程度上存在于诸如Asn-Ala的其他二肽序列时。当此类脱酰胺化位点，特别是Asn-Gly存在于CDR序列中时，移除该位点，典型是通过保守性取代以移除有牵连的残基之一可能因此是期望的。

许多用于抗体序列人源化的方法是本领域中已知的；参见例如Almagro&Fransson,Front Biosci.13:1619-1633(2008)的综述。一个通常使用的方法为CDR移植法，其例如对于衍生自鼠的嵌合抗体而言涉及鉴定对鼠可变域基因的人类种系基因对应物以及将鼠CDR序列移植至此框架中。抗体与目标抗原间的相互作用的特异性主要存在于位于重链和轻链的六个CDR的氨基酸残基。因此，相较于在CDR外面的序列，在CDR里面的氨基酸序列在个别抗体间更多变。因为CDR序列负责大部分的抗体-抗原相互作用，所以可能的是表达模拟特定的天然存在的抗体或更一般地为任何具有给定氨基酸序列的特定抗体的特性的重组抗体，通过例如构建表达载体进行，所述表达载体表达移植到来自不同的抗体的框架序列中的来自特定抗体的CDR序列。因此，可能的是将非人类抗体“人源化”且仍实质上维持初始的抗体的结合特异性和亲和力。CDR移植法可以基于Kabat CDR定义，虽然更最近的文献(Magdelaine-Beuzelin等人,Crit Rev.Oncol Hematol.64:210-225(2007))已建议定义(international ImMunoGeneTics information www.imgt.org)可以改善人源化的结果(参见Lefranc等人,Dev.Comp Immunol.27:55-77(2003))。

在一些情况中，相较于CDR自其获得的亲本抗体，CDR移植可能减少经移植CDR的非人类抗体的结合特异性和亲和力以及因此减少生物活性。回复突变(有时称为“框架修复”)可以在经移植CDR的抗体的所选位点(典型在框架区内)导入以重新建立亲本抗体的结合特异性和亲和力。对于可能的回复突变的位置的鉴定可使用文献中和抗体数据库中可得的信息进行。为回复突变的候选物的氨基酸残基典型是位于抗体分子的表面的氨基酸残基，而通常不改变包埋的或具有低表面暴露程度的残基。

对于CDR移植和回复突变的供选择的人源化技术为表面重修(resurfacing)，其中非人类来源的非表面暴露的残基得到保留，而将表面残基改变成人类残基。

在某些情况中，也可能期望的是改变一或多个CDR氨基酸残基以改善对目标表位的结合亲和力。这称为“亲和力成熟”且任选地可关联人源化来进行，例如在抗体的人源化导致结合特异性或亲和力减少且无法单独通过回复突变充分地改善结合特异性或亲和力的情况下。各种亲和力成熟方法是本领域中已知的，例如由Burks等人,Proc Natl AcadSci USA、94:412–417(1997)所描述的体外扫描饱和诱变方法、以及Wu等人,Proc NatlAcad Sci USA 95:6037–6042(1998)的逐步体外亲和力成熟方法。

如用在本文中，术语抗体的“抗原结合部分”(或仅仅“抗体部分”)指抗体的一或多个部分或片段，其保留与抗原(例如人类PD-1、或其部分)特异性结合的能力。已显示全长抗体的某些片段可以进行抗体的抗原结合功能。涵盖在术语“抗原结合部分”内的结合片段的实例包含(i)Fab片段：由V_L、V_H、C_L和C_H1域所组成的单价片段(例如以下所描述的12819.17149和12865.17150Fab片段)；(ii)F(ab')₂片段：包含两个在铰链区处由二硫桥连接的Fab片段的二价片段；(iii)由V_H和C_H1域所组成的的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的V_L和V_H域所组成的Fv片段，(v)dAb片段，其由V_H域组成；以及(vi)能够特异性地与抗原结合的分离的互补决定簇(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个域(V_L和V_H)是由分开的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过使它们能够以其中V_L和V_H域配对以形成单价分子的单一蛋白质链(称为单链Fv(scFv))的形式制备的合成的接头连接在一起。也落入本发明内是包含V_H及/或V_L的抗原结合性分子。在V_H的情况中，该分子也可以包含CH1、铰链、CH2、或CH3区域中的一种或多种。此类单链抗体也意图涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。单链抗体的其他形式(诸如双抗体(diabody))也是涵盖的。双抗体为二价双特异性抗体，其中V_H和V_L域是在单一多肽链上表达，但使用过短以至于相同的链上的两个域无法配对的接头，藉此使所述域与另一链的互补域配对且创造两个抗原结合性位点。

抗体部分(诸如Fab和F(ab')₂片段)可以自完整的抗体使用常规技术(诸如完整抗体的木瓜酶或胃蛋白酶消化)制备。此外，抗体、抗体部分和免疫粘附分子可以使用标准重组DNA技术(例如如本文中所描述者)获得。

抗PD-1抗体的类别(同种型)和亚类可以通过任何本领域中已知的方法测定。一般而言，抗体的类别和亚类可以使用对特定的抗体的类别和亚类有特异性的抗体测定。此类抗体是商品化的。类别和亚类可以通过ELISA、Western印迹以及其他技术测定。或者，类别和亚类可以通过测序抗体的重链及/或轻链的整个恒定区或其部分，将它们的氨基酸序列与各种免疫球蛋白的类别和亚类的已知氨基酸序列比较，并且确定抗体的类别和亚类来测定。

当提及抗体序列的给定位点的特定氨基酸残基时，例如“35S”的指示指位置和残基，即在此情况中指出丝氨酸残基(S)存在于序列的位置35。类似地，例如“13Q+35S”的指示指在相应位置中的两个残基。

除非另外指出，本文的公开内容中提及的所有抗体氨基酸残基编号是在编号方案下的。

抗PD-1抗体

本发明提供针对PD-1的抗体及其抗原结合部分。抗体可以为嵌合的，具有衍生自鸡的可变域和人类恒定区，或可以是人源化的。在本文中公开的抗体特别是人源化抗体。

8个本发明的所选人源化抗PD-1抗体的V_H和V_L氨基酸序列(SEQ ID No:2至17)是进一步于以下表4(实施例4)中显示。用于参考，以下表1中提供了SEQ ID No.。

在本文中公开的抗PD-1抗体可以5个数字的编号(例如“12819”)或以10个数字的编号(例如“12819.15384”)提及。如用在本文中，5个数字的编号指所有具有在表2中针对该数字显示的重链和轻链CDR1-3序列的抗体，而使用10个数字的编号指特定的人源化变体。例如，12819.15384是具有如表2所示的12819抗体的CDR序列的特定的人源化变体。该5个数字的编号涵盖例如除了FR中的一些改变外(例如成熟轻链的N末端缺少残基SY、或具有残基SS替代SY)与以下表1中显示的10个数字的变体相同的抗体。这些修饰不改变抗体的功能(例如抗原结合性)特性。

表1人源化抗PD-1抗体的重链和轻链可变域的氨基酸序列的SEQ ID No

以下表2提供抗体的重链和轻链CDR氨基酸序列的SEQ ID No。

表2抗PD-1抗体的CDR氨基酸序列的SEQ ID No

抗体	H-CDR1	H-CDR2	H-CDR3	L-CDR1	L-CDR2	L-CDR3
							12819	18	19	20	21	22	23
12748	24	25	26	27	28	29
							12865	30	31	32	33	34	35
12892	36	37	38	39	40	41
							12796	42	43	44	45	46	47
12777	48	49	50	51	52	53
							12760	54	55	56	57	58	59
13112	60	61	62	63	64	65

在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自下组：

a)抗体，其H-CDR1-3分别包含SEQ ID No:18-20的氨基酸序列；

b)抗体，其重链可变域(V_H)在序列上与SEQ ID No:2的氨基酸序列至少90％相同；

c)抗体，其V_H包含SEQ ID No:2的氨基酸序列；

d)抗体，其重链(HC)包含SEQ ID No:2和67的氨基酸序列；

e)抗体，其L-CDR1-3分别包含SEQ ID No:21-23的氨基酸序列；

f)抗体，其轻链可变域(V_L)在序列上与SEQ ID No:3的氨基酸序列至少90％相同；

g)抗体，其V_L包含SEQ ID No:3的氨基酸序列；

h)抗体，其轻链(LC)包含SEQ ID No:3和68的氨基酸序列；

i)抗体，其H-CDR1-3和L-CDR1-3分别包含SEQ ID No:18-23的氨基酸序列；

j)抗体，其V_H在序列上与SEQ ID No:2的氨基酸序列至少90％相同且其V_L在序列上与SEQ ID No:3的氨基酸序列至少90％相同；

k)抗体，其V_H包含SEQ ID No:2的氨基酸序列且其V_L包含SEQ ID No:3的氨基酸序列；和

l)抗体，其HC包含SEQ ID No:2和67的氨基酸序列且其LC包含SEQ ID No:3和68的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自下组：

a)抗体，其H-CDR1-3分别包含SEQ ID No:24-26的氨基酸序列；

b)抗体，其重链可变域(V_H)在序列上与SEQ ID No:4的氨基酸序列至少90％相同；

c)抗体，其V_H包含SEQ ID No:4的氨基酸序列；

d)抗体，其重链(HC)包含SEQ ID No:4和67的氨基酸序列；

e)抗体，其L-CDR1-3分别包含SEQ ID No:27-29的氨基酸序列；

f)抗体，其轻链可变域(V_L)在序列上与SEQ ID No:5或66的氨基酸序列至少90％相同；

g)抗体，其V_L包含SEQ ID No:5或66的氨基酸序列；

h)抗体，其轻链(LC)包含SEQ ID No:5或66的氨基酸序列与SEQ ID No:68的氨基酸序列；

i)抗体，其H-CDR1-3和L-CDR1-3分别包含SEQ ID No:24-29的氨基酸序列；

j)抗体，其V_H在序列上与SEQ ID No:4的氨基酸序列至少90％相同且其V_L在序列上与SEQ ID No:5或66的氨基酸序列至少90％相同；

k)抗体，其V_H包含SEQ ID No:4的氨基酸序列且其V_L包含SEQ ID No:5或66的氨基酸序列；和

l)抗体，其HC包含SEQ ID No:4和67的氨基酸序列且其LC包含SEQ ID No:5或66以及SEQ ID No:68的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自下组：

a)抗体，其H-CDR1-3分别包含SEQ ID No:30-32的氨基酸序列；

b)抗体，其重链可变域(V_H)在序列上与SEQ ID No:6的氨基酸序列至少90％相同；

c)抗体，其V_H包含SEQ ID No:6的氨基酸序列；

d)抗体，其重链(HC)包含SEQ ID No:6和67的氨基酸序列；

e)抗体，其L-CDR1-3分别包含SEQ ID No:33-35的氨基酸序列；

f)抗体，其轻链可变域(V_L)在序列上与SEQ ID No:7的氨基酸序列至少90％相同；

g)抗体，其V_L包含SEQ ID No:7的氨基酸序列；

h)抗体，其轻链(LC)包含SEQ ID No:7和68的氨基酸序列；

i)抗体，其H-CDR1-3和L-CDR1-3分别包含SEQ ID No:30-35的氨基酸序列；

j)抗体，其V_H在序列上与SEQ ID No:6的氨基酸序列至少90％相同且其V_L在序列上与SEQ ID No:7的氨基酸序列至少90％相同；

k)抗体，其V_H包含SEQ ID No:6的氨基酸序列且其V_L包含SEQ ID No:7的氨基酸序列；和

l)抗体，其HC包含SEQ ID No:6和67的氨基酸序列且其LC包含SEQ ID No:7和68的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自下组：

a)抗体，其H-CDR1-3分别包含SEQ ID No:36-38的氨基酸序列；

b)抗体，其重链可变域(V_H)在序列上与SEQ ID No:8的氨基酸序列至少90％相同；

c)抗体，其V_H包含SEQ ID No:8的氨基酸序列；

d)抗体，其重链(HC)包含SEQ ID No:8和67的氨基酸序列；

e)抗体，其L-CDR1-3分别包含SEQ ID No:39-41的氨基酸序列；

f)抗体，其轻链可变域(V_L)在序列上与SEQ ID No:9的氨基酸序列至少90％相同；

g)抗体，其V_L包含SEQ ID No:9的氨基酸序列；

h)抗体，其轻链(LC)包含SEQ ID No:9和68的氨基酸序列；

i)抗体，其H-CDR1-3和L-CDR1-3分别包含SEQ ID No:36-41的氨基酸序列；

j)抗体，其V_H在序列上与SEQ ID No:8的氨基酸序列至少90％相同且其V_L在序列上与SEQ ID No:9的氨基酸序列至少90％相同；

k)抗体，其V_H包含SEQ ID No:8的氨基酸序列且其V_L包含SEQ ID No:9的氨基酸序列；和

l)抗体，其HC包含SEQ ID No:8和67的氨基酸序列且其LC包含SEQ ID No:9和68的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自下组：

a)抗体，其H-CDR1-3分别包含SEQ ID No:42-44的氨基酸序列；

b)抗体，其重链可变域(V_H)在序列上与SEQ ID No:10的氨基酸序列至少90％相同；

c)抗体，其V_H包含SEQ ID No:10的氨基酸序列；

d)抗体，其重链(HC)包含SEQ ID No:10和67的氨基酸序列；

e)抗体，其L-CDR1-3分别包含SEQ ID No:45-47的氨基酸序列；

f)抗体，其轻链可变域(V_L)在序列上与SEQ ID No:11的氨基酸序列至少90％相同；

g)抗体，其V_L包含SEQ ID No:11的氨基酸序列；

h)抗体，其轻链(LC)包含SEQ ID No:11和68的氨基酸序列；

i)抗体，其H-CDR1-3和L-CDR1-3分别包含SEQ ID No:42-47的氨基酸序列；

j)抗体，其V_H在序列上与SEQ ID No:10的氨基酸序列至少90％相同且其V_L在序列上与SEQ ID No:11的氨基酸序列至少90％相同；

k)抗体，其V_H包含SEQ ID No:10的氨基酸序列且其V_L包含SEQ ID No:11的氨基酸序列；和

l)抗体，其HC包含SEQ ID No:10和67的氨基酸序列且其LC包含SEQ ID No:11和68的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自下组：

a)抗体，其H-CDR1-3分别包含SEQ ID No:48-50的氨基酸序列；

b)抗体，其重链可变域(V_H)在序列上与SEQ ID No:12的氨基酸序列至少90％相同；

c)抗体，其V_H包含SEQ ID No:12的氨基酸序列；

d)抗体，其重链(HC)包含SEQ ID No:12和67的氨基酸序列；

e)抗体，其L-CDR1-3分别包含SEQ ID No:51-53的氨基酸序列；

f)抗体，其轻链可变域(V_L)在序列上与SEQ ID No:13的氨基酸序列至少90％相同；

g)抗体，其V_L包含SEQ ID No:13的氨基酸序列；

h)抗体，其轻链(LC)包含SEQ ID No:13和68的氨基酸序列；

i)抗体，其H-CDR1-3和L-CDR1-3分别包含SEQ ID No:48-53的氨基酸序列；

j)抗体，其V_H在序列上与SEQ ID No:12的氨基酸序列至少90％相同且其V_L在序列上与SEQ ID No:13的氨基酸序列至少90％相同；

k)抗体，其V_H包含SEQ ID No:12的氨基酸序列且其V_L包含SEQ ID No:13的氨基酸序列；和

l)抗体，其HC包含SEQ ID No:12和67的氨基酸序列且其LC包含SEQ ID No:13和68的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自下组：

a)抗体，其H-CDR1-3分别包含SEQ ID No:54-56的氨基酸序列；

b)抗体，其重链可变域(V_H)在序列上与SEQ ID No:14的氨基酸序列至少90％相同；

c)抗体，其V_H包含SEQ ID No:14的氨基酸序列；

d)抗体，其重链(HC)包含SEQ ID No:14和67的氨基酸序列；

e)抗体，其L-CDR1-3分别包含SEQ ID No:57-59的氨基酸序列；

f)抗体，其轻链可变域(V_L)在序列上与SEQ ID No:15的氨基酸序列至少90％相同；

g)抗体，其V_L包含SEQ ID No:15的氨基酸序列；

h)抗体，其轻链(LC)包含SEQ ID No:15和68的氨基酸序列；

i)抗体，其H-CDR1-3和L-CDR1-3分别包含SEQ ID No:54-59的氨基酸序列；

j)抗体，其V_H在序列上与SEQ ID No:14的氨基酸序列至少90％相同且其V_L在序列上与SEQ ID No:15的氨基酸序列至少90％相同；

k)抗体，其V_H包含SEQ ID No:14的氨基酸序列且其V_L包含SEQ ID No:15的氨基酸序列；和

l)抗体，其HC包含SEQ ID No:14和67的氨基酸序列且其LC包含SEQ ID No:15和68的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自下组：

a)抗体，其H-CDR1-3分别包含SEQ ID No:60-62的氨基酸序列；

b)抗体，其重链可变域(V_H)在序列上与SEQ ID No:16的氨基酸序列至少90％相同；

c)抗体，其V_H包含SEQ ID No:16的氨基酸序列；

d)抗体，其重链(HC)包含SEQ ID No:16和67的氨基酸序列；

e)抗体，其L-CDR1-3分别包含SEQ ID No:63-65的氨基酸序列；

f)抗体，其轻链可变域(V_L)在序列上与SEQ ID No:17的氨基酸序列至少90％相同；

g)抗体，其V_L包含SEQ ID No:17的氨基酸序列；

h)抗体，其轻链(LC)包含SEQ ID No:17和68的氨基酸序列；

i)抗体，其H-CDR1-3和L-CDR1-3分别包含SEQ ID No:60-65的氨基酸序列；

j)抗体，其V_H在序列上与SEQ ID No:16的氨基酸序列至少90％相同且其V_L在序列上与SEQ ID No:17的氨基酸序列至少90％相同；

k)抗体，其V_H包含SEQ ID No:16的氨基酸序列且其V_L包含SEQ ID No:17的氨基酸序列；

l)抗体，其HC包含SEQ ID No:16和67的氨基酸序列且其LC包含SEQ ID No:17和68的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合部分包含12819抗体的H-CDR1-3和L-CDR1-3氨基酸序列(例如抗体12819.15384)。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合部分包含12748抗体的H-CDR1-3和L-CDR1-3氨基酸序列(例如抗体12748.15381或抗体12748.16124)。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合部分包含12865抗体的H-CDR1-3和L-CDR1-3氨基酸序列(例如抗体12865.15377)。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合部分包含12892抗体的H-CDR1-3和L-CDR1-3氨基酸序列(例如抗体12892.15378)。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合部分包含12796抗体的H-CDR1-3和L-CDR1-3氨基酸序列(例如抗体12796.15376)。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合部分包含12777抗体的H-CDR1-3和L-CDR1-3氨基酸序列(例如抗体12777.15382)。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合部分包含12760抗体的H-CDR1-3和L-CDR1-3氨基酸序列(例如抗体12760.15375)。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合部分包含13112抗体的H-CDR1-3和L-CDR1-3氨基酸序列(例如抗体13112.15380)。

在另一个实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合部分具有在氨基酸序列上分别与抗体12819.15384、12748.15381、12748.16124、12865.15377、12892.15378、12796.15376、12777.15382、12760.15375、和13112.15380的任一者的V_H和V_L至少90％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％)相同的V_H和V_L。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合部分具有分别包含抗体12819.15384、12748.15381、12748.16124、12865.15377、12892.15378、12796.15376、12777.15382、12760.15375、和13112.15380的任一者的V_H和V_L氨基酸序列的V_H和V_L。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合部分包含以下的H-CDR1-3和L-CDR1-3氨基酸序列：

a)分别为SEQ ID No:18、19、20、21、22、和23；

b)分别为SEQ ID No:24、25、26、27、28、和29；

c)分别为SEQ ID No:30、31、32、33、34、和35；

d)分别为SEQ ID No:36、37、38、39、40、和41；

e)分别为SEQ ID No:42、43、44、45、46、和47；

f)分别为SEQ ID No:48、49、50、51、52、和53；

g)分别为SEQ ID No:54、55、56、57、58、和59；或

h)分别为SEQ ID No:60、61、62、63、64、和65。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合部分包含与以下的氨基酸序列80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的V_H、以及与以下的氨基酸序列80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的V_L：

a)分别为SEQ ID No:2和3；

b)分别为SEQ ID No:4和5；

c)分别为SEQ ID No:4和66；

d)分别为SEQ ID No:6和7；

e)分别为SEQ ID No:8和9；

f)分别为SEQ ID No:10和11；

g)分别为SEQ ID No:12和13；

h)分别为SEQ ID No:14和15；或

i)分别为SEQ ID No:16和17。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体或其抗原结合部分包含为以下的氨基酸序列的V_H和V_L：

a)分别为SEQ ID No:2和3；

b)分别为SEQ ID No:4和5；

c)分别为SEQ ID No:4和66；

d)分别为SEQ ID No:6和7；

e)分别为SEQ ID No:8和9；

f)分别为SEQ ID No:10和11；

g)分别为SEQ ID No:12和13；

h)分别为SEQ ID No:14和15；或

i)分别为SEQ ID No:16和17。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含：

a)由SEQ ID No:2和67的氨基酸序列所组成的HC和由SEQ ID No:3和68的氨基酸序列所组成的LC；

b)由SEQ ID No:4和67的氨基酸序列所组成的HC和由SEQ ID No:5和68的氨基酸序列所组成的LC；

c)由SEQ ID No:4和67的氨基酸序列所组成的HC和由SEQ ID No:66和68的氨基酸序列所组成的LC；

d)由SEQ ID No:6和67的氨基酸序列所组成的HC和由SEQ ID No:7和68的氨基酸序列所组成的LC；

e)由SEQ ID No:8和67的氨基酸序列所组成的HC和由SEQ ID No:9和68的氨基酸序列所组成的LC；

f)由SEQ ID No:10和67的氨基酸序列所组成的HC和由SEQ ID No:11和68的氨基酸序列所组成的LC；

g)由SEQ ID No:12和67的氨基酸序列所组成的HC和由SEQ ID No:13和68的氨基酸序列所组成的LC；

h)由SEQ ID No:14和67的氨基酸序列所组成的HC和由SEQ ID No:15和68的氨基酸序列所组成的LC；或

i)由SEQ ID No:16和67的氨基酸序列所组成的HC和由SEQ ID No:17和68的氨基酸序列所组成的LC。

在一些实施方案中，在本文中描述的抗PD-1抗体或抗原结合部分的任一者可以具有以下特性的至少一者：

a)以750pM或更低的K_D与人类PD-1结合；

b)以7nM或更低的K_D与食蟹猴PD-1结合；

c)以1nM或更低的K_D与小鼠PD-1结合；

d)不与大鼠PD-1结合；

e)在SEB全血测定法中增加IL-2分泌；

f)在单向混合淋巴细胞反应测定法中增加IFN-γ分泌；

h)如由生物膜干涉分析测定的，在10μg/ml的浓度下阻断PD-L1及PD-L2与PD-1的结合达至少90％；以及

i)体内抑制肿瘤生长。

在一些实施方案中，在本文中描述的抗PD-1抗体或抗原结合部分的任一者可以以至少900、至少850、至少800、至少750、至少700、至少650、至少600、至少550、至少500、至少450、至少400、至少350、至少300、至少250、至少200、至少150、至少100、至少50、至少40、至少30、或至少20pM的K_D与人类PD-1结合。在一些实施方案中，使用表面等离振子共振测定K_D。在具体的实施方案中，抗PD-1抗体或抗原结合部分以比纳武单抗、派姆单抗、或两者高的亲和力与人类PD-1结合。

在一些实施方案中，在本文中描述的抗PD-1抗体或抗原结合部分的任一者可以以至少9000、至少8000、至少7000、至少6000、至少5000、至少4000、至少3000、至少2500、至少2000、至少1500、至少1000、至少900、至少800、至少700、至少600、至少500、至少400、至少300、至少200、至少100、至少75、至少50、至少25、至少20、至少15、至少10、或至少5pM的K_D与食蟹猴PD-1(SEQ ID No:89)结合。在一些实施方案中，使用表面等离振子共振测定K_D。

在一些实施方案中，在本文中描述的抗PD-1抗体或抗原结合部分的任一者可以以至少1000、至少950、至少900、或至少850pM的K_D与小鼠PD-1(SEQ ID No:91)结合。在一些实施方案中，使用表面等离振子共振测定K_D。

在一些实施方案中，在本文中描述的抗PD-1抗体或抗原结合部分的任一者在流式细胞测量竞争测定法中在10μg/ml的浓度可以抑制PD-1与PD-L1间的相互作用达至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％。在一些实施方案中，抗PD-1抗体或抗原结合部分可以抑制PD-1与PD-L1间的相互作用达至少83％。

在一些实施方案中，在本文中描述的抗PD-1抗体或抗原结合部分的任一者在10μg/ml的浓度可以阻断PD-L1及PD-L2与PD-1的结合达至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％，如由生物膜干涉分析测定的。在一些实施方案中，抗PD-1抗体或抗原结合部分阻断PD-L1及PD-L2与PD-1的结合达至少90％。

在一些实施方案中，在本文中描述的抗PD-1抗体或抗原结合部分的任一者可以与12865、12892、和12777抗体(例如抗体12865.15377、12892.15378、和12777.15382)竞争或交叉竞争对PD-1的结合。在一些实施方案中，在本文中描述的抗PD-1抗体或抗原结合部分的任一者可以与12819抗体(例如抗体12819.15384)竞争或交叉竞争对PD-1的结合。在一些实施方案中，在本文中描述的抗PD-1抗体或抗原结合部分的任一者可以与12760和13112抗体(例如抗体12760.15375和13112.15380)竞争或交叉竞争对PD-1的结合。

在一些实施方案中，本发明的抗PD-1抗体(或其抗原结合部分)与包含SEQ ID No:1的以下残基的至少一者(例如至少一者、至少二者、至少三者、至少四者、或至少五者)的PD-1的表位结合：V44、V64、L128、P130、K131、A132、E136、和T145。在一些实施方案中，抗体或抗原结合部分与包含SEQ ID No:1的残基V64、L128、P130、K131、和A132的PD-1的表位结合(诸如12819抗体，例如抗体12819.15384)。在一些实施方案中，抗体或抗原结合部分与包含SEQ ID No:1的残基K131和E136的PD-1的表位结合(诸如12865抗体，例如抗体12865.15377)。在一些实施方案中，抗体或抗原结合部分与包含SEQ ID No:1的残基V44和T145的PD-1的表位结合(诸如13112抗体，例如抗体13112.15380)。

在一些实施方案中，本发明的抗PD-1抗体(或其抗原结合部分)与包含SEQ ID No:1的残基56-64、69-90、及/或122-140的PD-1的表位结合。在一些实施方案中，抗体或抗原结合部分与包含SEQ ID No:1的残基69-90和122-140的PD-1的表位结合(诸如12819和12865抗体，例如抗体12819.15384和12865.15377)。在一些实施方案中，抗体或抗原结合部分与包含SEQ ID No:1的残基56-64、69-90、和122-140的PD-1的表位结合(例如12819抗体)。在一些实施方案中，抗体或抗原结合部分与包含SEQ ID No:1的残基69-90和122-140的PD-1的表位结合(例如12865抗体)。在一些实施方案中，抗体或部分与SEQ ID No:1的残基69-75(或其片段，诸如一个、两个、三个、四个、五个、或六个残基的片段)结合(诸如12819和12865抗体，例如抗体12819.15384和12865.15377)。在一些实施方案中，抗体或部分与SEQ IDNo:1的残基136-140(或其片段，诸如一个、两个、三个、或四个残基的片段)结合(诸如12819和12865抗体，例如抗体12819.15384和12865.15377)。在一些实施方案中，抗体或部分与SEQ ID No:1的残基69-75(或其片段)以及残基136-140(或其片段)结合(诸如12819和12865抗体，例如抗体12819.15384和12865.15377)。也涵盖具有任何以上残基的组合的表位。

在一些实施方案中，包含如本文中所描述的PD-1表位的氨基酸序列可以用作为免疫原(例如施用于动物或作为用于筛选抗体文库的抗原)以产生或鉴定与所述表位结合的抗PD-1抗体或其抗原结合部分。

通过在本文中描述的方法获得的抗PD-1抗体的类别可以改变或转换成另一个类别或亚类。在本发明的一个方面，编码V_L或V_H的核酸分子使用本领域中公知的方法分离以使其不包含编码C_L或C_H的核酸序列。编码V_L或V_H的核酸分子接着可操作连接至分别编码来自不同类别的免疫球蛋白分子的C_L或C_H的核酸序列。这可以使用包含C_L或C_H链的载体或核酸分子(如以上描述)实现。例如，最初为IgM的抗PD-1抗体可以类别转换成IgG。进一步，类别转换可以用以将一个IgG亚类转变成另一个，例如将IgG₁转变成IgG₂。κ轻链恒定区可以改变成λ轻链恒定区。用于生产具有期望的Ig同种型的本发明的抗体的优选方法包含以下步骤：分离编码抗PD-1抗体的重链的核酸分子和编码抗PD-1抗体的轻链的核酸分子，获得重链的可变域，连接期望的同种型的重链的可变域和重链的恒定区，在细胞中表达轻链和连接的重链，并且收集具有期望的同种型的抗PD-1抗体。

本发明的抗PD-1抗体可以为IgG、IgM、IgE、IgA、或IgD分子，但典型是属于IgG同种型，例如属于IgG亚类IgG₁、IgG_2a或IgG_2b、IgG₃或IgG₄。在一个实施方案中，抗体是IgG₁。在另一个实施方案中，抗体是IgG₄。

在一个实施方案中，抗PD-1抗体可以在Fc区域中包含至少一个突变。一些不同的Fc突变是已知的，其中这些突变提供改变的效应器功能。例如，在许多情况中，以下会是期望的：减少或排除效应器功能，例如在配体/受体相互作用是不想要的情况下或在抗体-药物缀合物的情况中。

在一个实施方案中，抗PD-1抗体在Fc区域中包含至少一个减少效应器功能的突变。可能有助于突变以减少效应器功能的Fc区域氨基酸位置包含位置228、233、234和235中的一处或多处，其中氨基酸位置是根据编号方案编号。

在一个实施方案中，位于位置234和235的氨基酸残基的一个或两个可以例如自Leu突变成Ala(L234A/L235A)。这些突变会减少IgG₁抗体的Fc区域的效应功能。此外/或者，位于位置228的氨基酸残基可以例如突变成Pro。在另一个实施方案中，位于位置233的氨基酸残基可以例如突变成Pro、位于位置234的氨基酸残基可以例如突变成Val、及/或位于位置235的氨基酸残基可以例如突变成Ala。氨基酸位置是根据编号方案编号。

在另一个实施方案中，在抗体是属于IgG₄亚类的情况下，其可包含突变S228P，即在位置228具有脯氨酸，其中氨基酸位置是根据编号方案编号。已知此突变减少不想要的Fab臂交换。

在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分可以为更大的免疫粘附分子(通过抗体或抗体部分与一或多个其他蛋白质或肽的共价性或非共价性关联形成)的部分。此类免疫粘附分子的实例包含使用链霉抗生物素蛋白核心区域以制备四聚体scFv分子(Kipriyanov等人,Human Antibodiesand Hybridomas 6:93-101(1995))以及使用半胱氨酸残基、标志物肽和C末端聚组氨酸标签以制备二价且经生物素化的scFv分子(Kipriyanov等人,Mol.Immunol.31:1047-1058(1994))。其他实例包含其中来自抗体的一或多个CDR共价性或非共价性地掺入分子中以使其变成与感兴趣的抗原特异性结合的免疫粘附素(immunoadhesin)。在此类实施方案中，CDR可以作为更大的多肽链的部分掺入，可以共价性连接至另一个多肽链、或可以非共价性掺入。

在另一个实施方案中，可以制备包含连接至另一个多肽的本发明的抗PD-1抗体的整体或部分的融合抗体或免疫粘附素。在一些实施方案中，仅抗PD-1抗体的可变域连接至多肽。在一些实施方案中，抗PD-1抗体的V_H域连接至第一多肽，而抗PD-1抗体的V_L域连接至第二多肽，所述第二多肽以下述方式与第一多肽联合，使得V_H和V_L域可以彼此相互作用以形成抗原结合位点。在另一个优选的实施方案中，V_H域和V_L域是通过接头分开，使得V_H和V_L域可以彼此相互作用(例如单链抗体)。V_H-接头-V_L抗体接着连接至感兴趣的多肽。此外，可以创造其中两个(或更多个)单链抗体彼此连接的融合抗体。若想要在单一多肽链上创造二价或多价抗体或若想要创造双特异性抗体，则这是有用的。

为创造单链抗体(scFv)，编码V_H和V_L的DNA片段可操作连接至编码柔性接头，例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一片段，使得V_H和V_L序列可以表达为连续的单链蛋白质，V_L和V_H域通过柔性接头连接。参见例如Bird等人,Science 242:423-426(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；以及McCafferty等人,Nature 348:552-554(1990)。单链抗体可以为单价的(若仅使用单一V_H和V_L)；二价(若使用两个V_H和V_L)；或多价(若使用超过两个V_H和V_L)。例如，可以产生特异性地与人类PD-1以及与另一个分子结合的双特异性或多价抗体。

在其他的实施方案中，其他经修饰的抗体可以使用编码抗PD-1抗体的核酸分子制备。例如“κ体”(Ill等人,Protein Eng.10:949-57(1997))、“微型抗体((minibody)”(Martin等人,EMBO J.13:5303-9(1994))、“双抗体”(Holliger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993))、或“Janusin”(Traunecker等人,EMBOJ.10:3655-3659(1991)和Traunecker等人,Int.J.Cancer(Suppl.)7:51-52(1992))可以使用标准分子生物技术依循说明书的教导制备。

本发明的抗PD-1抗体或抗原结合部分可以衍生化或连接至另一个分子(例如另一个肽或蛋白质)。一般而言，将抗体或其部分衍生化以使得PD-1结合不受衍生化或加标记不利地影响。因此，本发明的抗体和抗体部分意图包含在本文中描述的人类抗PD-1抗体的完整的和经修饰的形式两者。例如，本发明的抗体或抗体部分可以功能性地连接(通过化学偶联、基因融合、非共价联合或其他方式)至一或多个其他分子实体，诸如另一抗体(例如双特异性抗体或双抗体)、检测剂、医试剂、及/或可以介导抗体或抗体部分与另一个分子(诸如链霉抗生物素蛋白核心区域或聚组氨酸标签)的联合的蛋白质或肽。

一种衍生化抗体的类型是通过交联两个或更多个抗体(属于相同类型的或属于不同的类型的，例如以创造双特异性抗体)生产。合适的交联剂包含异双功能性的交联剂，具有两个由适当的间隔物分开的独特反应性基团(例如间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)，或同双功能性的交联剂(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)。此类接头可自例如Pierce Chemical Company，Rockford，Il获得。

抗PD-1抗体也可以用化学基团(诸如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基基团、或碳水化合物基团)衍生化。这些基团可以有用于改善抗体的生物特征以例如增加血清半衰期。

也可以标记根据本发明的抗体。如用在本文中，术语“标记物”或“加标记”指将另一个分子掺入抗体中。在一个实施方案中，标记物是可检测的标志物，例如掺入经放射性标记的氨基酸或接附至可以通过加记号的抗生物素蛋白检测的生物素基部分的多肽(例如含有荧光标志物或可以通过光学或比色学方法检测的酶活性的链霉抗生物素蛋白)。在另一个实施方案中，标记物或标志物可以为治疗性的，例如药物缀合物或毒素。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域中已知的且可以使用。用于多肽的标记物的实例包含但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标记物(例如FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶标记物(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标志物、生物素基基团、预决定的由二级报告物识别的多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位置、金属结合域、表位标签)、磁性剂，诸如钆螯合物、毒素，诸如百日咳毒素、紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、依米丁(emetine)、丝裂霉素、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌(mitoxantrone)、光辉霉素(mithramycin)、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔(propranolol)、和嘌呤霉素和其类似物或同源物。在一些实施方案中，标记物是通过各种长度之间隔臂接附以减少潜在的空间位阻。

在一些实施方案中，本发明的抗体可以以中性的形式(包含两性离子形式)或以带正电或带负电的种类存在。在一些实施方案中，抗体可以与抗衡离子复合以形成药学可接受的盐。

术语“药学可接受的盐”指复合体，其包含一或多个抗体和一或多个抗衡离子，其中抗衡离子衍生自药学可接受的无机和有机酸和碱。

双特异性结合分子

在进一步的方面，本发明提供具有在本文中所描述的抗PD-1抗体的结合特异性和另一个抗PD-1抗体(例如另一个在本文中描述的抗PD-1抗体)或靶向不同蛋白质(诸如另一个免疫检查点蛋白质、癌症抗原、或其活性介导疾病病况诸如癌症的另一个细胞表面分子)的抗体的结合特异性的双特异性结合分子。此类双特异性结合分子是本领域中已知的，且在本文的别处给出双特异性结合分子的不同类型的实例。

核酸分子和载体

本发明还提供编码在本文中描述的抗PD-1抗体或其抗原结合部分的核酸分子和序列。在一些实施方案中，不同的核酸分子编码抗PD-1抗体或其抗原结合部分的重链和轻链氨基酸序列。在其他的实施方案中，相同的核酸分子编码抗PD-1抗体或其抗原结合部分的重链和轻链氨基酸序列。

除非另外规定，提及核苷酸序列涵盖其互补物。因此，提及具有特定序列的核酸应当理解成涵盖具有其互补序列的其互补链。在本文中提及时，术语“多核苷酸”意指长度至少10个碱基的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的经修饰形式)的多聚形式。该术语包含单链和双链形式。

本发明还提供与在本文中叙述的一种或多种核苷酸序列(例如与选自由SEQ IDNo:69-88所组成的组的核苷酸序列)至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。术语“百分比序列同一性”在核酸序列的上下文中指当以最大对应性比对时两个序列中相同的残基。序列同一性比较的长度可以在至少约九个核苷酸，通常为至少约18个核苷酸，更常为至少约24个核苷酸，典型为至少约28个核苷酸，更典型为至少约32个核苷酸，与优选为至少约36个、48个或更多个核苷酸的延伸内。存在有一些可以用于测量核苷酸序列同一性的本领域中已知的不同算法。例如，多核苷酸序列可以使用FASTA、Gap或Bestfit比较，它们是Wisconsin Package版本10.0，Genetics Computer Group(GCG),Madison,Wisconsin.FASTA中的程序。FASTA(其包含例如程序FASTA2和FASTA3)提供查询与搜寻序列间最佳重叠的区域的比对和百分比序列同一性(参见例如Pearson,Methods Enzymol.183:63-98(1990)；Pearson,Methods Mol.Biol.132:185-219(2000)；Pearson,Methods Enzymol.266:227-258(1996)；和Pearson,J.Mol.Biol.276:71-84(1998)；通过引用并入本文中)。除非另外规定，使用特定程序或运算法的默认参数。例如，核酸序列间的百分比序列同一性可以使用FASTA以如GCG版本6.1(通过引用并入本文中)中提供的其默认参数(6的字长和用于评分矩阵的NOPAM因子)或使用Gap以如于GCG版本6.1中提供的其默认参数测定。

在一个方面，本发明提供包含选自由SEQ ID No:69-88所组成的组的核苷酸序列的核酸分子。

在以上实施方案的任一中，核酸分子可以是分离的。

在进一步的方面，本发明提供适用于表达如本文中所描述的抗体或其抗原结合部分的链之一的载体。如用在本文中，术语“载体”意指下述核酸分子，其能够转运其已连接的另一个核酸。在一些实施方案中，载体是质粒，即额外的DNA区段可以连接至其中的DNA的环状双链段。在一些实施方案中，载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接至病毒基因组中。在一些实施方案中，载体在导入有它们的宿主细胞中能够自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。在其他的实施方案中，载体(例如非附加型哺乳动物载体)在导入至宿主细胞后可以掺入宿主细胞的基因组中，从而随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或仅“表达载体”)。

本发明提供包含编码本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合部分的重链、本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合部分的轻链、或本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合部分的重链和轻链两者的核酸分子的载体。本发明进一步提供包含编码融合蛋白质、经修饰的抗体、抗体片段、及其探针的核酸分子的载体。

编码本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合部分的重链及/或轻链的核酸分子可以自任何生产此类抗体或部分的来源分离。在各种实施方案中，核酸分子是自表达自以人类PD-1抗原免疫的动物分离的抗PD-1抗体的B细胞、或自从此类B细胞生产的永生化细胞分离的。分离编码抗体的核酸的方法是本领域中公知的。可以分离mRNA并用于生产cDNA以用于抗体基因的聚合酶链式反应(PCR)或cDNA克隆。在一些实施方案中，本发明的核酸分子可为合成的而非分离的。

在一些实施方案中，本发明的核酸分子可以包含编码来自本发明的抗PD-1抗体或抗原结合部分的V_H域的核苷酸序列，该核苷酸序列以符合读码框的方式连接至编码来自任何来源的重链恒定区的核苷酸序列。类似地，本发明的核酸分子可以包含编码来自本发明的抗PD-1抗体或抗原结合部分的V_L域的核苷酸序列，该核苷酸序列以符合读码框的方式连接至编码来自任何来源的轻链恒定区的核苷酸序列。

在本发明的进一步的方面，可以将编码重链(V_H)及/或轻链(V_L)的可变域的核酸分子“转化”成全长抗体基因。在一个实施方案中，编码V_H或V_L域的核酸分子是通过以下转化成全长抗体基因：插入已分别编码重链恒定(CH)或轻链恒定(CL)域的表达载体中，使得该V_H区段可操作连接至该载体内的CH区段，及/或V_L区段可操作连接至该载体内的CL区段。在另一个实施方案中，编码V_H及/或V_L域的核酸分子是通过以下转化成全长抗体基因：使用标准分子生物技术将编码V_H及/或V_L域的核酸分子联接(例如连接)至编码CH及/或CL域的核酸分子。接着，编码全长重链及/或轻链的核酸分子可以由导入有它们的细胞表达且接着可以分离抗PD-1抗体。

核酸分子可以用于重组表达大量的抗PD-1抗体。如本文中所描述的，核酸分子也可以用于生产嵌合抗体、双特异性抗体、单链抗体、免疫粘附素、双抗体、经突变的抗体和抗体衍生物。

在另一个实施方案中，本发明的核酸分子用作特定抗体序列的探针或PCR引物。例如，核酸可以在诊断方法中用作为探针或用作为PCR引物以扩增可以特别用于分离编码抗PD-1抗体的可变域的额外的核酸分子的DNA的区域。在一些实施方案中，核酸分子为寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸来自感兴趣的抗体的重链和轻链的高度可变域。在一些实施方案中，寡核苷酸编码本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合部分的CDR中的一个或多个的整体或部分，如本文中所描述的。

在另一个实施方案中，核酸分子和载体可以用于制备突变的抗PD-1抗体。抗体可以在重链及/或轻链的可变域中突变以例如改变该抗体的结合特性。例如，突变可以在CDR中的一个或多个中产生以增加或减少抗PD-1抗体的K_D、以增加或减少k_off、或以改变抗体的结合特异性。在另一个实施方案中，一个或多个突变是在本发明的单克隆抗体中在已知相较于种系改变的氨基酸残基处产生。突变可在可变域的CDR或框架区中或在恒定区中产生。在优选的实施方案中，突变是在可变域中产生。在一些实施方案中，一个或多个突变是在本发明的抗体或其抗原结合部分的可变域的CDR或框架区中在已知相较于种系改变的氨基酸残基处产生的。

在另一个实施方案中，将框架区突变以使得所得的框架区具有相对应种系基因的氨基酸序列。突变可以在框架区或恒定区中产生以增加抗PD-1抗体的半衰期。参见例如PCT公开文本WO 00/09560。也可以产生在框架区或恒定区中的突变以改变抗体的免疫原性、及/或以提供共价性或非共价性结合至另一个分子的位点。根据本发明，单一抗体可以在可变域的CDR或框架区的任一或多者中或在恒定区中具有突变。

在一些实施方案中，本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合部分是通过以下表达：将编码部分或全长轻链和重链的DNA(如以上描述地获得的)插入表达载体中使得将基因可操作连接至必要的表达控制序列(诸如转录和翻译控制序列)。表达载体包含质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、植物病毒，诸如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒、粘粒、YAC、EBV衍生性附加体、等等。可以将编码抗体的序列连接至载体中以使得该载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节该编码抗体的序列的转录和翻译的意图功能。可以选择表达载体和表达控制序列以与所使用的表达宿主细胞相容。可以将编码抗体轻链的序列和编码抗体重链的序列插入分开的载体中，并且可以可操作连接至相同的或不同的表达控制序列(例如启动子)。在一个实施方案中，将两个编码序列都插入相同的表达载体中，并且可以可操作连接至相同的表达控制序列(例如共同的启动子)，连接至分开的相同的表达控制序列(例如启动子)，或连接至不同的表达控制序列(例如启动子)。可以通过标准方法(例如连接抗体基因片段和载体上的互补限制性位置，或不存在限制性位置时的平端连接)将编码抗体的序列插入表达载体中。

便利的载体为编码功能上完整的人类CH或CL免疫球蛋白序列且具有经工程化改造以使得可以容易插入和表达任何V_H或V_L序列的适当的限制性位置(如以上描述的)的载体。在此类载体中编码HC和LC的基因可以含有会通过稳定化相关mRNA而造成总体抗体蛋白质产量增强的内含子序列。内含子序列侧翼为剪接供体和剪接受体位点，其决定RNA剪接会发生的位置。内含子序列的位置可以在抗体链的可变区域或恒定区中、或当使用多个内含子时在可变区域和恒定区两者中。多腺苷酸化和转录终止可以在在编码区域的下游的天然染色体位点处发生。重组表达载体也可以编码促进抗体链自宿主细胞分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆入载体中以使得信号肽以符合读码框的方式连接至免疫球蛋白链的氨基末端。信号肽可以为免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的蛋白质的信号肽)。

除了抗体链基因外，本发明的重组表达载体可以带有控制抗体链基因在宿主细胞中的表达的调节性序列。本领域技术人员会领会到表达载体的设计(其包含调节性序列的选择)可以取决于诸如要转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质的表达的水平、等等。对哺乳动物宿主细胞表达而言，优选的调节性序列包含在哺乳动物细胞中指挥高水平的蛋白质表达的病毒元件，诸如衍生自逆转录病毒LTR的启动子及/或增强子、衍生自细胞巨大病毒(CMV)的启动子及/或增强子(诸如CMV启动子/增强子)、衍生自猴病毒40(SV40)的启动子及/或增强子(诸如SV40启动子/增强子)、衍生自腺病毒的启动子及/或增强子(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))、多瘤和强哺乳动物启动子，诸如天然的免疫球蛋白和肌动蛋白启动子。关于病毒调节性元件及其序列的进一步描述，参见例如美国专利5,168,062、4,510,245和4,968,615。用于在植物中表达抗体的方法(其包含启动子和载体的描述)以及植物的转染是本领域中已知的。参见例如美国专利6,517,529。在细菌细胞和真菌细胞(例如酵母细胞)中表达多肽的方法也是本领域中公知的。

除了抗体链基因和调节性序列外，本发明的重组表达载体可以带有另外的序列，诸如调节载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起点)和选择标志物基因。选择标志物基因促进已经导入有载体的宿主细胞的选择(参见例如美国专利4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，典型地，选择标志物基因将对药物(诸如G418、潮霉素或甲氨蝶呤)的抗性赋予已经导入有载体的宿主细胞。例如，选择标志物基因包含二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(以在甲氨蝶呤选择/扩增的情况中用于dhfr-宿主细胞)、neo基因(用于G418选择)、和谷氨酸合成酶基因。

如用在本文中，术语“表达控制序列”意指对实现与它们连接的编码序列的表达和加工而言必要的多核苷酸序列。表达控制序列包含适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；高效RNA加工信号，诸如剪接和多腺苷酸化信号；稳定化细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当期望时，增强蛋白质分泌的序列。此类控制序列的性质随宿主生物体而不同；在原核生物中，此类控制序列一般包含启动子、核糖体结合位点、和转录终止序列；在真核生物中，一般而言，此类控制序列包含启动子和转录终止序列。术语“控制序列”意图包含(至少)其存在对于表达和加工而言必要的所有组分，并且也可以包含其存在是有益的其他组分，例如前导序列和融合伴侣序列。

宿主细胞和抗体及抗体组合物生产的方法

本发明的另外的方面指用于生产本发明的抗体组合物和抗体及其抗原结合部分的方法。本发明的此方面的一个实施方案指用于生产如本文中定义的抗体的方法，其包含提供能够表达该抗体的重组宿主细胞，在适于该抗体的表达的条件下培养该宿主细胞，并且分离所得的抗体。通过此类重组宿主细胞中的此类表达生产的抗体在本文中称为“重组抗体”。本发明还提供此类宿主细胞的后代细胞及通过其生产的抗体。

如用在本文中，术语“重组宿主细胞”(或仅“宿主细胞”)意指已经导入有重组表达载体的细胞。本发明提供可以包含例如以上描述的根据本发明的载体的宿主细胞。本发明还提供包含例如编码本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合部分的重链或其抗原结合部分的核苷酸序列、编码本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合部分的轻链或其抗原结合部分的核苷酸序列、或两者的宿主细胞。应当理解“重组宿主细胞”和“宿主细胞”不仅意指特定主题细胞，而且还意指此类细胞的后代。因为某些修饰可能在后继的世代中由于突变或环境影响而发生，所以此类后代可能(事实上)与亲本细胞不完全相同，但仍包含在如用在本文中的术语“宿主细胞”的范围内。

可以将编码抗PD-1抗体的核酸分子和包含这些核酸分子的载体用于转染适合的哺乳动物、植物、细菌或酵母宿主细胞。转染可以通过任何用于将多核苷酸导入宿主细胞中的已知方法。用于将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞中的方法是本领域中公知的，并且包含由右旋糖聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、由聚凝胺(polybrene)介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸在脂质体中包囊、以及将DNA直接微注射至细胞核中。此外，可通过病毒载体将核酸分子导入哺乳动物细胞中。转化细胞的方法是本领域中公知的。参见例如美国专利4,399,216、4,912,040、4,740,461、和4,959,455。转化植物细胞的方法是本领域中公知的，其包含例如由土壤杆菌介导的转染、生物射弹转化(biolistictransformation)、直接注射、电穿孔和病毒转化。转化细菌和酵母细胞的方法也是本领域中公知的。

作为用于表达的宿主可用的哺乳动物细胞系是本领域中公知的，并且包含许多自美国菌种保存中心(ATCC)可获得的永生化细胞系。这些特别包含中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞、SP2细胞、HEK-293T细胞、293Freestyle细胞(Invitrogen)、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、非洲绿猴肾细胞(COS)、人类肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、A549细胞、和许多其他细胞系。特别优选的细胞系是通过确定哪个细胞系具有高表达水平来选择。可使用的其他细胞系为昆虫细胞系，诸如Sf9或Sf21细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养一段时间生产抗体，所述一段时间足以使抗体在宿主细胞中表达或更优选将抗体分泌至培养宿主细胞的培养基中。可以使用标准蛋白质纯化方法自培养基回收抗体。植物宿主细胞包含例如烟草(Nicotiana)、拟南芥(Arabidopsis)、浮萍、玉米、小麦、马铃薯、等等。细菌宿主细胞包含大肠杆菌和链霉菌属(Streptomyces)物种。酵母宿主细胞包含粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。

进一步地，可以使用许多已知技术来增强本发明的抗体或其抗原结合部分自生产细胞系的表达。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是用于在某些条件下增强表达的常见方法。GS系统是在欧洲专利0 216 846、0 256 055、0 323 997和0 338 841中完整或部分讨论。

可能的是由不同的细胞系或自基因转基因动物中表达的抗体彼此会具有不同的糖苷化模式。然而，无论抗体的糖苷化状态如何，且更一般地，无论翻译后修饰存在与否，所有由在本文中提供的核酸分子编码的或包含在本文中提供的氨基酸序列的抗体为本发明的一部份。

药物组合物

本发明的另一方面是包含本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合部分或抗PD-1抗体组合物作为活性成分(或作为唯一的活性成分)的药物组合物。药物组合物可以包含任何如本文中所描述的抗PD-1抗体组合物或抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，组合物意图用于改善、预防、及/或治疗与PD-1相关的病症(例如特征在于PD-1的过表达或过度活性的病症)及/或癌症。在一些实施方案中，组合物意图用于活化免疫系统。在一些实施方案中，组合物意图用于改善、预防、及/或治疗源于诸如皮肤、肺、肠、卵巢、脑、前列腺、肾脏、软组织、造血系统、头和颈、肝脏、膀胱、乳房、胃、子宫和胰脏的组织的癌症。

一般地，本发明的抗体或其抗原结合部分适合于与一种或多种药学上可接受的赋形剂结合作为配制剂施用，例如如以下所描述。

本发明的药物组合物会包含一种或多种本发明的抗PD-1抗体或结合部分，例如一种或两种抗PD-1抗体或结合部分。在一个实施方案中，组合物包含单一本发明的抗PD-1抗体或其结合部分。

在另一个实施方案中，药物组合物可以包含至少一种抗PD-1抗体或其抗原结合部分(例如一种抗PD-1抗体或部分)和一种或多种靶向一种或多种有关的细胞表面受体(例如一种或多种与癌症有关的受体)的另外的抗体。

术语“赋形剂”在本文中用于描述除了本发明的化合物以外的任何成分。赋形剂的选择在很大的程度上会取决于诸如以下的因素：特定的施用的模式、赋形剂对溶解度和稳定性的效果、和剂型的性质。如用在本文中，“药学上可接受的赋形剂”包含任何及所有溶剂、分散介质、涂层材料、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂、等等，其为生理上相容的。药学上可接受的赋形剂的一些实例为水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等、以及其组合。在许多情况中，在组合物中包含等张剂(例如糖、多元醇，诸如甘露糖醇、山梨糖醇、或氯化钠)会是优选的。药学可接受的物质的其他实例为润湿剂或小量的辅助性物质，诸如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，它们增强抗体的货架期或有效性。

本发明的药物组合物以及其制备方法对本领域技术人员而言会是显而易见的。此类组合物以及其制备方法可以参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第19版(Mack Publishing Company,1995)。药物组合物优选是在GMP(优良制备规范)条件下制备。

本发明的药物组合物可以以散装、呈单一单位剂量的形式、或成复数个单一单位剂量的形式制备、包装、或出售。如用在本文中“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量一般是等于会施用于受试者的活性成分的剂量或此类剂量的便利的部份(诸如例如此类剂量的一半或三分之一)。

本领域中公认的任何用于施用肽、蛋白质或抗体的方法可以适当地用于本发明的抗体和抗原结合部分。

本发明的药物组合物典型适用于胃肠外施用。如用在本文中，药物组合物的“胃肠外施用”包含任何特征在于以下的施用的途径：物理上破坏受试者的组织并通过组织的破口施用药物组合物，因此一般造成直接施用于血流中、至肌肉中、或至内部器官中。因此，胃肠外施用包含但不限于通过注射组合物来施用药物组合物、通过通过外科手术切口施用组合物、通过穿透组织的非外科手术伤口施用组合物、等等。特别地，涵盖胃肠外施用包含但不限于皮下、腹膜内、肌肉内、胸骨内、静脉内、动脉内、鞘内、心室内、尿道内、颅内、和滑膜内注射或灌注；和肾透析灌注技术。也涵盖局部灌流。优选的实施方案包含静脉内和皮下途径。

适用于胃肠外施用的药物组合物的配制剂典型包含与药学可接受的载体诸如无菌水或无菌等张盐水组合的活性成分。此类配制剂可以以适用于推注或适用于连续施用的形式制备、包装、或出售。可注射的配制剂可以以单位剂型诸如以安瓿或以含有防腐剂的多剂容器的形式制备、包装、或出售。用于胃肠外施用的配制剂包含但不限于悬浮液、溶液、油或水性媒剂中的乳液、糊剂、等等。此类配制剂可以进一步包含一种或多种另外的成分，包含但不限于悬浮剂、稳定剂、或分散剂。在用于胃肠外施用的配制剂的一个实施方案中，活性成分是以用于在胃肠外施用重建组合物前以适合的媒剂(例如无菌的无热原水)重建的干燥(即粉末或粒状)形式提供。胃肠外的配制剂也包含水溶液，其可以含有赋形剂，诸如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选至3至9的pH)，但对于一些应用而言，它们可以更适于配制成无菌非水溶液的形式或要结合适合的媒剂(vehicle)(诸如无菌的无热原水)使用的干燥形式。例示性胃肠外施用形式包含无菌水溶液，例如丙二醇或右旋糖水溶液中的溶液或悬浮液。若期望，此类剂型可以是适当缓冲的。其他有用的可胃肠外施用的配制剂包含那些包含呈微晶形式的或脂质体制剂中的活性成分的配制剂。用于胃肠外施用的配制剂可以配制成立即及/或经修饰释放。经修饰释放配制剂包含延缓释放、持续释放、脉冲释放、受控释放、靶向释放和程序性释放。

例如，在一个方面，无菌可注射溶液可以通过在适当的溶剂中掺入所需量的抗PD-1抗体或其抗原结合部分或抗PD-1抗体组合物与以上列举的成分之一或组合(若需要的话)，然后过滤灭菌来制备。一般地，分散体是通过将活性化合物掺入含有基本分散介质和来自以上列所举者的所需要的其他成分的无菌媒剂中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况中，优选的制备的方法是真空干燥和冷冻干燥，其自活性成分与任何另外的期望成分的先前经无菌过滤的溶液产生活性成分与任何另外的期望成分的粉末。溶液的适当的流动性可以例如通过使用涂层材料诸如卵磷脂、通过维持所需要的粒度(在分散体的情况中)以及通过使用表面活性剂来维持。可注射组合物的延长的吸收可以通过将延缓吸收的试剂，例如硬脂酸盐和明胶包含在组合物中及/或通过使用经修饰的释放涂层材料，例如缓慢释放涂层材料带来。

本发明的抗体也可以鼻内施用或通过吸入施用，典型是呈来自干燥粉末吸入器的干燥粉末的形式(单独的、呈现混合物的形式、或呈例如与适合的药学上可接受的赋形剂混合的经混合组分颗粒的形式)、呈来自经加压容器、泵、喷雾(spray)、喷雾器(atomiser)(优选为使用电流体力学的喷雾器以生产细雾)、或雾化器(有或无使用适合的推进剂)的气溶胶喷雾剂的形式、或呈鼻滴剂的形式。

经加压容器、泵、喷雾、喷雾器、或雾化器一般含有本发明的抗体的溶液或悬浮液，其包含例如用于分散活性物、溶解活性物、或延长活性物的释放的适合的试剂、推进剂作为溶剂。

在于干燥粉末或悬浮液配制剂中使用前，一般将药物产品微米化至适用于通过吸入递送的大小(典型为小于5微米)。这可以通过任何适当的粉碎方法，诸如螺旋喷射研磨、流体床喷射研磨、超临界流体加工以形成纳米颗粒、高压均质化、或喷雾干燥实现。

可以将用于吸入器或吹入器的胶囊、锡箔囊(blisters)和筒(cartridges)配制成含有本发明的化合物、适合的粉末基底和性能修饰剂的粉末混合物。

用于喷雾器使用电流体力学以生产细雾的适合的溶液配制剂可以每次致动含有适合剂量的本发明的抗体，并且致动体积可以例如从1μL至100μL改变。

可以将适合的调味剂(flavours)(诸如薄荷脑和左薄荷脑)或甜味剂(诸如糖精或糖精钠)添加至那些意图用于吸入/鼻内施用的本发明的配制剂。

可以将用于吸入/鼻内施用的配制剂配制成立即及/或经修饰释放。经修饰释放配制剂包含延缓释放、持续释放、脉冲释放、受控释放、靶向释放和程序性释放。

在干燥粉末吸入剂和气溶胶的情况中，通过递送计量的量的阀的方式确定剂量单位。典型地，将根据本发明的单位安排成施用计量的剂量或一“喷”的本发明的抗体。总体每日剂量典型会在贯穿一日以单剂施用或更常呈分开的剂量的形式施用。

也可以将本发明的抗体和抗体部分配制成用于口服途径施用。口服施用可以涉及吞咽，使得化合物进入胃肠道、及/或颊部施用、舌部施用、或舌下施用，藉其化合物直接自口部进入血流。

适用于口服施用的配制剂包含固体、半固体和液体系统，诸如片剂；含有多颗粒(multi-particulate)或纳米颗粒(nano-particulate)、液体、或粉末的软或硬胶囊；锭剂(包含充满液体的)；咀嚼物；凝胶；快速分散剂型；膜；卵形剂(ovules)；喷雾；以及颊部/粘膜粘附性贴片。

液体配制剂包含悬浮液、溶液、糖浆和酏剂。此类配制剂可以用作软或硬胶囊(例如自明胶或羟基丙基甲基纤维素制备)中的填充物，并且典型包含载体，例如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甲基纤维素、或适合的油、和一种或多种乳化剂及/或悬浮剂。也可以通过来自例如药袋(sachet)的固体的重建来制备液体配制剂。

本发明的抗体和组合物的治疗用途

在一个方面，本发明的抗PD-1抗体和其抗原结合部分、抗PD-1组合物、和双特异性结合分子用于在有需要的人类中增强或活化免疫系统。在一些实施方案中，该患者具有特征在于PD-1的过表达或过度活性的病况。在一些实施方案中，患者是免疫抑制的。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分、组合物、或双特异性结合分子药物组合物用于治疗癌症，例如源于诸如皮肤、肺、肠、卵巢、脑、前列腺、肾脏、软组织、造血系统、头和颈、肝脏、膀胱、乳房、胃、子宫和胰脏的组织的癌症、以及依赖PD-1活性或其中患者表达或过表达PD-L1、PD-L2、或两者的任何癌症或其他病况。通过本发明的抗PD-1抗体、其抗原结合部分、抗PD-1抗体组合物、及/或双特异性结合分子治疗的癌症可以包含例如黑色素瘤(诸如晚期黑色素瘤、或无法切除的黑色素瘤或转移性黑色素瘤)、非小细胞肺癌、膀胱癌、头和颈鳞状细胞癌、卵巢癌、结肠直肠癌、何杰金氏淋巴瘤、和肾细胞癌(RCC)。

在一些实施方案中，通过本发明的抗PD-1抗体、抗原结合部分、抗PD-1组合物、及/或双特异性结合分子治疗的癌症可以包含例如黑色素瘤(例如晚期或转移性黑色素瘤)、非小细胞肺癌、头和颈鳞状细胞癌、肾细胞癌、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、神经胶母细胞瘤、胶质瘤、鳞状细胞肺癌、小细胞肺癌、肝细胞癌、膀胱癌、上尿路癌、食道癌、胃食道连接部癌(gastroesophageal junction cancer)、胃癌、肝癌、结肠癌、结肠直肠癌、多发性骨髓瘤、肉瘤、急性髓样白血病、慢性髓样白血病、脊髓发育不良综合征、鼻咽癌、慢性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、小淋巴细胞性淋巴瘤、卵巢癌、胃肠癌、原发性腹膜癌、输卵管癌、泌尿上皮癌、与HTLV有关的T细胞白血病/淋巴瘤、前列腺癌、生殖泌尿道癌、脑膜瘤、肾上腺皮质癌、神经胶肉瘤、纤维肉瘤、肾癌、乳腺癌、胰脏癌、子宫内膜癌、皮肤基底细胞癌、阑尾癌、胆道癌、唾液腺癌、晚期Merkel细胞癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、间皮瘤、和实体瘤。

“治疗”指减轻或消除生物病症及/或至少一种其伴随症状的方法。如用在本文中，“减轻”疾病、病症或病况意指减少该疾病、病症、或病况的症状的严重性及/或发生频率。进一步地，本文中提及“治疗”包含提及治愈性、缓和性和预防性治疗。

“治疗有效量”指所施用的治疗剂的量，其会将所治疗的病症的症状中的一种或多种缓和至某种程度。抗癌症治疗剂的治疗有效量可以造成肿瘤收缩、增加存活、消除癌细胞、减低疾病进展、逆转转移、或其他保健专家期望的临床端点。

本发明的抗体组合物或抗体或其抗原结合部分可以单独施用或组合一种或多种其他药物或抗体(或呈任何其组合)施用。本发明的药物组合物、方法与用途因此也涵盖与其他活性剂组合(共施用)的实施方案，如以下详细说明的。

如用在本文中，关于本发明的抗体组合物和抗体及其抗原结合部分和一种或多种其他治疗剂，术语“共施用”和“与xx组合”是意图意指且确实指并且包含以下：

-将本发明的抗体组合物/抗体/抗原结合部分和治疗剂的此类组合同时施用于需要治疗的患者，当将此类组分一起配制成于实质相同的时间将所述组分释放至所述患者的单一剂型时，

-将本发明的抗体组合物/抗体/抗原结合部分和治疗剂的此类组合实质上同时施用于需要治疗的患者，当将此类组分彼此分开配制成分开的剂型时，所述剂型在实质相同的时间时由所述患者摄取，此后将所述组分在实质相同的时间时释放到所述患者，

-将本发明的抗体组合物/抗体/抗原结合部分和治疗剂的此类组合相继施用于需要治疗的患者，当将此类组分彼此分开配制成于分开的剂型时，所述剂型在连续的时间由所述患者摄取且在各个施用间有明显的时间间隔，此后将所述组分在实质上不同的时间释放至所述患者；以及

-将本发明的抗体组合物/抗体/抗原结合部分和治疗剂的此类组合相继施用于需要治疗的患者，当将此类组分一起配制成单一剂型时，所述单一剂型以受控的方式释放所述组分，随后在相同的及/或不同的时间时将它们同时、连续、及/或重叠释放至所述患者，

其中各个部分可以通过相同的或不同的途径施用。

本发明的抗体组合物和抗体和其抗原结合部分可以在无其他的治疗性治疗下施用，即呈独立的疗法。或者，利用本发明的抗体组合物和抗体及其抗原结合部分的治疗可以包含至少一种其他的治疗性治疗(组合疗法)。在一些实施方案中，抗体组合物或抗体或其抗原结合部分可以与另一种药疗/药物共施用或配制以用于治疗癌症。其他的治疗性治疗可以包含例如化学治疗剂、抗肿瘤剂、或抗血管生成剂、不同的抗癌症抗体、及/或放射疗法。

通过组合本发明的抗体组合物、抗体、或抗原结合部分与已知诱发癌细胞的终端分化的试剂，可以进一步改善效果。此类化合物可以例如选自由以下所组成的组：视黄酸、反式视黄酸、顺式视黄酸、丁酸苯酯、神经生长因子、二甲亚砜、活性形式维生素D3、过氧化物体增殖物活化受体γ、12-O-十四烷酰基佛波醇13-醋酸酯、六亚甲基-双-乙酰胺、转化生长因子β、酪酸、环AMP、和维司力农(vesnarinone)。在一些实施方案中，化合物是选自由视黄酸、丁酸苯酯、全反式视黄酸和活性形式维生素D所组成的组。

可以使用包含本发明的抗PD-1抗体组合物或抗PD-1抗体或其抗原结合部分和至少一种其他试剂(例如化学治疗剂、抗肿瘤剂、或抗血管生成剂)的药品作为用于在癌症疗法中同时、分开或相继施用的组合治疗。其他试剂可以为适用于治疗讨论的特定癌症的试剂，例如选自由以下所组成的组的试剂：烷化剂，例如铂衍生物，诸如顺铂、卡铂及/或奥沙利铂(oxaliplatin)；植物生物碱，例如紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)及/或伊立替康(irinotecan)；抗肿瘤抗生素，例如多柔比星(阿霉素)、柔红霉素、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)米托蒽醌、放线菌素D、博莱霉素、放线菌素、藤黄霉素(luteomycin)、及/或丝裂霉素；拓扑异构酶抑制剂，诸如托泊替康(topotecan)；及/或抗代谢物，例如氟尿嘧啶及/或其他氟嘧啶。

本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合部分或抗PD-1抗体组合物也可以组合诸如疫苗、细胞因子、酶抑制剂和T细胞疗法的其他抗癌症治来使用。在疫苗的情况中，其可以例如为含有一或多种与治疗的癌症有关的抗原的蛋白质、肽或DNA疫苗、或包含树突细胞加上抗原的疫苗。适合的细胞因子包含例如IL-2、IFN-γ和GM-CSF。一种具有抗癌症活性的酶抑制剂的实例为吲哚胺-2,3-加双氧酶(IDO)抑制剂，例如1-甲基-D-色氨酸(1-D-MT)。过继性T细胞疗法指各种涉及扩展或工程化改造患者自身的T细胞以识别并攻击其肿瘤的免疫治疗技术。

也涵盖本发明的抗PD-1抗体或其抗原结合部分或抗PD-1抗体组合物可以结合酪氨酸激酶抑制剂在辅助性疗法中使用。这些是与受体的细胞内酪氨酸激酶域相互作用并通过竞争细胞内Mg-ATP结合位置来抑制配体诱发性受体磷酸化的合成的、主要衍生自喹唑啉(quinazoline)的、低分子量分子。

在一些实施方案中，抗体组合物或抗体或其抗原结合部分可以组合另一种介导免疫系统活化的药疗/药物使用，该药疗/药物包含但不限于介导A2AR、BLTA、B7-H3、B7-H4、CTLA-4、CD27、CD28、CD40、CD55、CD73、CD122、CD137、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、CTLA-3、CEACAM(例如CEACAM-1及/或CEACAM-5)、GAL9、GITR、HVEM、ICOS、IDO、KIR、LAIR1、LAG-3、OX40、TIGIT、TIM-3、TGFR-β、VISTA及/或2B4的表达或活性的试剂。在一些实施方案中，试剂是与以上分子之一结合的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明的抗体组合物或抗体或其抗原结合部分可以组合CTLA-4抑制剂(例如抗CTLA-4抗体，诸如曲美木单抗(tremelimumab)或易普利单抗(ipilimumab))施用。在一个实施方案中，本发明的抗体组合物或抗体或其抗原结合部分可以与易普利单抗组合施用。

在某些方面，本发明的抗体和抗原结合部分可以组合另一种PD-1途径的抑制剂(其可以靶向PD-1或一种或多种其配体)施用。此类抑制剂的实例包含其他抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、和抗PD-L2抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体组合物、抗体、及/或抗原结合部分可以组合派姆单抗及/或纳武单抗施用。

应当理解本发明的抗体组合物和抗体及其抗原结合部分可以用于如本文中所描述的治疗的方法，可以用于如本文中所描述的治疗，及/或可以用于制备用于如本文中所描述的治疗的药物。

施用的剂量和途径

本发明的抗体组合物会以有效量施用以治疗讨论的病况，即以对于实现期望的结果而言是必要的剂量和时间期间。治疗有效量可以根据诸如以下的因素变化：治疗的特定病况、患者的年龄、性别和重量、以及抗体是否以独立治疗的形式施用或组合一种或多种另外的抗癌治疗来施用。

可以调整剂量方案以提供最理想的期望反应。例如，可以施用单一推注，可以随着时间施用数个分开的剂量或按治疗情况的急迫性所表明的成比例地减少或增加剂量。对于施用的容易性和剂量的一致性而言，以剂量单位形式配制胃肠外的组合物是特别有利的。如用在本文中，剂量单位形式指物理上离散的单位，其适用作为用于治疗的患者/受试者的单位剂量；各个单位含有经计算以产生期望的治疗效果的约定量的活性化合物加上所需要的药用载体。本发明的剂量单位形式的规格一般是由以下支配且直接取决于以下：(a)化学治疗剂的独特特征和要实现的特定治疗或预防性效果，和(b)复合此类活性化合物以用于在个体中治疗敏感性的本领域中固有的限制。

因此，基于在本文中提供的公开内容，熟练技术人员会领会剂量和给药方案是根据治疗剂领域中公知的方法来调整。即，可以容易地建立最大可容忍剂量，并且可以确定提供患者以可检测的治疗利益的有效量，也可以确定施用每剂以提供患者以可检测的治疗利益的时间需要。因此，虽然在本文中例示某些剂量和施用方案，但是这些实例决不限制在实现本发明时可以提供给患者的剂量和施用方案。

应当注意剂量值可以随着要减轻的病况的类型和严重性而变化，并且可以包含单剂或多剂。应当进一步理解对于特定的受试者而言，特定的剂量方案应当随着时间根据个体的需要和施用组合物或监督组合物的施用的人的专业判断作调整，并且本文中提出的剂量范围仅是例示性的且非意图限制体现的组合物的范围或实现。进一步地，使用本发明的组合物的剂量方案可以基于各种因素，其包含疾病的类型、患者的年龄、重量、性别、医疗条件、病况的严重性、施用的途径、和所利用的具体抗体。因此，剂量方案可以广泛变化，但可以使用标准方法常规确定。例如，可以基于药动学或药效学参数调整剂量，所述参数可以包含临床功效，诸如毒性效果及/或实验室值。因此，本发明涵盖患者内剂量逐步上升(escalation)，如由熟练技术人员所测定的。确定适当的剂量和方案是相关领域中公知的，并且应当理解成一旦提供在本文中公开的教导，就为本领域技术人员考虑。

涵盖本发明的抗体组合物的适合剂量会在0.1-100mg/kg，诸如约0.5-50mg/kg，例如约1-20mg/kg的范围。抗体组合物可以例如以至少0.25mg/kg，例如至少0.5mg/kg，诸如至少1mg/kg，例如至少1.5mg/kg，诸如至少2mg/kg，例如至少3mg/kg，诸如至少4mg/kg，例如至少5mg/kg；和例如直至达至多50mg/kg，诸如直至达至多30mg/kg，例如直至达至多20mg/kg，诸如直至达至多15mg/kg的剂量施用。施用一般会以适合的间隔重复，例如每周一次、每二周一次、每三周一次、或每四周一次，达负责的医生(其在必要时可视需要增加或减少剂量)视为适当的时间长度。

用于肿瘤疗法的有效量可以通过其以下能力测量：在患者中稳定化疾病进展及/或减轻症状，且优选地逆转疾病进展，例如通过减少肿瘤大小。本发明的抗体或组合物抑制癌症的能力可以通过体外分析(例如如实施例中描述的)以及在对于人类肿瘤中的效力有预期性的适合的动物模型中评估。会选择适合的剂量方案以在每种特定情况中提供最佳的治疗反应，例如以单一推注或以连续灌注施用，且有剂量的可能的调整，如每种情况的急迫性指出。

诊断用途和组合物

本发明的抗体也可用于诊断方法(例如体外、离体)。例如，抗体可以用于检测及/或测量来自患者的样品(例如组织样品、或体液样品，诸如发炎渗出液、血液、血清、肠液、唾液、或尿液)中的PD-1的水平。适合的检测和测量方法包含免疫学方法，诸如流式细胞术、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、化学发光测定法、放射性免疫测定法、和免疫组织学。本发明进一步涵盖包含在本文中描述的抗体的试剂盒(例如诊断试剂盒)。

除非在本文中另外定义，结合本发明使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员所通常了解的意义。以下描述了例示性方法和材料，虽然与本文中描述者类似或等同的方法和材料也可以用于实现或测试本发明。在矛盾的情况下，应当以本说明书(包含定义)为准。

一般地，结合在本文中描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、分析化学、合成有机化学、药物和制药化学、以及蛋白质和核酸化学及杂交使用的命名法以及技术在本领域中是公知的并且被一般地使用。根据制备商的说明书进行酶反应和纯化技术，如本领域中通常完成的或如本文中所描述的。

进一步地，除非另为上下文需要，单数的术语应当包含复数且复数的术语应当包含单数。贯穿本说明书和实施方案，词语“具有”和“包含”或其变体应当理解成意指包括所陈述的整体或整体的组但不排除任何其他整体或整体的组。

所有本文中提及的出版物和其他参考文献通过引用完整并入。虽然在本文中引用许多文件，但是此引用并不构成承认任何这些文件形成本领域中的共同一般知识的一部份。

为了更佳地了解本发明，提出以下实施例。这些实施例仅是用于阐明的目的并且不应解释为以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1：自鸡B细胞克隆抗PD-1抗体

通过Symplex^TM抗体发现技术的方式进行自分泌抗体的B细胞(ASC)克隆衍生自鸡的抗体基因。简言之，自已经以PD-1抗原(呈可溶蛋白质抗原的形式及/或呈其天然在真核细胞上展示的与细胞膜结合的形式)免疫的鸡的淋巴样器官分离ASC。以经荧光标记的抗体染色ASC允许在分选至PCR容器前自其他细胞(例如T细胞、幼稚B细胞、单核细胞、等等)区别ASC。通过流式细胞术进行单一ASC分选。随后，如以下所描述对每个经分选的B细胞实施Symplex^TM程序以产生含有关联V_H和V_L对的PCR产物。

在经分选的ASC上进行V_H和V_L编码序列的连接，以促进序列的关联配对。该方法利用基于一步骤多重重叠延伸RT-PCR的二步骤PCR程序接着为巢式PCR。使用Symplex^TM技术连接关联V_H和V_L序列的原理是在WO 2005/042774；WO 2008/104184；WO 2010/022738、和Meijer等人,J Mol Biol 358(3):764-72(2006)中详细描述。简言之，通过重叠延伸PCR在所谓的巢式PCR步骤中连接经扩增的关联V_H和V_L的片段。在后续的过程中，合并PCR产物，之后克隆入质粒载体中。以下述方式完成这点，以使得所克隆的编码鸡抗体的可变域的DNA片段可以在经转染的哺乳动物细胞中从单一质粒表达构建体表达为完整的嵌合抗体。结果，针对展现与PD-1抗原特异性结合的嵌合抗体筛选细胞上清液是可能的。

材料和方法

修改如以上列举的出版物中描述的Symplex^TM技术以自经分选的鸡B细胞扩增V_L和V_H。如以下所描述的，以二步骤完成功能性表达构建体的克隆。

步骤1。在巢式PCR反应中扩增含有配对的V_H和V_L片段的经扩增的PCR产物。这允许在每个末端加入ApaI和AvrII的侧翼限制酶识别位点。由于关联V_H和V_L序列在来自每个经分选的ASC的单一PCR产物中配对，在将所有的PCR片段合并后进行PCR产物的克隆。构建质粒pML392以通过消化对应的限制性位置ApaI和AvrII来接受Symplex^TM PCR产物。合并的PCR产物和pML392的所得连接在图1中显示。此处，PCR产物的插入分别将V_H和V_L序列置于人类CH1-CH2-CH3和λ恒定cDNA区域之前，以获得全长重链和轻链阅读框。

步骤2。在最初的构建体中，将编码重链和轻链序列的两个阅读框以头对头放置，并以含有AscI和NheI的限制酶识别位点的DNA序列分开。通过插入在重链和轻链基因的两个5’末端之间包含5’-UTR和信号肽的对应的经AscI/NheI消化的双重CMV启动子DNA片段，获得完整的表达构建体，如图2中描绘的。

实施例2：抗PD-1参考抗体类似物的克隆

本实施例简要解释了如何产生抗PD-1抗体的参考类似物纳武单抗和派姆单抗。

编码纳武单抗和派姆单抗的抗体类似物的重链和轻链可变域的氨基酸序列是自网站imgt.org/mAb-DB/获得；参见以下表3。使用人类密码子选择将蛋白质序列逆翻译成DNA序列。接着基因合成对应的DNA序列，并将其克隆入含有恒定人类IgG₄重链或κ轻链域的表达载体中，导致全长抗体的表达。为预防Fab臂交换，以脯氨酸取代位于位置228的丝氨酸残基(Angal等人,Mol.Immunol.30:105-108(1993))。使用标准蛋白质表达系统用对应的表达质粒转染CHO细胞。使用标准蛋白质A纯化柱层析分离法纯化对应的抗体上清液。

表3经基因合成的抗体类似物

实施例3：针对与在细胞表面表达的PD-1的结合来筛选抗体库

以384孔格式使用293fectin^TM转染试剂(Invitrogen，目录编号12347-019)在HEK293细胞中个别转染并且表达抗PD-1全集的克隆抗体，并在转染后第6日收集含有抗体的上清液。

对于基于细胞的抗体筛选，以384孔格式使用FreeStyle^TM MAX试剂(Invitrogen，目录编号16447-100)转染CHO-S细胞以表达全长人类PD-1，并将未经转染的细胞用作为阴性对照。为了允许多重筛选设置，使用CFSE标记未经转染的细胞并以1对1的比率和各自每ml 1E6个细胞的密度与未经标记的经PD-1转染的细胞混合。在384孔板中，混合40μl的此细胞混合物与10μl的含有抗体的上清液，并通过以非洗涤设置加入山羊抗人类IgG(H+L)AF647二抗(Molecular Probes，目录编号A21445)来揭示与细胞结合的抗体。使用高通量流式细胞术(Screener，Intellicyt)获得样品并使用软体通过绘制CFSE对人类IgG结合(AF647)来分析数据。将PD-1特异性主要命中鉴定为仅与经人类PD-1转染的细胞(CSFE阴性)结合而不与对照细胞(CFSE阳性)结合的抗体克隆，且收集板数和板座标以用于命中挑出以及随后的序列分析。

实施例4：抗PD-1抗体的人源化

进行鸡抗PD-1抗体的框架区的人源化以生产抗体分子，所述抗体分子当施用于人类时具有最小的免疫原性，而实质上保留亲本鸡抗体的特异性和亲和力。

材料和方法

使用“CDR移植”方法进行衍生自鸡的抗体的人源化，该方法是由Jones等人,Nature 321:522–525(1986)最初描述。首先，将抗体的可变重链(V_H)域和可变轻链(V_L)域对人类IgG数据库作blast以寻找最接近的人类种系基因。这将人类IGHV3-23*01(M99660)和IGLV3-19*01(X56178)基因分别鉴定为最接近鸡V_H和V_L基因。类似地，分别为V_H和V_L从IGHJ1*01(J00256)和IGLJ6*01(M18338)衍生用于J基因区域人源化的所选人类氨基酸序列。此外，针对鸡免疫球蛋白种系基因比对抗体V_H和V_L基因以鉴定可能在抗体功能及/或结构中起作用的框架区中的体细胞突变。此类残基可以以所谓的“回复突变”残基包含在最终人源化抗体基因中。最后，认为有些已知在抗体结构、稳定性和功能中起重要作用的氨基酸位置(所谓的“Vernier残基”(Foote和Winter、J Mol Biol.224(2):487-99(1992))产生包含来自相对应种系的人类或鸡残基的备选人源化抗体变体。

根据CDR1和CDR2的定义确定本文中的CDR序列。对于重链和轻链CDR3，本文中的定义在IMGT-CDR3的上游包含一个额外的氨基酸残基(Cys)且在下游包含一个额外的氨基酸残基(对于V_H CDR3是Trp，对于V_L CDR3是Phe)。

通过重叠延伸PCR进行鸡CDR和人类框架区的装配。将所得的人源化V_H和V_L PCR产物克隆入带有人类重链和轻链恒定区的表达载体(质粒)中。为增加在λ链上游的信号肽的正确切割，将λ基因IGLV3.19的第二个氨基酸(Ser)以其他人类种系(例如IGLV3.25)中存在的另一种氨基酸(Tyr)替换。重链序列含有两个“LALA”突变(L234A/L235A)，其已知减少IgG1抗体的Fc区域的效应器功能(Armour等人,Eur J Immunol.29(8):2613-24(1999)；和Armour等人,Mol Immunol.40(9):585-93(2003))。表达载体也含必要的调节性序列，从而允许在哺乳动物细胞的转染后装配成全长抗体的轻链和重链的同时表达。

结果

最终的人源化抗体序列是在以下表4中显示，并且CDR序列分开在表5中显示。表中的CDR序列根据编号方案定义。

表4人源化抗PD-1抗体的V_H和V_L序列^*

*CDR区域是以斜体、加下划线、且以粗体表示。

表5人源化抗PD-1抗体的H-CDR序列和L-CDR序列

所有人源化抗体都包含以下显示的IgG1“LALA”变体重链恒定区和轻链恒定区氨基酸序列。

重链恒定区(SEQ ID No:67)：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

轻链恒定区(SEQ ID No:68)：

GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

实施例5：抗PD-1抗体候选物的筛选

PD-1主要是表达在经活化的T淋巴细胞的表面上，在那里其负调节T细胞活性。为了选择最有功能的抗PD-1抗体候选物，建立两种不同的体外筛选系统：葡萄球菌属肠毒素B(SEB)全血测定法和单向混合淋巴细胞反应测定法。

材料和方法

在SEB全血测定法中针对功能活性初步筛选呈IgG1-LALA支架格式(即具有实施例4中描述的“LALA”突变)且经如以上描述地克隆和人源化的69种独特的人源化mAb的全集。SEB是与II类MHC分子和T细胞受体(TCR)的特定Vβ区域结合并驱动T细胞的非特异性刺激的超级抗原(super-antigen)。这导致多克隆T细胞活化/增殖和包含IL-2和IFN-γ的细胞因子的释放。

为了为抗PD-1活性的筛选研究SEB测定法的相关性，在SEB刺激之前和之后针对不同的供体研究PD-1的表达水平。在SEB刺激后第0日和第3日通过流式细胞术测试来自六个不同供体的PBMC的PD-1表达。设定相关淋巴细胞门以用于进一步分析。

基于SEB全血测定法中的筛选，使用来自至少三个不同供体的血液，鉴定出顶部的10个抗PD-1抗体先导候选物。接着进一步滴定抗PD-1抗体先导候选物以获得每个单独抗体与阳性对照(抗PD-1抗体派姆单抗(Merck)和纳武单抗(Bristol-Myers Squibb)的参考类似物)比较的剂量反应曲线；参见实施例2。

在替代的体外分析，单向混合淋巴细胞反应(MLR)分析中验证顶部的10个所选择的抗PD-1抗体的功能性。在此测定法中，将来自一个供体的树突细胞(DC)与来自另一个供体的CD4⁺T细胞共培养以获得异型抗原特异性刺激(在所有T细胞的10-15％中诱发)，导致T细胞活化/增殖和细胞因子分泌。

由于候选物之一(12748.15381)的蛋白质稳定性问题，对于此特定抗体使用替代的种系序列。下文提及所得的抗体之一，12748.16124。此变体与12748.15381具有不同的V_L序列但相同的V_H序列(表1，如上)。

结果

图4中的数据清楚地显示表达PD-1的淋巴细胞的频率在SEB刺激后在所有所测试的供体中都增加。这些观察结果确认了此测定法对于抗PD-1抗体筛选的相关性。

SEB测定法中的最有功能的抗PD-1抗体的滴定(图5A-I中显示)鉴定出具有类似于或优于阳性对照抗体类似物派姆单抗和纳武单抗的功能性的抗PD-1先导候选物。在此测定法中，在所指出的抗体的存在下用SEB刺激全血48h，并在48小时后通过ELISA测量IL-2分泌。每个数据点代表六个重复的平均值，横杠指示SEM。

图5A-H显示使用人源化的抗PD-1抗体获得的结果。由于抗体之一[12748.15381]的聚集高于5％，对此抗体测试替代的框架。图5I中的数据显示初始人源化抗体[12748.15381]及其种系(框架)变体[12748.16124]的类似的功能性。

在单向MLR测定法中验证抗PD-1抗体的功能性。在此测定法中，共培养来自两种不同供体的树突细胞和CD4⁺T细胞(比率1:10)，并在5日后通过MesoScale测量IFN-γ分泌。每个数据点代表六个重复的平均值，横杠指出SEM。自单向MLR测定法获得的数据和图6A-H中阐明的数据显示与自SEB测定法获得的数据相同的抗PD-1抗体的功能性和排序。不同测定法间的数据的此种一致性提供所选抗体是有功能的进一步确认。

所选抗体源自两种不同的主要表位仓(epitope bin)，指示它们与两种不同的非重叠表位结合。所有所显示的抗PD-1抗体都属于仓1，除了12760和13112抗体以外，它们属于仓2。发现了来自仓1的抗PD-1抗体在这些体外测定法中显示最高的功能性。

实施例6：对于PD-L1配体阻断活性的抗PD-1抗体的流式细胞测量分析

此实施例阐明如何通过使用细胞表面表达的PD-1和经荧光染料标记的可溶性PD-L1来进行流式细胞测量竞争测定法而针对配体阻断活性测试抗PD-1抗体的组。

材料和方法

在多重细胞测定法中研究PD-L1配体阻断活性，在所述测定法中人类和食蟹猴PD-1在CHO-S细胞上重组表达，并且通过流式细胞术分析经R-PE(R-藻红蛋白)标记的人类PD-L1-Fc嵌合蛋白质的结合。使用Lightning-R-藻红蛋白缀合试剂盒(InnovaBiosciences，UK)使商品化的重组PD-L1-Fc嵌合蛋白质(R&DSystems，USA)与R-PE缀合。将经暂时转染以表达人类PD-1的CHO-S细胞与暂时表达食蟹猴PD-1的经CFSE染色的CHO-S细胞混合。接着在冰上以20μg/ml的50μl抗PD-1抗体温育此细胞混合物，接着添加约3.4μg/ml的50μl经R-PE标记的PD-L1-Fc(16.4nM最终浓度)并进一步再温育20min(最终抗PD-1抗体浓度：10μg/ml)。使用与APC(别藻蓝蛋白)缀合的抗人类IgG轻链抗体检测结合的抗体。通过分别检测R-PE和APC荧光的流式细胞术定量PD-L1和抗PD-1抗体的结合。

结果

竞争实验的结果在图7A-B呈现并在以下表6中总结。所有的抗PD-1抗体以10μg/ml的最终抗体浓度测试(参见以上)。三个所测试的抗体能够抑制PD-L1结合达83％或更多，其与抗PD-1参考抗体lambrolizumab(Merck)类似，所述lambrolizumab与派姆单抗相同且作为阳性对照而包括在内。一种抗体(12777.13362P)仅部分地抑制结合达69％。一种抗体(13112.13208)不阻断PD-1结合。PD-L1与PD-1表达性细胞在阴性对照抗VEGFR2抗体雷莫芦单抗(ramucirumab)(Genentech)的存在下的结合设置为0％。

表6在抗PD-1抗体的存在下的PD-L1结合抑制

表6中显示的人源化变体与共享其名称中的前5个数字的、表1中的那些变体具有相同的氨基酸序列，除了表1中的变体在轻链的N末端具有氨基酸残基“SY”以外。在一些实施方案中，SY二肽在抗体轻链的表达期间改善信号肽加工。预期表1和6中的变体具有相同的功能特性。

实施例7：针对人类和食蟹猴PD-1ECD抗原的PD-1抗体亲和力的测量

此实施例证明了大多数抗PD-1抗体对人类PD-1的细胞外域(ECD)和食蟹猴PD-1的细胞外域(ECD)两者显示高的皮摩尔(pM)亲和力和良好的交叉反应性。

材料和方法

在XPR-36表面等离振子共振(SPR)生物传感器(Bio-Rad，USA)上进行经纯化的抗PD-1抗体全集的动力学结合分析。经His标记的人类或食蟹猴PD-1ECD抗原自AcroBiosystems，UK购买。在单价抗原条件下通过固定抗PD-1抗体并将单价PD-1抗原维持在溶液中来测量结合动力学，如之前描述的(Canziani等人,Anal Biochem 325(2):301-307(2004))。应用最低可能的抗PD-1抗体浓度以预防非特异性结合和质量转运限制。对于测量抗体动力学，将抗PD-1抗体调整至1.0μg/ml的浓度并且在通过固定约1000RU的单克隆抗人类Fc抗体(Biacore，Denmark)产生的抗人类IgG Fc表面上捕捉。以25nM至0.31nM的3倍浓度范围对抗PD-1抗体测试与人类或食蟹猴PD-1ECD的结合，接着用3M MgCl2再生缓冲液(Biacore，Denmark)再生表面。使用20μl/min的高流动速率、3.33min的结合时间和介于1.5小时和2.75小时之间的解离时间。将所记录的结合反应拟合至简单朗缪(Langmuir)1:1结合模型以用于使用双重参照计算结合速率常数(k_on或ka)、解离速率常数(k_off或kd)和亲和力常数(K_D)。

结果

结合动力学在以下表7中制作成表，所述表7阐明了抗PD-1抗体的组以pM范围中的非常高的亲和力与PD-1结合。所有的抗体以比纳武单抗和派姆单抗类似物高的亲和力识别人类PD-1。最高亲和力的抗体[12819.15384]以20pM的K_D与人类PD-1结合。

表7如由表面等离振子共振(SPR)测量的抗PD-1抗体与人类或食蟹猴PD-1ECD的结合动力学

实施例8：抗PD-1抗体的表位入仓

此实施例阐明PD-1抗体如何基于配对竞争模式分组成数个表位仓。属于不同表位仓的抗体识别PD-1ECD上的不同表位。

方法

通过表面等离振子共振(SPR)分析使用连续流动微点样器(CFM)(WasatchMicrofluidics，US)组合IBIS MX96SPR仪器(IBIS Technologies，The Netherlands)进行配对抗体竞争的研究。在E2SSPR传感器(Ssens BV，The Netherlands)上进行表面等离振子共振成像分析。在50mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)中将总共十种抗PD-1抗体(人类，IgG1)稀释至10μg/ml。使用连续流动微点样器将抗体点样至E2S上并缀合15分钟。在点样后，将置于IBIS MX96生物传感器中并以1M乙醇胺(pH 8.5)失活10分钟。在传感器制备后，使用典型的三明治式测定法进行抗体竞争分析。在HBS-EP运作缓冲液中稀释单价PD-1ECD抗原(Sino Biological，China)并将其以50nM浓度注射并通过抗PD-1抗体的缀合阵列捕捉。接着，进行HBS-EP运作缓冲液中稀释至100nM的10个PD-1抗体中每个的个别注射以建立抗体竞争模式。在每个竞争循环后，用10mM甘氨酸HCl缓冲液(pH 2.0)再生传感器表面。

结果

十种抗PD-1抗体的竞争模式在图8中呈现。发现12866和12807在基于细胞的分析中没有功能活性，但仍因为其识别不同的表位而包含在内。发现所测试的功能性抗PD-1抗体与两个非重叠的表位仓结合。属于表位仓1的功能性抗体都交叉阻断彼此并且包含纳武单抗类似物(“Nivo”)、派姆单抗类似物(“Pembro”)、12819、12892、12865、和12777。发现这些抗体显著阻断PD-L1和PD-L2结合。发现12760和13112结合分开的表位仓2，因为它们交叉阻断彼此，但不阻断任何来自表位仓1的抗体的结合。结果，12760和13112可能结合不与PD-L1和PD-L2配体结合位点重叠的PD-1上的不同位点。

属于表位仓1的交叉阻断性功能性抗体12819、12865、12892、12777、纳武单抗和派姆单抗可以基于与12866和12807的竞争而进一步细分成四个子仓(图8)。12819(仓1C)是唯一阻断12866和12807两者的结合的抗体，而纳武单抗(仓1D)仅阻断12866且派姆单抗(仓1F)仅阻断12807。属于仓1E的抗体的组(12865、12892和12777)是独特的，因为它们不阻断12866或12807的结合。

最后，12866(仓1A)和12807(仓1B)结合独特的表位仓。12866受到12819和纳武单抗阻断但不受其他抗PD-1抗体阻断，而12807受到12819和派姆单抗阻断但不受其他抗PD-1抗体阻断。

实施例9：对小鼠和大鼠PD-1ECD抗原的PD-1抗体交互反应性的测量

此实施例证明了抗PD-1抗体12819.15384强力地与小鼠PD-1交叉反应但不与大鼠PD-1结合。

材料和方法

经His标记的小鼠和大鼠PD-1ECD自Sino Biologials购买。如实施例7中描述，实施动力学结合分析。

结果

结合动力学是在以下表8中作成表格。抗PD-1抗体12819.15384与小鼠PD-1以809pM的K_D结合但不识别大鼠PD-1。对人类PD-1ECD的亲和力与实施例7中测量的亲和力类似。抗体12865.17150不结合小鼠或大鼠PD-1。纳武单抗或派姆单抗参考类似物都不与小鼠或大鼠PD-1交叉反应(数据未显示)。

表8如由表面等离振子共振(SPR)测量的PD-1抗体12819.15384对人类、小鼠或大鼠PD-1ECD的结合动力学

^*N.B：不结合。

实施例10：PD-1mAb的PD-L1和PD-L2配体阻断活性的分析

此实施例阐明通过使用生物膜干涉分析进行竞争测定法对抗PD-1抗体的组分析PD-L1或PD-L2配体阻断活性。

材料和方法

使用Octet QK384仪器(Fortebio，USA)通过生物膜干涉(BLI)分析进行PD-L1或PD-L2配体阻断活性的研究。在抗人类Fc感应芯片(Fortebio，USA)上捕捉浓度为5μg/ml的商品化人类PD-1Fc融合蛋白质(Sino Biological)并以阴性对照抗体阻断残余的抗Fc位点。接着，以浓度为10μg/ml的抗PD-1抗体饱和经抗原包被的表面。在以抗PD-1抗体饱和PD-1后，通过用以5μg/ml测试的人类PD-L1或PD-L2Fc融合蛋白质(SinoBiological)温育来评估PD-L1或PD-L2的配体阻断活性。

结果

竞争测定法的结果在以下表9中呈现。所有的抗体均完全阻断PD-L1或PD-L2配体结合两者，除了抗体12760.13169(其显示PD-L1或PD-L2的不明显的阻断(分别为26％和36％))和13112.13208(其未显示PD-L1的阻断且显示PD-L2的弱阻断(分别为27％和53％))以外。这些结果与表位入仓分析(实施例8)及表位定位分析(实施例11)良好一致，所述分析显示除了12760和13112以外的所有抗体都结合重叠的表位，所述表位被定位到PD-1上的PD-L1和PD-L2结合位点，而12760和13112抗体结合分开的PD-1位点且不与PD-L1和PD-L2明显交叉竞争。

表9在抗PD-1抗体饱和后的PD-L1和PD-L2抑制

实施例11：通过PD-1诱变进行的抗PD-1抗体的表位定位

抗体表位一般可以表征为线性表位(也称为连续表位)或构象性表位(也称为不连续表位)。线性表位是基于单一连续氨基酸序列限定，而构象性表位可以由许多较小的不连续的线性序列或单一接触残基所组成。在抗体与抗原间的分子间蛋白质界面处聚簇的接触残基的集合也称为热点或核心表位(Moreira等人,Proteins 68(4):803-12(2007))。目前公认的是大多数B细胞表位在自然中是不连续的(Sivalingam和Shepherd,Mol Immunol.51(3-4):304-92012(2012)、Kringelum等人,Mol Immunol.53(1-2):24-34(2013))，平均表位跨越15-22个氨基酸残基，其中2-5个氨基酸贡献了结合能量的大部分(Sivalingam和Shepherd，如上)。

通过对与111种不同的PD-1突变体的结合亲和力进行排序，此实施例阐明了12819和12865抗体的结合表位如何可以分成与受纳武单抗和派姆单抗识别的表位不同的线性表位和热点。

方法

人类PD-1受体是由268个氨基酸(残基21-288)的细胞外域组成。细胞外域跨越氨基酸21-170，接着为跨膜域(残基171-191)和细胞质域(残基192-288)。PD-1属于免疫球蛋白超家族并且由被布置成GFCC’β链在一侧上而ABEDβ链在相反侧上的两个β片层的8个反平行β链的相互作用产生的两层β夹层构成。两个β片层是通过残基C54-C123间的二硫键稳定化的。人类PD-1：人类PD-L1复合体的晶体结构是可用的(PDB 4ZQK)，但在C’和Dβ链间的C’D环以及在残基146后的C末端序列的一些是非结构化的且缺少的(PDB 4ZQK，Zak等人,Structure 23(12):2341-2348(2015))。最近，公开了人类PD-1：派姆单抗复合体的晶体结构(PDB 5JXE，Na等人,Cell Res.2016[Epub印刷前]，PMID:27325296)。在此结构中，C’D环是有序得多，并且显示对派姆单抗结合而言重要的接触残基在此环上聚簇成核心表位。目前没有人类PD-1：人类PD-L2复合体的晶体结构。人类PD-1在溶液中的NMR结构显示与晶体结构PDB 4ZQK的高度结构类似性(PDB 2M2D，Cheng等人,J Biol Chem 288(17):11771-85(2013))。人类PD-1以1:1的化学计量结合人类PD-L1或PD-L2配体，并且结合主要发生在由GFCC’β片层介导的重叠结合位点处(Cheng等人,J Biol Chem 288(17):11771-11785(2013))(图9，小图A和B)。人类PD-L1经由位于Cβ链中的接触残基V64、N66、Y68和位于F及Gβ链中的G124、I126、L128、A132、I134和E136与人类PD-1结合(Zak等人,Structure 23(12):2341-8(2015))。人类PD-L1和PD-L2分别以8μM和2μM的K_D与人类PD-1结合(Cheng等人，如上)。

人类PD-1的蛋白质序列是自Uniprot下载(登录号Q15116；该氨基酸序列以SEQ IDNo:1呈现)。全长食蟹猴(Macaca fascicularis)蛋白质序列是自Uniprot下载(登录号B0LAJ3_MACFA(SEQ ID No:89))。鸡(Gallus gallus)、小鼠(Mus musculus)和褐家鼠(Rattus norvegicus)PD-1的全长蛋白质序列是自NCBI下载(分别为XP_422723.(SEQ IDNo:90)、NP_032824.1(SEQ ID No:91)及XP_006245633.1(SEQ ID No:92))。不同PD-1细胞外氨基酸序列相较于人类PD-1的序列同一性在以下表10中显示。

表10物种间的PD-1ECD序列比较

	氨基酸差异	％序列同一性
			食蟹猴PD-1ECD	6	96.0
褐家鼠PD-1ECD	50	66.7
			小鼠PD-1ECD	57	62.0
鸡PD-1ECD	73	51.3

通过组合来自于的分辨率测定的人类PD-1：人类PD-L1复合体的晶体结构(PDB 4ZQK)和APO人类PD-1的NMR结构(PDB 2M2D)的结构信息建立人类PD-1的分子模型。结构PDB 4ZQK用作为模型的基础，PD-1的缺少的C’D环和C末端部分自NMR结构提供。接着，突出显示表面暴露的氨基酸残基，并对人类PD-1ECD上的表面暴露的残基设计83个个别的丙氨酸取代(丙氨酸扫描)并将5个在人类、小鼠和大鼠PD-1间不同的暴露的残基位置回复突变成大鼠PD-1残基。

为了在天然人类PD-1结构的背景中定位线性抗体表位，产生23个嵌合性蛋白质，其中人类PD-1ECD序列中的10个氨基酸依次交换为重叠5个氨基酸的区段中的鸡序列。在跨越氨基酸31-146的人类PD-1的细胞外域中进行序列交换，由于在此区段外的鸡蛋白质序列不与人类PD-1良好比对且得以省略。

合成编码人类PD-1的细胞外域的PD-1cDNA并将其克隆入含有CMV启动子和人类IgG₁Fc序列(残基P101-K330)的载体中，导致IgG₁Fc C末端融合至所克隆的PD-1ECD。通过标准PCR和工程化改造技术产生经突变的人类PD-1Fc融合构建体，并且在2ml培养物中使用ExpiCHO^TM表达系统瞬时表达蛋白质。在9日后收获人类PD-1Fc融合构建体并通过表面等离振子共振(SPR)对上清液测试对抗PD-1Fab的结合亲和力。使用连续流动微点样器(CFM，Wasatch Microfluidics，Salt Lake City,US)将含有PD-1融合蛋白质的培养物上清液固定在G-a-hu-IgG Fc(Ssens BV，The Netherlands)上15分钟。在点样后，将置于IBIS MX96生物传感器中并使用FixIT试剂盒(Ssens BV，The Netherlands)将捕捉的蛋白质固定至该表面。通过应用所谓的动力学滴定系列(Karlsson R.2006)进行动力学分析，其中本发明的抗体的单体Fab片段以1nM至50nM的渐增浓度注射，在每次抗原注射后不应用表面再生步骤。进行Fab结合15分钟并进行抗原解离30分钟。使用Scrubber 2软体将所记录的结合反应拟合至简单朗缪1:1结合模型以用于计算结合速率常数(k_on或ka)、解离速率常数(k_off或k_d)和亲和力常数(K_D)。

结果

评估抗PD-1Fab 12819.17149和12865.17150和参考类似物纳武单抗和派姆单抗的结合亲和力。12819.17149和12865.17150在VH和VL氨基酸序列上分别与12819.15384和12865.15377完全相同，但是由不同的10个数字的编号标识，因为在宿主细胞中在相同的质粒上而非在分开的质粒上共表达前两个变体各自的重链和轻链序列。包含非PD-L1和PD-L2配体阻断性Fab 13112.15380和作为对照。

所有111个所测试的PD-1突变体表达良好。仅仅三个嵌合构建体不结合任何所测试的抗体，暗示导入这三个构建体的突变可能导致主要构象扰乱，这影响所有测试的PD-1抗体的结合。与经突变的PD-1构建体结合的Fab抗体的结合亲和力相较于野生型的改变以K_D突变体/K_D野生型的比率(经标准化的结合亲和力)表达。通过将10个氨基酸鸡序列插入人类PD-1ECD来进行的线性表位扫描的概要在以下表11中显示。使用至少5倍亲和力减少作为检测到对经突变的PD-1构建体的结合亲和力减少的截留标准。在一些实例中，对于特定抗体无法检测到结合。这些构建体列为N.B.(不结合)。

也通过进行83个丙氨酸取代或5个大鼠回复突变来定位单一接触残基(以下表12)。

针对所测试的抗体鉴定的线性表位或接触残基的概要在表13中呈现。以在人类PD-1ECD的结构上的密度图显示的经定位的结合表位的图解在图9中显示。

分析显示12819和12865抗PD-1抗体的结合表位相较于参考抗体纳武单抗和派姆单抗是明显有区别的(表11-13，图9)。派姆单抗的核心表位(图9，小图C)是位于C’β链上以及位于C’-D环上。接触残基/线性表位也在C和Fβ链上找到，在那里也存在PD-L1的接触残基。纳武单抗的核心表位(图9，小图D)存在于Fβ链的末端上以及在整个Gβ链上，覆盖了经报道的由人类PD-L1所利用的PD-1接触残基的一些。12819和12865的核心表位(图9，小图E和F)位于F和Gβ链上，比纳武单抗覆盖了更多区域且在此区域中与人类PD-L1的所有经报道的接触残基重叠。12865对在残基69-75处的突变也非常敏感。12819也在Cβ链上与派姆单抗共享有一个接触残基(V64)，其也已报道为人类PD-L1的接触残基。12819和12865两者共享定位至C和C’β链以及C’D环中的一些的线性表位。除了残基V64外，所测试的抗体间不共有其他接触残基。通过丙氨酸扫描显示了非配体阻断性抗体13112定位到距离PD-L1和PD-L2配体阻断性位点较远的区域(图9，小图G)。

总之，此实施例阐明虽然12819、12865、纳武单抗和派姆单抗结合人类PD-1上可以阻断PD-L1和PD-L2配体的结合的重叠表位，但每种抗体具有独特的结合表位，这如从竞争结合分析证明(表位入仓，实施例8)，并且通过使用一组111个PD-1突变体来定位个别的线性表位和接触残基以分子水平显示，如表13中汇总。12819也是所研究的抗PD-1组中与小鼠PD-1ECD交叉反应的唯一抗体(809pM的K_D，实施例9)，突出显示了此抗体的结合表位相较于其他所测试的PD-1抗体是独特的。

表12对经丙氨酸扫描的人类PD-1ECD残基的Fab抗体结合亲和力*

*列出以K_D突变体/K_D野生型的形式表达的经标准化结合。

表13通过使用经突变的PD-1Fc融合构建体鉴定的抗PD-1抗体结合表位

实施例12：12819抗体在四个同基因鼠肿瘤模型中的体内效力

此实施例证明了12819抗体在四个同基因鼠肿瘤模型中的体内效力。

方法

将2x10⁵个Sa1N(纤维肉瘤)、1x10⁶个CT26(结肠癌)、5x10⁶个ASB-XIV(肺癌)、或8x10⁶个MC38(结肠癌)细胞皮下地接种至6-8周龄雌性A/J(Sa1N)、BALB/cAnNRj(CT26和ASB-XIV)、或C57BL/6(MC38)小鼠的侧腹。通过卡尺每周二维测量肿瘤三次且根据以下方程以mm³计算肿瘤体积：(宽度)²x长度x 0.5。在30-50mm³的平均肿瘤大小时，将小鼠随机化到二组各十只动物且起始治疗。通过腹膜内注射媒剂缓冲液或单克隆抗体12819.17149每周治疗小鼠三次总共六次治疗，接着为观察期。抗体治疗以10mg/kg给药。运用使用Bonferroni氏多重比较检验的两因素ANOVA以比较在治疗组之间每个时间点时的肿瘤体积。使用GraphPad Prism第5.0版(GraphPadSoftware,Inc.)进行统计分析。

结果

结果显示所有所测试的同基因肿瘤模型中抗体12819.17149的深刻的肿瘤抑制效果(P<0.001对媒剂)(图10)。抗体12819.17149在Sa1N肿瘤模型中诱发了肿瘤生长消退，并且在CT26、MC38和ASB-XIV肿瘤模型中导致肿瘤生长延缓。

实施例13：12819抗体在使用CD8⁺/CD4⁺T细胞和A375黑色素瘤细胞的混合物的经半人源化的异种移植肿瘤模型中的体内效力

此实施例证明了12819抗体在其中人类黑色素瘤细胞系A375与经纯化的人类CD8⁺和CD4⁺T细胞混合的经半人源化的异种移植肿瘤模型中的体内效力。

方法

自人类PBMC供体分离4.5x10⁵个CD8⁺和CD4⁺T细胞并将其与2.05x10⁶个A375(人类黑色素瘤)癌细胞混合，然后将其皮下接种至6-8周龄雌性NODscid小鼠的侧腹。在肿瘤接种日起始治疗并通过腹膜内注射媒剂缓冲液、(派姆单抗)(10mg/kg)、或单克隆抗体12819.17149(10mg/kg)每周治疗小鼠三次共六次治疗，接着为观察期。通过卡尺每周二维地测量肿瘤三次且根据以下方程以mm³计算肿瘤体积：(宽度)²x长度x 0.5。运用使用Bonferroni氏多重比较检验的两因素ANOVA以比较在治疗组之间每个时间点时的肿瘤体积。使用GraphPad Prism第5.0版(GraphPadSoftware,Inc.)进行统计分析。

结果

在经半人源化的肿瘤模型中，用抗体12819.17149治疗导致明显的肿瘤生长延缓(P<0.001对媒剂)，而相较于经媒剂治疗组对肿瘤生长显示有限的效果(图11)。

表14 SEQ ID No的列表

序列表

*在DNA序列中斜体字指示克隆位置

SEQ ID No:1(人类PD-1多肽，Uniprot登录号Q15116(PDCD1_HUMAN))

MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL

SEQ ID No:2(人源化的[12819.15384]V_H氨基酸序列)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTRYDMVWVRQAPGKGLEWVAGIGDSNKMTRYAPAVKGRATISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGSCIACWDEAGRIDAWGQGTLVTVSS

SEQ ID No:3(人源化的[12819.15384]V_L氨基酸序列)

SYELTQDPAVSVALGQTVRITCSGGGSYDGSSYYGWYQQKPGQAPVTVIYNNNNRPSDIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCGSYDRPETNSDYVGMFGSGTKVTVL

SEQ ID No:4(人源化的[12748.15381]和[12748.16124]V_H氨基酸序列)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMNWVRQAPGKGLEWVAGIGNDGSYTNYGAAVKGRATISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASDIRSRNDCSYFLGGCSSGFIDVWGQGTLVTVSS

SEQ ID No:5(人源化的[12748.15381]V_L氨基酸序列)

SYELTQDPAVSVALGQTVRITCSGGSSYSYGWFQQKPGQAPVTVIYESNNRPSDIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCGNADSSSGIFGSGTKVTVL

SEQ ID No:6(人源化的[12865.15377]V_H氨基酸序列)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSDHGMQWVRQAPGKGLEYVGVIDTTGRYTYYAPAVKGRATISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTTCVGGYLCNTVGSIDAWGQGTLVTVSS

SEQ ID No:7(人源化的[12865.15377]V_L氨基酸序列)

SYELTQDPAVSVALGQTVRITCSGGGSSSYYGWYQQKPGQAPVTVIYDDTNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCGGYEGSSHAGIFGSGTKVTVL

SEQ ID No:8(人源化的[12892.15378]V_H氨基酸序列)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSSYTMQWVRQAPGKGLEWVGVISSTGGSTGYGPAVKGRATISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVKSISGDAWSVDGLDAWGQGTLVTVSS

SEQ ID No:9(人源化的[12892.15378]V_L氨基酸序列)

SYELTQDPAVSVALGQTVRITCSGGGSAYGWYQQKPGQAPVTVIYYNNQRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCGSYDSSAVGIFGSGTKVTVL

SEQ ID No:10(人源化的[12796.15376]V_H氨基酸序列)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSSYTMQWVRQAPGKGLEWVGVISSTGGSTGYGPAVKGRATISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVKSVSGDAWSVDGLDAWGQGTLVTVSS

SEQ ID No:11(人源化的[12796.15376]V_L氨基酸序列)

SYELTQDPAVSVALGQTVRITCSGGGSAYGWYQQKPGQAPVTVIYYNNQRPSDIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCGSYDSSAVGIFGSGTKVTVL

SEQ ID No:12(人源化的[12777.15382]V_H氨基酸序列)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSSYGMQWVRQAPGKGLEWVGVISGSGITTLYAPAVKGRATISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCTRSPSITDGWTYGGAWIDAWGQGTLVTVSS

SEQ ID No:13(人源化的[12777.15382]V_L氨基酸序列)

SYELTQDPAVSVALGQTVRITCSGGDGSYGWFQQKPGQAPVTVIYDNDNRPSDIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCGNADLSGGIFGSGTKVTVL

SEQ ID No:14(人源化的[12760.15375]V_H氨基酸序列)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTFNMVWVRQAPGKGLEYVAEISSDGSFTWYATAVKGRATISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSDCSSSYYGYSCIGIIDAWGQGTLVTVSS

SEQ ID No:15(人源化的[12760.15375]V_L氨基酸序列)

SYELTQDPAVSVALGQTVRITCSGGISDDGSYYYGWFQQKPGQAPVTVIYINDRRPSNIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCGSYDSSAGVGIFGSGTKVTVL

SEQ ID No:16(人源化的[13112.15380]V_H氨基酸序列)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYNMFWVRQAPGKGLEFVAEISGSNTGSRTWYAPAVKGRATISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSIYGGYCAGGYSCGVGLIDAWGQGTLVTVSS

SEQ ID No:17(人源化的[13112.15380]V_L氨基酸序列)

SYELTQDPAVSVALGQTVRITCSGGSSDYYGWFQQKPGQAPVTVIYYNNKRPSDIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCGNADSSVGVFGSGTKVTVL

SEQ ID No:18(12819HCDR1氨基酸序列)

GFTFTRYD

SEQ ID No:19(12819HCDR2氨基酸序列)

IGDSNKMT

SEQ ID No:20(12819HCDR3氨基酸序列)

CAKGSCIACWDEAGRIDAW

SEQ ID No:21(12819LCDR1氨基酸序列)

GSYDGSSY

SEQ ID No:22(12819LCDR2氨基酸序列)

NNN

SEQ ID No:23(12819LCDR3氨基酸序列)

CGSYDRPETNSDYVGMF

SEQ ID No:24(12748HCDR1氨基酸序列)

GFTFSDYA

SEQ ID No:25(12748HCDR2氨基酸序列)

IGNDGSYT

SEQ ID No:26(12748HCDR3氨基酸序列)

CASDIRSRNDCSYFLGGCSSGFIDVW

SEQ ID No:27(12748LCDR1氨基酸序列)

SSYS

SEQ ID No:28(12748LCDR2氨基酸序列)

ESN

SEQ ID No:29(12748LCDR3氨基酸序列)

CGNADSSSGIF

SEQ ID No:30(12865HCDR1氨基酸序列)

GFDFSDHG

SEQ ID No:31(12865HCDR2氨基酸序列)

IDTTGRYT

SEQ ID No:32(12865HCDR3氨基酸序列)

CAKTTCVGGYLCNTVGSIDAW

SEQ ID No:33(12865LCDR1氨基酸序列)

GSSSY

SEQ ID No:34(12865LCDR2氨基酸序列)

DDT

SEQ ID No:35(12865LCDR3氨基酸序列)

CGGYEGSSHAGIF

SEQ ID No:36(12892HCDR1氨基酸序列)

GFDFSSYT

SEQ ID No:37(12892HCDR2氨基酸序列)

ISSTGGST

SEQ ID No:38(12892HCDR3氨基酸序列)

CVKSISGDAWSVDGLDAW

SEQ ID No:39(12892LCDR1氨基酸序列)

GSA

SEQ ID No:40(12892LCDR2氨基酸序列)

YNN

SEQ ID No:41(12892LCDR3氨基酸序列)

CGSYDSSAVGIF

SEQ ID No:42(12796HCDR1氨基酸序列)

GFDFSSYT

SEQ ID No:43(12796HCDR2氨基酸序列)

ISSTGGST

SEQ ID No:44(12796HCDR3氨基酸序列)

CVKSVSGDAWSVDGLDAW

SEQ ID No:45(12796LCDR1氨基酸序列)

GSA

SEQ ID No:46(12796LCDR2氨基酸序列)

YNN

SEQ ID No:47(12796LCDR3氨基酸序列)

CGSYDSSAVGIF

SEQ ID No:48(12777HCDR1氨基酸序列)

GFDFSSYG

SEQ ID No:49(12777HCDR2氨基酸序列)

ISGSGITT

SEQ ID No:50(12777HCDR3氨基酸序列)

CTRSPSITDGWTYGGAWIDAW

SEQ ID No:51(12777LCDR1氨基酸序列)

DGS

SEQ ID No:52(12777LCDR2氨基酸序列)

DND

SEQ ID No:53(12777LCDR3氨基酸序列)

CGNADLSGGIF

SEQ ID No:54(12760HCDR1氨基酸序列)

GFTFSTFN

SEQ ID No:55(12760HCDR2氨基酸序列)

ISSDGSFT

SEQ ID No:56(12760HCDR3氨基酸序列)

CAKSDCSSSYYGYSCIGIIDAW

SEQ ID No:57(12760LCDR1氨基酸序列)

ISDDGSYY

SEQ ID No:58(12760LCDR2氨基酸序列)

IND

SEQ ID No:59(12760LCDR3氨基酸序列)

CGSYDSSAGVGIF

SEQ ID No:60(13112HCDR1氨基酸序列)

GFTFSSYN

SEQ ID No:61(13112HCDR2氨基酸序列)

ISGSNTGSRT

SEQ ID No:62(13112HCDR3氨基酸序列)

CAKSIYGGYCAGGYSCGVGLIDAW

SEQ ID No:63(13112LCDR1氨基酸序列)

SSDY

SEQ ID No:64(13112LCDR2氨基酸序列)

YNN

SEQ ID No:65(13112LCDR3氨基酸序列)

CGNADSSVGVF

SEQ ID No:66(人源化的[12748.16124]V_L氨基酸序列(替代的种系))

SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGGSSYSYGWFQQKPGQAPVTVIYESNNRPSDIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCGNADSSSGIFGSGTKVTVL

SEQ ID No:67(重链恒定区氨基酸序列氨基酸序列)

SEQ ID No:68(轻链λ恒定区氨基酸序列)

SEQ ID No:69(人源化的[12819.15384]V_H DNA序列)

GGCGCGCCGAGGTGCAGCTGCTGGAATCTGGAGGAGGACTGGTCCAGCCAGGTGGATCCCTGCGACTGAGCTGCGCCGCTTCTGGATTCACCTTTACAAGATACGACATGGTGTGGGTCCGCCAGGCACCAGGAAAGGGACTGGAGTGGGTGGCTGGTATCGGCGATAGTAACAAGATGACCCGCTACGCACCTGCCGTCAAAGGGAGGGCAACAATTAGTCGGGACAACTCAAAGAATACTCTGTATCTGCAGATGAATTCCCTGCGAGCTGAGGATACAGCAGTGTACTATTGTGCCAAAGGTAGCTGCATCGCCTGTTGGGACGAAGCTGGCCGTATTGATGCATGGGGACAGGGGACTCTGGTGACCGTCTCGAG

SEQ ID No:70(人源化的[12819.15384]V_L DNA序列)

GCTAGCCTCTTACGAGCTGACTCAGGACCCTGCAGTGAGTGTCGCCCTGGGCCAGACAGTGAGAATCACTTGCTCCGGCGGAGGGAGCTACGATGGTTCCAGCTACTATGGCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGACAGGCACCTGTGACCGTCATCTATAACAATAACAATAGGCCATCTGACATTCCCGATCGGTTCAGTGGATCTAGTTCAGGGAACACAGCTTCTCTGACCATTACAGGAGCCCAGGCTGAGGACGAAGCAGATTACTATTGTGGGTCATACGACAGGCCAGAAACAAATTCCGATTATGTGGGAATGTTTGGTAGCGGCACTAAAGTCACCGTCCTAGG

SEQ ID No:71(人源化的[12748.15381]和[12748.16124]V_H DNA序列)

GGCGCGCCGAGGTGCAGCTGCTGGAAAGCGGAGGAGGACTGGTCCAGCCAGGTGGATCTCTGCGACTGAGTTGCGCCGCTTCAGGCTTCACATTTTCTGACTACGCCATGAACTGGGTGAGGCAGGCTCCTGGCAAGGGACTGGAGTGGGTCGCAGGAATCGGGAACGATGGAAGTTACACTAATTATGGAGCAGCCGTGAAGGGGAGAGCTACTATTTCCCGCGACAACAGCAAAAATACCCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGAGAGCTGAAGATACCGCAGTGTACTATTGTGCCTCTGACATCAGGAGTCGGAATGATTGCTCCTATTTCCTGGGAGGGTGTTCCAGCGGCTTTATTGACGTGTGGGGTCAGGGCACCCTGGTCACAGTCTCGAG

SEQ ID No:72(人源化的[12748.15381]V_L DNA序列)

GCTAGCCTCTTACGAGCTGACCCAGGACCCAGCAGTGTCCGTCGCCCTGGGCCAGACAGTGAGAATCACTTGCTCCGGCGGATCCAGCTACAGCTATGGGTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGTCAGGCCCCTGTGACCGTCATCTATGAAAGTAACAATAGGCCATCAGACATTCCCGATCGGTTTTCTGGCTCTAGTTCAGGAAACACAGCTAGTCTGACCATCACAGGGGCCCAGGCTGAGGACGAAGCTGATTACTATTGTGGCAATGCAGATTCCAGCTCTGGAATTTTCGGGTCCGGTACTAAAGTCACCGTCCTAGG

SEQ ID No:73(人源化的[12865.15377]V_H DNA序列)

GGCGCGCCGAGGTGCAGCTGCTGGAATCCGGAGGAGGACTGGTCCAGCCAGGTGGATCCCTGCGACTGAGCTGCGCCGCTTCTGGATTCGACTTTAGCGATCACGGGATGCAGTGGGTGAGACAGGCACCAGGCAAGGGACTGGAGTACGTGGGTGTCATCGACACCACAGGCCGCTATACATACTATGCACCTGCCGTCAAGGGCAGGGCTACCATTAGTCGGGACAACTCAAAAAATACACTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCTGAAGATACTGCAGTGTACTATTGCGCCAAAACTACCTGCGTGGGAGGGTACCTGTGCAATACCGTCGGAAGTATCGATGCTTGGGGACAGGGGACACTGGTGACTGTCTCGAG

SEQ ID No:74(人源化的[12865.15377]V_L DNA序列)

GCTAGCCTCCTACGAGCTGACTCAGGACCCAGCAGTGAGCGTCGCCCTGGGCCAGACAGTGAGAATCACTTGCTCTGGCGGAGGGTCCAGCTCTTACTATGGTTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCTCCTGTGACCGTCATCTATGACGATACAAACAGGCCAAGTGGAATTCCCGATCGGTTCTCAGGTAGTTCATCCGGCAATACAGCTTCTCTGACCATCACAGGGGCCCAGGCTGAGGACGAAGCAGATTACTATTGTGGTGGCTATGAAGGAAGCTCTCACGCCGGGATTTTTGGAAGTGGGACTAAAGTCACCGTCCTAGG

SEQ ID No:75(人源化的[12892.15378]V_H DNA序列)

GGCGCGCCGAGGTGCAGCTGCTGGAAAGTGGAGGAGGACTGGTCCAGCCAGGTGGAAGCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCTAGTGGCTTCGACTTTTCCAGCTACACCATGCAGTGGGTGAGGCAGGCACCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGGCGTCATCTCTAGTACTGGAGGGTCTACCGGATACGGGCCTGCTGTGAAGGGAAGGGCAACAATTTCACGGGATAACTCCAAAAATACTCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCAGAAGACACAGCCGTGTACTATTGCGTGAAATCAATCTCCGGAGATGCCTGGTCTGTGGACGGGCTGGATGCTTGGGGTCAGGGCACCCTGGTCACAGTCTCGAG

SEQ ID No:76(人源化的[12892.15378]V_L DNA序列)

GCTAGCCTCATACGAGCTGACCCAGGACCCAGCAGTGTCCGTCGCCCTGGGACAGACAGTGAGAATCACTTGCTCCGGAGGAGGATCCGCCTACGGTTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCACCTGTGACCGTCATCTACTATAACAATCAGAGGCCATCTGGCATTCCCGACCGGTTCAGTGGATCCAGCTCTGGGAACACAGCAAGTCTGACCATCACAGGCGCCCAGGCTGAGGACGAAGCCGATTACTATTGTGGAAGCTATGATAGTTCAGCTGTGGGGATTTTTGGTTCTGGCACTAAAGTCACCGTCCTAGG

SEQ ID No:77(人源化的[12796.15376]V_H DNA序列)

GGCGCGCCGAGGTGCAGCTGCTGGAAAGTGGAGGAGGACTGGTCCAGCCAGGTGGAAGCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCTAGTGGCTTCGACTTTTCCAGCTACACCATGCAGTGGGTGAGGCAGGCACCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGGCGTCATCTCTAGTACTGGAGGGTCTACCGGATACGGGCCTGCTGTGAAGGGAAGGGCAACAATTTCACGGGATAACTCCAAAAATACTCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCAGAAGACACAGCCGTGTACTATTGCGTGAAATCAGTCTCCGGAGATGCCTGGTCTGTGGACGGGCTGGATGCTTGGGGTCAGGGCACCCTGGTCACAGTCTCGAG

SEQ ID No:78(人源化的[12796.15376]V_L DNA序列)

GCTAGCCTCATACGAGCTGACCCAGGACCCAGCAGTGTCCGTCGCCCTGGGCCAGACAGTGAGAATCACTTGCTCCGGAGGAGGATCCGCCTACGGTTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCACCTGTGACCGTCATCTACTATAACAATCAGAGGCCATCTGACATTCCCGATCGGTTCAGTGGATCCAGCTCTGGGAACACAGCAAGTCTGACCATCACAGGCGCCCAGGCTGAGGACGAAGCCGATTACTATTGTGGAAGCTATGATAGTTCAGCTGTGGGGATTTTTGGTTCTGGCACTAAAGTCACCGTCCTAGG

SEQ ID No:79(人源化的[12777.15382]V_H DNA序列)

GGCGCGCCGAGGTGCAGCTGCTGGAATCCGGAGGAGGACTGGTCCAGCCAGGTGGAAGCCTGCGACTGTCTTGCGCCGCTAGTGGATTCGACTTTTCCAGCTACGGAATGCAGTGGGTGAGGCAGGCACCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGGCGTCATCTCTGGAAGTGGGATTACCACACTGTACGCACCTGCCGTCAAGGGAAGGGCTACTATCTCACGGGACAACTCTAAAAATACAGTGTATCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCTGAAGATACCGCAGTCTACTATTGTACACGCTCACCCTCCATCACAGACGGCTGGACTTATGGAGGGGCCTGGATTGATGCTTGGGGTCAGGGCACTCTGGTGACCGTCTCGAG

SEQ ID No:80(人源化的[12777.15382]V_L DNA序列)

GCTAGCCAGCTACGAGCTGACCCAGGACCCAGCAGTGTCCGTCGCCCTGGGCCAGACAGTGAGAATCACTTGCAGTGGCGGAGATGGGTCATACGGTTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGACAGGCCCCTGTGACCGTCATCTATGACAACGATAATAGGCCATCTGACATTCCCGATCGGTTTAGTGGCTCCAGCTCTGGAAACACAGCTTCTCTGACCATCACAGGGGCCCAGGCTGAGGACGAAGCTGATTACTATTGTGGCAATGCAGACCTGTCCGGGGGTATTTTCGGCAGCGGAACTAAAGTCACCGTCCTAGG

SEQ ID No:81(人源化的[12760.15375]V_H DNA序列)

GGCGCGCCGAGGTGCAGCTGCTGGAATCTGGAGGAGGACTGGTCCAGCCAGGTGGATCCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCTTCTGGATTCACCTTTAGTACATTCAACATGGTGTGGGTCAGGCAGGCACCTGGAAAGGGACTGGAGTACGTGGCTGAAATCTCCAGCGACGGCTCTTTTACATGGTATGCAACTGCCGTCAAGGGCAGGGCCACCATTAGTCGGGATAACTCAAAAAATACAGTGTACCTGCAGATGAATTCCCTGAGGGCTGAGGACACCGCAGTCTACTATTGCGCAAAATCCGATTGTTCTAGTTCATACTATGGATATAGCTGTATCGGGATCATTGACGCTTGGGGTCAGGGCACTCTGGTGACCGTCTCGAG

SEQ ID No:82(人源化的[12760.15375]V_L DNA序列)

GCTAGCCTCCTATGAGCTGACCCAGGACCCAGCAGTGAGCGTCGCCCTGGGCCAGACAGTGAGAATCACTTGCTCCGGCGGAATTAGCGACGATGGCTCTTACTATTACGGATGGTTCCAGCAGAAGCCCGGACAGGCCCCTGTGACCGTCATCTATATTAACGACAGGCGGCCAAGTAATATCCCCGATAGGTTTTCAGGGTCCAGCTCTGGTAACACAGCTTCTCTGACCATTACAGGGGCCCAGGCTGAGGACGAAGCTGATTATTACTGTGGCTCTTACGATAGTTCAGCAGGGGTGGGTATCTTCGGCAGTGGAACTAAAGTCACCGTCCTAGG

SEQ ID No:83(人源化的[13112.15380]V_H DNA序列)

GGCGCGCCGAGGTGCAGCTGCTGGAAAGTGGAGGAGGACTGGTCCAGCCAGGTGGATCACTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTTTCCAGCTACAACATGTTCTGGGTGCGCCAGGCACCAGGAAAGGGACTGGAGTTTGTCGCTGAAATCTCTGGTAGTAATACTGGAAGCCGAACCTGGTACGCACCTGCCGTGAAGGGCAGGGCTACAATTTCTCGGGACAACAGTAAAAATACTCTGTATCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCTGAGGATACAGCAGTGTACTATTGTGCAAAATCAATCTACGGAGGGTATTGCGCCGGTGGCTATTCCTGTGGTGTGGGCCTGATTGACGCATGGGGACAGGGGACCCTGGTCACAGTCTCGAG

SEQ ID No:84(人源化的[13112.15380]V_L DNA序列)

GCTAGCCTCATACGAGCTGACCCAGGACCCAGCAGTGTCCGTCGCCCTGGGCCAGACAGTGAGAATCACTTGCAGTGGCGGATCCAGCGATTACTATGGGTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGTCAGGCCCCTGTGACCGTCATCTACTATAACAACAAGAGGCCATCTGACATTCCCGATCGGTTTAGTGGCTCTAGTTCAGGAAACACAGCCTCCCTGACCATTACAGGGGCCCAGGCTGAGGACGAAGCTGATTACTATTGTGGCAATGCAGACTCCAGCGTGGGAGTCTTCGGGTCTGGTACTAAGGTGACCGTCCTAGG

SEQ ID No:85(人源化的[12748.16124]V_L DNA序列(替代的种系))

GCTAGCCTCTTACGAGCTGACTCAGCCACCTTCCGTGTCCGTGTCCCCAGGACAGACCGCAAGAATCACATGCAGTGGCGGATCCAGCTACTCATATGGGTGGTTCCAGCAGAAGCCTGGTCAGGCCCCCGTGACAGTCATCTATGAGAGCAACAATAGGCCTTCTGACATTCCAGAACGGTTTAGTGGCTCTAGTTCAGGAACCACAGTGACTCTGACCATCAGCGGGGTCCAGGCCGAGGACGAAGCTGATTACTATTGTGGCAACGCTGATTCCAGCTCTGGAATTTTCGGGTCCGGTACAAAAGTGACTGTCCTAGG

SEQ ID No:86(重链恒定区基因组DNA序列，内含子包含在内)

CTCGAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGGTGAGAGGCCAGCACAGGGAGGGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGGCTCAGCGCTCCTGCCTGGACGCATCCCGGCTATGCAGTCCCAGTCCAGGGCAGCAAGGCAGGCCCCGTCTGCCTCTTCACCCGGAGGCCTCTGCCCGCCCCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGCTTTTTCCCCAGGCTCTGGGCAGGCACAGGCTAGGTGCCCCTAACCCAGGCCCTGCACACAAAGGGGCAGGTGCTGGGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGCCCACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCGGACACCTTCTCTCCTCCCAGATTCCAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGGTAAGCCAGCCCAGGCCTCGCCCTCCAGCTCAAGGCGGGACAGGTGCCCTAGAGTAGCCTGCATCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACACGTCCACCTCCATCTCTTCCTCAGCACCTGAAgccgccGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGTGGGACCCGTGGGGTGCGAGGGCCACATGGACAGAGGCCGGCTCGGCCCACCCTCTGCCCTGAGAGTGACCGCTGTACCAACCTCTGTCCCTACAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA

SEQ ID No:87(重链恒定区cDNA序列)

CTCGAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAgccgccGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA

SEQ ID No:88(轻链λ恒定区DNA序列)

CCTAGGTCAGCCCAAGGCCAACCCCACTGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTCCAAGCCAACAAGGCCACACTAGTGTGTCTGATCAGTGACTTCTACCCGGGAGCTGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCAAACCCTCCAAACAGAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAA

SEQ ID No:89(食蟹猴PD-1多肽，NCBI登录号B0LAJ3_MACFA)

SEQ ID No:90(鸡PD-1多肽，NCBI登录号XP_422723.3)

SEQ ID No:91(小鼠PD-1多肽，NCBI登录号NP_032824.1)

SEQ ID No:92(褐家鼠PD-1多肽，NCBI登录号XP_006245633.1)

序列表

<110> 西福根有限公司

<120> 抗PD-1抗体和组合物

<130> 022675.WO052

<140>

<141>

<150> 62/236,341

<151> 2015-10-02

<160> 92

<170> PatentIn第3.5版

<210> 1

<211> 288

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly

165 170 175

Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys

180 185 190

Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro

195 200 205

Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly

210 215 220

Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro

225 230 235 240

Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly

245 250 255

Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg

260 265 270

Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu

275 280 285

<210> 2

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多肽”

<400> 2

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Asp Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gly Ile Gly Asp Ser Asn Lys Met Thr Arg Tyr Ala Pro Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Ser Cys Ile Ala Cys Trp Asp Glu Ala Gly Arg Ile Asp

100 105 110

Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 3

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多肽”

<400> 3

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Asp Gly Ser Ser

20 25 30

Tyr Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Thr Val

35 40 45

Ile Tyr Asn Asn Asn Asn Arg Pro Ser Asp Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln

65 70 75 80

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Tyr Asp Arg Pro Glu

85 90 95

Thr Asn Ser Asp Tyr Val Gly Met Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr

100 105 110

Val Leu

<210> 4

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多肽」

<400> 4

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gly Ile Gly Asn Asp Gly Ser Tyr Thr Asn Tyr Gly Ala Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Asp Ile Arg Ser Arg Asn Asp Cys Ser Tyr Phe Leu Gly Gly

100 105 110

Cys Ser Ser Gly Phe Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser

130

<210> 5

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多肽”

<400> 5

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Ser Tyr Gly Trp

20 25 30

Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Glu Ser

35 40 45

Asn Asn Arg Pro Ser Asp Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

50 55 60

Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu

65 70 75 80

Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Asn Ala Asp Ser Ser Ser Gly Ile Phe Gly

85 90 95

Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100

<210> 6

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多肽”

<400> 6

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Asp His

20 25 30

Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val

35 40 45

Gly Val Ile Asp Thr Thr Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Ala Pro Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Thr Thr Cys Val Gly Gly Tyr Leu Cys Asn Thr Val Gly Ser

100 105 110

Ile Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 7

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多肽”

<400> 7

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Ser Ser Ser Tyr Tyr Gly

20 25 30

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Asp

35 40 45

Asp Thr Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser

50 55 60

Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp

65 70 75 80

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Gly Tyr Glu Gly Ser Ser His Ala Gly

85 90 95

Ile Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105

<210> 8

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多肽”

<400> 8

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Val Ile Ser Ser Thr Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Gly Pro Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Ser Ile Ser Gly Asp Ala Trp Ser Val Asp Gly Leu Asp Ala

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多肽”

<400> 9

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Ser Ala Tyr Gly Trp Tyr

20 25 30

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Tyr Asn Asn

35 40 45

Gln Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly

50 55 60

Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala

65 70 75 80

Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Tyr Asp Ser Ser Ala Val Gly Ile Phe Gly

85 90 95

Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100

<210> 10

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多肽”

<400> 10

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Val Ile Ser Ser Thr Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Gly Pro Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Ser Val Ser Gly Asp Ala Trp Ser Val Asp Gly Leu Asp Ala

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 11

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多肽”

<400> 11

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Ser Ala Tyr Gly Trp Tyr

20 25 30

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Tyr Asn Asn

35 40 45

Gln Arg Pro Ser Asp Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly

50 55 60

Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala

65 70 75 80

Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Tyr Asp Ser Ser Ala Val Gly Ile Phe Gly

85 90 95

Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100

<210> 12

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多肽”

<400> 12

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Val Ile Ser Gly Ser Gly Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Pro Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Ser Pro Ser Ile Thr Asp Gly Trp Thr Tyr Gly Gly Ala Trp

100 105 110

Ile Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 13

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多肽”

<400> 13

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Ser Gly Gly Asp Gly Ser Tyr Gly Trp Phe

20 25 30

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Asp Asn Asp

35 40 45

Asn Arg Pro Ser Asp Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly

50 55 60

Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala

65 70 75 80

Asp Tyr Tyr Cys Gly Asn Ala Asp Leu Ser Gly Gly Ile Phe Gly Ser

85 90 95

Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100

<210> 14

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多肽”

<400> 14

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe

20 25 30

Asn Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val

35 40 45

Ala Glu Ile Ser Ser Asp Gly Ser Phe Thr Trp Tyr Ala Thr Ala Val

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ser Asp Cys Ser Ser Ser Tyr Tyr Gly Tyr Ser Cys Ile Gly

100 105 110

Ile Ile Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 15

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多肽”

<400> 15

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ile Ser Asp Asp Gly Ser Tyr

20 25 30

Tyr Tyr Gly Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Thr Val

35 40 45

Ile Tyr Ile Asn Asp Arg Arg Pro Ser Asn Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln

65 70 75 80

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Tyr Asp Ser Ser Ala

85 90 95

Gly Val Gly Ile Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 16

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多肽”

<400> 16

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asn Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val

35 40 45

Ala Glu Ile Ser Gly Ser Asn Thr Gly Ser Arg Thr Trp Tyr Ala Pro

50 55 60

Ala Val Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Lys Ser Ile Tyr Gly Gly Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Ser

100 105 110

Cys Gly Val Gly Leu Ile Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser

130

<210> 17

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多肽”

<400> 17

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Ser Asp Tyr Tyr Gly Trp

20 25 30

Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Tyr Asn

35 40 45

Asn Lys Arg Pro Ser Asp Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

50 55 60

Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu

65 70 75 80

Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Asn Ala Asp Ser Ser Val Gly Val Phe Gly

85 90 95

Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100

<210> 18

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 18

Gly Phe Thr Phe Thr Arg Tyr Asp

1 5

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 19

Ile Gly Asp Ser Asn Lys Met Thr

1 5

<210> 20

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 20

Cys Ala Lys Gly Ser Cys Ile Ala Cys Trp Asp Glu Ala Gly Arg Ile

1 5 10 15

Asp Ala Trp

<210> 21

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 21

Gly Ser Tyr Asp Gly Ser Ser Tyr

1 5

<210> 22

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 22

Asn Asn Asn

1

<210> 23

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 23

Cys Gly Ser Tyr Asp Arg Pro Glu Thr Asn Ser Asp Tyr Val Gly Met

1 5 10 15

Phe

<210> 24

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 24

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ala

1 5

<210> 25

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 25

Ile Gly Asn Asp Gly Ser Tyr Thr

1 5

<210> 26

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 26

Cys Ala Ser Asp Ile Arg Ser Arg Asn Asp Cys Ser Tyr Phe Leu Gly

1 5 10 15

Gly Cys Ser Ser Gly Phe Ile Asp Val Trp

20 25

<210> 27

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 27

Ser Ser Tyr Ser

1

<210> 28

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 28

Glu Ser Asn

1

<210> 29

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 29

Cys Gly Asn Ala Asp Ser Ser Ser Gly Ile Phe

1 5 10

<210> 30

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 30

Gly Phe Asp Phe Ser Asp His Gly

1 5

<210> 31

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 31

Ile Asp Thr Thr Gly Arg Tyr Thr

1 5

<210> 32

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 32

Cys Ala Lys Thr Thr Cys Val Gly Gly Tyr Leu Cys Asn Thr Val Gly

1 5 10 15

Ser Ile Asp Ala Trp

20

<210> 33

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 33

Gly Ser Ser Ser Tyr

1 5

<210> 34

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 34

Asp Asp Thr

1

<210> 35

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 35

Cys Gly Gly Tyr Glu Gly Ser Ser His Ala Gly Ile Phe

1 5 10

<210> 36

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 36

Gly Phe Asp Phe Ser Ser Tyr Thr

1 5

<210> 37

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 37

Ile Ser Ser Thr Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 38

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 38

Cys Val Lys Ser Ile Ser Gly Asp Ala Trp Ser Val Asp Gly Leu Asp

1 5 10 15

Ala Trp

<210> 39

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 39

Gly Ser Ala

1

<210> 40

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 40

Tyr Asn Asn

1

<210> 41

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 41

Cys Gly Ser Tyr Asp Ser Ser Ala Val Gly Ile Phe

1 5 10

<210> 42

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 42

Gly Phe Asp Phe Ser Ser Tyr Thr

1 5

<210> 43

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 43

Ile Ser Ser Thr Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 44

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 44

Cys Val Lys Ser Val Ser Gly Asp Ala Trp Ser Val Asp Gly Leu Asp

1 5 10 15

Ala Trp

<210> 45

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 45

Gly Ser Ala

1

<210> 46

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 46

Tyr Asn Asn

1

<210> 47

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 47

Cys Gly Ser Tyr Asp Ser Ser Ala Val Gly Ile Phe

1 5 10

<210> 48

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 48

Gly Phe Asp Phe Ser Ser Tyr Gly

1 5

<210> 49

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 49

Ile Ser Gly Ser Gly Ile Thr Thr

1 5

<210> 50

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 50

Cys Thr Arg Ser Pro Ser Ile Thr Asp Gly Trp Thr Tyr Gly Gly Ala

1 5 10 15

Trp Ile Asp Ala Trp

20

<210> 51

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 51

Asp Gly Ser

1

<210> 52

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 52

Asp Asn Asp

1

<210> 53

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 53

Cys Gly Asn Ala Asp Leu Ser Gly Gly Ile Phe

1 5 10

<210> 54

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 54

Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe Asn

1 5

<210> 55

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 55

Ile Ser Ser Asp Gly Ser Phe Thr

1 5

<210> 56

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 56

Cys Ala Lys Ser Asp Cys Ser Ser Ser Tyr Tyr Gly Tyr Ser Cys Ile

1 5 10 15

Gly Ile Ile Asp Ala Trp

20

<210> 57

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 57

Ile Ser Asp Asp Gly Ser Tyr Tyr

1 5

<210> 58

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 58

Ile Asn Asp

1

<210> 59

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 59

Cys Gly Ser Tyr Asp Ser Ser Ala Gly Val Gly Ile Phe

1 5 10

<210> 60

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 60

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asn

1 5

<210> 61

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 61

Ile Ser Gly Ser Asn Thr Gly Ser Arg Thr

1 5 10

<210> 62

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 62

Cys Ala Lys Ser Ile Tyr Gly Gly Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Ser Cys

1 5 10 15

Gly Val Gly Leu Ile Asp Ala Trp

20

<210> 63

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 63

Ser Ser Asp Tyr

1

<210> 64

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 64

Tyr Asn Asn

1

<210> 65

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的肽”

<400> 65

Cys Gly Asn Ala Asp Ser Ser Val Gly Val Phe

1 5 10

<210> 66

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多肽”

<400> 66

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Gly Ser Ser Tyr Ser Tyr Gly Trp

20 25 30

Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Glu Ser

35 40 45

Asn Asn Arg Pro Ser Asp Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

50 55 60

Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu

65 70 75 80

Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Asn Ala Asp Ser Ser Ser Gly Ile Phe Gly

85 90 95

Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100

<210> 67

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多肽”

<400> 67

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 68

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多肽”

<400> 68

Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 69

<211> 379

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多核苷酸”

<400> 69

ggcgcgccga ggtgcagctg ctggaatctg gaggaggact ggtccagcca ggtggatccc 60

tgcgactgag ctgcgccgct tctggattca cctttacaag atacgacatg gtgtgggtcc 120

gccaggcacc aggaaaggga ctggagtggg tggctggtat cggcgatagt aacaagatga 180

cccgctacgc acctgccgtc aaagggaggg caacaattag tcgggacaac tcaaagaata 240

ctctgtatct gcagatgaat tccctgcgag ctgaggatac agcagtgtac tattgtgcca 300

aaggtagctg catcgcctgt tgggacgaag ctggccgtat tgatgcatgg ggacagggga 360

ctctggtgac cgtctcgag 379

<210> 70

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多核苷酸”

<400> 70

gctagcctct tacgagctga ctcaggaccc tgcagtgagt gtcgccctgg gccagacagt 60

gagaatcact tgctccggcg gagggagcta cgatggttcc agctactatg gctggtatca 120

gcagaagcca ggacaggcac ctgtgaccgt catctataac aataacaata ggccatctga 180

cattcccgat cggttcagtg gatctagttc agggaacaca gcttctctga ccattacagg 240

agcccaggct gaggacgaag cagattacta ttgtgggtca tacgacaggc cagaaacaaa 300

ttccgattat gtgggaatgt ttggtagcgg cactaaagtc accgtcctag g 351

<210> 71

<211> 400

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多核苷酸”

<400> 71

ggcgcgccga ggtgcagctg ctggaaagcg gaggaggact ggtccagcca ggtggatctc 60

tgcgactgag ttgcgccgct tcaggcttca cattttctga ctacgccatg aactgggtga 120

ggcaggctcc tggcaaggga ctggagtggg tcgcaggaat cgggaacgat ggaagttaca 180

ctaattatgg agcagccgtg aaggggagag ctactatttc ccgcgacaac agcaaaaata 240

ccctgtacct gcagatgaac tcactgagag ctgaagatac cgcagtgtac tattgtgcct 300

ctgacatcag gagtcggaat gattgctcct atttcctggg agggtgttcc agcggcttta 360

ttgacgtgtg gggtcagggc accctggtca cagtctcgag 400

<210> 72

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多核苷酸”

<400> 72

gctagcctct tacgagctga cccaggaccc agcagtgtcc gtcgccctgg gccagacagt 60

gagaatcact tgctccggcg gatccagcta cagctatggg tggttccagc agaagcccgg 120

tcaggcccct gtgaccgtca tctatgaaag taacaatagg ccatcagaca ttcccgatcg 180

gttttctggc tctagttcag gaaacacagc tagtctgacc atcacagggg cccaggctga 240

ggacgaagct gattactatt gtggcaatgc agattccagc tctggaattt tcgggtccgg 300

tactaaagtc accgtcctag g 321

<210> 73

<211> 385

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多核苷酸”

<400> 73

ggcgcgccga ggtgcagctg ctggaatccg gaggaggact ggtccagcca ggtggatccc 60

tgcgactgag ctgcgccgct tctggattcg actttagcga tcacgggatg cagtgggtga 120

gacaggcacc aggcaaggga ctggagtacg tgggtgtcat cgacaccaca ggccgctata 180

catactatgc acctgccgtc aagggcaggg ctaccattag tcgggacaac tcaaaaaata 240

cactgtacct gcagatgaac tctctgaggg ctgaagatac tgcagtgtac tattgcgcca 300

aaactacctg cgtgggaggg tacctgtgca ataccgtcgg aagtatcgat gcttggggac 360

aggggacact ggtgactgtc tcgag 385

<210> 74

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多核苷酸”

<400> 74

gctagcctcc tacgagctga ctcaggaccc agcagtgagc gtcgccctgg gccagacagt 60

gagaatcact tgctctggcg gagggtccag ctcttactat ggttggtacc agcagaagcc 120

cggccaggct cctgtgaccg tcatctatga cgatacaaac aggccaagtg gaattcccga 180

tcggttctca ggtagttcat ccggcaatac agcttctctg accatcacag gggcccaggc 240

tgaggacgaa gcagattact attgtggtgg ctatgaagga agctctcacg ccgggatttt 300

tggaagtggg actaaagtca ccgtcctagg 330

<210> 75

<211> 376

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多核苷酸”

<400> 75

ggcgcgccga ggtgcagctg ctggaaagtg gaggaggact ggtccagcca ggtggaagcc 60

tgagactgtc ttgcgccgct agtggcttcg acttttccag ctacaccatg cagtgggtga 120

ggcaggcacc aggcaaggga ctggagtggg tgggcgtcat ctctagtact ggagggtcta 180

ccggatacgg gcctgctgtg aagggaaggg caacaatttc acgggataac tccaaaaata 240

ctctgtatct gcagatgaac agcctgaggg cagaagacac agccgtgtac tattgcgtga 300

aatcaatctc cggagatgcc tggtctgtgg acgggctgga tgcttggggt cagggcaccc 360

tggtcacagt ctcgag 376

<210> 76

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多核苷酸”

<400> 76

gctagcctca tacgagctga cccaggaccc agcagtgtcc gtcgccctgg gacagacagt 60

gagaatcact tgctccggag gaggatccgc ctacggttgg tatcagcaga agcccggcca 120

ggcacctgtg accgtcatct actataacaa tcagaggcca tctggcattc ccgaccggtt 180

cagtggatcc agctctggga acacagcaag tctgaccatc acaggcgccc aggctgagga 240

cgaagccgat tactattgtg gaagctatga tagttcagct gtggggattt ttggttctgg 300

cactaaagtc accgtcctag g 321

<210> 77

<211> 376

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多核苷酸”

<400> 77

ggcgcgccga ggtgcagctg ctggaaagtg gaggaggact ggtccagcca ggtggaagcc 60

tgagactgtc ttgcgccgct agtggcttcg acttttccag ctacaccatg cagtgggtga 120

ggcaggcacc aggcaaggga ctggagtggg tgggcgtcat ctctagtact ggagggtcta 180

ccggatacgg gcctgctgtg aagggaaggg caacaatttc acgggataac tccaaaaata 240

ctctgtatct gcagatgaac agcctgaggg cagaagacac agccgtgtac tattgcgtga 300

aatcagtctc cggagatgcc tggtctgtgg acgggctgga tgcttggggt cagggcaccc 360

tggtcacagt ctcgag 376

<210> 78

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多核苷酸”

<400> 78

gctagcctca tacgagctga cccaggaccc agcagtgtcc gtcgccctgg gccagacagt 60

gagaatcact tgctccggag gaggatccgc ctacggttgg tatcagcaga agcccggcca 120

ggcacctgtg accgtcatct actataacaa tcagaggcca tctgacattc ccgatcggtt 180

cagtggatcc agctctggga acacagcaag tctgaccatc acaggcgccc aggctgagga 240

cgaagccgat tactattgtg gaagctatga tagttcagct gtggggattt ttggttctgg 300

cactaaagtc accgtcctag g 321

<210> 79

<211> 385

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多核苷酸”

<400> 79

ggcgcgccga ggtgcagctg ctggaatccg gaggaggact ggtccagcca ggtggaagcc 60

tgcgactgtc ttgcgccgct agtggattcg acttttccag ctacggaatg cagtgggtga 120

ggcaggcacc aggcaaggga ctggagtggg tgggcgtcat ctctggaagt gggattacca 180

cactgtacgc acctgccgtc aagggaaggg ctactatctc acgggacaac tctaaaaata 240

cagtgtatct gcagatgaac tccctgagag ctgaagatac cgcagtctac tattgtacac 300

gctcaccctc catcacagac ggctggactt atggaggggc ctggattgat gcttggggtc 360

agggcactct ggtgaccgtc tcgag 385

<210> 80

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多核苷酸”

<400> 80

gctagccagc tacgagctga cccaggaccc agcagtgtcc gtcgccctgg gccagacagt 60

gagaatcact tgcagtggcg gagatgggtc atacggttgg ttccagcaga agcccggaca 120

ggcccctgtg accgtcatct atgacaacga taataggcca tctgacattc ccgatcggtt 180

tagtggctcc agctctggaa acacagcttc tctgaccatc acaggggccc aggctgagga 240

cgaagctgat tactattgtg gcaatgcaga cctgtccggg ggtattttcg gcagcggaac 300

taaagtcacc gtcctagg 318

<210> 81

<211> 388

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多核苷酸”

<400> 81

ggcgcgccga ggtgcagctg ctggaatctg gaggaggact ggtccagcca ggtggatccc 60

tgagactgag ctgcgccgct tctggattca cctttagtac attcaacatg gtgtgggtca 120

ggcaggcacc tggaaaggga ctggagtacg tggctgaaat ctccagcgac ggctctttta 180

catggtatgc aactgccgtc aagggcaggg ccaccattag tcgggataac tcaaaaaata 240

cagtgtacct gcagatgaat tccctgaggg ctgaggacac cgcagtctac tattgcgcaa 300

aatccgattg ttctagttca tactatggat atagctgtat cgggatcatt gacgcttggg 360

gtcagggcac tctggtgacc gtctcgag 388

<210> 82

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多核苷酸”

<400> 82

gctagcctcc tatgagctga cccaggaccc agcagtgagc gtcgccctgg gccagacagt 60

gagaatcact tgctccggcg gaattagcga cgatggctct tactattacg gatggttcca 120

gcagaagccc ggacaggccc ctgtgaccgt catctatatt aacgacaggc ggccaagtaa 180

tatccccgat aggttttcag ggtccagctc tggtaacaca gcttctctga ccattacagg 240

ggcccaggct gaggacgaag ctgattatta ctgtggctct tacgatagtt cagcaggggt 300

gggtatcttc ggcagtggaa ctaaagtcac cgtcctagg 339

<210> 83

<211> 400

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多核苷酸”

<400> 83

ggcgcgccga ggtgcagctg ctggaaagtg gaggaggact ggtccagcca ggtggatcac 60

tgagactgtc ctgcgccgcc tccggcttca ccttttccag ctacaacatg ttctgggtgc 120

gccaggcacc aggaaaggga ctggagtttg tcgctgaaat ctctggtagt aatactggaa 180

gccgaacctg gtacgcacct gccgtgaagg gcagggctac aatttctcgg gacaacagta 240

aaaatactct gtatctgcag atgaactctc tgagggctga ggatacagca gtgtactatt 300

gtgcaaaatc aatctacgga gggtattgcg ccggtggcta ttcctgtggt gtgggcctga 360

ttgacgcatg gggacagggg accctggtca cagtctcgag 400

<210> 84

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多核苷酸”

<400> 84

gctagcctca tacgagctga cccaggaccc agcagtgtcc gtcgccctgg gccagacagt 60

gagaatcact tgcagtggcg gatccagcga ttactatggg tggttccagc agaagcccgg 120

tcaggcccct gtgaccgtca tctactataa caacaagagg ccatctgaca ttcccgatcg 180

gtttagtggc tctagttcag gaaacacagc ctccctgacc attacagggg cccaggctga 240

ggacgaagct gattactatt gtggcaatgc agactccagc gtgggagtct tcgggtctgg 300

tactaaggtg accgtcctag g 321

<210> 85

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多核苷酸”

<400> 85

gctagcctct tacgagctga ctcagccacc ttccgtgtcc gtgtccccag gacagaccgc 60

aagaatcaca tgcagtggcg gatccagcta ctcatatggg tggttccagc agaagcctgg 120

tcaggccccc gtgacagtca tctatgagag caacaatagg ccttctgaca ttccagaacg 180

gtttagtggc tctagttcag gaaccacagt gactctgacc atcagcgggg tccaggccga 240

ggacgaagct gattactatt gtggcaacgc tgattccagc tctggaattt tcgggtccgg 300

tacaaaagtg actgtcctag g 321

<210> 86

<211> 1606

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多核苷酸”

<400> 86

ctcgagtgcc tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac 60

ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac 120

ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca 180

gtcctcagga ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac 240

ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt 300

tggtgagagg ccagcacagg gagggagggt gtctgctgga agccaggctc agcgctcctg 360

cctggacgca tcccggctat gcagtcccag tccagggcag caaggcaggc cccgtctgcc 420

tcttcacccg gaggcctctg cccgccccac tcatgctcag ggagagggtc ttctggcttt 480

ttccccaggc tctgggcagg cacaggctag gtgcccctaa cccaggccct gcacacaaag 540

gggcaggtgc tgggctcaga cctgccaaga gccatatccg ggaggaccct gcccctgacc 600

taagcccacc ccaaaggcca aactctccac tccctcagct cggacacctt ctctcctccc 660

agattccagt aactcccaat cttctctctg cagagcccaa atcttgtgac aaaactcaca 720

catgcccacc gtgcccaggt aagccagccc aggcctcgcc ctccagctca aggcgggaca 780

ggtgccctag agtagcctgc atccagggac aggccccagc cgggtgctga cacgtccacc 840

tccatctctt cctcagcacc tgaagccgcc gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca 900

aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 960

gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 1020

aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 1080

ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1140

aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaaggtgg gacccgtggg 1200

gtgcgagggc cacatggaca gaggccggct cggcccaccc tctgccctga gagtgaccgc 1260

tgtaccaacc tctgtcccta cagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc 1320

atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta 1380

tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac 1440

cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga 1500

caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca 1560

caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtccccgggt aaatga 1606

<210> 87

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多核苷酸”

<400> 87

ctcgagtgcc tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac 60

ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac 120

ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca 180

gtcctcagga ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac 240

ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt 300

tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagccgc 360

cgggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg 420

gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt 480

caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca 540

gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa 600

tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac 660

catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg 720

ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag 780

cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc 840

tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag 900

caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca 960

ctacacgcag aagagcctct ccctgtcccc gggtaaatga 1000

<210> 88

<211> 325

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 来源

<223> /注=“人工序列之描述：合成的多核苷酸”

<400> 88

cctaggtcag cccaaggcca accccactgt cactctgttc ccgccctcct ctgaggagct 60

ccaagccaac aaggccacac tagtgtgtct gatcagtgac ttctacccgg gagctgtgac 120

agtggcctgg aaggcagatg gcagccccgt caaggcggga gtggagacca ccaaaccctc 180

caaacagagc aacaacaagt acgcggccag cagctacctg agcctgacgc ccgagcagtg 240

gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa gggagcaccg tggagaagac 300

agtggcccct acagaatgtt cataa 325

<210> 89

<211> 288

<212> PRT

<213> 食蟹猴

<400> 89

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Glu Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Ala Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Leu Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Ala Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Arg Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Ala Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly

165 170 175

Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys

180 185 190

Ser Arg Ala Ala Gln Gly Thr Ile Glu Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro

195 200 205

Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly

210 215 220

Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Ala Pro

225 230 235 240

Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly

245 250 255

Leu Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg

260 265 270

Ser Pro Arg Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu

275 280 285

<210> 90

<211> 304

<212> PRT

<213> 鸡

<400> 90

Met Gly Lys Glu Ala Pro Ser Gly Thr Gly His Arg His Arg Ala Gln

1 5 10 15

Gln Gly Thr Arg Arg Pro Ala Met Ala Leu Gly Thr Ser Arg Thr Met

20 25 30

Trp Asp Ser Thr Glu Ala Ala Leu Val Val Leu Cys Val Leu Leu Leu

35 40 45

Cys Cys Asn Pro Pro Leu Ala Gly Cys His Gln Val Thr Leu Phe Pro

50 55 60

Ala Thr Leu Thr Arg Pro Ala Gly Ser Ser Ala Thr Phe Ile Cys Asn

65 70 75 80

Ile Ser Met Glu Asn Ser Ser Leu Glu Phe Asn Leu Asn Trp Tyr Gln

85 90 95

Lys Thr Asn Asn Ser Asn Pro Gln Lys Ile Ala Gly Ile Ile Arg Asn

100 105 110

Ile Pro Gln Lys Lys Met Glu Lys Tyr Arg Leu Phe Asn Asn Thr Pro

115 120 125

Val Phe Lys Met Glu Ile Leu Asn Leu His Gln Asn Asp Ser Gly Phe

130 135 140

Tyr Tyr Cys Gly Leu Ile Thr Phe Ser Arg Ser Asp Lys Val Val Glu

145 150 155 160

Ser Ser His Ser Gln Leu Val Val Thr Glu Ala Pro Glu Lys Thr Asn

165 170 175

Thr Ile Asp Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ser Ser Pro Pro Asp His Ile

180 185 190

Lys Ala Val Leu Leu Gly Thr Leu Leu Leu Ala Gly Val Ile Val Leu

195 200 205

Leu Leu Phe Gly Tyr Ile Ile Ile Asn Asn Arg Arg Ala Asp Val Gln

210 215 220

Lys Pro Ser Ser Gly Asn Thr Leu Ala Glu Val Lys Pro Pro Val Val

225 230 235 240

Pro Val Pro Thr Val Asp Tyr Gly Val Leu Glu Phe Gln Arg Asp Pro

245 250 255

His Ser Gln Val Pro Leu Glu Thr Cys Pro Ala Glu Gln Thr Glu Tyr

260 265 270

Ala Thr Ile Val Phe Pro Glu Glu Lys Pro Ile Thr Pro Glu Arg Gly

275 280 285

Lys Arg His Lys Asp Glu Arg Thr Trp Gln Leu Pro Ser Gln Pro Cys

290 295 300

<210> 91

<211> 288

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 91

Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp

20 25 30

Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met

50 55 60

Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala

65 70 75 80

Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln

85 90 95

Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp

100 105 110

Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val

130 135 140

Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met Val Ile Gly Ile Met Ser Ala

165 170 175

Leu Val Gly Ile Pro Val Leu Leu Leu Leu Ala Trp Ala Leu Ala Val

180 185 190

Phe Cys Ser Thr Ser Met Ser Glu Ala Arg Gly Ala Gly Ser Lys Asp

195 200 205

Asp Thr Leu Lys Glu Glu Pro Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Val Ala

210 215 220

Tyr Glu Glu Leu Asp Phe Gln Gly Arg Glu Lys Thr Pro Glu Leu Pro

225 230 235 240

Thr Ala Cys Val His Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Thr Glu Gly

245 250 255

Leu Gly Ala Ser Ala Met Gly Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Leu Gln

260 265 270

Gly Pro Arg Pro Pro Arg His Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu

275 280 285

<210> 92

<211> 288

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 92

Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp

20 25 30

Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met

50 55 60

Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala

65 70 75 80

Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln

85 90 95

Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp

100 105 110

Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val

130 135 140

Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met Val Ile Gly Ile Met Ser Ala

165 170 175

Leu Val Gly Ile Pro Val Leu Leu Leu Leu Ala Trp Ala Leu Ala Val

180 185 190

Phe Cys Ser Thr Ser Met Ser Glu Ala Arg Gly Ala Gly Ser Lys Asp

195 200 205

Asp Thr Leu Lys Glu Glu Pro Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Val Ala

210 215 220

Tyr Glu Glu Leu Asp Phe Gln Gly Arg Glu Lys Thr Pro Glu Leu Pro

225 230 235 240

Thr Ala Cys Val His Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Thr Glu Gly

245 250 255

Leu Gly Ala Ser Ala Met Gly Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Leu Gln

260 265 270

Gly Pro Arg Pro Pro Arg His Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu

275 280 285

Claims

1.抗PD-1抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体与其重链和轻链可变域包含以下氨基酸序列的抗体竞争与人类PD-1的结合、或与其重链和轻链可变域包含以下氨基酸序列的抗体结合人类PD-1的相同表位：

a)分别为SEQ ID No:2和3；

b)分别为SEQ ID No:4和5；

c)分别为SEQ ID No:4和66；

d)分别为SEQ ID No:6和7；

e)分别为SEQ ID No:8和9；

f)分别为SEQ ID No:10和11；

g)分别为SEQ ID No:12和13；

h)分别为SEQ ID No:14和15；或

i)分别为SEQ ID No:16和17。

2.权利要求1的抗PD-1抗体或抗原结合部分，其中所述抗PD-1抗体选自下组：

a)抗体，其H-CDR1-3分别包含SEQ ID No:18-20的氨基酸序列；

c)抗体，其V_H包含SEQ ID No:2的氨基酸序列；

d)抗体，其重链(HC)包含SEQ ID No:2和67的氨基酸序列；

e)抗体，其L-CDR1-3分别包含SEQ ID No:21-23的氨基酸序列；

g)抗体，其V_L包含SEQ ID No:3的氨基酸序列；

h)抗体，其轻链(LC)包含SEQ ID No:3和68的氨基酸序列；

k)抗体，其V_H包含SEQ ID No:2的氨基酸序列且其V_L包含SEQ ID No:3的氨基酸序列；以及

3.权利要求1的抗PD-1抗体或抗原结合部分，其中所述抗PD-1抗体选自下组：

a)抗体，其H-CDR1-3分别包含SEQ ID No:24-26的氨基酸序列；

c)抗体，其V_H包含SEQ ID No:4的氨基酸序列；

d)抗体，其重链(HC)包含SEQ ID No:4和67的氨基酸序列；

e)抗体，其L-CDR1-3分别包含SEQ ID No:27-29的氨基酸序列；

g)抗体，其V_L包含SEQ ID No:5或66的氨基酸序列；

h)抗体，其轻链(LC)包含SEQ ID No:5或66的氨基酸序列以及SEQ ID No:68的氨基酸序列；

k)抗体，其V_H包含SEQ ID No:4的氨基酸序列且其V_L包含SEQ ID No:5或66的氨基酸序列；以及

4.权利要求1的抗PD-1抗体或抗原结合部分，其中所述抗PD-1抗体选自下组：

a)抗体，其H-CDR1-3分别包含SEQ ID No:30-32的氨基酸序列；

c)抗体，其V_H包含SEQ ID No:6的氨基酸序列；

d)抗体，其重链(HC)包含SEQ ID No:6和67的氨基酸序列；

e)抗体，其L-CDR1-3分别包含SEQ ID No:33-35的氨基酸序列；

g)抗体，其V_L包含SEQ ID No:7的氨基酸序列；

h)抗体，其轻链(LC)包含SEQ ID No:7和68的氨基酸序列；

5.权利要求1的抗PD-1抗体或抗原结合部分，其中所述抗PD-1抗体选自下组：

a)抗体，其H-CDR1-3分别包含SEQ ID No:36-38的氨基酸序列；

c)抗体，其V_H包含SEQ ID No:8的氨基酸序列；

d)抗体，其重链(HC)包含SEQ ID No:8和67的氨基酸序列；

e)抗体，其L-CDR1-3分别包含SEQ ID No:39-41的氨基酸序列；

g)抗体，其V_L包含SEQ ID No:9的氨基酸序列；

h)抗体，其轻链(LC)包含SEQ ID No:9和68的氨基酸序列；

6.权利要求1的抗PD-1抗体或抗原结合部分，其中所述抗PD-1抗体选自下组：

a)抗体，其H-CDR1-3分别包含SEQ ID No:42-44的氨基酸序列；

c)抗体，其V_H包含SEQ ID No:10的氨基酸序列；

d)抗体，其重链(HC)包含SEQ ID No:10和67的氨基酸序列；

e)抗体，其L-CDR1-3分别包含SEQ ID No:45-47的氨基酸序列；

g)抗体，其V_L包含SEQ ID No:11的氨基酸序列；

h)抗体，其轻链(LC)包含SEQ ID No:11和68的氨基酸序列；

7.权利要求1的抗PD-1抗体或抗原结合部分，其中所述抗PD-1抗体选自下组：

a)抗体，其H-CDR1-3分别包含SEQ ID No:48-50的氨基酸序列；

c)抗体，其V_H包含SEQ ID No:12的氨基酸序列；

d)抗体，其重链(HC)包含SEQ ID No:12和67的氨基酸序列；

e)抗体，其L-CDR1-3分别包含SEQ ID No:51-53的氨基酸序列；

g)抗体，其V_L包含SEQ ID No:13的氨基酸序列；

h)抗体，其轻链(LC)包含SEQ ID No:13和68的氨基酸序列；

8.权利要求1的抗PD-1抗体或抗原结合部分，其中所述抗PD-1抗体选自下组：

a)抗体，其H-CDR1-3分别包含SEQ ID No:54-56的氨基酸序列；

c)抗体，其V_H包含SEQ ID No:14的氨基酸序列；

d)抗体，其重链(HC)包含SEQ ID No:14和67的氨基酸序列；

e)抗体，其L-CDR1-3分别包含SEQ ID No:57-59的氨基酸序列；

g)抗体，其V_L包含SEQ ID No:15的氨基酸序列；

h)抗体，其轻链(LC)包含SEQ ID No:15和68的氨基酸序列；

9.权利要求1的抗PD-1抗体或抗原结合部分，其中所述抗PD-1抗体选自下组：

a)抗体，其H-CDR1-3分别包含SEQ ID No:60-62的氨基酸序列；

c)抗体，其V_H包含SEQ ID No:16的氨基酸序列；

d)抗体，其重链(HC)包含SEQ ID No:16和67的氨基酸序列；

e)抗体，其L-CDR1-3分别包含SEQ ID No:63-65的氨基酸序列；

g)抗体，其V_L包含SEQ ID No:17的氨基酸序列；

h)抗体，其轻链(LC)包含SEQ ID No:17和68的氨基酸序列；

k)抗体，其V_H包含SEQ ID No:16的氨基酸序列且其V_L包含SEQ ID No:17的氨基酸序列；和

10.抗PD-1抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含以下的H-CDR1-3和L-CDR1-3氨基酸序列：

a)分别为SEQ ID No:18、19、20、21、22、和23；

b)分别为SEQ ID No:24、25、26、27、28、和29；

c)分别为SEQ ID No:30、31、32、33、34、和35；

d)分别为SEQ ID No:36、37、38、39、40、和41；

e)分别为SEQ ID No:42、43、44、45、46、和47；

f)分别为SEQ ID No:48、49、50、51、52、和53；

g)分别为SEQ ID No:54、55、56、57、58、和59；或

h)分别为SEQ ID No:60、61、62、63、64、和65。

11.抗PD-1抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含具有与以下的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的重链可变域和轻链可变域：

a)分别为SEQ ID No:2和3；

b)分别为SEQ ID No:4和5；

c)分别为SEQ ID No:4和66；

d)分别为SEQ ID No:6和7；

e)分别为SEQ ID No:8和9；

f)分别为SEQ ID No:10和11；

g)分别为SEQ ID No:12和13；

h)分别为SEQ ID No:14和15；或

i)分别为SEQ ID No:16和17。

12.抗PD-1抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含具有以下的氨基酸序列的重链可变域和轻链可变域：

a)分别为SEQ ID No:2和3；

b)分别为SEQ ID No:4和5；

c)分别为SEQ ID No:4和66；

d)分别为SEQ ID No:6和7；

e)分别为SEQ ID No:8和9；

f)分别为SEQ ID No:10和11；

g)分别为SEQ ID No:12和13；

h)分别为SEQ ID No:14和15；或

i)分别为SEQ ID No:16和17。

13.抗PD-1抗体，其包含：

a)包含SEQ ID No:2和67的氨基酸序列的重链(HC)和包含SEQ ID No:3和68的氨基酸序列的轻链(LC)；

14.抗PD-1抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含H-CDR1-3和L-CDR1-3，所述H-CDR1-3和L-CDR1-3分别包含SEQ ID No:18-20和SEQ ID No:21-23的氨基酸序列。

15.抗PD-1抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含含有SEQ ID No:2的氨基酸序列的V_H和含有SEQ ID No:3的氨基酸序列的V_L。

16.抗PD-1抗体，其包含含有SEQ ID No:2和67的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID No:3和68的氨基酸序列的轻链。

17.抗PD-1抗体或其抗原结合部分，其与PD-1上的包含氨基酸残基K131的表位结合。

18.权利要求17的抗PD-1抗体或抗原结合部分，其中所述表位进一步包含PD-1氨基酸残基P130和A132。

19.权利要求18的抗PD-1抗体或抗原结合部分，其中所述表位进一步包含PD-1氨基酸残基V64和L128。

20.权利要求17的抗PD-1抗体或抗原结合部分，其中所述表位进一步包含PD-1氨基酸残基E136。

21.抗PD-1抗体或其抗原结合部分，其与PD-1上的包含氨基酸残基V44和T145的表位结合。

22.抗PD-1抗体或其抗原结合部分，其与PD-1上的包含SEQ ID No:1的氨基酸残基69-90和122-140的表位结合。

23.权利要求22的抗体或抗原结合部分，其中所述表位进一步包含SEQ ID No:1的氨基酸残基56-64。

24.抗PD-1抗体或其抗原结合部分，其与PD-1上的包含SEQ ID No:1的残基69-75或其片段的表位结合。

25.抗PD-1抗体或其抗原结合部分，其与PD-1上的包含SEQ ID No:1的残基136-140或其片段的表位结合。

26.抗PD-1抗体或其抗原结合部分，其与PD-1上的包含SEQ ID No:1的残基69-75或其片段以及残基136-140或其片段的表位结合。

27.权利要求1-12、14、15、和17-26中任一项的抗PD-1抗体，其中所述抗体是IgG。

28.权利要求27的抗PD-1抗体，其中所述抗体是IgG₁。

29.权利要求28的抗PD-1抗体，其中所述抗体在Fc区域中包含至少一个突变。

30.权利要求29的抗PD-1抗体，其中所述抗体包含根据IMGT编号方案编号的重链氨基酸位点228、234和235中的一处或多处的突变。

31.权利要求30的抗PD-1抗体，其中将位于位点234和235的一个或两个氨基酸残基突变成Ala，及/或其中将位于位点228的氨基酸残基突变成Pro。

32.权利要求1-31中任一项的抗PD-1抗体或抗原结合部分，其中所述抗体或部分具有以下特性的至少一种：

a)以750pM或更低的K_D与人类PD-1结合；

b)以7nM或更低的K_D与食蟹猴PD-1结合；

c)以1nM或更低的K_D与小鼠PD-1结合；

d)不与大鼠PD-1结合；

e)在SEB全血测定法中增加IL-2分泌；

f)在单向混合淋巴细胞反应测定法中增加IFN-γ分泌；

h)如由生物膜干涉(Bio-Layer Interferometry)分析测定的，在10μg/ml的浓度下阻断PD-L1及PD-L2与PD-1的结合达至少90％；和

i)体内抑制肿瘤生长。

33.药物组合物，其包含权利要求1-32中任一项的抗PD-1抗体或抗原结合部分以及药学上可接受的赋形剂。

34.权利要求33的药物组合物，其进一步包含化学治疗剂、抗肿瘤剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、或PD-1途径抑制剂。

35.分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-32中任一项的抗PD-1抗体的重链或其抗原结合部分的核苷酸序列、或编码权利要求1-32中任一项的抗PD-1抗体的轻链或其抗原结合部分的核苷酸序列、或两者。

36.载体，其包含权利要求35的分离的核酸分子，其中所述载体进一步包含表达控制序列。

37.宿主细胞，其包含编码权利要求1-32中任一项的抗PD-1抗体的重链或其抗原结合部分的核苷酸序列、和编码权利要求1-32中任一项的抗PD-1抗体的轻链或其抗原结合部分的核苷酸序列。

38.用于生产抗PD-1抗体或其抗原结合部分的方法，其包含提供权利要求37的宿主细胞、在适合于表达所述抗体或部分的条件下培养所述宿主细胞、并且分离所得的抗体或部分。

39.双特异性结合分子，其具有根据权利要求1-32中任一项的抗PD-1抗体的结合特异性和另一不同的抗体的结合特异性。

40.用于在有此需要的患者中增强免疫力的方法，其包括对所述患者施用权利要求1-32中任一项的抗PD-1抗体、根据权利要求33或34的药物组合物、或根据权利要求39的双特异性结合分子。

41.用于治疗患者中的癌症的方法，其包括对所述患者施用权利要求1-32中任一项的抗PD-1抗体、根据权利要求33或34的药物组合物、或根据权利要求39的双特异性结合分子。

42.权利要求41的方法，其中所述癌症是源于选自下组的组织：皮肤、肺、肠、卵巢、脑、前列腺、肾脏、软组织、造血系统、头和颈、肝脏、膀胱、乳房、胃、子宫和胰脏。

43.权利要求41的方法，其中所述癌症选自晚期或转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌、头颈鳞状细胞癌、肾细胞癌、或何杰金氏淋巴瘤。

44.权利要求40-43中任一项的方法，其进一步包括施用化学治疗剂、抗肿瘤剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、或PD-1途径抑制剂。

45.权利要求1-32中任一项的抗PD-1抗体或抗原结合部分、根据权利要求33或34的药物组合物、或根据权利要求39的双特异性结合分子在制备药物中的用途，所述药物用于在患者中增强免疫力。

46.权利要求1-32中任一项的抗PD-1抗体或抗原结合部分、根据权利要求33或34的药物组合物、或根据权利要求39的双特异性结合分子在制备药物中的用途，所述药物用于在患者中治疗癌症。

47.权利要求46的用途，其中所述癌症是源于选自下组的组织：皮肤、肺、肠、卵巢、脑、前列腺、肾脏、软组织、造血系统、头和颈、肝脏、膀胱、乳房、胃、子宫和胰脏。

48.权利要求46的用途，其中所述癌症选自晚期或转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌、头颈鳞状细胞癌、肾细胞癌、或何杰金氏淋巴瘤。

49.权利要求45-48中任一项的用途，其中所述药物进一步包含化学治疗剂、抗肿瘤剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、或PD-1途径抑制剂。

50.权利要求1-32中任一项的抗PD-1抗体或抗原结合部分、根据权利要求33或34的药物组合物、或根据权利要求39的双特异性结合分子，用于在有此需要的患者中增强免疫力。

51.权利要求1-32中任一项的抗PD-1抗体或抗原结合部分、根据权利要求33或34的药物组合物、或根据权利要求39的双特异性结合分子，用于治疗患者中的癌症。

52.根据权利要求51使用的抗体或抗原结合部分、药物组合物、或双特异性结合分子，其中所述癌症是源于选自下组的组织：皮肤、肺、肠、卵巢、脑、前列腺、肾脏、软组织、造血系统、头和颈、肝脏、膀胱、乳房、胃、子宫和胰脏。

53.根据权利要求51使用的抗体或抗原结合部分、药物组合物、或双特异性结合分子，其中所述癌症选自晚期或转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌、头颈鳞状细胞癌、肾细胞癌、或何杰金氏淋巴瘤。

54.根据权利要求50-53使用的抗体或抗原结合部分、药物组合物、或双特异性结合分子，其中所述抗体或抗原结合部分、药物组合物、或双特异性结合分子与化学治疗剂、抗肿瘤剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、或PD-1途径抑制剂一起施用。