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CN108264539B - 一种抗菌肽rl-18及其应用 - Google Patents

一种抗菌肽rl-18及其应用 Download PDF

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CN108264539B
CN108264539B CN201711459010.1A CN201711459010A CN108264539B CN 108264539 B CN108264539 B CN 108264539B CN 201711459010 A CN201711459010 A CN 201711459010A CN 108264539 B CN108264539 B CN 108264539B
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antimicrobial
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徐彦召
孙亚伟
张慧辉
王磊
王青
夏小静
李�杰
朱慧丽
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YUNNAN YUXI CITY HONGYUN CHEMICAL Co.,Ltd.
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Abstract

本发明公开了一种抗菌肽RL‑18，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1，抗菌肽RL‑18的分子量为2139.615Da，等电点为12.4。所述的抗菌肽RL‑18采用自动多肽合成仪按照常规多肽固相合成法合成。本发明的抗菌肽RL‑18对革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌)、革兰阴性菌(大肠杆菌、沙门菌)、真菌(白色念珠菌)都有高效的抗菌活性，抗菌作用快，具有低溶血性、良好耐盐性和耐热性，不产生耐药性。因此，本发明的抗菌肽RL‑18在制备抗感染药物、畜牧业发展、人类疾病预防与治疗、洗涤化妆品等方面具有广阔的应用前景。

Description

一种抗菌肽RL-18及其应用
技术领域
本发明属于抗菌肽研究技术领域，具体涉及一种抗菌肽RL-18及其应用。
背景技术
自弗莱明发现青霉素以来，抗生素(Antibiotics)类药物是人类治疗感染性疾病常用的一类药物，显著提高了人类的生活质量，挽救了无数人和动物的生命。但是，抗生素的不正确使用(如大量使用、滥用)所致病原微生物的耐药性不断产生、抗生素残留危害事件频发，给临床疾病诊断提出了巨大挑战，严重威胁着人类健康，并影响着畜牧业发展。寻找新抗菌药物成为解决抗生素耐药和残留的重要途径。抗菌肽是一种非常有前景的抗生素替代品。抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是一种小分子多肽，具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤、免疫调节、中和内毒素等多种生物学活性。抗菌肽可由宿主基因编码，或可根据抗菌肽的特征进行人工改造与设计。因分子量小、热稳定性好、水溶性好、抗菌谱广、不易形成耐药性等特性，抗菌肽被认为是抗生素的最佳替代品。
抗菌肽的研究已经得到人们的广泛关注，成为生物制药领域的热点。权威的抗菌肽数据库APD3(http://aps.unmc.edu/AP/main.php)已收录2878条抗菌肽序列(截至2017.12.22)。目前，已有许多抗菌肽被制备成药物。抗菌肽的来源主要包括生物体分离鉴定和人工设计与改造。生物体分离鉴定可以获得天然来源的抗菌肽，但其产量低、活性不够理想。而抗菌肽的人工设计与改造是获得抗菌肽的快速、有效途径，已经成为抗菌肽开发的一个重要内容。因此，获得结构简单、抗菌活性高、制备容易的抗菌肽是抗菌肽开发研究中迫切的需求。本发明根据抗菌肽的理化特性(主要是离子性、疏水性、二级结构等)与构效关系(主要是抑菌活性)，发明了一种抗菌肽RL-18。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗菌肽RL-18及其应用。本发明的抗菌肽RL-18对革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌)、革兰阴性菌(大肠杆菌、沙门菌)和真菌(白色念珠菌)都有较好的抗菌活性，抗菌作用快，具有低溶血性，耐热、耐盐。因此，本发明的抗菌肽RL-18在制备抗感染药物、畜牧业发展、人类疾病预防与治疗、食品防腐、洗涤剂、化妆品等方面具有广阔的应用前景。
为实现发明目的，本发明采用的技术方案为：
本发明提供了一种抗菌肽RL-18，所述抗菌肽RL-18的氨基酸序列如下：
精氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-组氨酸-丝氨酸-亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸-苏氨酸-亮氨酸-丙氨酸-丝氨酸-精氨酸-亮氨酸(SEQ ID NO.1)。
根据上述的抗菌肽RL-18，所述抗菌肽RL-18有18个氨基酸残基，其分子量为2139.615Da，等电点为12.4。
本发明所述的抗菌肽RL-18可用于制备治疗革兰阳性菌、革兰阴性菌或/和真菌感染的药物。所述药物包含上述抗菌肽RL-18，并混合有一种或一种以上医药上可接受的载体和/或添加剂。
本发明所述的抗菌肽RL-18还可用于制备饲料添加剂、消毒剂、防腐剂、洗涤剂或化妆品添加剂。
本发明所述的抗菌肽RL-18采用自动多肽合成仪按照常规多肽固相化学合成法合成，合成方向为从C端到N端，其合成的详细步骤为：
a、溶涨树脂：将Fmoc-Leu-Wang resin树脂加入自动多肽合成仪反应器内，并加入二甲基甲酰胺DMF进行溶涨，1gFmoc-Leu-Wang resinin树脂加入DMF的量约为12mL(DMF应完全浸没树脂)，溶涨时间为10～30min，溶涨可重复1～2次；
b、脱保护：树脂溶涨后，将储罐内20％哌啶(20％哌啶是将哌啶溶于二甲基甲酰胺DMF中配制而成的)加入到反应器内，浸没树脂(1gFmoc-Leu-Wang resinin树脂需要加入20％哌啶约为10mL)，使溶涨后的树脂脱保护，时间约为30min，然后加入二甲基甲酰胺DMF进行洗涤；
c、缩合反应：接着按照抗菌肽RL-18氨基酸序列的排序加入第二种氨基酸精氨酸Fmoc-Arg，并加入缩合剂HCTU(6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯)和催化剂NMM(N-甲基吗啡啉)或DIEA(N,N二异丙基乙胺)进行缩合反应；反应结束后加入二甲基甲酰胺DMF进行反复洗涤，除去未反应的氨基酸；所述精氨酸与Fmoc-Leu-Wang resinin树脂的摩尔比为5:1；所述缩合剂HCTU与亮氨酸Fmoc-Leu之间的摩尔比为1:1；所述催化剂NMM或DIEA与亮氨酸二者之间的摩尔比为4:1；
洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依照上述步骤c同样方法依次加入Fmoc-Ser、Fmoc-Ala、Fmoc-Leu、Fmoc-Thr、Fmoc-Lys、Fmoc-Leu、Fmoc-Leu、Fmoc-Ser、Fmoc-His、Fmoc-Ser、Fmoc-Leu、Fmoc-Leu、Fmoc-Lys、Fmoc-Phe、Fmoc-Arg和Fmoc-Arg进行缩合反应、洗涤，最后一个缩合反应、洗涤后，得到多肽产物；每次缩合反应、洗涤后所得产物均按照步骤b的方法进行脱保护、洗涤，然后加入下一个氨基酸进行缩合反应、洗涤(每次缩合反应中，所加入氨基酸与Fmoc-Leu-Wang resinin树脂的摩尔比均为5:1；所述缩合剂HCTU与每种所加氨基酸二者之间的摩尔比均为1:1；所述催化剂NMM或DIEA与每种所加氨基酸二者之间的摩尔比均为4:1)；
d、多肽产物的脱保护和裂解：在步骤c所得多肽产物中加入20％哌啶到反应器内，并浸没多肽产物(对1g树脂进行脱保护所用20％哌啶的量约为10mL)，使其对多肽产物进行脱保护；脱保护后，依次加入二甲基甲酰胺DMF、二氯甲烷DCM进行反复洗涤；洗涤后，加入三氟乙酸TFA进行裂解(对1g树脂进行裂解所用TFA的体积约为20mL)，使多肽从树脂上裂解下来；对裂解后的产物进行过滤(用砂心漏斗进行过滤)，得到滤液；
e、沉淀合成多肽：用冷乙醚对所得滤液进行洗涤、离心，以沉淀合成多肽，其过程为：在步骤d得到的滤液中加入其3倍体积的冷乙醚(预先保存于4℃)，密封后颠倒混匀，冰浴10min，在4000r/m下离心10min，弃上清液体，回收沉淀；用冷乙醚重悬沉淀，重复上述步骤三次，之后将所得沉淀干燥12～16h，得到合成肽粗品；
f、合成肽粗品的纯化：采用半制备型高效液相色谱仪P2000对合成肽粗品进行过柱纯化，收集纯度≥95％的馏分，即得到纯化后的抗菌肽RL-18，其纯度≥95％。
半制备型高效液相色谱仪为P2000是由北京沃华创新科技有限公司提供，色谱柱为C18反相柱(4.6*250mm)，流动相A为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液(0.1mL三氟乙酸溶于100mL乙腈溶液中)，流动相B为0.1％的三氟乙酸水溶液(0.1mL三氟乙酸溶于100mL去离子水中)，使用上述处理柱，上样后25min内，流动相A的比例由27％逐步调至52％，流动相B的比例由73％逐步调至48％，25.1min时，流动相A的比例变为100％，流动相B的比例变为0％，以1mL/min的流速进行30min的分离，检测波长为220nm，收集纯度≥95％的馏分(如附图1所示)；
本发明抗菌肽RL-18的确认鉴定：采用液相色谱质谱联用仪(Waters micromassZQ-2000)测定所得产品抗菌肽的分子量，经测定：RL-18分子量为2139.615Da(如附图2所示)。高效液相色谱条件：色谱柱为C18反相柱(4.6*250mm)，流动相A为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液(0.1mL三氟乙酸溶于100mL乙腈溶液中)，流动相B为0.1％的三氟乙酸水溶液(0.1mL三氟乙酸溶于100mL去离子水中)，上样后25min内，流动相A的比例由25％逐步调至50％，流动相B的比例由75％逐步调至50％，25.1min时，流动相A的比例变为100％，流动相B的比例变为0％，以1mL/min的流速进行30min的分离，检测波长为220nm。质谱测定条件：采用正离子化模式，其毛细管电压为3.00KV，毛细管出口电压50V，碎裂电压为5V，干燥气流量为1.5L/min，干燥气温度为350℃，扫描范围为400～1900m/z。
本发明具有的积极有益效果：
本发明的抗菌肽RL-18由18个氨基酸组成，对革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌)、革兰阴性菌(大肠杆菌、沙门菌)和真菌(白色念珠菌)都有抗菌活性，抗菌作用快，抗菌活性强，具有低溶血性，耐热性和耐盐性好，不产生耐药性。因此，本发明的抗菌肽RL-18在制备抗感染药物、畜牧业发展、人类疾病治疗方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明抗菌肽RL-18的高效液相色谱图。
图2为本发明抗菌肽RL-18的质谱图。
图3为抗菌肽RL-18的等电点分析结果。
图4为抗菌肽RL-18对大肠杆菌CVCC2059最小抑菌浓度测定结果。
图5为抗菌肽RL-18对沙门菌CVCC3376最小抑菌浓度测定结果。
图6为抗菌肽RL-18对金黄色葡萄球菌ATCC6538最小抑菌浓度测定结果。
图7为抗菌肽RL-18对白色念珠菌ATCC10231最小抑菌浓度测定结果。
图8为抗菌肽RL-18对大肠杆菌临床耐药株最小抑菌浓度测定结果。
图9为抗菌肽RL-18的溶血率测定结果。
图10为抗菌肽RL-18的耐热性测定结果。
图11为抗菌肽RL-18的耐盐性测定结果。
具体实施方式
以下结合具体的实施例对本发明作进一步详细的说明，但并不限制本发明的范围。
实施例1：
一种抗菌肽RL-18，其氨基酸序列如下：
精氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-组氨酸-丝氨酸-亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸-苏氨酸-亮氨酸-丙氨酸-丝氨酸-精氨酸-亮氨酸(SEQ ID NO.1)。
该抗菌肽RL-18含有18个氨基酸残基，其分子量为2139.615Da，等电点为12.4。所述抗菌肽RL-18带正电荷，可吸引细菌表面的负电荷。
本实施例抗菌肽RL-18是采用自动多肽合成仪按照常规多肽固相化学合成法合成，最终合成抗菌肽RL-18经半制备型高效液相色谱仪进行纯化分析处理，其纯度≥95％。
本发明所得抗菌肽RL-18产品的鉴定：
(1)分子量的测定：采用分析型液相色谱质谱联用仪(Waters micromass ZQ-2000)测定所得抗菌肽RL-18的分子量，经测定，其分子量为2139.615Da，结果如附图2所示。
具体的检测条件为：①色谱条件为：色谱柱为C18反相柱(4.6*250mm)，流动相A为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液(0.1mL三氟乙酸溶于100mL乙腈溶液中)，流动相B为0.1％的三氟乙酸水溶液(0.1mL三氟乙酸溶于100mL去离子水中)，上样后25min内，流动相A的比例由25％逐步调至50％，流动相B的比例由75％逐步调至50％，25.1min时，流动相A的比例变为100％，流动相B的比例变为0％，以1mL/min的流速进行30min的分离，检测波长为220nm。②质谱测定条件：采用正离子化模式，其毛细管电压为3.00KV，毛细管出口电压50V，碎裂电压为5V，干燥气流量为1.5L/min，干燥气温度为350℃，扫描范围为400～1900m/z。
(2)氨基酸序列结构测定：采用自动氨基酸测序仪测定抗菌肽RL-18的氨基酸序列结构。经测定，抗菌肽RL-18含有18个氨基酸残基，其氨基酸序列为：精氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-组氨酸-丝氨酸-亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸-苏氨酸-亮氨酸-丙氨酸-丝氨酸-精氨酸-亮氨酸。
(3)等电点分析：
打开DNAStar软件中的EditSeq，打开file，点击“new”中的“new protein”，输入抗菌肽RL-18的氨基酸序列，另存为pro格式的文档。然后再打开DNAStar软件中的Protean，打开file，点击“open”，选择刚保存为pro格式的文档，点击“打开”，选择“Analysis”中的“Titration Curve”，即可以获得等电点数据，结果见图3。经测定，本发明抗菌肽RL-18的等电点为12.4。
实施例2：本发明抗菌肽RL-18的应用实施
1、抗菌肽RL-18的抑菌活性分析
采用琼脂平板扩散法测定抗菌肽RL-18的抑菌活性，其受试微生物菌株为：大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌，大肠杆菌CVCC2059、金黄色葡萄球菌ATCC6538和白色念珠菌ATCC10231购自南京便诊生物科技有限公司，沙门菌CVCC3776购置中国兽医微生物菌种保藏管理中心，大肠杆菌临床耐药株(分离自腹泻仔猪，经药敏试验和16S rRNA测序鉴定)。
将上述受试微生物(1×106CFU/mL)分别稀释于50℃的底层培养基(TSB 0.3g，超纯的琼脂糖0.1g，加超纯水至10ml，pH 7.4)中，倒灭菌平板，凝固，用打孔器打孔(孔径约3mm)，酒精灯稍加热进行封底，用移液器向每孔中加入5μL抗菌肽(1mg/mL)，每个平板包括阳性对照和阴性对照。阳性对照：庆大霉素针对革兰阴性菌和革兰阳性菌，氟康唑针对真菌；阴性对照：PBS缓冲液。将平板静置1h，使测试液扩散入琼脂糖中。然后，再添加上层覆盖培养基(TSB 0.3g，超纯的琼脂糖0.1g，加超纯水至10ml，pH 7.4，50℃左右)。将培养平板在37℃倒置培养过夜，然后记录孔周边的透明圈的直径，每个菌种重复测定三次，计算平均值。
表1抗菌肽RL-18的抑菌活性分析结果
Figure BDA0001529859590000071
注：A表示该菌株对庆大霉素耐药，其所用的阳性对照药物不是庆大霉素，而是一种类Bac5抗菌肽，专利申请号：201710643182.8。
由表1抗菌活性检测结果显示，本发明的抗菌肽RL-18对大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌均有较高的抗菌活性，而且对大肠杆菌临床耐药株也有较高对抗菌活性。因此，本发明的抗菌肽RL-18可望在制备治疗动物和人细菌性疾病的药物方面有着很好的应用前景，同时，根据已知抗菌肽的一般特性，抗菌肽RL-18在饲料添加剂、消毒剂、防腐剂、洗涤剂或化妆品添加剂等方面有良好的应用愿景。
2、抗菌肽RL-18的最小抑菌浓度(MIC)测定
受试微生物菌株为：大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌，大肠杆菌CVCC2059、金黄色葡萄球菌ATCC6538和白色念珠菌ATCC10231购自南京便诊生物科技有限公司，沙门菌CVCC3776购置中国兽医微生物菌种保藏管理中心，大肠杆菌临床耐药株大肠杆菌临床耐药株(分离自腹泻仔猪，经药敏试验和16S rRNA测序鉴定)。
将受试菌株在TSB液体培养基中扩大培养，测菌液的OD600值。当OD值在0.6-0.8时，将菌液在6000r/min条件下离心10min，弃去上清，收集菌体沉淀，将菌体沉淀用等体积的PBS缓冲液(0.01M)重悬，再用MH培养基将细菌悬液稀释到2×106CFU/mL。用去离子水稀释抗菌肽RL-18样品，使其浓度为0.78-1200μg/mL。在96孔细胞培养板中，每孔分别添加50μL不同浓度的抗菌肽RL-18和50μL稀释的细菌溶液，每个浓度重复三孔，置于37℃培养16-18h，然后混匀每孔中的溶液，测定其OD600值，以OD值突然变化对应的抗菌肽RL-18浓度为其MIC，结果见图4、图5、图6、图7和图8。
由图4、图5、图6、图7和图8可知，抗菌肽RL-18对大肠杆菌CVCC2059的最小抑菌浓度(MIC)为12.5μg/mL，对沙门菌CVCC3776的最小抑菌浓度(MIC)为12.5μg/mL，对金黄色葡萄球菌ATCC6538的最小抑菌浓度(MIC)均为400μg/mL，对白色念珠菌ATCC10231的最小抑菌浓度(MIC)均为200μg/mL，对大肠杆菌临床耐药株的最小抑菌浓度(MIC)均为50μg/mL。结果表明，该抗菌肽RL-18对常见的细菌的最小抑菌浓度均达到微克级，对大肠杆菌临床耐药株的最小抑菌浓度也达到微克级，由此说明，本发明的抗菌肽RL-18具有极强的抑菌活力。
3、抗菌肽RL-18的溶血性分析
取新鲜鸡血液，用3.8％柠檬酸钠抗凝，将抗凝血经3000r/min离心10min，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤沉淀3次，至上清为无色、透明，再用PBS配制1％红细胞。用PBS将抗菌肽RL-18的浓度调整为0.39-400μg/mL，加入等体积的红细胞悬液。以PBS为阴性对照，以1％Tritonx-100为阳性对照，37℃作用1h，1500r/min离心10min，将上清液依次加入96孔板，用酶标仪测540nm处的OD值。然后根据计算公式溶血率(％)＝(检测孔OD值-阴性孔OD值)/(阳性孔OD值-阴性孔OD值)×100％计算抗菌肽RL-18的溶血率，其结果见图9。
由图9可知，在最小抑菌浓度(MIC)条件下，抗菌肽RL-18的溶血率均低于50％，说明抗菌肽RL-18有较好的安全性，临床应用前景大。
4、抗菌肽RL-18的耐热性分析
将浓度为1mg/mL的抗菌肽RL-18溶液分别置于0℃、25℃、50℃、75℃、100℃条件下作用30min；然后按实施例2中抑菌活性分析的方法对五种不同温度下处理后的抗菌肽RL-18溶液进行抑菌活性(按上述的琼脂平板扩散法分析抑菌活性)，受试微生物菌株为大肠杆菌CVCC2059，结果见图10。
由图10可知，随着温度的升高，抗菌肽RL-18对大肠杆菌的抗菌活性逐渐降低，但经高温(70℃和100℃)的处理，抗菌肽RL-18仍具有较好的抗菌活性。由此表明，抗菌肽RL-18具有较好的耐热性能。
5、抗菌肽RL-18的耐盐稳定性分析
将浓度为1mg/mL的抗菌肽RL-18溶液分装10份，编号1～10，分别向编号为1～5号的抗菌肽RL-18溶液中加入氯化钠，使得1～5号的抗菌肽RL-18溶液中氯化钠的终浓度分别为50、100、150、200、250mM；向编号为6～10号的抗菌肽RL-18溶液中加入氯化钠钾，使得6～10号的抗菌肽RL-18溶液中氯化钾的终浓度分别为50、100、150、200、250mM，将编号1～10号的抗菌肽RL-18溶液在室温条件下放置30min；然后按上述的琼脂平板扩散法测定编号为1～10的抗菌肽RL-18的抑菌活性，受试微生物为大肠杆菌CVCC2059。
由图11可知，随着盐离子浓度的升高，抗菌肽RL-18对大肠杆菌的抗菌活性有所降低，但高浓度(高于生理浓度)时，抗菌肽RL-18仍具有较好的抗菌活性。这表明，抗菌肽RL-18具有较好的耐盐性能。
综上所述，本发明抗菌肽RL-18产品呈低溶血性、抗菌谱广，有良好的耐热、耐盐性能，对革兰阴性菌、革兰阳性菌和真菌都具有高效的抗菌作用，特别是对临床耐药菌也具有较好的抗菌活性。所以，本发明产品抗菌肽RL-18在制备治疗革兰阳性菌、革兰阴性菌和真菌所致疾病的药物中能够得到较好的应用，而且，还可用于制备饲料添加剂、消毒剂、防腐剂、洗涤剂或化妆品添加剂。
序列表
<110> 河南科技学院
<120> 一种抗菌肽RL-18及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Arg Phe Lys Leu Leu Ser His Ser Leu Leu Lys Thr Leu Ala Ser
1 5 10 15
Arg Leu

Claims (4)

1.一种抗菌肽RL-18，其特征在于，所述抗菌肽RL-18的氨基酸序列如下：
精氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-组氨酸-丝氨酸-亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸-苏氨酸-亮氨酸-丙氨酸-丝氨酸-精氨酸-亮氨酸。
2.一种权利要求1所述抗菌肽RL-18的用途，其特征在于，所述用途为：抗菌肽RL-18在制备治疗革兰阳性菌、革兰阴性菌或/和真菌感染的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物包含抗菌肽RL-18，并混合有一种或一种以上医药上可接受的载体和/或添加剂。
4.一种权利要求1所述的抗菌肽RL-18在制备饲料添加剂、消毒剂、防腐剂、洗涤剂或化妆品添加剂中的应用。
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