CN108251420B

CN108251420B - 抑制人和动物中CTGF基因表达的siRNA、包含其的组合物及其应用

Info

Publication number: CN108251420B
Application number: CN201611237630.6A
Authority: CN
Inventors: 张鸿雁; 高山
Original assignee: Suzhou Ruibo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Ruibo Biotechnology Co ltd
Priority date: 2016-12-28
Filing date: 2016-12-28
Publication date: 2024-08-02
Anticipated expiration: 2036-12-28
Also published as: CN108251420A

Abstract

本发明提供了能够抑制人和动物中CTGF基因表达的siRNA分子、药物组合物及其应用。所述siRNA为双链结构，包括完全互补的正义链和反义链，其中所述正义链含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。本发明提供的siRNA分子能够长效地抑制人和动物中CTGF基因的表达，治疗或改善肝纤维化以及与其相关的肝脏疾病，且在体内的稳定性高。

Description

抑制人和动物中CTGF基因表达的siRNA、包含其的组合物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种siRNA、一种药物组合物及其应用；具体地，涉及能够抑制人和动物中CTGF基因表达的siRNA分子、含有该siRNA分子的药物组合物及其应用。

背景技术

肝纤维化是指肝脏内弥漫性细胞外基质(ECM)的过度沉积，是继发于各种形式慢性肝损伤之后的组织修复过程中的代偿反应，也是慢性肝病发展为肝硬化、肝癌等严重致死性疾病的必经病变过程，所以抗肝纤维化成为慢性肝病治疗的重中之重。

目前治疗肝纤维化的手段非常有限，主要包括两大方面：一是针对原发病去除致病因素，如抗病毒、戒酒等；二是针对肝纤维化本身的治疗，如通过抑制炎症或脂质过氧化，或者抑制肝星状细胞(HSC)的增殖活化，以及促进胶原降解等。临床药物中，使用干扰素抑制星状细胞的激活和增殖细胞外基质的表达，使用拉米夫定抑制HBV DNA的复制，使用秋水仙碱和水飞蓟素干扰细胞的胶原分泌。但这些药物对肝纤维化的治疗效果不确切，对肝纤维化患者生存率也无明显改善，而副作用发生率却明显增加。

结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)是一种新发现的可刺激成纤维细胞增殖和胶原沉积的生长因子，可由成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞合成分泌。成年哺乳动物心、脑、肾、肺、肝、胎盘中均有表达，如广泛表达于人类多种组织器官中。在病理情况下，其过度表达与某些增生性或纤维化疾病的发生发展密切相关，如硬皮病、肾纤维化、肝硬化、肺纤维化、动脉粥样硬化等。

CTGF是TGF-β下游的靶基因。在胚胎发育、软骨形成以及创伤修复过程中，CTGF具有一定的生理作用，被认为是启动间充质转化(EMT)及肝损伤修复的“总开关”，决定慢性肝损伤是再生修复还是纤维化修复。CTGF参与肝纤维化的生物学作用主要表现在如下几个方面：(1)在其他细胞因子的协同下刺激细胞外基质(ECM)的合成，抑制其降解，导致ECM的积聚及结构改建；(2)介导细胞黏附；(3)促进细胞趋化效应，在体外能趋化成纤维细胞；(4)通过改变TGF-β/BMP-7的比例，促进EMT的发生。TGF-β可能在肝纤维化起始阶段起关键作用，而持续的CTGF高表达才是肝纤维化得以形成和发展的主要原因。

设计针对CTGF基因的siRNA，抑制纤维化肝脏组织的CTGF的表达，可以作为治疗和预防肝纤维化和肝硬化的有效手段。然而迄今为止，用于治疗与CTGF基因表达相关的疾病的siRNA药物临床应用进展缓慢，其中，siRNA本身的活性和在血液中的稳定性较差，是影响该类药物进展缓慢的原因之一。此外，siRNA针对不同物种的靶核酸存在物种间差异，一定程度上阻碍了siRNA药物研发进程。因此，迫切需要开发一种具有潜在临床应用价值的，具有良好稳定性和生物活性的，同时在多物种中高度同源的，用于治疗与CTGF基因表达相关的疾病的siRNA和含siRNA的药物组合物。

发明内容

本发明提供具有良好生物活性和潜在临床应用价值的，用于治疗与CTGF基因表达相关的疾病的siRNA和含siRNA的药物组合物及其应用。特别是提供具有良好生物活性、稳定性和潜在临床应用价值的，用于治疗与CTGF基因表达相关的疾病的siRNA和含siRNA的药物组合物及其应用。

第一方面，本发明提供了一种能够特异性靶向CTGF的siRNA，所述siRNA为双链结构，包括完全互补的正义链和反义链，其中所述正义链含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，其中，

正义链：5’-ACAUUAAGAAGGGCAAAAA-3’(SEQ ID NO:1)，

反义链：5’-UUUUUGCCCUUCUUAAUGU-3’(SEQ ID NO:2)。

第二方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物含有本发明提供的siRNA以及药学上可接受的载体；所述siRNA与药学上可接受的载体的重量比为1:(1-500)，优选为1:(1-50)。

第三方面，本发明还提供了本发明的siRNA和/或药物组合物在制备用于治疗或改善与CTGF基因表达相关的疾病的药物中的应用。

第四方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒含有本发明提供的siRNA和/或药物组合物。

第五方面，本发明提供了一种治疗或改善纤维化病症的方法，该方法包括将本发明提供的siRNA和/或药物组合物给予有需要的患者。

第六方面，本发明提供了一种抑制CTGF基因在细胞中表达的方法，该方法包括将本发明提供的siRNA和/或药物组合物导入所述细胞。

本发明提供的siRNA具有良好的活性，在细胞水平上，50nM的siRNA对CTGF mRNA的抑制率高达80％。本发明提供的修饰的siRNA分子活性保持不变，同时能够在血液中稳定存在72小时以上。

特别需要说明的是，本发明提供的siRNA在不同物种中具有高度同源性。由于这种高度同源性，一方面，在不同物种间的试验可以采用相同序列的siRNA及其药物组合物，减少根据不同动物的基因构成而合成不同序列siRNA的过程，可以大大缩短动物实验进程，快速进入临床试验；另一方面，也避免采用不同序列siRNA所带来的对相应动物CTGF mRNA抑制效率、稳定性的不确定性，从而可以加速药物研发进程。

本发明提供的药物组合物在动物体内可以有效地抑制CTGF mRNA的表达，从而抑制或改善肝纤维化的发展进程。特别地，通过将由含胺化合物、辅助脂质、聚乙二醇化脂质这三种组分形成的脂质混合物用作药学上可接受的载体与本发明的siRNA形成药物组合物，可将本发明的siRNA特异性地递送至肝脏，并表现出显著的mRNA抑制作用：在TAA诱导的肝纤维化小鼠模型上，本发明的药物组合物对肝脏CTGF mRNA的表达抑制效率最高可达70％，肝纤维化病理国际评分显示模型鼠的纤维化症状得到了有效的改善。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式中予以详细说明。

附图说明

图1：siRNA CT修饰前后的血清稳定性电泳图；

图2：RBP131/CTM1、RBP131/CTM2和RBP131/CTM3药物组合物在TAA肝纤维化模型小鼠体内对肝组织中CTGF mRNA的抑制效率；

图3：根据肝纤维化病理国际评分标准进行专家打分，评估RBP131/CTM1、RBP131/CTM2和RBP131/CTM3药物组合物在TAA肝纤维化模型小鼠体内对肝纤维化的治疗效果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

1、siRNA

本发明中使用的CTGF基因的mRNA序列为Genebank注册号：NM_001901.2所示的序列。

本发明提供了一种siRNA，所述siRNA为双链结构，包括完全互补的正义链和反义链，其中所述正义链含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，其中，

正义链：5’-ACAUUAAGAAGGGCAAAAA-3’(SEQ ID NO:1)，

反义链：5’-UUUUUGCCCUUCUUAAUGU-3’(SEQ ID NO:2)。

为了增强siRNA双链的稳定性，按照本发明的一个实施方式，所述正义链和所述反义链中至少一条单链的3’末端还连接有1至3个额外核苷酸，从而在所述正义链和所述反义链互补配对后形成至少一个由1至3个核苷酸构成的3’突出端；优选地，所述3’突出端为连续的2个脱氧胸腺嘧啶核苷酸dTdT或尿嘧啶核苷酸UU；优选地，所述正义链和所述反义链都含有3’突出端。

在具体实施方式中，含有3’突出端的siRNA为siRNA CT，其正义链和反义链序列分别为：

正义链：5’-ACAUUAAGAAGGGCAAAAAdTdT-3’(SEQ ID NO:3)；

反义链：5’-UUUUUGCCCUUCUUAAUGUdTdT-3’(SEQ ID NO:4)。

为了进一步提高siRNA在血液中的稳定性，避免在体内遭到核酸酶降解，按照本发明的一个实施方式，所述正义链和所述反义链中的至少一条单链中的至少一个核苷酸为含有修饰基团的核苷酸，所述修饰基团可以是现有的各种起到提高siRNA稳定性的修饰基团。这些修饰方式可参见Watts,J.K.,G.F.Deleavey,and M.J.Damha,Chemically modifiedsiRNA:tools and applications.Drug Discov Today,2008.13(19-20):p.842-55。

在本发明的一些实施方式中，本发明提供的siRNA为含有如下修饰基团中的至少一种的siRNA：1)所述相互互补的所述正义链和所述反义链中的至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基中的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基，2)所述相互互补的所述正义链和所述反义链中的至少一条单链的磷酸-糖骨架中的核糖基中的至少一部分为具有修饰基团的核糖基。优选情况下，具有修饰基团的核糖基为2’-羟基被甲氧基取代而成的2’-甲氧基核糖基或者为2’-羟基被氟取代而成的2’-氟代核糖基；具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的一个氧原子被硫原子取代而成的硫代磷酸酯基；所述硫代磷酸酯基结构如式VI所示：

按照本发明的一个具体实施方式，本发明提供的siRNA为以下三种siRNA中的任意一种：

CTM1：

正义链为：5’-ACmAUUmAAGAAGGGCmAAAAA-dT-s-dT-3’，

反义链为：5’-UUmUUUfGCCCUUCUUfAAUfGU-dT-s-dT-3’；

CTM2：

正义链为：5’-ACmAUUmAAGAAGGGCmAAAAA-dT-s-dT-3’，

反义链为：5’-UUmUUUfGCCCfUUCUUfAAUfGU-dT-s-dT-3’；

CTM3：

正义链为：5’-ACmAUUmAAGAAGGGCmAAAAA-dT-s-dT-3’，

反义链为：5’-UUmUUfUfGCfCCfUUCUfUfAAUfGU-dT-s-dT-3’；

其中，小写字母m表示该字母左侧的一个核苷酸的核糖基团为2’-甲氧基核糖基；小写字母f表示该字母左侧的一个核苷酸的核糖基团为2’-氟代核糖基；小写字母d表示该字母右侧的一个核苷酸为脱氧核糖核苷酸；小写字母s表示该字母两侧的脱氧核糖核苷酸之间磷酸酯基为硫代磷酸酯基。

本领域技术人员清楚知晓的是，可以通过本领域常规的siRNA制备方法(例如固相合成和液相合成)得到本发明所述的siRNA。其中，固相合成已经有商业化订制服务，苏州瑞博生物技术有限公司也具有此类固相合成能力。可以通过使用具有相应修饰的核苷酸单体将修饰的核苷酸引入本发明所述的siRNA中，制备具有相应修饰的核苷酸单体的方法及将修饰的核苷酸引入siRNA的方法也是本领域技术人员所熟知的。

2、组合物

本发明的药物组合物含有本发明所述的siRNA和药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可以是siRNA给药领域常规使用的载体，例如但不限于磁性纳米粒(magnetic nanoparticles，如Fe₃O₄、Fe₂O₃)、碳纳米管(carbon nanotubes)、介孔硅(mesoporous silicon)、磷酸钙纳米粒(calcium phosphate nanoparticles)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)、聚酰胺胺型树形高分子(polyamidoamine(PAMAM)dendrimer)、聚L-赖氨酸(poly(L-lysine)，PLL)、壳聚糖(chitosan)、1,2-二油酰基-3-三甲铵丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP)、聚D型或L型乳酸/羟基乙酸共聚物(poly(D&L-lactic/glycolic acid)copolymer，PLGA)、聚(2-氨乙基乙撑磷酸酯)(poly(2-aminoethyl ethylene phosphate)，PPEEA)和聚(甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯)(poly(2-dimethylaminoethyl methacrylate)，PDMAEMA)以及它们的衍生物等。在本发明的药物组合物中，对siRNA和药学上可接受的载体的含量没有特别要求，一般地，siRNA与药学上可接受的载体的重量比为1:(1-500)，优选为1:(1-50)。

在本发明的药物组合物中，还可以包含药学上可接受的其它辅料，该辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种。例如，所述药学上可接受的其它辅料可以包括pH值缓冲液、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。所述pH值缓冲液可以为pH值7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液和/或pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液，优选为pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液。所述保护剂可以为肌醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖和葡糖糖中的至少一种。以所述药物组合物的总重量为基准，所述保护剂的含量可以为0.01-30重量％。所述渗透压调节剂可以为氯化钠和/或氯化钾。所述渗透压调节剂的含量使所述药物组合物的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克。根据所需渗透压，本领域技术人员可以容易地确定所述渗透压调节剂的含量。

根据本发明的一些实施方式，所述药物组合物可以为液体制剂，例如注射液；也可以为冻干粉针剂，实施给药时与液体辅料混合，配制成液体制剂。所述液体制剂可以但不限于用于皮下、肌肉或静脉注射给药，也可以但不限于通过喷雾给药到肺脏、或通过喷雾经肺脏给药到其它脏器组织(如肝脏)。优选地，所述药物组合物用于静脉注射给药。

在本发明的药物组合物的一个优选实施方式中，所述药物组合物可以为脂质体制剂的形式。在一个更优选的实施方式中，所述脂质体制剂中使用的药学上可接受的载体包含含胺化合物、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质。其中，所述含胺化合物、辅助脂质和聚乙二醇化脂质可分别选自于CN201180060664.1(通过引用将其整体并入本文)中所描述的含胺的转染化合物或其药学上可接受的盐或衍生物、辅助脂质和聚乙二醇化脂质中的一种或多种。

具体而言，所述含胺化合物可为CN201180060664.1中描述的如下式I所示的化合物或其药学上可接受的盐：

式I，

其中：

X₁和X₂各自独立地是O、S、N-A或C-A，其中A是氢或C₁-C₂₀烃链；

Y和Z各自独立地是C＝O、C＝S、S＝O、CH-OH或SO₂；

R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆和R₇各自独立地是氢，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链脂族基团，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链杂脂族基团，被取代的或未被取代的、支链或直链酰基，被取代的或未被取代的、支链或直链芳基，被取代的或未被取代的、支链或直链杂芳基；

x是1-10的整数；

n是1-3的整数，m是0-20的整数，p是0或1，其中，如果m＝p＝0，那么R₂是氢，

并且，如果n或m中的至少一个是2，那么R₃和在式I中的氮形成如式II或式III所示的结构：

其中，g、e和f各自独立地是1-6的整数，“HCC”代表烃链，且每个*N表示在式I中的氮原子。

在某些实施方式中，R₃是多胺。在其它实施方式中，R₃是缩酮。在某些实施方式中，在式I中的R₁和R₂中的每一个独立地是任意的被取代的或未被取代的、支链或直链烷基或烯基，所述烷基或烯基具有3至约20个碳原子，诸如8至约18个碳原子，和0至4个双键，诸如0至2个双键。

在某些实施方式中，如果n和m中的每一个独立地具有1或3的值，那么R₃和在式I中的氮可形成如式VII-式XVI所示结构中的任意一种：

其中，g、e和f各自独立地是1-6的整数，每个“HCC”代表烃链，且每个*N表示在式I中的氮原子。

其中，式I所示化合物可以根据CN201180060664.1中的描述制备。

优选地，所述含胺化合物可为CN201180060664.1中描述的含胺化合物72(记为式IV)或含胺化合物87(记为式V)，如下所示：

优选地，所述辅助脂质可以是胆固醇、胆固醇的类似物和/或胆固醇的衍生物等。

优选地，所述聚乙二醇化脂质可以是1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]，即1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]。

在本发明的药物组合物的一个更优选的实施方式中，所使用的药学上可接受的载体同时包含上文所描述的含胺化合物、辅助脂质、聚乙二醇化脂质这三种组分，这三种组分形成脂质混合物。在该优选的实施方式中，所述药物组合物中含胺化合物、辅助脂质、聚乙二醇化脂质三者之间的摩尔比为(19.7-80)：(19.7-80)：(0.3-50)。更优选地，所述药物组合物中含胺化合物、辅助脂质、聚乙二醇化脂质三者之间的摩尔比为(50-70)：(20-40)：(3-20)。

由本发明的siRNA与上述脂质混合物形成的脂质体颗粒具有约30nm至约200nm的平均直径，通常为约40nm至约135nm，更通常地，该脂质体颗粒的平均直径是约50nm至约120nm、约50nm至约100nm、约60nm至约90nm或约70nm至约90nm，例如，该脂质体颗粒的平均直径是约30、40、50、60、70、75、80、85、90、100、110、120、130、140、150或160nm。

在脂质体制剂形式的药物组合物中，本发明的siRNA与全部脂质(例如含胺化合物、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质)的重量比(重量/重量比)在从约1:1至约1:50、从约1:1至约1:30、从约1:3至约1:20、从约1:4至约1:18、从约1:5至约1:17、从约1:5至约1:15、从约1:5至约1:12、从约1:6至约1:12或从约1:6至约1:10的范围内，例如，本发明的siRNA与全部脂质的重量比为约1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17或1:18。

本发明提供的药物组合物在销售时各组分可以独立存在，在使用时可以液体制剂的形式存在。本发明提供的含有上述药学上可接受的载体形成的药物组合物可以按照已知的各种方法制备。按照本发明一个实施方式，本发明提供的药物组合物与上述脂质混合物形成的药物组合物可以根据CN201180060664.1中的描述方法制备；更优选地，可以按照如下方法制备：

将含胺化合物、辅助脂质和聚乙二醇化脂质按照上述摩尔比悬浮于醇中并混匀得到脂质溶液；醇的用量使得到的脂质溶液的总质量浓度为2-25mg/mL，优选为8-18mg/mL。所述醇选自药学上可接受的醇，诸如在室温附近为液体的醇，例如，乙醇、丙二醇、苯甲醇、甘油、聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400中的一种或多种，优选为乙醇。

将本发明提供的siRNA溶解于缓冲盐溶液中，得到siRNA水溶液。缓冲盐溶液的浓度为0.05-0.5M，优选为0.1-0.2M，调节缓冲盐溶液的pH至4.0-5.5，优选为5.0-5.2，缓冲盐溶液的用量使siRNA的浓度不超过0.6mg/mL，优选为0.2-0.4mg/mL。所述缓冲盐选自可溶性醋酸盐、可溶性柠檬酸盐中的一种或多种，优选为醋酸钠和/或醋酸钾。

将脂质溶液和siRNA水溶液混合，将混合后得到的产物在40-60℃孵育至少2分钟，优选5-30分钟，得到孵育后的脂质体制剂。脂质溶液和siRNA水溶液的体积比为1：(2-5)，优选1:3。

将孵育后的脂质体制剂浓缩或稀释，去除杂质，除菌，得到本发明提供的药物组合物，其理化参数为pH值为6.5-8，包封率不低于80％，粒径为40-200nm，多分散指数不高于0.30，渗透压为250-400mOsm/kg；优选地，pH值为7.2-7.6，包封率不低于90％，粒径为60-100nm，多分散指数不高于0.20，渗透压为300-400mOsm/kg。

其中，浓缩或稀释可以在去除杂质之前、之后或同时进行。去除杂质的方法可以采用现有各种方法，优选使用切相流系统，中空纤维柱，在100K Da条件下超滤，超滤交换溶液为pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)。除菌的方法可以采用现有各种方法，优选在0.22μm滤器上过滤除菌。

3、试剂盒

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本发明提供的siRNA和/或药物组合物。

按照本发明提供的试剂盒，siRNA、药学上可接受的载体和/或辅料可以单独存在，以其中两种或两种以上的混合物的形式存在，或者以最终药物组合物的形式存在。当药学上可接受的载体单独存在且所述载体为上述脂质混合物时，含胺化合物、辅助脂质和聚乙二醇化脂质可以各自独立存在，也可以以其中两种或三种的混合物的形式存在。在一个实施方式中，可使一个容器用于提供siRNA、另外一个或多个容器用于提供含胺化合物、辅助脂质和聚乙二醇化脂质，任选地另外一个或多个容器提供辅料。

除了siRNA和药学上可接受的载体和/或辅料以外，所述试剂盒中还可包含实现本发明提供的药物组合物的一种或多种特定应用所必需或有益的组分，如(1)一种或多种用于实现所希望的细胞转染的组分，(2)一种或多种用于实现特定疾病或身体障碍的诊断、治疗或预防的组分，如一种或多种额外的治疗化合物或组合物、一种或多种诊断试剂，(3)一种或多种缓冲剂，(4)阳性或阴性对照样品，(5)赋形剂、稳定剂或防腐剂等。一般来说，所述组分存在于与siRNA和药学上可接受的载体和/或辅料的容器均不同的容器中。此外，所述试剂盒还可包含用于将siRNA与药学上可接受的载体和/或辅料或其它成分进行混合的说明书。

在本发明提供的试剂盒中，所述siRNA和药学上可接受的载体和/或辅料可以任何形式提供，例如液体形式、干燥形式或冻干形式。优选所述siRNA和药学上可接受的载体和/或辅料基本上纯净和/或无菌。可任选地在本发明的试剂盒中提供无菌水、生理盐水、PBS中的一种或多种。

4、siRNA分子或组合物的应用

本发明提供了如上所述siRNA和/或药物组合物在制备用于治疗或改善与CTGF基因表达相关的疾病的药物中的应用。

本发明还提供了一种治疗或改善肝纤维化病症的方法，该方法包括将本发明提供的siRNA和/或药物组合物给予患有上述病症的患者，通过RNA干扰的机制达到治疗或改善与CTGF基因表达相关的疾病的目的。

本发明所述的与CTGF基因表达相关的疾病是与纤维化相关的疾病，这样的疾病具体的例子包括但不限于：肝纤维化、肾纤维化(CKD，包括ESRD)、肺纤维化(包括ILF)、腹膜纤维化、声带纤维化、肠纤维化、骨髓纤维化、心脏纤维化、与脑梗死相关的纤维化、与全部可能类型的意外或医源性(手术)皮肤损伤相关的异常瘢痕化(疤痕疙瘩)、硬皮病、青光眼滤过术失败、肠粘连、肝硬化、动脉粥样硬化或慢性肝损伤。

本发明所使用的术语“给药/给予”是指通过使得至少部分地将siRNA或药物组合物定位于期望的位点以产生期望效果的方法或途径，将siRNA或药物组合物放置入受试者体内。适于本发明方法的给药途径包括局部给药和全身给药。一般而言，局部给药导致与受试者整个身体相比将更多siRNA或药物组合物递送至特定位点；而全身给药导致将所述siRNA或药物组合物递送至受试者的基本整个身体。考虑到本发明旨在提供治疗和/或改善肝纤维化的手段，优选能够将药物递送至肝脏的给药方式。

可通过本领域已知的任何合适途径向受试者给药，所述途径包括但不仅限于：口服或胃肠外途径，包括静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药(气雾剂)、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药(包括口腔含化给药和舌下给药)。给药频率可以是每天、每周、每个月或每年1次或多次。

本发明所述的siRNA或药物组合物的使用剂量可为本领域常规的剂量，所述剂量可以根据各种参数、尤其是受试者的年龄、体重和性别来确定。可基于由细胞培养分析和动物研究得到的数据得出人用剂量的范围。

在给予本发明所述的药物组合物时，例如，对于雄性或雌性、6-8周龄、体重18-25g的C57BL/6J小鼠，通过静脉给药方式，以所述药物组合物中的siRNA的量计，其siRNA用量可以为0.001-50mg/kg体重，优选为0.01-10mg/kg体重，更优选为0.05-5mg/kg体重，最优选为0.1-3mg/kg体重。

按照本发明另外一个实施方式，本发明提供了一种抑制CTGF基因在细胞中表达的方法，该方法包括将本发明提供的siRNA和/或药物组合物导入所述细胞。通过将本发明的siRNA和/或药物组合物导入细胞，可以通过RNA干扰的机制达到抑制CTGF基因的表达这一目的。所述细胞为成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞等。

采用本发明提供的方法抑制CTGF基因在上述细胞中表达，无论使用提供的siRNA还是药物组合物，siRNA用量一般是这样的量：其足以减少靶基因的表达，并导致在靶细胞表面处100pM至1μM、或1nM至100nM、或5nM至50nM或至约10nM的细胞外浓度。达到该局部浓度所需的量将随各种因素而变化，所述因素包括递送方法、递送部位、在递送部位和靶细胞或组织之间的细胞层的数目、递送是局部还是全身等。在递送部位处的浓度可以显著高于在靶细胞或组织的表面处的浓度。

实施例

本发明的内容将通过下述具体实施例进行具体描述，但本发明的范围不限于以下具体内容。如无特别说明，以下实施例中使用的试剂为生化试剂商店中可以买到的常规试剂，所使用的方法为本领域技术人员所熟知的方法。

制备实施例1

本发明以CTGF mRNA(Genebank注册号：(NM_001901.2)为siRNA设计的模板，得到2条物种保守的siRNA，其序列信息见表1。同时，设置正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示、反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的siRNA，编号为NC。NC为与CTGF mRNA无对应靶作用位点的无关序列，作为阴性对照。

表1:7条靶向CTGF的siRNA信息

上述siRNA在不同物种间具有高度的同源性，具体表现为siRNA CT与人(NM_001901.2)、大鼠(NM_022266.2)、小鼠(NM_010217.2)、恒河猴(XM_015137431.1)、食蟹猴(NM_001284927.1)的靶序列(ACAUUAAGAAGGGCAAAAA，SEQ ID No.9)完全匹配。siRNA CT2与人(NM_001901.2)、恒河猴(XM_015137431.1)、食蟹猴(NM_001284927.1)的靶序列(GAGUGGAGCGCCUGUUCCA，SEQ ID No.10)完全匹配，与大鼠(NM_022266.2)和小鼠(NM_010217.2)的靶序列(GAGUGGAGCGCCUGUUCUA，SEQ ID No.11)存在1个核苷酸错配，即第18位核苷酸不匹配。

通过常规固相合成方法得到表1中所列的siRNA的正义链和反义链。用退火盐溶液溶解等摩尔的正义链和反义链混合物，随后常规退火以形成siRNA双链，其中，双链的两端分别具有dTdT的3’突出端。

实验实施例1

本实验实施例用于检测制备实施例1中得到的siRNA在体外对CTGF mRNA表达水平的抑制率。

将人类宫颈癌细胞株(Hela)(购自ATCC，CCL-2^TM)用含有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的DMEM完全培养基接种培养于24孔板，接种密度为4×10⁵细胞/孔，每孔0.5ml，37℃培养过夜。

细胞转染的具体操作步骤如下：将500ng制备实施例1中合成的各siRNA样品，分别稀释于50μl Opti-MEM无血清培养基中，同时将1μl Lipofectamine^TM2000(Invitrogen公司)稀释于50μl Opti-MEM无血清培养基中，将上述两种溶液分别在室温下孵育5分钟后，均匀混合。混合溶液于室温静置20分钟后，把100μl的上述混合溶液加入到接种有Hela细胞的24孔板中。siRNA的最终浓度约为50nM。将细胞于37℃培养4小时，再加入1ml含10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的DMEM完全培养基，然后在37℃再培养24小时。以无转染操作的细胞作为背景对照(记为CON)，转染无关siRNA NC作为阴性siRNA对照(记为NC)，转染CTGF siRNA作为测试组。

通过荧光定量实时PCR(qRT-PCR)检测分别转染了不同siRNA的Hela细胞中CTGFmRNA的表达量，具体步骤如下：

在培养转染的细胞24小时后，用Rneasy mini Kit(Qiagen公司)提取细胞中的总RNA。每个样品取2μg总RNA按照PrimeScript^TM1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara公司)的使用方法反转录得到cDNA，利用 Premix Ex Taq^TM(Takara公司)试剂盒进行荧光定量实时PCR反应。PCR条件如下：

95℃预变性10min，进入循环：95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环后，72℃延伸10min。其中，用于扩增CTGF和作为定量PCR反应的内参基因GAPDH的PCR扩增引物如表2所示。

采用相同的处理方式，在小鼠胚胎成纤维细胞系(NIH 3T3，购自ATCC，产品编号CRL-1658)中，检测上述siRNA对CTGF mRNA表达水平的抑制率，其中用于扩增小鼠CTGF和内参基因GAPDH的PCR扩增引物如表2所示。

表2：定量PCR检测用引物序列

siRNA分子对CTGF mRNA表达水平的抑制率按如下等式计算：

CTGF mRNA抑制率＝[1-(测试组CTGF RNA的拷贝数/测试组GAPDH mRNA的拷贝数)/(背景对照组CTGF mRNA的拷贝数/背景对照组GAPDH mRNA的拷贝数)]×100％。检测结果如表3所示。

表3：siRNA体外活性结果

由此可见，50nM下，siRNA CT在两种细胞模型上的抑制率均在80％左右，而siRNACT2在CTGF mRNA上的靶作用位点与CT相近，但在上述两种细胞模型上却几乎没有抑制作用。

制备实施例2

对上述活性好的siRNA CT及阴性对照NC进行合理的化学修饰，其修饰信息见表4。

表4：修饰的siRNA分子的序列

其中，大写字母C、G、U、A和T表示核苷酸的碱基组成；小写字母d表示该字母d右侧的一个核苷酸为脱氧核糖核苷酸；小写字母m表示该字母m左侧的一个核苷酸的核糖基团为2’-甲氧基核糖基；小写字母f表示该字母f左侧的一个核苷酸的核糖基团为2’-氟代核糖基；小写字母s表示该字母两侧的脱氧核糖核苷酸之间磷酸酯基为硫代磷酸酯基。

通过常规固相合成方法得到表4中所列的siRNA正义链和反义链，常规退火后形成siRNA双链。

实验实施例2

本实验实施例用于检测修饰前后siRNA CT在体外对CTGF mRNA表达水平的抑制率。

实验及检测方法同实验实施例1，检测结果如表5所示。

表5：修饰前后siRNA CT体外活性结果

从表5可以看出，siRNA CT经化学修饰后，其抑制活性与未修饰siRNA相比，活性相当，50nM siRNA在细胞水平的基因抑制率在70％以上，仍然能够高效抑制靶基因CTGF的表达。

实验实施例3

本实验实施例检测修饰前后siRNA CT在血清环境中的稳定性。

将修饰前后siRNA CT(20μM，10μl)与50μl胎牛血清(FBS，购自HyClone，货号GTB0060)和40μl PBS混合，在37℃下体外孵育一定时间后取样，具体而言，分别在0、2、4、6、8、24、48、72小时取出10μl样本，并立即进行液氮速冻，随后冻存于-80℃备用。配制20重量％的非变性聚丙烯酰胺凝胶；取10μl上述样品与4μl上样缓冲液(20mM EDTA，36重量％甘油，0.06重量％溴酚蓝)混合，取1μl 20μM未经血清处理的siRNA与4μl上样缓冲液混合，作为电泳Marker(标记为M)，上样，在80mA恒流条件下电泳60分钟左右。电泳结束后，用1×Sybr Gold染料(Invitrogen，Cat.11494)染色15分钟后成相，结果如图1所示。以NC和NC-M作为实验阳性和阴性对照。

由图1可以看出，经修饰的siRNA CTM1、CTM2和CTM3加入FBS并孵育一定时间后，其主带(指与Marker所示的条带平行的带，代表全长序列)在血清中稳定存在的时间能够延续至72h，大大地推迟了siRNA的降解时间，表现出极高的血清稳定性。说明修饰后siRNA分子具有作为药物在动物体中使用的可能。

制备实施例3：siRNA药物组合物的制备

本制备实施例用来制备siRNA药物组合物RBP131/siRNA及RBP130/siRNA。

将三种干粉脂质化合物，即含胺化合物(如式IV或式V所示，其制备方法参见CN201180060664.1中的化合物72或87)、胆固醇、聚乙二醇化脂质(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]以59:29:12的摩尔比悬浮于乙醇中并混合，三种脂质化合物的总质量浓度约为8.85mg/ml。将待测siRNA(制备实施例2中的NC-M、CTM1、CTM2、CTM3)分别溶解于200mM醋酸钠(pH 5.2)溶液中，使siRNA的浓度为0.2mg/ml。以1:3的体积比，快速混合所得到的脂质乙醇溶液和siRNA醋酸钠水溶液。在表6中描述了混合后得到的脂质体制剂的具体组成。

表6脂质体制剂的组成

将混合后得到的脂质体制剂在约50℃孵育10分钟。孵育后，使用切相流系统，中空纤维柱100K Da超滤，超滤交换溶液为pH 7.4的PBS。超滤的同时可以将制剂浓缩或稀释到期望的siRNA浓度。超滤后的制剂在0.22μm滤器上过滤除菌。

将由式V所示的含胺化合物、胆固醇、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]组成的脂质混合物称为RBP131，由式IV所示的含胺化合物、胆固醇、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]组成的脂质混合物称为RBP130。所得药物组合物RBP131/siRNA或RBP130/siRNA在使用前储存在4℃，并检测相关理化性质，RBP131/siRNA和RBP130/siRNA的理化参数相似，检测结果见表7。

表7 RBP131/siRNA和RBP130/siRNA的理化参数

检测指征	参数范围
		pH	7.2-7.6
包封率(％)	≥90％
		siRNA浓度(mg/ml)	0.10-0.15
粒径(nm)	60-100
		PDI	≤0.20
渗透压(mOsm/kg)	300-400

其中，包封率采用RiboGreen法检测，所用试剂(Quant-iT^TM RNAReagent and Kit)购于Thermo Fisher(Invitrogen)公司，货号R11490。根据说明书操作步骤检测样品中siRNA的荧光强度，再按照文献(J.Heyes et.al,Journal of ControlledRelease,107(2005):276–287)所述方法计算包封率：

包封率＝[(Triton处理组荧光强度-无Triton处理组荧光强度)/Triton处理组荧光强度]×100％

其他理化参数采用本领域技术人员熟知的常规技术手段检测。

实验实施例4

本实验实施例用于检测制备实施例3中的RBP131/siRNA药物组合物在TAA肝纤维化模型小鼠体内对肝组织中CTGF表达水平的抑制率，通过专家打分评价药物组合物对肝纤维化的治疗效果。

(1)小鼠造模及给药方法

将6-8周龄36只C57小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)随机分成6组(每组6只，均为雄性)，其中1组给予PBS(标记为Normal)，另外5组用于TAA造模，随后分别给予PBS、RBP131/NC-M、RBP131/CTM1、RBP131/CTM2和RBP131/CTM3药物组合物，标记为PBS、NC-M、CTM1、CTM2和CTM3。

用双蒸水配置9质量％的TAA(硫代乙酰胺，分析纯，购自国药集团化学试剂公司)储液，避光保存，稀释300倍配成工作液，作为小鼠的日常饮水，从第四周开始平行尾静脉给药。所有动物根据体重计算药量，siRNA给药剂量为1mg/kg，体积为5ml/kg。每周两次，连续给药四周，最后一次给药后24h采用安乐死法处死小鼠，对动物进行大体解剖，观察体内脏器是否有病变，收集肝脏。

(2)小鼠肝脏组织CTGF表达水平检测

将采集的肝脏组织的一部分放入RNA later(Sigma Aldrich公司，货号R0901)中保存，采用实时荧光定量PCR法检测肝组织中CTGF mRNA的表达水平。

用组织匀浆仪匀浆肝组织，再用Trizol(Thermo Fisher公司，货号15596026)根据说明书操作步骤提取得到总RNA。使用ImProm-II^TM反转录试剂盒(Promega公司)按其说明书将提取的总RNA逆转录为cDNA，接着使用2×Ultra SYBR Mixture(with ROX)(北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW0956)试剂盒，以cDNA为模板按照说明书的步骤进行CTGFmRNA的表达量的检测。其中，用于扩增小鼠CTGF和作为内参基因的GAPDH的PCR引物如表2所示。

siRNA抑制活性用CTGF基因表达剩余量表示，按如下等式计算：

CTGF基因表达量＝(测试组CTGF的拷贝数/测试组GAPDH的拷贝数)/(对照组CTGF的拷贝数/对照组GAPDH的拷贝数)×100％。其中，各测试组为分别经RBP131/NC-M、RBP131/CTM1、RBP131/CTM2和RBP131/CTM3处理的TAA模型小鼠；对照组为经PBS处理的TAA模型小鼠。结果如图2所示。

(3)专家打分，评估药物组合物治疗肝纤维化的效果

将采集的肝左中叶约1.5×1.5cm²的组织用4质量％中性甲醛固定，进行肝纤维化病理学评价和特殊胶原染色评价。

甲醛固定的肝脏组织，经基本的脱水、透明和包埋后，用石蜡进行切片，按照Masson染色方法进行染色，包括：脱蜡，复水；铬化处理；自来水漂洗，苏木素染核；Masson丽春红酸性复红，酸化，脱水，透明，封片等。切片在显微镜下观察，按照文献(Zhao XYet.al.Pathology International 2008；58:580–588)的评价标准，至少两人进行纤维化双盲打分，然后对不同处理组的打分结果进行统计分析，结果如图3所示。

其中，肝纤维化病理国际评分标准如下：

0分：无纤维化形成；

1分：肝小叶静脉附近开始有轻微纤维生成；

2分：小叶静脉间隔板开始形成；

3分：小叶静脉隔板积累，不完全分割肝小叶；

4分：小叶静脉间隔板完全分割肝小叶，形成假小叶；

5分：小叶静脉和汇管区间隔板中度形成，假小叶进一步增加；

6分：大量小叶静脉和汇管区间隔板中度形成，假小叶面积超过50％。

由图2可以看出，在TAA诱导的肝纤维化小鼠模型上，RBP131/CTM1、RBP131/CTM2和RBP131/CTM3，通过尾静脉每周两次给药，给药剂量为1mg/kg，连续给药4周，能够有效抑制肝脏CTGF mRNA的表达，抑制效率分别为45％、70％和51％；而阴性对照RBP131/NC-M对肝组织CTGF基因mRNA无抑制作用。

通过切片可以看出，与TAA造模的PBS组相比，RBP131/CTM1、RBP131/CTM2和RBP131/CTM3组的肝脏胶原纤维生成量有所下调，小叶静脉间隔板积累减少，假小叶形成也显著减弱。图3所示的打分结果表明，经RBP131/CTM1、RBP131/CTM2和RBP131/CTM3治疗的肝纤维化小鼠，其肝脏纤维化症状得到了有效改善。

此外，采用相同的方法，对制备实施例3中得到的RBP130/siRNA药物组合物进行了相同的测试，测试结果与RBP131/siRNA药物组合物类似。

本发明提供的siRNA是一种有效治疗或改善肝纤维化的全新手段，通过抑制CTGF基因的表达，使得肝脏胶原纤维生成量有所下调，小叶静脉间隔板积累减少，假小叶形成也显著减弱，从而极大改善肝脏纤维化症状。另外本发明提供的RBP131/siRNA或RBP130/siRNA药物组合物靶向肝脏，可有效降低肝脏中CTGF基因的表达，治疗或改善肝纤维化。因此，本发明的药物组合物具备潜在的临床应用价值。

以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所发明的内容。

序列表

<110> 苏州瑞博生物技术有限公司

<120> 抑制人和动物中CTGF基因表达的siRNA、包含其的组合物及其应用

<130> DP1F162462ZX/CNSZRB/GL

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CTGF siRNA 正义链

<400> 1

acauuaagaa gggcaaaaa 19

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CTGF siRNA 反义链

<400> 2

uuuuugcccu ucuuaaugu 19

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA CT 正义链

<400> 3

acauuaagaa gggcaaaaat t 21

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA CT 反义链

<400> 4

uuuuugcccu ucuuaaugut t 21

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA CT2 正义链

<400> 5

gaguggagcg ccuguuccat t 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA CT2 反义链

<400> 6

uggaacaggc gcuccacuct t 21

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA NC 正义链

<400> 7

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA NC 反义链

<400> 8

acgugacacg uucggagaat t 21

<210> 9

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人/大鼠/小鼠/恒河猴/食蟹猴靶序列

<400> 9

acauuaagaa gggcaaaaa 19

<210> 10

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人/恒河猴/食蟹猴靶序列

<400> 10

gaguggagcg ccuguucca 19

<210> 11

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 大鼠/小鼠靶序列

<400> 11

gaguggagcg ccuguucua 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人

<400> 12

cacccgggtt accaatgaca 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人

<400> 13

tccgggacag ttgtaatggc 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人

<400> 14

ggtcggagtc aacggattt 19

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人

<400> 15

ccagcatcgc cccacttga 19

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 16

ggtgtgtgac gagcccaag 19

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 17

accccgcaga acttagcc 18

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 18

aactttggca ttgtggaagg gctc 24

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 19

tggaagagtg ggagttgctg ttga 24

Claims

1.一种siRNA，所述siRNA为以下三种siRNA中的任意一种：

CTM1：

正义链为：5’- ACmAUUmAAGAAGGGCmAAAAA-dT-s-dT -3’，

反义链为：5’- UUmUUUfGCCCUUCUUfAAUfGU-dT-s-dT -3’；

CTM2：

正义链为：5’- ACmAUUmAAGAAGGGCmAAAAA-dT-s-dT -3’，

反义链为：5’- UUmUUUfGCCCfUUCUUfAAUfGU-dT-s-dT -3’；

CTM3：

正义链为：5’- ACmAUUmAAGAAGGGCmAAAAA-dT-s-dT - 3’，

反义链为：5’- UUmUUfUfGCfCCfUUCUfUfAAUfGU-dT-s-dT -3’；

2.一种药物组合物，含有权利要求1所述的任意一种siRNA和药学上可接受的载体；所述siRNA与所述药学上可接受的载体的重量比为1:(1-50)。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中，所述药学上可接受的载体含有含胺化合物、辅助脂质和聚乙二醇化脂质，

其中，所述含胺化合物为如式IV所示的含胺化合物和/或如式V所示的含胺化合物：

式IV；

式V；

所述辅助脂质为胆固醇；

所述聚乙二醇化脂质为1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中，所述含胺化合物、辅助脂质、聚乙二醇化脂质三者之间的摩尔比为(50-70) : (20-40) : (3-20)。

5.一种试剂盒，其中，所述试剂盒含有权利要求1所述的siRNA和/或权利要求2-4中任一项所述的药物组合物。

6.权利要求1所述的siRNA和/或权利要求2-4中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗或改善与CTGF基因表达相关的疾病的药物中的应用，所述疾病为肝纤维化。