CN108244454B

CN108244454B - 一种复合酶和添加剂及它们的应用以及脱除玉米赤霉烯酮或α-玉米赤霉烯醇的方法

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Publication number: CN108244454B
Application number: CN201611248794.9A
Authority: CN
Inventors: 苏会波; 林海龙; 李凡; 陈博; 周勇; 郭翠; 李久仁; 樊维荣; 佟易; 李义
Original assignee: Cofco Biochemical Energy Yushu Co ltd; Cofco Corp; Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd; Jilin COFCO Bio Chemical Co Ltd; Anhui BBCA Biochemical Co Ltd
Current assignee: Cofco Biochemical Energy Yushu Co ltd; Cofco Corp; Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd; Jilin COFCO Bio Chemical Co Ltd; Anhui BBCA Biochemical Co Ltd
Priority date: 2016-12-29
Filing date: 2016-12-29
Publication date: 2021-04-27
Anticipated expiration: 2036-12-29
Also published as: CN108244454A

Abstract

本发明涉及微生物领域，公开了一种复合酶和添加剂及它们的应用以及脱除玉米赤霉烯酮或α‑玉米赤霉烯醇的方法。具体地，本发明提供了一种复合酶，该复合酶含有内酯酶和漆酶，且所述内酯酶与所述漆酶的重量比为1：1‑10。本发明将内酯酶和漆酶组合使用，由此得到的复合酶能够高效且安全地脱除ZEN及其主要代谢产物α‑ZOL，特别是将其应用于粮油或饲料中时，不仅可以高效且安全地脱除其中的ZEN和α‑ZOL，还不会影响粮油或饲料的适口性，具有良好的工业应用前景。另外，在本发明的一种优选的实施方式中，复合酶还含有铜剂，例如，叶绿素铜钠盐和/或叶绿素铜钾盐，可以进一步提高ZEN及其主要代谢产物α‑ZOL的脱除率。

Description

一种复合酶和添加剂及它们的应用以及脱除玉米赤霉烯酮或 α-玉米赤霉烯醇的方法

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体地，涉及一种复合酶，含有该复合酶的添加剂，所述复合酶和/或添加剂在脱除玉米赤霉烯酮和/或α-玉米赤霉烯醇中的应用，以及一种脱除玉米赤霉烯酮和/或α-玉米赤霉烯醇的方法。

背景技术

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)是由镰刀菌产生并释放到土壤环境中的真菌毒素，它是世界上污染范围最广泛的一种镰刀菌毒素。1999年，D.Mello等人研究发现，ZEN能够降低怀孕动物的胚胎成活率及新生胎儿的出生率。ZEN对人体的影响主要是引发肿瘤、诱导DNA收缩、导致染色体失常等。此外，ZEN可与17β-雌二醇受体结合，导致脂肪氧化反应、细胞凋亡并导致蛋白质和DNA合成的抑制，还可以抑制其它大分子的生物合成。另外，在植物体内，ZEN主要代谢为α-玉米赤霉烯醇(α-Zearalenol，α-ZOL)，有研究表明，α-ZOL产生的毒性是ZEN的数倍。因此，严格控制粮油或饲料中ZEN及其主要代谢产物α-ZOL的含量十分有必要。

ZEN作为世界上污染粮油或饲料最广泛的真菌毒素之一，在欧洲、非洲、北美洲、南美洲等世界各地的谷物中以及农副产品中都检测到了ZEN的存在。ZEN可以通过污染谷类等农作物，进而进入人或动物体内，危害人和动物的健康，造成巨大的经济损失。同时，ZEN本身具有分布广、繁殖快、耐热、毒性大、残留时间长等问题，已经引起了全世界的关注。目前，大部分国家对粮油或饲料中的ZEN含量都作了十分严格的规定，例如，澳大利亚规定谷物中ZEN的含量不能超过50ng/g；意大利规定在谷物和谷类产品当中ZEN的含量不能超过100ng/g；在法国，植物油和谷类当中ZEN的含量必须低于200ng/g。

目前，脱除ZEN毒素的方法主要分为物理法、化学法和生物法。物理法包括机械分离处理、高温失活、放射处理或吸附剂等；化学法是通过酸碱溶液或其它化合物对毒素进行处理。然而，通过物理和化学处理以脱除ZEN的方法具有局限性。例如，通过热处理，不能有效地使ZEN钝化；通过挤出和使用氧化剂进行处理，虽然可以在一定程度上降低ZEN的含量，但是在饲料和食品的制备过程中采用挤出方法和使用氧化剂(如臭氧或过氧化氢)，由于成本较高、处理样品的品质损失、效率和特异性较低而受到限制。总之，由于物理法存在着成本高、操作难、处理后的产物可能对粮油、饲料或环境造成污染等缺点，化学法可能会改变饲料的性状，产生有害残留物，从而存在食品安全问题等缺陷，从而限制了这两种方法在实际生产中的应用。

生物法主要是利用微生物或其降解产物进行ZEN降解的过程，具有对原料的感官性状、营养物质影响较小等优点，同时，还具有安全、环保、高效的特点，因此，利用现代生物技术去除粮油或/饲料中ZEN的研究具有良好的应用前景。已有研究表明，目前，研究报道表明多种微生物具有降解ZEN的作用，例如，枯草芽孢杆菌、粉红粘帚霉、米根霉、匍枝根霉、少根根霉、黑曲霉、解毒毛孢酵母等。但是，将上述细菌或真菌应用于粮油或饲料中进行ZEN降解时，很可能会对粮油或饲料的适口性造成一定的影响，并且产生的ZEN降解率还有待进一步的提高。

然而，迄今为止，很少见到关于使用生物法同时降解ZEN及其主要代谢产物α-ZOL的相关报道，由于α-ZOL很可能在植物体内代谢产生，进而污染粮油或饲料产品，因此，十分有必要寻找一种能够同时降解粮油或饲料中的ZEN及其主要代谢产物α-ZOL的生物方法。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的以上缺陷，提供一种复合酶，含有该复合酶的添加剂，所述复合酶和/或添加剂在脱除玉米赤霉烯酮和/或α-玉米赤霉烯醇中的应用，以及一种脱除玉米赤霉烯酮和/或α-玉米赤霉烯醇的方法。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种复合酶，其中，该复合酶含有内酯酶和漆酶，且所述内酯酶与所述漆酶的重量比为1：1-10。

第二方面，本发明还提供了一种添加剂，其中，该添加剂含有上述复合酶。

第三方面，本发明还提供了上述复合酶和/或添加剂在脱除玉米赤霉烯酮和/或α-玉米赤霉烯醇中的应用。

第四方面，本发明还提供了一种脱除玉米赤霉烯酮或α-玉米赤霉烯醇的方法，该方法包括：将上述复合酶和/或上述添加剂与样品接触，其中，所述样品为被玉米赤霉烯酮和/或α-玉米赤霉烯醇污染的样品。

通过上述技术方案，将内酯酶和漆酶组合使用，由此得到的复合酶能够高效且安全地脱除ZEN及其主要代谢产物α-ZOL，特别是将其应用于粮油或饲料中时，不仅可以高效且安全地脱除其中的ZEN和α-ZOL，还不会影响粮油或饲料的适口性，具有良好的工业应用前景。另外，在本发明的一种优选的实施方式中，复合酶还含有铜剂，例如，叶绿素铜钠盐和/或叶绿素铜钾盐，可以进一步提高ZEN及其主要代谢产物α-ZOL的脱除率。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

第一方面，本发明提供了一种复合酶，其中，该复合酶含有内酯酶和漆酶，且所述内酯酶与所述漆酶的重量比为1：1-10。

为了进一步提高复合酶对ZEN或α-ZOL的脱除效果，优选情况下，所述内酯酶与所述漆酶的重量比为1：2-8，更优选为1：4-6。

在本发明中，术语“内酯酶”是指可以特异性作用于ZEN和α-ZOL结构中的内脂键的酶。漆酶的酶分类号为EC 1.10.3.2。

在本发明中，对所述内酯酶的来源没有特别的限定，只要可以使ZEN或α-ZOL中的内酯结构发生水解即可，例如，可以通过现有的方法制备得到，也可以通过常规的商购获得。

在本发明中，对所述漆酶的来源没有特别的限定，可以为本领域的常规选择，例如，可以通过现有的方法制备得到，也可以通过常规的商购获得。

根据本发明，所述复合酶还可以含有铜剂；且相对于100重量份的所述内酯酶和所述漆酶的总和，所述铜剂的含量可以为0.001-0.05重量份，优选为0.01-0.05重量份。

在本发明中，所述铜剂可以为本领域常规使用的可以添加至粮油和/或饲料中的任意一种铜剂(铜离子源，即，能够提供铜离子的物质)；优选地，所述铜剂为叶绿素铜钠盐和/或叶绿素铜钾盐。并且，本发明对所述铜剂的来源没有特别的限定，可以为本领域的常规选择，例如可以通过常规的商购获得。

根据本发明，本发明对所述复合酶的形式没有特别的限定，可以为本领域的常规选择。为了方便使用和保存，所述复合酶的形式可以为液态和/固态，优选为固态。

在优选的情况下，为了方便使用和保存，所述复合酶中的各组分可以混合在一起包装，也可以各自独立包装，然后在使用时再进行混合。

本发明还提供了上述复合酶的制备方法，该方法包括：将内酯酶和漆酶进行混合，且所述内酯酶与所述漆酶的用量的重量比为1：1-10。

为了进一步提高复合酶对ZEN或α-ZOL的脱除效果，优选情况下，所述内酯酶与所述漆酶的用量的重量比为1：2-8，更优选为1：4-6。

优选的情况下，上述复合酶的制备方法包括：将内酯酶、漆酶和铜剂进行混合，且相对于100重量份的所述内酯酶和所述漆酶的总和，所述铜剂的用量为0.001-0.05重量份，优选为0.01-0.05重量份。

在本发明中，所述铜剂可以为本领域常规使用的可以添加至粮油和/或饲料中的任意一种铜剂(铜离子源，即，能够提供铜离子的物质)；优选地，所述铜剂为叶绿素铜钠盐和/或叶绿素铜钾盐。并且，本发明对所述铜剂的来源没有特别的限定，可以为本领域的常规选自，例如可以通过常规的商购获得。

在本发明中，所述添加剂以本发明提供的复合酶作为活性组分。以所述添加剂的总重量为基准，所述复合酶的含量可以为50-99.9重量％，优选为60-95重量％，更优选为70-90重量％。另外，所述添加剂还可以含有本领域技术人员公知的溶剂(如甘油、糖类和蛋白酶抑制剂等蛋白保护剂)、激动剂、润湿剂、稳定剂、抗氧化剂等。

在本发明中，所述添加剂中还可以含有生理学上可接受的载体，其中，所述生理上可接受的载体选自如下物质中的至少一种：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦、麦麸或小麦组分、稻米或米糠、蔗糖、淀粉、Na₂SO₄、滑石粉和PVA以及它们的混合物。

根据本发明，所述添加剂还可以含有地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、米曲霉、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种中的至少一种。

第三方面，本发明还提供了上述复合酶和/或上述添加剂在脱除玉米赤霉烯酮和/或α-玉米赤霉烯醇中的应用。

第四方面，本发明还提供了一种脱除玉米赤霉烯酮或α-玉米赤霉烯醇的方法，其特征在于，该方法包括：将上述复合酶和/或上述添加剂与样品接触，其中，所述样品为被玉米赤霉烯酮和/或α-玉米赤霉烯醇污染的样品。

根据本发明，所述样品可以为粮油和/或饲料，且相对于1kg的所述样品，所述复合酶的用量至少为0.001g，优选为至少为0.01g以上，更优选为至少为0.1g以上。

在本发明中，所述被玉米赤霉烯酮污染的样品中玉米赤霉烯酮的含量至少为1ppm，优选为至少为10ppm，更优选为至少为100ppm。

在本发明中，所述被α-玉米赤霉烯醇污染的样品中α-玉米赤霉烯醇的含量至少为0.5ppm，优选为至少为1ppm，更优选为至少为5ppm。

在本发明中，当所述样品为液体时，“ppm”表示的是“μg/mL”；当所述样品为固体时，“ppm”表示的是“μg/g”。

在本发明中，术语“粮油”是指对谷类、豆类等粮食和油料及其加工成品和半成品的统称，特别是指人类可以食用的产品。例如，所述粮油可以为本领域常见的人类可以食用的粮油产品，具体地，所述粮油可以包括谷物及其农副产品、油和脂肪制品、酒类、奶及其制品等中的至少一种。

在本发明中，术语“饲料”是指农业或牧业饲养的动物的食物的总称。例如，所述饲料可以为本领域常见的饲养动物所使用的食物，具体地，所述饲料可以包括：a)谷类，例如小粒谷物(如小麦、大麦、裸麦、燕麦以及它们的组合)和/或大粒谷物如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、干酒糟及可溶物(DDGS)、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳，棕榈仁和柑橘渣；c)青贮饲料；d)得自如下来源的蛋白质：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；e)从植物和动物来源获得的油和脂肪；f)矿物质和维生素。

根据本发明，所述接触条件可以包括：pH为3-7，温度为20-50℃，时间为8-24h；优选地，pH为5-7，温度为25-45℃，时间为10-20h。

在本发明中，当所述样品为固体时，所述pH值按照GB/T 12456-2008的方法进行测定。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

在以下制备例、实施例和对比例中，如无特别说明，各材料均可以通过商购获得，各方法均为本领域的常规方法。

漆酶购自湖北赛创科技有限公司；

ZEN和α-ZOL标准品购自Sigma公司。

制备例1

本制备例用于说明内酯酶的制备方法。

按照CN105755023A(SEQ ID NO.1)公开的序列，委托宝生物工程(大连)有限公司人工化学合成相应的基因片段，将该基因片段通过分子克隆方法克隆至载体PET30a质粒(具有His标签，购于美国Invitrogen公司)，得到重组载体，将该重组载体转化BL21(DE3)大肠杆菌菌株(购自北京华越洋生物科技有限公司，货号为NRR01210，下同)，使BL21(DE3)大肠杆菌菌株中表达UDP-葡萄糖基转移酶，得到重组菌株。挑取单菌落接种至LB液体培养基(LB培养基：牛肉膏5克，蛋白胨10克，氯化钠5克，补足水分至1000毫升115℃灭菌20min备用，pH7.0)中，于37℃培养至OD₆₀₀值在2-6之间，收集菌悬液冰浴30min，在4℃条件下，10000rpm离心20min，收集菌体，用磷酸盐缓冲液(PBS，135mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mMKH₂PO₄，8mM K₂HPO₄，pH 7.2)溶液悬浮后，超声波破碎，然后在4℃条件下，10000rpm离心20min，收集上清液，即为粗酶液。

将制备得到粗酶液。将粗酶液置于冰上，缓慢加入磨碎的硫酸铵粉末，边加边搅拌，添加到硫酸铵饱和为止。在4℃静置24h，12000r/min离心50min，弃上清，用少量磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.2)溶解沉淀。将PBS溶解的沉淀透析，除去硫酸铵，重悬于缓冲液(pH7.4，50mM NaCl，含10mM咪唑)中。由于表达出的重组酶含有His标签，利用Ni柱进行亲和层析纯化，1mL/min平衡Ni柱后，以流量0.5mL/min直接将重悬的粗酶液上样，继续使用缓冲液(pH 7.4，50mM NaCl，含10mM咪唑)1mL/min洗脱未吸附或吸附的非特异性杂蛋白，然后以缓冲液(pH 7.4，50mM NaCl，500mM咪唑)洗脱收集目的蛋白，以获得纯化的酶液。将酶液在-40℃下预冻12h，然后经冷冻干燥机处理制得内酯酶干粉A1。

制备例2

本制备例用于说明内酯酶的制备方法。

按照制备例1的方法进行，所不同的是，按照GenBank号为AB076037.1所示序列人工化学合成相应的基因片段，以代替实施例1中使用的基因片段，以制得内酯酶干粉A2。

实施例1-7和对比例1-4

按照表1所示的各实施例和对比例的配比进行复合酶的配制。向1kg受ZEN和α-ZOL污染的玉米粉(其中，ZEN的含量为50ppm，α-ZOL的含量为5ppm，玉米粉的浸出液的pH为6.0)中加入10g各实施例配制的复合酶作为试验组，以不加入复合酶的1kg上述玉米粉作为对照组，并向各试验组和对照组分别加入1kg蒸馏水，每组做三个重复，混合均匀后于30℃下脱毒15h。然后分别从各试验组和对照组准确称量样品。

1)ZEN检测

按照GB/T 28716-2012方法测定经处理后的各样品ZEN的含量，并按下式计算ZEN的脱除率(％)。

ZEN的脱除率(％)＝(处理前样品中ZEN的质量-处理后后样品中ZEN的质量)/处理前样品中ZEN的质量×100％。

2)α-ZOL检测

按照如上步骤1)ZEN检测中的方法处理样品，其中，α-ZOL的检测条件为：AgilentEclipse XDB-C18，150mm×4.6nm(5μm)色谱柱，流动相：水/乙腈/甲醇＝43％/50％/7％，紫外检测波长：265nm，柱温30℃，流速1mL/min，进样量20μL；

α-ZOL的脱除率(％)＝(处理前样品中α-ZOL的质量-处理后样品中α-ZOL的质量)/处理前样品中α-ZOL的质量×100％。

ZEN和α-ZOL的检测结果如表2所示。其中，对照组无任何ZEN和α-ZOL脱除现象。

使用以上实施例1-7中经处理后的玉米粉喂养猪14天，结果表明，在此期间，猪的饮食、饮水和日常活动均表现正常，并且猪的体重也一直保持稳定增长的趋势。以上结果说明将上述菌剂添加至玉米粉中用于猪的饲养，具有安全性。

表1

表2

	ZEN脱除率(％)	α-ZOL脱除率(％)
			实施例1	92.3	95.4
实施例2	91.4	94.9
			实施例3	91.3	95.0
实施例4	89.4	93.7
			实施例5	88.7	92.6
实施例6	86.1	92.3
			实施例7	84.2	89.0
对比例1	76.4	72.6
			对比例2	78.9	60.3
对比例3	77.9	63.9
			对比例4	75.7	64.2

由以上表2的数据可以看出，将内酯酶和漆酶组合使用，由此得到的复合酶能够高效且安全地脱除ZEN及其主要代谢产物α-ZOL，特别是将其应用于粮油或饲料中时，不仅可以高效且安全地脱除其中的ZEN和α-ZOL，还不会影响粮油或饲料的适口性，具有良好的工业应用前景。

另外，通过表2中实施例1和实施例5的结果可以看出，复合酶还含有铜剂可以进一步提高ZEN及其主要代谢产物α-ZOL的脱除率。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims

1.一种复合酶，其特征在于，该复合酶含有内酯酶和漆酶，且所述内酯酶与所述漆酶的重量比为1：4-6；

其中，所述内酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

其中，所述复合酶还含有铜剂；且相对于100重量份的所述内酯酶和所述漆酶的总和，所述铜剂的含量为0.001-0.05重量份；

其中，所述铜剂为叶绿素铜钠盐和/或叶绿素铜钾盐。

2.根据权利要求1所述的复合酶，其中，所述复合酶的形式为固态。

3.一种添加剂，其特征在于，该添加剂含有权利要求1或2所述的复合酶。

4.根据权利要求3所述的添加剂，其中，所述添加剂还含有地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、米曲霉、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种中的至少一种。

5.权利要求1或2所述的复合酶和/或权利要求3或4所述的添加剂在脱除玉米赤霉烯酮和/或α-玉米赤霉烯醇中的应用。

6.一种脱除玉米赤霉烯酮或α-玉米赤霉烯醇的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1或2所述的复合酶和/或权利要求3或4所述的添加剂与样品接触，其中，所述样品为被玉米赤霉烯酮和/或α-玉米赤霉烯醇污染的样品。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述样品为粮油和/或饲料，且相对于1kg的所述样品，所述复合酶的用量至少为0.001g。

8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述样品为粮油和/或饲料，且相对于1kg的所述样品，所述复合酶的用量为至少为0.01g以上。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，所述接触条件包括：pH为3-7，温度为20-50℃，时间为8-24h。

10.根据权利要求7或8所述的方法，其中，所述接触条件包括：pH为5-7，温度为25-45℃，时间为10-20h。