CN108186713A - 一种落花安神口服液及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种落花安神口服液及其制备方法和应用，所述落花安神口服制备方法如下：取落花生枝叶，加10倍量水浸泡2‑4小时，煎煮二次，第二次加水亦为10倍量，每次煎煮1小时；煎液滤过，合并滤液并浓缩至相对密度1.15‑1.20，放冷，加乙醇使含醇量达60％，搅匀，静置24小时，滤取上清液，滤液回收乙醇至无醇味，加水搅匀，静置24小时，取上清液滤过，加入蒸馏液及蔗糖、苯甲酸钠使溶解，调节相对密度至1.07‑1.10，冷藏静置48小时，滤过，滤液加水，密闭煮沸，灌装，灭菌，即得。本发明对落花生枝叶治疗失眠症的活性成分进行筛选，并以该活性成分为指标，筛选出落花安神口服液制剂最佳制备工艺。

Description

一种落花安神口服液及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及中药制药技术领域，具体地说，是一种落花安神口服液及其制备方法和应用。

背景技术

1988年全国名老中医王翘楚教授以中医“天人相应”理论和自然界阴阳消长规律为指导，发现落花生叶与人体“入夜则寐，入昼则寤”现象同步一致，提出两者可能有共同物质基础的设想(假说)，从而组织课题组对落花生枝叶治疗失眠症临床疗效和有关药学作系统研究。目前，落花安神口服液是上海市中医医院院内制剂，治疗多种原因引起的失眠症，多次系统观察结果显示，落花安神口服液治疗失眠症确有较好疗效，无明显不良反应和依赖性。

1973年到1983年，美国和日本有两篇关于落花生枝叶化学成分研究的论文，1987年后国内有1-2篇关于落花生枝叶镇静催眠作用的药理研究报道，直到2001年6月止，未有任何关于落花生枝叶镇静催眠作用的有效化学成分研究的报道。中国专利200410016412.0公开一种具有平肝活血安神作用的中药组合物及制备方法，以落花生枝叶和丹参的提取物与药用辅料组成的各种口服制剂，具体公开如下方法：(1)有效成份提取物的制备取重量百分组成为落花生枝叶15-85％、丹参85-15％的药材加水煎煮2次，合并水煎液滤液，浓缩至1-2g生药/ml，加入乙醇使含醇量为70％，冷藏，过滤，滤液浓缩回收乙醇至相对密度1.10-1.40，过滤即得；或按上述药材重量百分比组成和提取方法，将落花生枝叶和丹参分别进行水提醇沉，合并二者提取液即得；提取物经HPLC检测4-羟基-N-甲基脯氨酸的含量不低于0.067％，丹参素的含量不低于0.067％。鉴于花生枝叶一般均采用传统水煎提取法，临床疗效较好，但水提取物杂质较多，故采用水提醇沉法制备以除去部分杂质，提高制剂质量。上述专利公开了以落花生枝叶和丹参的提取物4-羟基-N-甲基脯氨酸、丹参素，混合治疗失眠。《全国中草药汇编》记载，落花生鲜叶60g浓煎成15-20ml睡前口服，有镇静、催眠作用，发明人研究发现，落花生枝叶药理镇静、催眠作用较强的部分氨基酸含量较高，醇沉后总氮含量仍在2％左右。因此有必要对落花生枝叶治疗失眠症活性成分进行筛选，以该活性成分为指标，研发优化落花安神口服液制剂制备工艺。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种落花安神口服液。

本发明的第二个目的是针对现有技术中的不足，提供一种落花安神口服液的制备方法。

本发明的第三个目的是针对现有技术中的不足，提供落花生枝叶提取物在制备治疗失眠的药物中的应用。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种落花安神口服液，所述落花安神口服液制备方法如下：取落花生枝叶，加10倍量水浸泡2-4小时，煎煮二次，第二次加水亦为10倍量，每次煎煮1小时，同时收集蒸馏液，备用；煎液滤过，合并滤液并浓缩至相对密度1.15-1.20(50度)，放冷，加乙醇使含醇量达60％，搅匀，静置24小时，滤取上清液，滤液回收乙醇至无醇味，加水搅匀，静置24小时，取上清液滤过，加入蒸馏液及蔗糖、苯甲酸钠使溶解，调节相对密度至1.07-1.10(20度)，冷藏静置48小时，滤过，滤液加水，密闭煮沸，灌装，灭菌，即得。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种落花安神口服液的制备方法，包括如下步骤：取落花生枝叶，加10倍量水浸泡2-4小时，煎煮二次，第二次加水亦为10倍量，每次煎煮1小时，同时收集蒸馏液，备用；煎液滤过，合并滤液并浓缩至相对密度1.15-1.20(50度)，放冷，加乙醇使含醇量达60％，搅匀，静置24小时，滤取上清液，滤液回收乙醇至无醇味，加水搅匀，静置24小时，取上清液滤过，加入蒸馏液及蔗糖、苯甲酸钠使溶解，调节相对密度至1.07-1.10(20度)，冷藏静置48小时，滤过，滤液加水，密闭煮沸，灌装，灭菌，即得。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

落花生枝叶提取物在制备治疗失眠的药物中的应用，所述落花生枝叶提取物制备方法如下：取落花生枝叶，加10倍量水浸泡2-4小时，煎煮二次，第二次加水亦为10倍量，每次煎煮1小时，同时收集蒸馏液，备用；煎液滤过，合并滤液并浓缩至相对密度1.15-1.20(50度)，放冷，加乙醇使含醇量达60％，搅匀，静置24小时，滤取上清液，滤液回收乙醇至无醇味，加水搅匀，静置24小时，取上清液滤过，加入蒸馏液，调节相对密度至1.07-1.10(20度)，冷藏静置48小时，滤过。

本发明优点在于：

1、本发明进行了落花生枝叶治疗失眠症活性物质的筛选研究，筛选出落花生枝叶药理镇静、催眠作用较强的活性物质。

2、本发明采用水提醇沉法，按照正交试验设计原理，以加水量、煎煮时间、保温时间、浓缩温度四个因素三个水平对提取的影响，以收率、活性物质4-羟基-N-甲基脯氨酸含量作为评估指标，进行正交设计实验，筛选出最佳提取工艺，在此基础上选择最佳醇沉浓度和纯化工艺，最终确定落花安神口服液制剂工艺。

3、本发明的落花安神口服液制剂，显著提高指标活性成分4-羟基-N-甲基脯氨酸含量。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1落花生枝叶指标成分的药理筛选

关于落花生枝叶治疗失眠症的化学成分研究未见相关的文献报导。为了建立落花生枝叶的指标化合物，我们和上海职工医学院药理教研室密切配合进行了活性物质的筛选工作。

取切碎的落花生枝叶2kg，加20倍水煮沸1小时后，滤取煎液，再加10倍量水煮沸1小时，滤取煎液，合并二次煎液，70℃水浴减压浓缩至2000ml，加正丁醇0.8L×2次，0.4L×1次萃取，正丁醇提取液用去离子水250ml×2次洗后于70℃减压浓缩至干，真空70℃干燥，称重32克。

正丁醇萃取后的水相和二次水洗正丁醇的水液合并，70℃减压浓缩至干，粉碎后加95％乙醇2000ml回流2小时，得95％乙醇提取液，减压70℃浓缩至干，真空70℃干燥，称重56克。

95％乙醇提取后的残渣(水溶物)70℃真空干燥，称重340克。

上述三个样品用光电管法进行药理实验，结果见表1。

实验方法：用光电管法研究药物对小鼠自主活动的影响。利用小鼠在自主活动光电自动记录仪中阻断光线次数，观察提取物对小鼠自主活动的影响。记录用药前15分钟，用药后15，30，45，60分钟的阻断光线次数。以蒸馏水为空白对照组，比较各用药组和空白对照组用药后各时间段之差异。所得数据用t检验法进行处理。

表1

*P<0.05***P<0.001

筛选结果：水提取物作用最强，醇提取物次之，正丁醇提取物无效。

根据以上药理结果，我们对水溶物部分进行了进一步的分离：

用95％乙醇不溶物(水溶物)320克粉碎后，加70％乙醇2000ml在水浴上回流二小时，冷却后过滤，滤液减压70℃浓缩至干，70℃真空干燥，称重163克。

70％乙醇过滤的滤渣加50％乙醇2000ml在水浴上回流二小时，冷却后过滤，滤液减压，70℃浓缩至干。70℃真空干燥，称重84克。

50％乙醇过滤的滤渣加30％乙醇2000ml在水浴上回流二小时，冷却后过滤，滤液减压70℃浓缩至干，70℃真空干燥，称重59克。

30％乙醇过滤的残渣70℃真空干燥，称重12克。

上述四个样品用光电管法进行药理实验，结果见表2。

表2

*P<0.05

筛选结果：70％乙醇提取物优于其他提取物。

根据以上结果，我们对70％乙醇提取物进行了进一步的分离：

70％乙醇提取物150克，用2000ml去离子水溶解后通过1500ml1300大孔吸附树脂，用1500ml去离子水洗后，通过大孔树脂的水溶液于70℃减压浓缩至干，真空干燥，称重116克。

1300大孔吸附树脂用2000ml 70％乙醇洗脱，收集洗脱液，于70℃减压浓缩至干，真空干燥，称重28克。

上述二个样品用光电管法进行药理实验，结果见表3。

表3

*P<0.05***P<0.001

筛选结果：70％乙醇提取不吸附物作用强，而70％乙醇提取吸附物无效。

根据以上结果，我们对70％乙醇提取物1300大孔吸附树脂不吸附物进行分离：

70％乙醇提取物1300大孔吸附树脂不吸附物100克，用2000克青岛硅胶H，低压柱层析分离，洗脱剂：BuOH-MeOH-NH4OH(0.5：1：0.2～0.5：3：0.2)薄层层析检出，展开剂与洗脱剂相同，碘显色，收集Rf值相同的流份合并，减压70℃浓缩至干，真空干燥，得到Fr.1：41克，Fr.2：0.866克，Fr.3：18.4克，Fr.4：28克，Fr.5：0.426克。(Fr.2和Fr.5由于样品太少，没能筛选)

上述Fr.1、Fr.3和Fr.4三个样品用光电管法进行药理实验，结果见表4。

表4

*P<0.05***P<0.001

筛选结果：Fr.1作用较Fr.3，Fr.4作用强。

根据以上结果，我们对Fr.1进行了进一步的分离：

Fr.1流份干燥物30克用去离子水100ml溶解，通过717阴树脂500ml，用500ml去离子水洗后，用500ml5％NH₄OH洗脱，洗脱液减压70℃浓缩至干，真空70℃干燥，称重8.16克(Fr.1A)

717阴树脂通过液和洗717阴树脂的水液合并通过500ml732阳树脂，用500ml去离子水洗后，用2％HCl500ml洗脱，洗脱液通过717阴树脂500ml，用500ml去离子水洗后，70℃减压浓缩至干，真空70℃干燥，2.32克(Fr.1B)732阳树脂通过液用717阴树脂中和后，减压70℃浓缩至干，真空干燥，称重11.64克(Fr.1C)

上述三个样品用光电管法进行药理实验，结果见表5。

表5

*P<0.05

筛选结果：Fr.1A作用较Fr.1C作用强。

Fr.1A经硅胶薄板层析两种展开剂系统：BuOH-MeOH-NH₄OH(0.5:1:0.2)；EtOAc-Me₂CO-1NHCl(1:3:0.1)展开，碘和10％H₂SO₄显色显示均为单一斑点。经EI-MS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT-135°谱和¹³C，¹H-COSY谱推测该化合物为(-)-(2S,4R)-1-Methyl-4-hydroxyprolidine-2-carboxylicacid，即4-羟基-N-甲基脯氨酸。合成该化合物的1H-NMR和¹³C-NMR数据与Fr.1A一致，证实Fr.1A即4-羟基-N-甲基脯氨酸。Fr.1A为无色方块结晶(甲醇)m.p.222～226℃，[α]D：-95.2(c,1.0,H₂O)，茚三酮反应呈紫红色，EI-MSM/Z 145(M)(1.26)，100(M-COOH)(100)，82(M-H2O-COOH)(3.42)。

实施例2落花安神口服液制剂工艺的研究

1.原料提取工艺的研究

1.1药材的鉴定与前处理

〔落花生枝叶〕

本品为豆科植物落花生Arachis hypogaea L.的干燥地上部分。落花生枝叶的化学成分研究至今不是很多[5，10]。落花生枝叶的水、醇、石油醚等提取物有镇静、催眠作用[7]。《全国中草药汇编》记载，落花生鲜叶60g浓煎成15-20ml睡前口服，有镇静、催眠作用。课题组最近研究发现，落花生枝叶药理镇静、催眠作用较强的部分氨基酸含量较高，醇沉后总氮含量仍在2％左右。

1.2提取工艺路线的设计与选择

1.2.1正交设计

本课题提取工艺采用水提醇沉法，按照正交试验设计原理，拟定考察四个因素三个水平对提取的影响，以收率、4-羟基-N-甲基脯氨酸含量以及丹参素含量为评估指标，并作方差分析，选择最佳工艺条件。因素-水平表见表6；正交设计表选择L⁹(3⁴)表，实验方案及测定结果见表7。

表6因素-水平表

表7正交试验及试验数据

*测定方法：4-羟基-N-甲基脯氨酸含量系以HPLC法测得。

1.2.2工艺选择

根据正交试验的结果，进行方差分析，综合考虑各因素对4-羟基-N-甲基脯氨酸含量、得率的影响程度，对于几乎没有影响的因素则从成本考虑，选择A₂B₂C₂D₃为最佳工艺。即按处方比例投入经筛选的药材，第一次加入药材10倍量的水，煮沸1小时后，保温1小时，过滤取滤液；药渣再加10倍量的水，煮沸1小时后，保温1小时，过滤取滤液，合并二次滤液。

1.2.3考察不同浓度乙醇对落花安神口服液4-羟基-N-甲基脯氨酸的影响：

取180g落花生枝叶，按上述最佳工艺提取。将水提液减压浓缩至150ml。将浓缩液分成五等份，每份加入无水乙醇，使之最终浓度分别达到30％、50％、60％、95％。取上清液浓缩至干，按4-羟基-N-甲基脯氨酸含量测定方法检测。结果如下：

表8不同浓度乙醇沉降试验及数据

乙醇浓度	干重(g)	Prol-mg
			95％	6.858	6.1852
60％	10.192	6.3839
			50％	14.207	4.2913
30％	10.828	4.6682

根据上表结果，确定以60％乙醇为最佳醇沉浓度。

1.3原料药液的浓缩与纯化工艺研究：

将合并的滤液于70℃水浴减压浓缩至1～2g生药/ml，以梯度递增方式加入95％乙醇，逐步提高乙醇浓度，使之含醇量达60％，将容器口盖严，冷藏静置24小时以上。取滤液于70℃水浴减压浓缩至流浸膏样，含水量为15％左右，得率约为16％。

2.制剂成型研究

参考王翘楚教授多年来临床用药剂量，并经药效学动物试验证明，花生叶30g，具有较好的镇静催眠作用。为用药方便，落花安神口服液在此基础上拟定规格为10ml/支，每支含生药量15g。

因此，本制剂最终工艺为：取落花生枝叶1500g，加10倍量水浸泡2-4小时后，煎煮二次，第二次加水亦为10倍量，每次1小时，同时收集蒸馏液100ml，备用，煎液滤过，合并两次滤液并浓缩至相对密度1.15—1.20(50度)，放冷，加乙醇使含醇量达60％，搅匀，静置24小时，滤取上清液，滤液回收乙醇至无醇味，加水搅匀，静置24小时，取上清液滤过，加入蒸馏液及蔗糖200g、苯甲酸钠3g使溶解，调节相对密度至1.07—1.10(20度)，冷藏静置48小时，滤过，滤液加水调整总量至1000ml，密闭煮沸30分钟，灌装，灭菌，即得。

3.工艺验证

3.1工艺一

(1)处方：落花生枝叶3000g、丹参1500g、苯甲酸钠3g、蔗糖100g、甜蜜素2g。

(2)制法：取落花生枝叶、丹参，加水煎煮两次，每次1小时，保温2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩，加3倍量95％乙醇使沉淀，静置12-24小时，滤取上清液，浓缩至相对密度1.15-1.32，加甜蜜素、蔗糖、苯甲酸钠，溶解，制成1000ml，混匀，既得。

(3)4-羟基-N-甲基脯氨酸的含量测定

柱：KR100-5NH2

流动相：乙腈-水(80:20)

检测器：示差

检测温度：30摄氏度

流速：1.0mL/min

测得口服液中4-羟基-N-甲基脯氨酸含量为39mg/10ml。

3.2工艺二

(1)处方：落花生枝叶3000g、苯甲酸钠1.5g、蔗糖200g。

(2)制法：取落花生枝叶，加10倍量水浸泡2-4小时后，煎煮二次，第二次加水亦为10倍量，每次1小时，同时收集蒸馏液100ml，备用。煎液滤过，合并两次滤液并浓缩至相对密度1.15—1.20(50度)，放冷，加乙醇使含醇量达60％，搅匀，静置24小时，滤取上清液，滤液回收乙醇至无醇味，加水搅匀，静置24小时，取上清液滤过，加入蒸馏液及蔗糖、苯甲酸钠使溶解，调节相对密度至1.07-1.10(20度)，冷藏静置48小时，滤过，滤液加水调整总量至1000ml，密闭煮沸30分钟，灌装，灭菌，即得。

(3)4-羟基-N-甲基脯氨酸的含量测定

柱：KR100-5NH2

流动相：乙腈-水(80:20)

检测器：示差

检测温度：30摄氏度

流速：1.0mL/min

测得口服液中4-羟基-N-甲基脯氨酸含量为68mg/10ml。

由上述对比可知，本发明的落花安神口服液制剂，可显著提高指标活性成分4-羟基-N-甲基脯氨酸含量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种落花安神口服液，其特征在于，制备方法如下：取落花生枝叶，加10倍量水浸泡2-4小时，煎煮二次，第二次加水亦为10倍量，每次煎煮1小时，同时收集蒸馏液，备用；煎液滤过，合并滤液并浓缩至相对密度1.15-1.20(50度)，放冷，加乙醇使含醇量达60％，搅匀，静置24小时，滤取上清液，滤液回收乙醇至无醇味，加水搅匀，静置24小时，取上清液滤过，加入蒸馏液及蔗糖、苯甲酸钠使溶解，调节相对密度至1.07-1.10(20度)，冷藏静置48小时，滤过，滤液加水，密闭煮沸，灌装，灭菌，即得。

2.一种落花安神口服液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：取落花生枝叶，加10倍量水浸泡2-4小时，煎煮二次，第二次加水亦为10倍量，每次煎煮1小时，同时收集蒸馏液，备用；煎液滤过，合并滤液并浓缩至相对密度1.15-1.20(50度)，放冷，加乙醇使含醇量达60％，搅匀，静置24小时，滤取上清液，滤液回收乙醇至无醇味，加水搅匀，静置24小时，取上清液滤过，加入蒸馏液及蔗糖、苯甲酸钠使溶解，调节相对密度至1.07-1.10(20度)，冷藏静置48小时，滤过，滤液加水，密闭煮沸，灌装，灭菌，即得。

3.落花生枝叶提取物在制备治疗失眠的药物中的应用，其特征在于，所述落花生枝叶提取物制备方法如下：取落花生枝叶，加10倍量水浸泡2-4小时，煎煮二次，第二次加水亦为10倍量，每次煎煮1小时，同时收集蒸馏液，备用；煎液滤过，合并滤液并浓缩至相对密度1.15-1.20(50度)，放冷，加乙醇使含醇量达60％，搅匀，静置24小时，滤取上清液，滤液回收乙醇至无醇味，加水搅匀，静置24小时，取上清液滤过，加入蒸馏液，调节相对密度至1.07-1.10(20度)，冷藏静置48小时，滤过。