CN108138206B

CN108138206B - 麦角硒因的制造方法

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Publication number: CN108138206B
Application number: CN201680044520.XA
Authority: CN
Inventors: 市川惠一; 篠原靖智; 原精一; 黑泽惠子; 山下由美子; 山下伦明
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 2015-08-07
Filing date: 2016-06-17
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2036-06-17
Also published as: US11629341B2; US11028400B2; JPWO2017026173A1; JP6932354B2; WO2017026173A1; EP3333266A4; EP3333266B1; CN108138206A; US20210317463A1; CN114606144A; EP3333266A1; EP3333266C0; US20180237815A1

Abstract

本发明的目的在于提供一种麦角硒因的制造方法，其与现有技术相比能够高产量地生产麦角硒因，因此可以工业规模地制造麦角硒因。以上目的通过以下麦角硒因的制造方法来解决：包括使组氨酸和硒化合物作用于转化株以得到麦角硒因的步骤，该转化株被插入编码下列(1)的酶的基因，并且将被插入的基因过量表达，(1)在存在S‑腺苷甲硫氨酸和铁(II)的条件下，催化从组氨酸和硒代半胱氨酸生成海西宁硒半胱氨酸的反应的酶。

Description

麦角硒因的制造方法

关联申请的相互参照

本申请主张于2015年8月7日提出的申请号为2015-157443的日本专利申请的优先权，并以全文引用的方式在此公开。

技术领域

本发明涉及麦角硒因的制造方法，特别涉及利用具有麦角硒因生产能力的微生物的麦角硒因的制造方法。

背景技术

硒(Se)是属于元素周期表第16族的元素，即氧族元素(硫族元素)的一种，是人类必不可少的微量元素。硒构成生物体内的酶或者蛋白质的一部分，在抗氧化反应中承担重要的职责。藻类、鱼贝类、肉类、蛋黄等含丰富的硒，因此可以通过含有上述物质的食物来摄取硒。

作为含有硒的酶，例如，已知在动物种属中包括含有硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸作为其构成氨基酸的谷胱甘肽过氧化物酶等。另外，据多数报告，在藻类和植物种属中也存在硒蛋白。

当硒不足时，因过氧化物产生细胞毒性，结果涉及心肌病(克山病)、大骨节病(地方病性变形性骨软骨关节症)、心绞痛或心肌梗塞等冠动脉疾病、心脏血管疾病等疾病的发作。除此之外，也有报告表明因缺乏硒而诱使肌肉痛、皮肤干燥、肝坏死、肺癌、大肠癌、前列腺癌、直肠癌、乳癌、白血病等癌症发作的风险提升。

另一方面，硒具有作为毒物的有害性。例如，以亚硒酸根离子的形态存在会增强毒性。因此，已知过量摄取硒会诱发指甲变形或脱毛、肠胃损伤、神经损伤、心肌梗塞、急性呼吸困难、肾衰竭等。因此，日本厚生劳动省制定了硒的饮食摄取标准，例如，30～49岁的男性 (女性)的推定的平均必要量为25(20)μg/日，推荐量为30(25)μg/日，上限量为460(350)μg/日(参照非专利文献1，该文献以全文引用的方式在此公开)。

现在，涉及缺乏硒的疾病的预防或治疗中，使用含有亚硒酸等无机态硒(无机硒化合物) 或者硒代蛋氨酸等有机态硒(有机硒化合物)的营养补充剂。另外，通过在含有无机硒化合物的培养基中培养酶，将含有高浓度的硒代蛋氨酸的硒酵母作为有机硒化合物的一种而利用。

作为其他的有机硒化合物的一种包括麦角硒因，已知麦角硒因具有生物抗氧化作用和细胞增殖促进作用等(参照专利文献1，该文献以全文引用的方式在此公开)。麦角硒因是将麦角硫因的SH基置换为SeH基的硒类似物，其抗氧化能力达到了麦角硫因的1，000倍(参照非专利文献3，该文献以全文引用的方式在此公开)。

作为麦角硒因的制作方法，除了从动物的脏器或血液中提取的方法(参照以下专利文献 1，该文献以全文引用的方式在此公开)外，还已知利用导入了与麦角硫因合成系有关的基因的分裂酵母，即粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的方法(参照非专利文献2，该文献以全文引用的方式在此公开)。

在先技术文献

专利文献

专利文献1：日本特许第5669056号公报

非专利文献

非专利文献1：日本厚生劳动省，“日本人的饮食摄取基准(2015年版)策定检讨会”报告书，平成26年3月28日(http://www.mhlw.go.jp/fIe/05-Shingika i-10901000-Kenkoukyoku-Soumuka/0000042638.pdf)

非专利文献2：PLoS One 2014May 14；9(5):e97774

非专利文献3：J.Biol.Chem.-2010 18134-8。

发明内容

发明欲解决的问题

记载在专利文献1的方法是从鱼类的脏器或血液中提取麦角硒因的方法，但是其中含有的麦角硒因的含有量非常少，存在为了获得大量的麦角硒因而需要大量的鱼类的问题。

另一方面，非专利文献2中记载了作为催化从组氨酸和硒代半胱氨酸生成海西宁硒半胱氨酸的反应的酶的Egt1，利用转化从而过量表达编码该酶的基因SPBC1604.01的转化粟酒裂殖酵母，以in vivo合成麦角硒因。但是，存在利用非专利文献2记载的转化粟酒裂殖酵母而得到的麦角硒因的量非常少这一问题。

因此，本发明欲解决的问题是提供一种相比非专利文献2记载的粟酒裂殖酵母，能够高产量地生产麦角硒因，由此可以工业规模地制造麦角硒因的麦角硒因制造方法。

解决问题的手段

本发明的发明者们为了解决上述问题而不断锐意研究，最终在作为菌类的一种的酱油曲霉(Aspergillus sojae)中成功地特定了基因AsEgtA，该基因AsEgtA编码催化从组氨酸和硒化合物生成麦角硒因的反应的酶。

其次，本发明的发明者们制作用于过量表达AsEgtA蛋白质的DNA构建体，通过将其导入到酱油曲霉并转化，成功地制作了过量表达AsEgtA蛋白质的转化酱油曲霉。另外，同样地，特定了与基因AsEgtA的具有高同源性的米曲霉(Aspergillus oryzae)的基因AoEgtA，成功地制作了过量表达AoEgtA蛋白质的转化米曲霉。

令人惊讶的是，得到的转化株不仅能从硒代胱氨酸等的有机硒化合物中，还能够从亚硒酸等无机硒化合物中生产麦角硒因，而且其产量显著地多于非专利文献2记载的转化粟酒裂殖酵母的麦角硒因的产量。

更令人惊讶的是，本发明的发明者发现即使添加了被认为有毒浓度的硒化合物，上述转化株相比于野生株明显表现出对硒化合物更高的耐性。另外，上述转化株能够按照常规方法培养，其增殖速度等与野生株相比并无显著的不同。由此可知，利用上述转化株可以大量生产麦角硒因。本发明是基于这样的成功的例子和见识而完成的发明。

因此，根据本发明的一实施例，提供一种麦角硒因的制造方法，包括使组氨酸和硒化合物作用于转化株以得到麦角硒因的步骤，该转化株被插入编码下列(1)的酶的基因，并且将被插入的基因过量表达。

(1)在存在S-腺苷甲硫氨酸和铁(II)的条件下，催化从组氨酸和硒代半胱氨酸生成下列式〔I〕

[化1]

所示的海西宁硒半胱氨酸(hercynylselenocysteine)的反应的酶。

优选地，硒化合物是从有机硒化合物、无机硒化合物及它们的盐所组成的组群中选出的至少一种硒化合物。

优选地，所述有机硒化合物及其盐是从硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸、硒蛋氨酸、Se-(甲基)硒基-L-半胱氨酸、硒肽、硒蛋白及它们的盐，以及硒酵母组成的组群中选出的至少一种硒化合物，并且所述无机硒化合物及其盐是从硒酸、亚硒酸、氯化硒、硒化物、硫化硒、二甲硒、硒代磷酸盐、二氧化硒及它们的盐组成的组群中选出的至少一种硒化合物。

优选地，所述转化株是被插入编码下列(2)的酶的基因，并且将被插入的基因过量表达的转化株，

(2)使用5'-磷酸吡哆醛作为辅酶，催化从下列式〔I〕

[化2]

所示的海西宁硒半胱氨酸生成麦角硒因的反应的酶。

优选地，所述转化株是将表达由硒酸还原酶、硒代半胱氨酸裂解酶和丝氨酸脱水酶组成的组群中选出的至少一种酶的微生物作为宿主生物。

优选地，所述转化株是将由曲霉(Aspergillus)属微生物、埃希氏菌(Escherichia) 属微生物、木霉(Trichoderuma)属微生物、镰孢菌(Fusarium)属微生物、青霉(Penicillium) 属微生物、根霉(Rhizopus)属微生物和链孢霉(Neuspora)属微生物组成的组群中选出的至少一种微生物作为宿主生物。

优选地，所述曲霉(Aspergillus)属微生物是将由酱油曲霉(Aspergillussojae)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、溜曲霉(Aspergillus tamarii)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、宇佐美曲霉(Aspergillususamii)、白曲霉(Aspergillus kawachii)和斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)组成的组群中选出的曲霉属微生物。

优选地，所述转化株将大肠杆菌作为宿主生物。

优选地，所述转化株是与宿主生物相比编码上述(1)的酶的基因的表达被增强以增加麦角硒因的量的转化株。

优选地，所述转化株是编码上述(1)的酶的基因的表达被增强的转化株，以使得利用适于宿主生物生长的含有硒胱氨酸的培养基，在30℃的条件下培养该转化株5天期间的情况下，麦角硒因的量为每1克湿菌体质量10μg以上，更优选地，为每1克湿菌体质量20μg以上，更优选地，为每1克湿菌体质量40μg以上，进一步优选地，为每1克湿菌体质量100μg以上。

优选地，编码上述(1)的酶的基因是从由具有序列表的SEQ ID NO：1记载的碱基序列的基因、以及具有序列表的SEQ ID NO：23记载碱基序列的基因组成的组群中选出的基因；或者上述(1)的酶是从由具有序列表的SEQ ID NO：4记载的氨基酸序列的酶、以及具有序列表的SEQ ID NO：24记载的氨基酸序列的酶组成的组群中选出的酶。

优选地，编码上述(2)的酶的基因是从由具有序列表的SEQ ID NO：2记载的碱基序列的基因、以及具有序列表的SEQ ID NO：3记载碱基序列的基因组成的组群中选出的基因；或者上述(2)的酶是从由具有序列表的SEQ ID NO：5记载的氨基酸序列的酶、以及具有序列表的SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列的酶组成的组群中选出的酶。

另外，作为本发明的一实施例，发现与使用上述转化株的制造方法相比，尽管麦角硒因的生产量为微量，但利用曲霉属微生物之类曲霉等的丝状菌，可以从硒胱氨酸等有机硒化合物、或亚硒酸等无机硒化合物中生产麦角硒因。换而言之，根据本发明的另一实施例，提供一种麦角硒因的制造方法，包括使组氨酸和硒化合物作用于曲霉属微生物这样的曲霉等丝状菌以得到麦角硒因的步骤，该丝状菌在基因组DNA上具有编码上述(1)的酶的基因。

发明的效果

根据本发明的一实施例的制造方法或转化株，通过培养通常的宿主生物的条件，能够制造高产量的麦角硒因。结果，根据本发明的一实施例的制造方法或转化株，能够期待工业规模地制造麦角硒因。

附图说明

图1表示LC-MS分析结果，该分析结果试验从在添加了硒胱氨酸的DPY液体培养基内培养实施例记载的对照株和转化酱油曲霉(“(AsEgtA+AsEgtC)转化株”)而得到的培养物中制作的麦角硒因提取液中，检出对应麦角硒因的峰；

图2表示LC-MS分析结果，该分析结果试验从在添加了硒胱氨酸的DPY液体培养基内培养实施例记载的对照株和转化酱油曲霉(“(AsEgtA+AsEgtC)转化株”)而得到的培养物中制作的麦角硒因提取液中，检出对应麦角硫因的峰；

图3是在图1的LC-MS分析结果中的保持时间(retention time)31分钟附近的峰的MS 光谱放大图；

图4是表示关于图3的由相对同位素丰度估算的麦角硒因的离子分布的计算值的图；

图5表示LC-MS分析结果，该分析结果试验在利用DPY液体培养基(“DPY”)、添加了硒胱氨酸的DPY液体培养基(“DPY+硒胱氨酸”)或者添加了亚硒酸的DPY液体培养基(“DPY+亚硒酸”)内培养实施例记载的转化酱油曲霉，并从得到的培养物中制作的麦角硒因提取液中检出对应麦角硒因的峰；

图6表示LC-MS分析结果，该分析结果试验在添加硒胱氨酸的DPY液体培养基内培养实施例记载的对照株和转化米曲霉(“AoEgtA转化株”)，并从得到的培养物中制作的麦角硒因提取液中检出对应麦角硒因的峰；

图7表示实施例记载的对照株(“NBRC4239株”)和转化酱油曲霉(“(AsEgtA+AsEgtC) 转化株”)对于硒代胱氨酸的毒性的评估结果；

图8表示实施例记载的对照株(“NBRC4239株”)和转化酱油曲霉(“(AsEgtA+AsEgtC) 转化株”)对于亚硒酸的毒性的评估结果；

图9是使用从实施例记载的转化株和对照株中提取的总蛋白质的SDS-PAGE的照片。其中 Lane1表示来自对照株、Lane2表示来自AsEgtA转化株、Lane3表示来自AsEgtB转化株、Lane4 表示来自AsEgtC转化株的蛋白质、Lane5表示来自(AsEgtA+AsEgtB)转化株、Lane6表示来自(AsEgtA+AsEgtC)转化株。

具体实施方式

以下说明本发明的一实施例的制造方法和转化株的详情。

(制造方法的概要)

制造方法的一实施例至少包括使组氨酸和硒化合物作用于转化株以得到麦角硒因的步骤，其中该转化株被插入编码下列(1)的酶(以下称为酶(1))的基因，并且将被插入的基因过量表达。在本说明书中，硒化合物包括除了硒化合物本身外，还有硒化合物的盐、络合物、交联物和衍生物。

[化3]

所示的海西宁硒半胱氨酸(hercynylselenocysteine)的反应的酶。

制造方法的一实施例所使用的转化株，通过过量表达用于编码酶(1)的基因，能够从组氨酸和硒化合物最终生成麦角硒因。其中，酶(1)作为外源基因被插入到转化株。可以得到一种或者两种以上的用于编码过量表达的酶(1)的基因。

本发明的保护范围不拘泥于任何理论或者推测，作为菌类的预测的麦角硒因的生物合成的一例，以从组氨酸和硒代半胱氨酸生成海西宁硒半胱氨酸的反应可由以下式〔II〕示意性表示：

[化4]

(在本式中，SAM表示S-腺苷甲硫氨酸)。酶(1)相当于式〔II〕的egtA。

制造方法的一实施例所使用的转化株，优选地为以下的转化株：该转化株进一步地被插入编码下列(2)的酶(以下称为酶(2))的基因，并且将被插入的基因过量表达。

(2)使用5'-磷酸吡哆醛作为辅酶，催化从上式〔I〕所示的海西宁硒半胱氨酸生成麦角硒因的反应的酶。

据信，制造方法的一实施例所使用的转化株，通过过量表达作为外源基因而编码被插入的酶(2)的基因，能够从如海西宁硒半胱氨酸等前驱物高效率地生成麦角硒因。但是，在宿主生物充分地表达酶(2)的情况下，可以不用插入编码酶(2)的基因。可以得到一种或者两种以上的用于编码过量表达的酶(2)的基因。

制造方法的一实施例所使用的转化株大致可以分为两类：过量表达编码酶(1)的基因，并且不过量表达编码酶(2)的基因的转化株；以及过量表达编码酶(1)的基因，并且过量表达编码酶(2)的基因的转化株。

(酶(1)和(2)的酶学性质)

如上述式〔II〕所示，酶(1)具有依赖于S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，催化将组氨酸转化为-NH2基被三甲基化的组氨酸三甲基内盐的反应的活性(以下称为第一活性)。进一步地，酶(2)具有在存在铁(II)的条件下，能够催化从组氨酸三甲基内盐和硒代半胱氨酸生成海西宁硒半胱氨酸的反应的活性(以下称为第二活性)。因此，酶(1)因为具有第一和第二活性，因此能够在存在S-腺苷甲硫氨酸和铁(II)的条件下，从组氨酸和硒代半胱氨酸生成麦角硒因。

酶(2)具有能够将5'-磷酸吡哆醛作为辅酶，催化从海西宁硒半胱氨酸生成麦角硒因的反应的活性(以下称为第三活性)。

用于制造方法的一实施例的转化株通过过量表达酶(1)、或者酶(1)和酶(2)的基因，在各自酶活性化的条件下，能够从例如组氨酸和硒代半胱氨酸等有机硒化合物最终生成麦角硒因。而且，令人惊讶的是该转化株不限于有机硒化合物，还能够从如亚硒酸等无机硒化合物生产麦角硒因。

另外，酶(1)和酶(2)也可以用于麦角硫因的生物合成。菌类预想的麦角硫因的生物合成的一例如下列式〔III〕所示。

[化5]

(在本式中，SAM表示S-腺苷甲硫氨酸，PLP表示5'-磷酸吡哆醛)。酶(1)相当于式〔III〕的egtA，酶(2)相当于式〔III〕的egtB和/或egtC。

(酶(1)和(2)的结构性质)

酶(1)具有上述酶学性质，即只要在存在S-腺苷甲硫氨酸和铁(II)的条件下，具有催化从组氨酸和硒代半胱氨酸生成海西宁硒半胱氨酸的反应的活性，则对于氨基酸序列、整体和部分的立体结构、分子量等结构性质；最适pH、最适温度、失活条件等生化学性质；来源生物等不做特别限制。但是由于酶(1)具有第一和第二活性，因此酶(1)优选为含有高度保守具有第一活性和/或第二活性的酶的保守结构域(Domain)。

作为具有第一活性的酶的保守结构域，例如可以列举SAM依赖性甲基转移酶的保守结构域，具体而言，可以列举含有DUF2260结构域的SAM依赖性甲基转移酶结构域。另外，作为具有第二活性的酶的保守结构域，例如可以列举硫酸酯酶的保守结构域，具体而言，可以列举甲酰甘氨酸生成酶(FGE)-硫酸酯酶结构域。由于酶具有第一和第二活性，上述保守结构域可以不是连接为一个整体，例如，可以在保守结构域内含有非保守结构域。另外，在SAM 依赖性甲基转移酶的保守结构域和硫酸酯酶的保守结构域之间,优选为含有DinB_2保守结构域，更优选为含有具有作为铁结合基序的HX₃HXE的DinB_2保守结构域。

例如，酶(1)的一例具有含有SAM依赖性甲基转移酶的保守结构域、DinB_2保守结构域和硫酸酯酶的保守结构域的构造，酶(1)的又一例具有含有DUF2260结构域的SAM依赖性甲基转移酶结构域、含有HX₃HXE的DinB_2保守结构域、以及FGE-硫酸酯酶保守结构域的构造。

酶(1)的优选例是具有与非专利文献2所述的NCUO4343的氨基酸序列的序列同一性优选为30％以上、更优选为40％以上、再优选为45％以上、进一步优选为60％以上、更进一步优选为70％以上的氨基酸序列。另外，在本说明书中，术语“序列同一性”是指将两个序列对齐时的序列之间的同一性(一致性；Identity)，而非两个序列之间的相似性(Simirality)。酶(1)的优选例的具体实例可以列举登录号分别是(括号中的数字表示使用SEQ ID NO：4 记载的AsEgtA蛋白质作为查询序列的Blastp获得的序列同一性)：XP_001727309.1(97％)、 XP_002375556.1(97％)、XP_001211614.1(74％)、GAA90479.1(75％)、XP_001261027.1(72％)、 XP_001275843.1(72％)、EDP55069.1(72％)、XP_755900.1(72％)、EHA24811.1(74％)、 XP_001397117.2(73％)、EYE96655.1(72％)、CAK42541.1(71％)、XP_680889.1(69％)、EPS32723.1 (66％)、GAD91762.1(63％)、EKV06018.1(63％)、XP_002487159.1(61％)、XP_002145387.1 (61％)、CDM31097.1(62％)、XP_002623045.1(57％)、EQL36096.1(57％)、EEQ91012.1(57％)、 XP_002794316.1(57％)、XP_002540839.1(57％)、XP_001246505.1(57％)、XP_003066681.1 (56％)、EFW18329.1(56％)、EEH06820.1(56％)、XP_003172803.1(55％)、EGE82230.1(56％)、 EGD95426.1(54％)、EZF30391.1(54％)、EHY53149.1(53％)、XP_002844140.1(54％)、 XP_003237555.1(54％)、EXJ78765.1(52％)、XP_001543980.1(53％)、EXJ84167.1(53％)、 EXJ76804.1(51％)、ETI21425.1(52％)、EXJ55868.1(52％)、EKG13377.1(51％)、XP_003836988.1(51％)、EON60831.1(50％)、EGE08446.1(52％)、EMD86163.1(51％)、EUN21814.1(51％)、EMD69895.1(50％)、EME40669.1(52％)、EUC45427.1(51％)、EEH18365.1(52％)、XP_001939537.1 (51％)、EUC28327.1(50％)、XP_003296645.1(50％)、EER38486.1(54％)、XP_007587632.1 (50％)、EOA87110.1(50％)、EEH47303.1(54％)、EMC91772.1(51％)、EJT79063.1(50％)、 XP_007289878.1(51％)、EMF09308.1(50％)、XP_007274188.1(49％)、XP_003849540.1(51％)、 ENH83409.1(50％)、EQB47754.1(48％)、XP_006693510.1(51％)、ETN41916.1(50％)、 XP_003711933.1(49％)、EWG46299.1(50％)、EGU87412.1(49％)、ESZ95365.1(48％)、EGC47631.1 (52％)、EXM31381.1(49％)、EXL83373.1(49％)、XP_385823.1(50％)、EMT70054.1(50％)、 EXK95313.1(49％)、CCT71860.1(50％)、EXM04867.1(49％)、EXA38531.1(49％)、EWZ34577.1 (49％)、EWY87102.1(49％)、ENH70585.1(49％)、EYB29661.1(50％)、EXK37219.1(49％)、 EWZ95323.1(49％)、EGY20613.1(49％)、EME78671.1(50％)、EKJ73623.1(50％)、EFQ30701.1 (48％)、EPE09977.1(48％)、EXV06624.1(49％)、ERS99852.1(49％)、EGO59462.1(49％)、 XP_003348780.1(48％)、EFY99927.1(49％)、XP_007594915.1(47％)、XP_003660752.1(49％)、 EAA27088.3(49％)、ERF68279.1(49％)、EFX04429.1(50％)、ETR98676.1(49％)、EFY84340.1 (48％)、XP_006968620.1(48％)、XP_003048884.1(49％)、EHK20832.1(49％)、EPE24413.1 (49％)、EJP62962.1(49％)、ETS83740.1(48％)、EHK45989.1(49％)、ELQ64904.1(47％)、 XP_006672555.1(48％)、ELQ40007.1(46％)、EXL83375.1(50％)、EXK95315.1(50％)、CCE33591.1 (48％)、EXM04869.1(51％)、EXA38533.1(50％)、EWZ95325.1(50％)、EXK37221.1(50％)、 EWZ34579.1(50％)、EWY87104.1(50％)、CCX31754.1(47％)、XP_956324.2(46％)以及XP_956324.2 (46％)的蛋白质，但不受上述的限制。其中，例如登录号为XP_001727309.1(97％)的蛋白质是具有SEQ ID NO：24记载的氨基酸序列的蛋白质。另外，确认了登录号为XP_001397117.2 (73％)的蛋白质是来源自黑曲霉的蛋白质，但确认在酱油曲霉中表达以及具有上述第一和第二活性。由此，作为酶(1)可以利用具有与AsEgtA蛋白质的氨基酸序列的序列同一性为40％以上、优选为50％以上、更优选为70％以上的氨基酸序列的甲基转移酶，或者被推定为甲基转移酶(methyltransferase，putative)的氨基酸序列或被认为是甲基转移酶的假定氨基酸 (hypothetical protein)的氨基酸序列的蛋白质。

酶(2)也具有上述酶学性质，即只要具有使用5'-磷酸吡哆醛作为辅酶，催化从海西宁硒半胱氨酸生成麦角硒因的反应的活性，则对其结构性质、生化学性质以及来源生物等不做特别限制。但是由于酶(2)具有第三活性，因此优选为含有高度保守具有第三活性的酶的保守结构域(Domain)。

作为具有第三活性的酶的保守结构域，可以列举例如PLP结合型半胱氨酸脱硫酶。作为酶(2)可以包括至少两种类型的结构的酶：具有包括了与贝约等人在文献(BELLO MH等，Fungal Genet Biol.2012Feb；49(2)：160-72；其全部公开内容通过引用并入本文)中记载的NCU04636 具有约75％序列同一性的PLP结合型半胱氨酸脱硫酶结构域的结构的酶；以及具有包括了在非专利文献2中记载的NCU11365具有约44％序列同一性的PLP结合型半胱氨酸脱硫酶结构域的结构的酶。酶(2)可以包含这两种中的任意一种或者两种。

(酶(1)和(2)的氨基酸序列)

酶(1)和(2)只要具有上述酶学性质，优选具有上述酶学性质和结构性质，则对其氨基酸序列不做特别限制。例如，SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列作为具有上述酶学性质和结构性质的酶(1)的一例，SEQ ID NO：5和6所示的氨基酸序列作为具有上述酶学性质和结构性质的酶(2)的一例。具有这些SEQ ID NO：4～6所示的氨基酸序列的酶全部来源自酱油曲霉(Aspergillus sojae)，并且被本发明的发明者们分别命名为AsEgtA、AsEgtB和AsEgtC 蛋白质。另外，编码这些酶的基因的碱基序列是SEQ ID NO：1～3所示的碱基序列。

同样地，SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列作为具有上述酶学性质和结构性质的酶(1) 的一例，具有该SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列的酶来源自米曲霉(Aspergillusoryzae)，并且被本发明的发明者们分别命名为AoEgtA蛋白质。另外，编码该酶的基因的碱基序列是 SEQ ID NO：23所示的碱基序列。

AsEgtA、AsEgtB和AsEgtC蛋白质是通过被存在于酱油曲霉的染色体DNA上的编码这些酶的基因所编码而得到的。另外，AoEgtA蛋白质是通过被存在于米曲霉的染色体DNA上的编码该酶的基因所编码而得到的。在本说明书中，有时将存在于这样的来源生物的染色DNA的基因，以及由该基因编码的蛋白质或者酶分别称为“野生型基因”，以及“野生型蛋白质”或者“野生型酶”。

酶(1)和(2)的氨基酸序列只要分别具有上述酶(1)和(2)的酶学性质，则也可以是由在野生型酶具有的氨基酸序列中出现一个到多个氨基酸的缺失、置换、加成等的氨基酸序列构成。这些氨基酸序列的“一个到多个氨基酸的缺失、置换、加成”中的“一个到多个” 的范围不做特别限制，例如是指1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19或20个氨基酸，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个左右的氨基酸，更优选为1、2、3、4或5个左右的氨基酸。另外，术语“氨基酸的缺失”是指氨基酸从序列中丢失或消除；术语“氨基酸的置换”是指氨基酸残基被其他氨基酸残基取代；术语“氨基酸的加成”是指通过将新氨基酸残基插入序列中而将新氨基酸残基添加到序列中。

作为“一个到多个氨基酸的缺失、置换或加成”的具体实施例包括一个到几个氨基酸被其他化学上类似的氨基酸置换的实施例。例如，可以列举将某疏水性氨基酸置换为其他疏水性氨基酸的情况，以及将某极性氨基酸置换成具有相同电荷的其他极性氨基酸的情况等。像这样在化学上类似的氨基酸在其技术领域是已知的。非极性(疏水性)氨基酸的具体实例可以列举丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。极性 (中性)氨基酸的具体实例可以列举甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和半胱氨酸。带正电荷的碱性氨基酸的具体实例可以列举精氨酸，组氨酸和赖氨酸。另外，带负电的酸性氨基酸的具体实例可以列举天冬氨酸和谷氨酸。

作为在野生型酶的氨基酸序列中，具有一个至几个氨基酸的缺失、置换、加成等的氨基酸序列，可以列举与野生型酶含有的氨基酸序列具有一定以上序列同一性的氨基酸序列，例如具有与野生型酶所含有的氨基酸相比，80％以上，优选85％以上，更优选90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％，进一步优选99.5％以上的序列同一性的氨基酸序列。

(编码酶(1)和(2)的基因)

编码酶(1)和(2)的基因只要具有编码酶(1)和(2)含有的氨基酸序列的碱基序列，且该酶(1)和(2)具有上述酶学特性的酶的氨基酸序列，优选具有上述酶学性质和结构性质，则对其不做特别限制。编码酶(1)和(2)的基因通过在转化株内过量表达以产生酶(1)和(2)。在本说明书中，术语“基因的表达”是指由基因通过转录和翻译而编码的酶以呈现其固有的催化活性的形式生产。另外，在本说明书中，术语“基因的过量表达”是指通过插入基因，以超过宿主生物体的原本表达水平地生产由该基因所编码的蛋白质(酶)。

编码酶(1)和(2)的基因可以是在其被导入宿主生物体时在该基因转录后，经剪接而能够生成酶(1)和(2)的基因，也可以是该基因被转录后，不经剪接而能够生成酶(1)和(2)的基因。

编码酶(1)和(2)的基因可以与来源生物的固有基因(即野生型基因)不完全相同，只要能够编码具有上述酶学性质的酶，其可以含有在严格条件下与野生型基因的碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的DNA。

在本说明书中，“在严格条件下杂交的碱基序列”是指将具有野生型基因的碱基序列的 DNA片段用作探针，通过菌落杂交法、噬菌斑杂交法、印迹杂交法等得到的DNA碱基序列。

在本说明书中，“严格条件”是指来自特定杂合体的信号可以与来自非特异性杂交体的信号清楚区分的条件，且根据使用的杂交系统，探针的种类、序列和长度而不同。这样的条件可以通过改变杂交温度、通过改变洗涤温度和盐浓度来决定。例如，在强烈地检测到来自非特异性杂交体的信号的情况下，通过提高杂交温度和洗涤温度，并且根据需要降低用于洗涤的盐浓度，可以提高特异性。另外，在来自特定杂种的信号也未被检测到的情况下，也可以通过降低杂交和洗涤的温度，以及根据需要增加洗涤的盐浓度来稳定杂交体。

作为严格条件的具体例子，例如，使用DNA探针作为探针，使用5×SSC、1.0％(w/v)核酸杂交用封闭剂(Boehringer Mannheim公司)和0.1％(w/v)N-月桂酰肌氨酸和0.02％(w/v)SDS进行杂交过夜(约8至16小时)。使用0.1～0.5×SSC和0.1％(w/v)SDS，优选使用0.1×SSC和0.1％(w/v)SDS，进行两次洗涤，每次15分钟。进行杂交和洗涤的温度为65℃以上，优选为68℃以上。

另外，作为具有在严格条件下杂交的碱基序列的DNA，可以列举例如使用包括具有源自菌落或噬菌斑的野生型基因的碱基序列的DNA，或者固定了该DNA的片段的过滤器(filter)，在上述严格条件下进行杂交而获得的DNA，或者在0.5～2.0M的NaCl存在下，在40～75℃的条件下进行杂交，优选在0.7～1.0M的NaCl的存在下，在65℃的条件下进行杂交之后，通过使用0.1～1×SSC溶液(1×SSC溶液含有150mM氯化钠和15mM柠檬酸钠)，在65℃的条件下洗涤过滤器而鉴别的DNA。探针的制作和杂交的方法可以按照MolecularCloning：A laboratory Manual，2nd-Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY， 1989，Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 1-38，JohnWiley&Sons， 1987-1997(以下将这些文献称为参考文献，参考文献的全部公开内容通过引用并入本文)等记载的方法来实施。另外，本领域的技术人员通过考虑除了上述缓冲液的盐浓度或温度等条件之外，还可以采取其他的探针浓度、探针长度、反应时间等各项条件，适当地设定用于获得具有在严格条件下与野生型基因的碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列的DNA的条件。

作为具有在严格条件下杂交的碱基序列的DNA，可以列举与具有野生型基因的碱基序列的用作探针的DNA的碱基序列具有一定以上的序列同一性的DNA，例如与含有野生型基因的碱基序列的DNA具有80％以上，优选为85％以上，更优选为90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上，98％或者99％以上，进一步优选为99.5％以上的序列同一性的DNA。

作为在严格条件下与野生型基因的碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列，例如野生型基因的碱基序列中含有1至多个，优选为1至50个，更优选为1至30个，进一步优选为 1至20个，进一步更优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基的缺失、置换、加成等的碱基序列。在此，术语“碱基的缺失”是指碱基缺失或从序列中消除，术语“碱基的置换”是指碱基被另一个碱基置换，术语“碱基的加成”是指以插入的方式添加新的碱基。

在严格条件下由与野生型基因的碱基序列互补的碱基序列杂交的碱基序列所编码的酶可能是由野生型基因的碱基序列编码的酶具有的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的缺失、置换、加成等而得到的氨基酸序列，其具有与由野生型基因的碱基序列编码的酶相同的酶活性。

(用于算出序列同一性的手段)

对于获得碱基序列或氨基酸序列的序列同一性的方法不做特别限制，例如，利用通常已知的方法，通过使用用于对齐野生型基因或者由野生型基因编码的酶的氨基酸序列与作为对象的碱基序列或氨基酸序列，从而算出两者之间的序列的一致率。

作为算出两个氨基酸序列或碱基序列的一致率的程序，例如已知Karlin和Altschul的算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA90: 5873-5877，1993),Altschul开发了使用该算法的BLAST程序(J.Mol.Biol.215:403- 410，1990)。进一步地,还已知比BLAST更高灵敏度地识别序列同一性的程序Gapped BLAST(Nucleic Acids Res.25:3389-3402，1997)。因此，本领域技术人员例如利用上述程序，能够从数据库中检索相对于给定的序列，表现出高序列同一性的序列。例如，可以在美国的National Center for Biotechnology Information的网页(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上使用那些程序。

上述各种方法可以通常用于从数据库中检索表示序列同一性的序列，但是作为识别个别的序列的同一性的手段，也可以使用Genetyx网络版version 12.0.1(Genetyx公司)的同源性分析。该方法基于Lipman-Pearson法(Science 227:1435-1441，1985)。在分析碱基序列的序列同一性时，如果可能的话使用编码蛋白质的区域(CDS或者ORF)。

(编码酶(1)和(2)的基因的来源)

编码酶(1)和(2)的基因例如来源自具有麦角硒因生产能力或者麦角硫因生产能力的物种或者表达酶(1)和(2)的物种。作为编码酶(1)和(2)的基因的来源生物，例如可以列举微生物。由于丝状菌中具有麦角硫因生产能力的已知菌种较多，因此在微生物中优选丝状菌。作为丝状菌的具体例子，可以列举曲霉属(Aspergillus)丝状菌，更具体可以列举酱油曲霉(Aspergillus sojae)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)、溜曲霉(Aspergillus tamarii)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)、白曲霉(Aspergillus kawachii)和斋藤曲霉(Aspergillussaitoi)等。

作为上述曲霉属丝状菌的具体实例而列举的酱油曲霉、米曲霉、黑曲霉、溜曲霉、泡盛曲霉、宇佐美曲霉、白曲霉和斋藤曲霉长期以来被用于味噌酱、酱油、日本酒、烧酒等发酵物的制造，以及柠檬酸的生产、淀粉酶等酶的制造，凭借对其高度酶生产力和长年使用带来安全性的高度信赖，是能够应用于工业的微生物。

如上所述，编码酶(1)和(2)的基因的来源生物不受特别的限制，只要在转换株中表达的酶(1)和(2)在宿主生物的培育条件下不会失活，或者有一定概率分别表现其活性即可。因此，编码酶(1)和(2)的基因的来源生物优选为与通过插入编码酶(1)和(2)的基因而转化的宿主生物有着近似培育条件的微生物。

(利用遗传工程技术克隆编码酶(1)和(2)的基因)

编码酶(1)和(2)的基因能够插入各种合适的公知载体。而且，将该载体导入适当的公知宿主生物，能够制作导入了含有编码酶(1)和(2)的基因的重组载体(重组DNA)的转化株。本领域技术人员可以适当选择编码酶(1)和(2)的基因的取得方法，编码酶(1) 和(2)的基因序列、酶(1)和(2)的氨基酸序列信息的取得方法，各种载体的制作方法或转化株的制作方法等。另外，在本说明书中转化或转化株分别包含转导或转导体。在后文中非限制性地记述了编码酶(1)和(2)的基因的克隆的一例。

克隆编码酶(1)和(2)的基因可以适当地使用通常用于基因克隆的一般方法。例如，可以从具有酶(1)和(2)生产能力的微生物或者各种细胞中，利用常规方法(例如参考技术文献中记载的方法)提取染色体DNA或mRNA。以提取的mRNA为模板能够合成cDNA。利用上述方法得到的染色体DNA或cDNA，能够制作染色体DNA或cDNA的库。

例如，编码酶(1)和(2)的基因可以通过将来源自含有该基因的微生物的染色体DNA 或cDNA作为模型，由克隆而得到。编码酶(1)和(2)的基因的来源生物如上文所述，作为一具体的实例，可以列举酱油曲霉NBRC4239株或者米曲霉RIB40株。例如培养酱油曲霉NBRC4239株，从得到的菌体上除去水分，在液氮中冷却的同时利用乳钵等将其物理磨碎以形成细粉末状的菌体碎片，利用常规方法从该菌体碎片中提取染色体DNA部分。提取染色体DNA 的操作可以利用DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen公司)等市售的染色体DNA提取试剂盒。

然后，以上述染色体DNA为模型，通过利用与5'末端序列和3'末端序列互补的合成引物进行聚合酶链式反应(以下称为“PCR”)，以扩增DNA。对引物不做特别限制，只要它们能扩增含有该基因的DNA片段即可。例如，可以列举参考酱油曲霉的基因组序列而设计的由SEQ ID NO：17至22所示的引物等。另外，使用这样的引物将扩增目的基因的全长，因此可以省略 RACE。作为其他的方法，通过5'RACE法或3'RACE法等适当的PCR，能够扩增含有目的基因片段的DNA，将它们连接以得到含有全长的目的基因的DNA。

另外，对于取得编码酶(1)和(2)的基因的方法不做特别限制，即使不适用基因工程技术的手段，例如采用化学合成法构建编码酶(1)和(2)的基因也是可行的。

确认通过PCR扩增的扩增产物或者化学合成基因中的碱基序列，例如可以通过以下步骤实现。首先，按照常规方法将欲确认其序列的DNA插入至适当的载体来制作重组DNA。为了克隆到载体中，可以使用例如TA Cloning Kit(Invitrogen公司)等市售试剂盒；例如pUC119 (Takara Bio公司)、pUC18(Takara Bio公司)、pBR322(Takara Bio公司)、pBluescript SK+(Stratagene公司)和pYES2/CT(Invitrogen公司)等市售质粒载体DNA；和例如λEMBL3 (Stratagene公司)等市售的噬菌体载体DNA。使用该重组DNA转化宿主生物，例如大肠杆菌(Escherichia coli)，优选为大肠杆菌JM109株(Takara Bio公司)或者大肠杆菌DH5 α株(Takara Bio公司)。利用QIAGEN Plasmid Mini Kit(Qiagen公司)等纯化得到的转化株含有的重组DNA。

然后用双脱氧测序技术(Methods in Enzymology，101,20-78,1983)检测插入该重组 DNA的各基因的碱基序列。对于在检测碱基序列时使用的序列分析装置不做特别限制，例如，可以列举Li-COR MODEL 4200L测序仪(Aloka公司)、370DNA测序系统(PerkinElmer公司)和CEQ 2000XL DNA分析系统(Beckman)等。由此，基于检测的碱基序列，可以获知翻译的蛋白质，即酶(1)和(2)的氨基酸序列。

(含有编码酶(1)和(2)的基因的重组载体的构建)

含有编码酶(1)和(2)的基因的重组载体(重组DNA)可以通过将含有编码酶(1)和(2)的任意基因的PCR扩增产物与各种载体以可以表达编码酶(1)和(2)的基因的方式结合来构建。例如，可以通过利用适当的限制酶切割含有编码酶(1)和(2)的任意基因的DNA 片段，并将该DNA片段连接到用适当的限制酶切割的质粒中来构建这样的重组载体。另外, 重组载体也可以通过使用例如In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech公司)等市售的重组载体制作试剂盒,将含有两端附着与质粒相同序列的该基因的DNA片段连接到来源自因反向聚合酶连锁反应(Inverse PCR)而扩增的质粒的DNA片段。

(转化株的制作方法)

对于在制造方法的一实施例中使用的转化株的制造方法不做特别限制。例如，可以列举按照常规方法将编码酶(1)、或者酶(1)和(2)的基因以表达的形式插入宿主生物体中的方法。具体而言，制作DNA构建体，在该DNA构建体中编码酶(1)和(2)的任意基因被插入至表达诱导型启动子和终止子之间。然后，通过仅利用含有编码酶(1)的基因的DNA构建体，或者利用含有编码酶(1)的基因的DNA构建体和含有编码酶(2)的基因的DNA构建体这两者来转化宿主生物体，从而获得仅过量表达编码酶(1)的基因的转化株，或者过量表达编码酶(1)的基因和编码酶(2)的基因这两者的转化株。在本说明书中，将用于转化宿主生物而制成的，由表达诱导型启动子-编码酶(1)或(2)的基因-终止子组成的DNA片段和含有该DNA片段的重组载体统称为“DNA构建体”。

对于将编码酶(1)、或酶(1)和(2)的基因以在宿主生物体中表达的方式引入宿主生物体中的方法不做特别限制；例如，可以利用同源重组直接将该基因导入宿主生物的染色体中的方法，也可以通过将该基因连接到质粒载体上来导入宿主生物体中的方法等。

在利用同源重组的方法中，可以将DNA构建体连接在染色体上重组位点的上游区域和下游区域的同源序列之间，插入到宿主生物体的基因组中。通过自身在高表达启动子的控制下于宿主生物内的过量表达，可以得到由自克隆(self-cloning)获得的转化株。对于高表达启动子不做特别限制，例如可以列举作为翻译延伸因子TEF1基因(tef1)的启动子区域、α -淀粉酶基因(amy)的启动子区域、碱性蛋白酶基因的启动子区域(alp)等。

在利用载体的方法中，使用常规方法将DNA构建体整合到用于转化宿主微生物的质粒载体中，并且可以按照常规方法转化相应的宿主生物体。

合适的载体-宿主系统只要是允许在宿主生物中生产酶(1)、或者酶(1)和(2)的系统，则对其不做特别限制。例如，可以列举pUC19和丝状菌的系统、pSTA14(Mol.Gen.Genet.218,99-104,1989)和丝状菌的系统等。

DNA构建体优选被导入宿主生物体的染色体中，但是作为其他的方法，也可以通过整合到自我复制型载体(Ozekietal，Biosci.Biotechnol.Biochem.59,1133(1995))中而不导入染色体来使用。

DNA构建体可以含有用于能够选择转化细胞的标记基因。对于标记基因不做特别限制，例如，可以列举如pyrG、niaD和adeA等与宿主生物体的营养需求互补的基因；以及例如针对吡啶代噻唑硫胺素、潮霉素B和寡霉素等药剂具有耐药性的基因等。此外，DNA构建体优选含有能够使编码酶(1)或酶(1)和(2)的基因在宿主中过量表达的启动子、终止子和其他调控序列(例如增强子和聚腺苷酸化序列等)。对于启动子不做特别限制，可以是任何合适的表达诱导型启动子或组成型启动子，例如可以列举tef1启动子、alp启动子和amy启动子等。对于终止子不做特别限制，例如可以是alp终止子、amy终止子和tef1终止子等。

如果插入的含有编码酶(1)或(2)的基因的DNA片段含有具有表达调控功能的序列，则在DNA构建体中并非一定需要编码酶(1)或(2)的基因的表达调控序列。另外，当通过共转化方法进行转化时，DNA构建体可以不包含标记基因。

可以将用于纯化的标签添加到DNA构建体中。例如，可以通过向编码酶(1)或(2)的基因的上游或下游添加合适的连接序列，将6个以上的组氨酸编码碱基序列的密码子添加到连接序列，以实现利用管柱的纯化。

DNA构建体的一实施例可以是例如将tef1基因启动子、编码酶(1)或(2)的基因、alp 基因终止子和pyrG标记基因连接到位于pUC19的多克隆位点的In-Fusion克隆位点的DNA构建体。

可以从本领域技术人员已知的方法中适当选择丝状菌的转化方法。例如，可以使用制作宿主生物的原生质体后，使用聚乙二醇和氯化钙的原生质体PEG技术(例如，参照Mol.Gen.Genet.218,99-104,1989，申请公开号为2007-222055的日本专利申请等)。再生转化株的培养基根据所使用的宿主生物和转化标记基因而适当选择。例如，在使用酱油曲霉作为宿主生物体，使用pyrG基因作为转化标记基因的情况下，可以在含有0.5％琼脂和1.2M 山梨糖醇的Czapek-Dox基本培养基(Difco公司)中再生转化株。

另外，例如，为了获得在制造方法的一实施例中使用的转化株，可以通过同源重组将编码存在于宿主染色体上的酶(1)、或酶(1)和(2)的基因的启动子置换为如tef1等高表达启动子。另外，除了高表达启动子外，优选插入如pyrG等转化标记基因。例如，为了实现这个目的，可以参照公开号为特开2011-239681的日本专利申请所述的第一实施例或图1，利用由编码酶(1)或(2)的基因的上流区域-转化标记基因-高表达启动子-编码酶(1)或(2) 的基因的全部或者一部分所组成的转化盒。在这种情况下，编码酶(1)或(2)的基因的上游区域和编码酶(1)或(2)的基因的全部或一部分用于同源重组。编码酶(1)或(2)的基因的全部或一部分可以使用包括从起始密码子延伸至中间区域的基因区域。适用于同源重组区域的长度优选为0.5kb以上。

为了确认产生了转化株，可以在酶(1)或酶(1)和(2)的酶活性存在的条件下培养转化株，然后检查培养后所得的培养物中的麦角硒因，或者通过确认检测的麦角硒因的量多于在相同条件下培育的宿主生物的培养物中的麦角硒因的量。

另外，为了确认产生了用于制造方法的一实施例的转化株，也可以通过从转化株中提取染色体DNA，以其为模型进行PCR，确认在发生转化的情况下生成了能够扩增的PCR产物。

例如，利用针对使用的启动子的碱基序列的正向引物和针对转化标记基因的碱基序列的反向引物的组合来进行PCR，并且确定是否产生具有预期长度的产物。

在通过同源重组进行转化的情况下，优选使用位于比所使用的上游同源区域更上游的正向引物和位于比所使用的下游同源区域更下游的反向引物进行PCR，确定在发生同源重组的情况下是否产生具有预期长度的产物。

(宿主生物)

宿主生物只要是通过含有编码酶(1)的基因的DNA构建体、或者含有编码酶(1)的基因的DNA构建体和含有编码酶(2)的基因的DNA构建体的转化而能够生产酶(1)、或者酶(1) 和(2)的微生物，则对其不做特别的限制，例如，鉴于硒化合物的毒性可以列举能够代谢硒的微生物，优选为能够表达硒酸还原酶(EC1.97.1.9)、硒代半胱氨酸裂解酶(EC4.4.1.16)、丝氨酸脱水酶(EC4.3.1.17)或这些酶中的两种或更多种的微生物，更优选为曲霉 (Aspergillus)属微生物、埃希氏菌(Escherichia)属微生物、木霉(Trichoderuma)属微生物、镰孢菌(Fusarium)属微生物、青霉(Penicillium)属微生物、根霉(Rhizopus)属微生物和链孢霉(Neuspora)属微生物等丝状菌、光合微生物以及益生菌微生物。

例如，已知有不动杆菌属微生物(Acinetobacter)、气单胞菌属微生物(Aeromonas)、节杆菌属微生物(Arthrobacter)、芽孢杆菌属微生物(Bacillus)、假丝酵母属微生物 (Candida)、头孢属微生物(Cephalosporium)、柠檬酸杆菌属微生物(Citrobacter)、棒状杆菌属微生物(Corynebacterium)、黄杆菌属微生物(Flavobacterium)、镰刀菌属微生物 (Fusarium)、微球菌属微生物(Micrococcus)、脉孢菌属微生物(Neurospora)、青霉属微生物(Penicillium)、假单胞菌属微生物(Pseudomonas)、沙门氏菌属微生物(Salmonella)、梨孢帚霉属微生物(Scopulariopsis)、月形单胞菌属微生物(Selenomonas)等微生物具有硒化合物的氧化还原能力(参照D.T.MAIERS et al.,APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,Oct.1988,p.2591-2593)。特别是从Thauera selenatis、大肠杆菌 (Escherichia coli)、阴沟杆菌(Enterobacter cloacae)、Bacillus selenatarsenatis 中发现编码硒酸还原酶或编码该酶的基因(参照阪口利文，《硒氧还原酶及其基因》，Biomedea， 2012年，第3卷，第133页)。另外，粘乳产碱杆菌(Alcaligenes viscolactis)、埃希氏菌属(Escherichia freundii)、假棒状杆菌(Corynebacterium pseudodiphtheriticum)、假单胞菌(Pseudomonasalkanolytica)、短杆菌(Brevibacterium leucinophagum)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、软腐菌(Erwinia carotovora)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、布克尔产碱杆菌(Alcaligenes bookeri)、无花果曲霉(Aspergillus ficuum)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、多枝犁头霉(Absidia corymbifera)、粗糙脉孢霉(Neurosporacrassa)、扩展青霉(Penicillium expansum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、白假丝酵母(Candida albicans)、贝氏汉逊酵母(Hansenula beckii)、酵母菌(Schwanniomyces occidentalis)具有硒代半胱氨酸裂解酶活性或具有所述活性的可能性(参照PATRICK CHOCAT et al.,JOURNAL OFBACTERIOLOGY,Oct.1983,p.455-457)。因此，这些微生物可以用作宿主生物。此外，除了那些微生物之外，可以将具有增强的硒代谢基因或异源基因表达的微生物用作宿主生物。并且，该微生物可能可以用作编码酶(1)的基因或编码酶(2)的基因的来源生物。

其中，宿主生物更优选为确认了能够生产麦角硫因的丝状菌、或者在其基因组DNA上具有编码酶(1)和(2)的基因的丝状菌。作为丝状菌的具体例子，可以列举在唐纳德等人的文献(Donald B.Melville et al,J.Biol.Chem.1956,223:9-17，其全部公开内容通过引用并入本文)和多萝西等人的文献(Dorothy S.Genghof，J.Bacteriology，Aug.1970，p.475-478，其全部公开内容通过引用并入本文)所记载的丝状菌，例如属于曲霉属、脉孢菌属、青霉属、镰刀菌属(Fusarium)、木霉属(Trichoderma)和毛霉属(Mucor)的丝状菌。作为在其基因组DNA上具有编码酶(1)和(2)的基因的丝状菌，例如可以列举属于新萨托菌(Neosartorya) 属、丝衣霉(Byssochlamys)属、篮状菌(Talaromyces)属、阿氏链霉菌(Ajellomyces) 属、副球菌(Paracoccidioides)属、Uncinocarpus属、球孢子菌(Coccidioides)属、节丝皮菌(Arthroderma)属、毛发癣菌(Trichophyton)属、外瓶霉(Exophiala)属、Capronia 属、卡氏枝孢霉(Cladophialophora)属、壳球孢(Macrophomina)属、小球腔霉(Leptosphaeria) 属、平脐蠕孢(Bipolaris)属、褥盘孢(Dothistroma)属、核腔菌(Pyrenophora)属、新壳梭孢(Neofusicoccum)属、毛球腔菌(Setosphaeria)属、Baudoinia属、顶囊壳 (Gaeumannomyces)属、盘二孢(Marssonina)属、亚球壳(Sphaerulina)属、核盘菌 (Sclerotinia)属、稻温病(Magnaporthe)属、轮枝菌(Verticillium)属、假尾孢 (Pseudocercospora)属、刺盘孢(Colletotrichum)属、蛇口壳(Ophiostoma)属、绿僵菌(Metarhizium)属、孢子丝菌(Sporothrix)属、粪壳(Sordaria)属等的丝状菌。

在这些丝状菌中，就安全性和容易培养而言，优选为作为编码酶(1)和(2)的基因来源生物的米曲霉、黑曲霉、烟曲霉、泡盛曲霉、宇佐美曲霉、白曲霉和斋藤曲霉等曲霉属微生物。

(编码酶(1)和(2)的基因的具体实例)

作为编码来源自酱油曲霉NBRC4239株的酶(1)的基因，例如可以列举记载在下文实施例中的基因AsEgtA。另外，作为编码来源自酱油曲霉NBRC4239株的酶(2)的基因，例如可以列举记载在下文实施例中的基因AsEgtB和AsEgtC。基因AsEgtA、AsEgtB和AsEgtC的碱基序列分别显示为序列表的SEQ ID NO：1～3中。此外，AsEgtA、sEgtB和AsEgtC蛋白质的氨基酸序列分别显示在序列表的SEQ ID NO：4～6中。

作为编码来源自米曲霉RIB40菌株的酶(1)的基因，例如可以列举记载在下文实施例中的基因AoEgtA。基因AoEgtA的碱基序列显示为序列表中SEQ ID NO：23。此外，AoEgtA蛋白质的氨基酸序列显示为序列表中SEQ ID NO：24。

对于从除酱油曲霉和米曲霉以外的微生物获得编码酶(1)和(2)的基因的方法不做特别限制。例如，可以通过基于基因AsEgtA、AsEgtB、AsEgtC和AoEgtA的碱基序列(SEQID NO： 1～3和SEQ ID NO：23)以及AsEgtA、AsEgtB、AsEgtC和AoEgtA蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：4～6和24)，对除了酱油曲霉和米曲霉以外的微生物的基因组DNA进行BLAST同源性检索，来特定具有与基因AsEgtA、AsEgtB、AsEgtC和AoEgtA的碱基序列的高度序列同一性的碱基序列的基因。或者，可以通过基于酱油曲霉和米曲霉以外的微生物的总蛋白质，特定具有与AsEgtA、AsEgtB、AsEgtC和AoEgtA蛋白质具有高度序列同一性的蛋白质，通过特定编码该蛋白质的基因来获得。可以通过利用获得的基因将来源生物转化为宿主生物，生产了麦角硒因，或者与宿主生物相比增加了麦角硒因的生产量来确定获得的基因是否与编码酶(1) 和(2)的基因是否相同。

由于酱油曲霉、米曲霉和黑曲霉在培养条件相似，所以具有一定概率能够将它们各自具有的基因互相插入而实现转化。例如，可以将编码来源自酱油曲霉的编码酶(1)、或者酶(1) 和(2)的基因导入作为宿主生物的米曲霉或黑曲霉来实现转化。为了确保酶(1)、或者酶(1) 和(2)具有所需的酶活性，优选编码酶(1)、或者酶(1)和(2)的基因的来源生物和宿主生物是相同的。例如，可以将编码来自酱油曲霉的酶(1)、或者酶(1)和(2)的基因转化到相同的酱油曲霉中。

编码酶(1)和(2)的基因可以是基于编码来自酱油曲霉等的酶(1)或(2)的基因的氨基酸序列，为了在宿主生物中表达而对其密码子、二级结构和GC含量进行优化的基因。作为这种基因的具体实例，可以列举在大肠杆菌中表达而合成的EcEgtA(SEQ ID NO：27)和EcEgtC(SEQ ID NO：28)。

(转化株的一个实施例)

在制造方法的一实施例中使用的转化株的一个实施例是通过将AsEgtA基因插入酱油曲霉，以过量表达AsEgtA蛋白质而转化的转化酱油曲霉。上述转化株的另一实施例是通过将基因AoEgtA插入米曲霉，转化以过量表达AoEgtA蛋白质的转化米曲霉。这样的转化酱油曲霉和转化米曲霉可以通过过量表达AsEgtA和AoEgtA蛋白来生产高于可检测量的麦角硒因，其中宿主生物不生产或者微量生产麦角硒因。此外，如下文的实施例所述，转化酱油曲霉和转化米曲霉不限于硒代半胱氨酸和硒代胱氨酸等有机硒化合物，还能够从亚硒酸等无机硒化合物中生产麦角硒因。因此，转化株的一实施例优选为与宿主生物相比编码酶(1)、或者酶(1) 和(2)的基因的表达以增加麦角硒因的方式增强的转化株。此外，转化株的一实施例更优选为与编码酶(1)的基因的表达被增强的转化株相比，以增加麦角硒因的方式增强的转化株。

另外，如下文的实施例所述，转化以过量表达AsEgtA蛋白质的转化酱油曲霉通过利用适于培养宿主生物酱油曲霉的DPY培养基，在30℃的条件下培养4～5日，在使用亚硒酸的情况下，每1g湿菌体质量能够获得15.8μg的麦角硒因，在使用硒代胱氨酸的情况下，每1g 湿菌体质量能够获得207.9μg的麦角硒因。因此，转化株的一实施例是编码酶(1)、或者酶 (1)和(2)的基因的表达被增强的转化株，以使得利用适于宿主生物生长的含有硒化合物的培养基，在30℃的条件下培养该转化株5天期间的情况下，麦角硒因的量为每1克湿菌体质量5μg以上，优选为10μg以上，更优选为20μg以上，进一步优选为40μg以上。转化株的又一实施例是编码酶(1)、或者酶(1)和(2)的基因的表达被增强的转化株，以使得利用适于宿主生物生长的含有亚硒酸的培养基，在30℃的条件下培养该转化株5天期间的情况下，麦角硒因的量为每1克湿菌体质量5μg以上，优选为6μg以上，更优选为10μg以上，进一步优选为15μg以上。转化株的又一实施例是编码酶(1)、或者酶(1)和(2)的基因的表达被增强的转化株，以使得利用适于宿主生物生长的含有硒代胱氨酸的培养基，在 30℃的条件下培养该转化株5天期间的情况下，麦角硒因的量为每1克湿菌体质量10μg以上，优选为20μg以上，更优选为40μg以上，进一步优选为100μg以上，更进一步优选为 200μg以上。

用于制造方法的一实施例中的转化株有时可以与由插入的编码酶(1)和(2)的基因所生产的一起，通过编码宿主生物原本保有的酶(1)和(2)的基因来生产与上述酶(1)和(2) 的结构性质相同或不同的野生型酶(1)和(2)。因此，即使不导入编码酶(2)的基因，在制造方法的一实施例中使用的转化株也能够生产麦角硒因。

在制造方法的一实施例中使用的转化株被插入编码下列(2)的酶的基因，并且过量表达该被插入的基因的转化古细菌或转化细菌。作为转化细菌的非限制性实例，可以列举通过 EcEgtA或EcEgtA和EcEgtC的质粒载体转化的转化大肠杆菌。

(制造方法)

制造方法的实施例是至少包括使组氨酸和硒化合物作用于转化株以得到麦角硒因的步骤的麦角硒因制造方法，其中该转化株被插入编码酶(1)、或者酶(1)和(2)的基因，并且过量表达被插入的基因。

将组氨酸和硒化合物作用于转化株上的方法只要是能使组氨酸和硒化合物与转化株接触，以利用转化株的酶而能够生产麦角硒因的方法，对此不做任何限制。例如，可以列举使用含有组氨酸和硒化合物且适于培育转化株的培养基，通过在适于培育转化株的条件下培养转化株，以制造麦角硒因的方法。对于培养方法不做特别限制，例如，可以列举在曝气或非曝气条件下进行的固体培养法或液体培养法。硒化合物的添加量只要不抑制转化株的生长即可，对此不做特别限制，例如在培养初期硒化合物是相对于菌体浓度非常小的量，优选为1mM 以下，更优选为0.1mM以下，进一步优选为0.05mM以下。为了获得大量的麦角硒因，优选在培养过程中或者随着菌体浓度的升高而增加硒化合物的添加量。例如，可以在培养开始后1 至24小时，优选为3至22小时，将浓度为0.001至10mM，优选为0.005至5mM的硒化合物额外地添加到培养液中。

培养基是用于培养宿主生物的常规培养基，即只要含有适当比例的碳源、氮源、无机物质和其他营养素的培养基，则可以使用任意的合成培养基或天然培养基。当宿主生物为曲霉属微生物的情况下，可以使用后述实施例中记载的DPY培养基，对此不做特别限制。但是，培养基成分中优选含有活化酶(1)所需的铁(II)。虽然铁(II)可以以化合物的形式添加到培养基中，但也可以以含矿物质的物质的形式添加。

硒化合物只要含有硒作为构成元素，则对此不做特别限制。例如，它可以是有机硒化合物、无机硒化合物及它们的盐，其中有机硒化合物及其盐优选为硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸、硒蛋氨酸、Se-(甲基)硒基-L-半胱氨酸、硒肽、硒蛋白和它们的盐，以及硒酵母，无机硒化合物及其盐优选为硒酸、亚硒酸、氯化硒、硒化物、硫化硒、二甲硒、硒代磷酸盐、二氧化硒及它们的盐。另外，硒化合物可以是含有有机硒化合物、无机硒化合物及它们盐的有机物。该有机物例如可以列举鲣鱼(加工品和干鲣鱼)、芥末(粉、颗粒芥末和膏状芥末)、猪肉(肾、肝和生肉)、牛肉(肾、生肉)、鮟鱇鱼(肝、生肉)、鳕鱼(鳕鱼子，生肉)、蓝鳍金枪鱼(红肉、生肉)、比目鱼(生肉)、鲣鱼(秋季捕捞、生肉)、帝王蟹(生肉)、葵花籽(油炸、调味)、竹荚鱼(烤)、方头鱼(生肉)、粒状调味料、黄鳍金枪鱼(生肉)、长鳍金枪鱼(生肉)、牡蛎(水煮)等含丰富硒的食品，但不限于此。硒化合物可以使用这些材料中的一种或两种以上的组合。

更优选地，硒化合物是硒代半胱氨酸或硒代胱氨酸。对于获得硒代半胱氨酸和硒代胱氨酸的方法不做限制，例如可以参考公开号为特开2001-61489号公报的日本专利申请来制造硒代半胱氨酸。

用于制造方法的一实施例中的转化株可以是上述转化株，例如在使用硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸等有机硒化合物作为硒化合物的情况下，转化株可以是导入了编码酶(1)和(2) 的基因且过量表达该被导入基因的转化株，在使用亚硒酸等无机硒化合物作为硒化合物的情况下，转化株可以是导入了编码酶(1)的基因且过量表达该被导入基因的转化株，但不限于此。

转化株的培养条件可以采用本领域技术人员公知的宿主生物的培养条件，例如，在宿主生物是丝状菌的情况下，可以将培养基的初始pH值调节至5至10，培养温度调节至20至40℃，培养时间可以适当选择，可以是数小时至数天，优选为1至7天，更优选为2至4天。对于培养手段不做特别限制，例如，可以采用曝气搅拌深层培养、振荡培养、静态培养等培养技术，优选为在存在充分的溶解氧的条件下培养。例如，作为培养曲霉属微生物的培养基和培养条件的一例，可以列举利用如后述实施例所述在DPY培养基，在30℃的条件下以160rpm 振荡培养3至5天。

对于培养结束后从培养物中提取硒元素的方法不做特别限制。为了提取目的，可以直接使用从培养物中经过滤、离心分离等操作而回收的菌体，也可以使用在回收后干燥的菌体或者进一步粉碎后的菌体。对于菌体的干燥方法不做特别限制，例如可以列举冷冻干燥、日晒干燥、热风干燥、真空干燥、曝气干燥、减压干燥等。

用于萃取的溶剂可以是任意能溶解麦角硒因的溶剂，例如可以列举甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮等有机溶剂；由这些有机溶剂和水混合而成的含水有机溶剂；以及水、温水和热水等。在加入溶剂后，根据需要在对菌体进行粉碎处理的同时提取麦角硒因。提取溶剂的温度可以设定为从室温到100℃。

作为麦角硒因的提取方法的一实施例，例如可以列举以下方法等：用水将从培养物收集的菌体洗涤后，将菌体加入水中以制作悬浊液，然后将得到的悬浊液以100℃、15分钟等条件下进行加温处理，通过离心分离收集上清液，再将收集的上清液过滤以除去不溶物。或另外，也可以不经过离心分离而直接过滤该加热处理后的悬浊液。

另外，代替上述的加热处理，例如可以使用下述方法用于菌体破碎处理：使用超声波粉碎机、法式压滤装置(French press)、珠磨机(DYNO-MILL)，研钵等破坏装置来破坏菌体的方法；使用如Yaselase等细胞壁裂解酶裂解菌体细胞壁的方法；或者使用SDS和Triton X-100 等表面活性剂来裂解菌体的方法。这些方法可以单独或组合使用。

可以通过将所得提取液进行离心分离、过滤、超滤、凝胶过滤、溶解差异分离、溶剂提取、色谱法(吸附色谱法、疏水性相互作用色谱法、阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱法、反相色谱)、结晶、活性炭处理，膜处理等纯化工艺来纯化麦角硒因。

麦角硒因的定性或定量分析可以通过例如LC-MS或LC-ICP-MS等来进行。本领域技术人员将适当选择分析的条件，例如，可以使用后述的实施例中描述的条件进行分析。

根据制造方法的一实施例，可以获得高产量的麦角硒因。例如，在非专利文献2的图S6和图3B等中记载了在无硒培养基中培养后产生的麦角硫因的生产量，以及在硒培养基中培养的麦角硫因和硒麦角硒因的峰值比，基于上述结果综合考虑，可以推定麦角硒因的生产量约为0.047μg/ml。相比之下，如后述实施例中所记载的，在制造方法的一实施例中，从分析值6.46μg-Se/ml(仅硒的量)计算麦角硒因的生产量为14.56μg/ml。因此，根据制造方法的一实施例与非专利文献2中描述的制造方法相比，具有能够制造100倍以上的麦角硒因的显著优点。

在制造方法的一实施例中，只要可以解决本发明的课题，可以在上述步骤之前、之后或期间加入各种其他步骤或操作。

制造方法的另一实施例不使用转化株，而是使用在其基因组DNA上具有编码酶(1)、或者酶(1)和(2)的基因的微生物的制造方法。例如，制造方法的另一实施例是一种麦角硒因的制造方法，包括使组氨酸和硒化合物作用于曲霉属微生物这样的曲霉等丝状菌以得到麦角硒因的步骤，其中该丝状菌在基因组DNA上具有编码酶(1)、或者酶(1)和(2)的基因。

在制造方法的一实施例中，生成物麦角硒因能够引起所用微生物的增殖抑制或生产抑制。于是，通过在培养基中添加铜离子等氧化剂，有可能使生成的麦角硒因二聚化(通过形成Se-Se 键)，从而避免微生物的增殖抑制或生产抑制。因此，在制造方法的一个实施例中，在将组氨酸和硒化合物应用于微生物期间，优选存在铜离子等氧化剂。

(麦角硒因的用途)

利用本发明的一实施例的制造方法或者转化株而得到的麦角硒因，充分利用其作为具有各种生理活性的功能性生体物质，以及作为耐热的水溶性物质的特征，可以用于制作一般食品和饮品、功能性食品和饮品、功能性声明的食品和饮品、特定保健用途的食品和饮品，营养功能食品和饮品，保健功能食品和饮品、特殊用途的食品和饮品、营养补充食品和饮品、健康补充食品和饮品、补充剂、美容食品和饮品、化妆品、医药产品，准医药产品或动物饲料等，或者生产这些产品的原材料。

特别是已知麦角硒因具有抗氧化活性，据悉该抗氧化活性达到其硫代类似物即麦角硫因的1000倍。因此，例如麦角硒因可以用作表现出捕获羟基自由基的能力、抑制亚铁的自动氧化的能力等生体抗氧化能力的物质，非常有用。另外，作为含有麦角硒因的具体产品，可以列举代替亚硒酸和硒代蛋氨酸的补充剂、用于癌症或缺血性心脏病等和生活方式相关疾病的预防剂或治疗剂，以及用于甲基汞的解毒剂等，但不限于此。

以下将通过实施例更详细地描述本发明，但是本发明并不受这些实施例的限制，只要能够解决本发明的问题，本发明可以采取各种形态。

实施例

[实施例1：插入基因AsEgtA、AsEgtB或AsEgtC的DNA构建体的制作]

(1)搜索对象基因

已知NCU04343和NCU11365是参与在粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)中生物合成麦角硫因的酶(参照非专利文献3和4)。另外，非专利文献3还提出了NCU04636涉及麦角硫因的生物合成的可能性。因此，使用编码粗糙脉孢菌的上述三种酶的基因作为查询序列，基于酱油曲霉(Aspergillus sojae)的NBRC4239株的基因组序列，检索与分别编码NCU04343、 NCU04636和NCU11365的基因的序列同一性相对高的结构域。检索使用了BLAST程序(tblastn) 和酱油曲霉NBRC4239株的基因组序列(DDBJ/EMBL/GenBank DNAdatabases，Accession numbers for the 65scaffold sequences；DF093557-DF093585，DNA RESEARCH 18，165-176， 2011)。

结果发现了SEQ ID NO：1所示的基因作为与NCU04343具有较高序列同一性的序列域。将该基因命名为AsEgtA基因(SEQ ID NO：1)，以示其为源自酱油曲霉的egtA基因。发现了 SEQ ID NO：2所示的基因作为与NCU04636具有较高序列同一性的序列域，将该基因命名为 AsEgtB基因(SEQ ID NO：2)。发现了SEQ ID NO：3所示的基因作为与NCU11365具有较高序列同一性的序列域，将该基因命名为AsEgtC基因(SEQ ID NO：3)。

使用基因信息处理软件Genetyx网络版version 12.0.1(Genetyx公司)进行氨基酸水平上的序列同一性的比较，AsEgtA蛋白质(SEQ ID NO：4)、AsEgtB蛋白质(SEQ ID NO：5) 和AsEgtC蛋白质(SEQ ID NO：6)与NCU04343、NCU04636和NCU11365的序列同一性分别为46％、75％和44％。此外，AsEgtC蛋白质与粟酒裂殖酵母中NCU11365的直系同源物SPBC660.12c的序列同一性为27％。上述结果表明，基于AsEgtA、AsEgtB和AsEgtC的碱基序列和氨基酸序列可以搜索其他曲霉属微生物的egtA基因、egtB基因和egtC基因。

(2)酱油曲霉NBRC4239株的染色体DNA的提取

用蒸馏水在150ml的锥形烧瓶中调制30ml的多聚蛋白胨-糊精培养基(1％(w/v)聚胨， 2％(w/v)糊精，0.5％(w/v)KH₂PO₄，0.1％(w/v)NaNO₃，0.05％(w/v)MgSO₄·7H₂O，0.1％(w/v)酪蛋白氨基酸；pH6.0)，接种酱油曲霉NBRC4239株的菌丝体，在30℃条件下振荡培养过夜。通过过滤所得的培养液来回收菌体，并将其置于纸巾片之间以除去水分，然后使用事先由液氮冷却过的研钵和研杵在液氮中冷冻的同时粉碎菌体。使用DNeasy Plant MiniKit (Qiagen公司)从得到的粉碎菌体中提取染色体DNA。

(3)用于构建体的质粒的制作

按下文的方法制作用于构建体的质粒，其中将翻译延伸因子基因tef1的启动子序列Ptef (tef1基因的上游748bp、SEQ ID NO：7)、碱性蛋白酶基因alp的终止子序列Talp(alp基因的下游800bp区域；SEQ ID NO：8)以及与尿苷的需求互补的转化标记基因pyrG(包括407bp 上游区、896bp编码区和535bp下游区的1838bp；SEQ ID NO：9)连接至质粒pUC19。

Ptef、Talp和pyrG使用上述得到的酱油曲霉NBRC4239株的染色体DNA作为模板DNA， KOD-Plus-DNA聚合酶(东洋纺公司)作为PCR酶，与该酶一起提供的试剂用作反应试剂，以及Mastercycler gradient(Eppendolf公司)作为装置，根据酶提供的方案进行PCR。用于扩增Ptef，Talp和pyrG的引物和PCR条件如下表1～3所示。另外，在表中所示的序列中，小写所示的序列是用于顺次连接Ptef、Talp和pyrG的各扩增片段，并进一步连接到pUC19 的添加的序列。扩增的DNA片段在1％(w/v)琼脂糖凝胶中分离，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)来纯化。

[表1]

[表2]

[表3]

pUC19使用了In-Fusion HD克隆试剂盒(Clontech公司)附属的pUC19线性化载体。使用上述In-Fusion HD克隆试剂盒，根据试剂盒提供的方案，将扩增的Ptef、Talp和pyrG连接到位于多克隆位点的In-Fusion克隆位点中的pUC19中，以获得用于构建体的质粒。

通过所得到的用于构建体的质粒，根据制造商的指示转化感受态细胞ECOS感受态大肠杆菌JM109(ECOS Competent E.coli JM109)(Nippon Gene公司)以获得转化大肠杆菌。

然后将得到的转化大肠杆菌在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中于37℃条件下振荡培养过夜。离心分离培养后的培养液以收集菌体。使用FastGene PlasmidMini Kit (Nippon Genetics公司)，根据试剂盒提供的方案从获得的菌体中提取质粒DNA。

(4)插入对象基因的构建体的制作

按照以下方法制作将对象基因AsEgtA、AsEgtB或AsEgtC连接到用于构建体的质粒的Ptef 和Talp之间的DNA构建体。

使用上述获得的用于构建体的质粒作为模板DNA，KOD-Plus-DNA聚合酶(东洋纺公司) 作为PCR酶，该酶附带的试剂作为反应试剂以及Mastercycler梯度(Eppendolf公司)作为装置，根据该酶提供的方案进行反向PCR，从而获得用于构建体的质粒的载体片段。使用的引物和PCR条件如下表4所示。在1％(w/v)琼脂糖凝胶中分离扩增的载体片段，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)(Qiagen)来纯化。

[表4]

为了扩增来源自酱油曲霉的AsEgtA(SEQ ID NO：1)、AsEgtB(SEQ ID NO：2)和AsEgtC (SEQ ID NO：3)基因，使用获得的酱油曲霉NBRC4239株的染色体DNA作为模板DNA，KOD-Plus-DNA聚合酶(东洋纺公司)作为PCR酶，该酶附带的试剂作为反应试剂以及Mastercycler gradient(Eppendolf公司)作为装置，根据酶提供的方案进行PCR。用于扩增AsEgtA，AsEgtB和AsEgtC的引物和PCR条件显示在下表5～7中。另外，在表中所示的序列中，小写所示的序列中添加了用于连接到用于构建体的质粒(在Ptef和Talp之间)的添加的序列。在1％(w/v)琼脂糖凝胶中分离扩增的DNA片段，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)来纯化。

[表5]

[表6]

[表7]

按照上文所述，按照试剂盒附带的方案使用In-Fusion HD克隆试剂盒连接扩增的载体片段与AsEgtA、AsEgtB或AsEgtC，得到用于插入的对象基因的DNA构建体，该对象基因被插入了AsEgtA、AsEgtB或AsEgtC。像这样获得的DNA构建体由来自pUC19的DNA片段、Ptef的DNA片段、AsEgtA的DNA片段；AsEgtB或AsEgtC、Talp的DNA片段、pyrG的DNA片段和来自pUC19的DNA片段从5'末端侧到3'末端侧连接而成。换而言之，可以得到Ptef-AsEgtA，AsEgtB或AsEgtC-Talp-pyrG顺次连接到pUC19的MCS中的三种不同的DNA构建体。

通过得到的DNA构建体，根据制造商的指示转化感受态细胞ECOS CompetentE.coli JM109 (Nippon Gene公司)，以获得转化的大肠杆菌。

将得到的转化大肠杆菌在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中于37℃条件下振荡培养过夜。离心分离培养后的培养液以收集菌体。使用FastGene Plasmid MiniKit(Nippon Genetics公司)，根据试剂盒提供的方案从得到的菌体中提取质粒DNA(DNA构建体)。

通过确定插入到被提取的质粒DNA中的各DNA的碱基序列，确定得到了被插入了AsEgtA、 AsEgtB或AsEgtC的DNA构建体。

[实施例2：转化酱油曲霉的制作(1)]

(1)来源自酱油曲霉NBRC4239株的pyrG破坏株

将各DNA构建体用乙醇沉淀之后，在TE中溶解，以形成具有所需浓度的DNA溶液，然后使用该DNA溶液按照以下顺序来转化来源自酱油曲霉NBRC4239株的pyrG破坏株(pyrG基因的上游48bp，编码区896bp，下游240bp)。

(2)来源自酱油曲霉菌NBRC4239株的pyrG破坏株的转化

将来源自酱油曲霉NBRC4239株的pyrG破坏株的菌丝体接种到500ml锥形瓶内的含有 20mM尿苷的聚胨糊精液体培养基100ml中，接种的培养基在30℃的条件下振荡培养约20个小时后，回收菌体。从回收的菌体制作原生质体。使用得到的原生质体和20μg的用于插入对象基因的DNA构建体，通过原生质体PEG法进行转化，然后使用含有0.5％(w/v)琼脂和1.2M山梨糖醇的Czapek-Dox基本培养基(Difco；pH6)在30℃的条件下培养5天以上，得到具有形成菌落能力的转化酱油曲霉。

通过导入补偿尿苷需求的基因pyrG，得到的转化酱油曲霉能够在不含尿苷的培养基中培养，因此能够被选作导入目的基因的菌株。

[实施例3：插入基因AoEgtA的DNA构建体的制作]

(1)对象蛋白质的检索

基于米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40株的总蛋白质，以酱油曲霉的AsEgtA蛋白的氨基酸序列作为查询序列搜索具有高序列同一性的蛋白质。搜索使用DOGAN(http://www.bio.nite.go.jp/dogan/project/view/AO)。

结果发现AO090012000265为与AsEgtA的氨基酸序列具有相对高序列同一性的蛋白质。另外，AO090012000265在非专利文献5的表2中记载为与粟酒裂殖酵母的Egt1相似的蛋白质。AO090012000265被认为与AsEgtA具有97％的序列同一性。将编码AO090012000265的基因命名为AoEgtA基因(SEQ ID NO：23)，以示其为源自米曲霉(Aspergillus oryzae)的 egtA基因。AoEgtA蛋白的氨基酸序列记载在SEQ ID NO：24中。

(2)米曲霉RIB40菌株的染色体DNA的提取

除了使用米曲霉RIB40菌株的菌丝体之外，按照与上述实施例1-(2)相同的方法进行。

(3)用于构建体的质粒的制作

使用上述实施例1-(3)中制作的载体片段。

(4)用于插入对象基因的构建体的制作

除了对象基因是AoEgtA并且使用上文获得的米曲霉RIB40菌株的染色体DNA作为模板 DNA之外，按照与上述实施例1-(4)相同的方法进行。另外，用于扩增AoEgtA的引物和PCR 条件如下表8所示。

[表8]

另外，与上述实施例1-(4)相同，通过确定插入到被提取的质粒DNA中的DNA的碱基序列，确定得到插入了AoEgtA的DNA构建体。

[实施例4：转化米曲霉的制作]

除了转化记载在公开号为特开2013-034416号公报的日本专利申请中的来源自米曲霉 RIB40菌株的pyrG破坏株之外，按照与上述实施例2-(1)和(2)中相同的方法进行。

[实施例5：使用转化的酱油曲霉的麦角硒因生产]

按照以下方式比较作为对照株的酱油曲霉NRBC4239株和通过基因AsEgtA和AsEgtC转化的转化酱油曲霉的各自的麦角硒因生产能力。

将各菌株的菌丝体接种到200mL锥形瓶中的添加了硒代胱氨酸的DPY液体培养基(0.1％ (w/v)组氨酸、1mM硒代胱氨酸、1％(w/v)聚胨、2％(w/v)糊精、0.5％(w/v)酵母提取物、0.5％(w/v)KH₂PO₄、0.05％(w/v)MgSO₄·7H₂O、0.00017％FeSO₄；pH未调节)40ml 中，在30℃、160rpm的条件下振荡培养5天。然后在Miracloth(Calbiochem公司)上从培养后的培养物中回收菌体。用40ml蒸馏水洗涤回收的菌体后，将菌体压在纸巾片之间以去除水分，从而得到湿菌体。通过添加8ml的水并搅拌，得到菌悬浊液。在100℃、15分钟的条件下加热处理得到的菌悬浊液。在该处理后，经离心分离得到回收的作为上清液的菌体外液, 并利用0.45μm的过滤器过滤该菌体外液以得到麦角硒因提取液。

通过下列条件的LC-MS分析所得的麦角硒因提取液。

[LC-MS的条件]

LC装置；Agilent 1100系列(安捷伦(Agilent)公司)

质谱仪；QSTAR Elite(AB sciex公司)

柱；COSMOSIL HILIC(4.6×250mm)

洗脱液；乙腈+0.1％甲酸：水+0.1％甲酸＝75：25(v/v)

流量；250μl/ml

检测；ESI阳性

注射；10μl

温度；室温

使用酱油曲霉NBRC4239株和由AsEgtA和AsEgtC转化的转化酱油曲霉而得到的麦角硒因提取液对应麦角硒因的质子化离子，m/z 278的LC-MS分析结果如图1所示。酱油曲霉NBRC4239 株的峰值非常小，而由AsEgtA和AsEgtC基因转化的转化酱油曲霉菌则被清楚地检测到了。

另外，对应于麦角硫因质子化离子的m/z 230处的LC-MS分析结果如图2所示。在使用酱油曲霉NBRC4239株的情况下检测到微量对应于麦角硫因的峰，而使用由基因AsEgtA和 AsEgtC转化的转化酱油曲霉的情况下则清楚地检测到对应于麦角硫因的峰。

[实施例6：麦角硒因生产的确认]

图3显示了在保持时间(retention time)31分钟附近检测到的图1所示的m/z 278处的峰的放大的MS频谱。而且，图4显示了由相对同位素丰度估算的麦角硒因的离子分布的计算值。由于离子分布的实测值基本一致，因此上述峰是表示麦角硒因的峰，从而证明了由基因AsEgtA和AsEgtC转化的转化酱油曲霉生产了麦角硒因。

[实施例7：使用转化酱油曲霉的麦角硒因的生产(1)]

在200mL锥形瓶中，将由基因AsEgtA和AsEgtC转化的转化酱油曲霉的菌丝体分别接种到40ml的DPY液体培养基；40ml的添加亚硒酸DPY液体培养基(1mM亚硒酸，0.1％(w/v)组氨酸、1％(w/v)聚胨、2％(w/v)糊精、0.5％(w/v)酵母提取物、0.5％(w/v)KH₂PO₄、 0.05％(w/v)MgSO₄·7H₂O，0.00017％FeSO₄；pH未调节)；或者40ml的添加了硒代胱氨酸的 DPY液体培养基，在30℃的条件下以160rpm振荡培养5天。然后在Miracloth(Calbiochem 公司)上从培养后的培养物中回收菌体。将回收的菌体用40ml蒸馏水洗涤后，将菌体压在纸巾之间以除去湿气，从而得到2.28g(添加有硒胱氨酸的DPY液体培养基)和1.89g(添加有亚硒酸的DPY液体培养基)的湿菌体质量。通过加入8ml水并搅拌，得到菌悬浊液。在100℃、 15分钟的条件下加热处理得到的菌悬浊液。在该处理后，利用0.45μm的过滤器过滤该经离心分离得到回收的作为上清液的菌体外液，以得到麦角硒因提取液。

通过上述条件的LC-MS分析所得麦角硒因提取液中存在麦角硒因。另外，根据山下等人在文章(THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.285，No.24，pp.18134-18138，June 11，2010，“EXPERIMENTAL PROCEDURES”，“Selenium Determination”，其全部公开内容通过引用并入本文)中描述的条件，通过LC-ICP-MS定量麦角硒因和总硒。

对应于麦角硒因的m/z 278的LC-MS分析结果如图5所示。DPY液体培养基本身未检出麦角硒因，通过添加硒胱氨酸或者亚硒酸而检出了麦角硒因。因此，确认了只要使用转化酱油曲霉，通过向培养基中添加硒化合物能够生产麦角硒因。

按照上述方法分析麦角硒因提取液中的麦角硒因含量(硒的当量)，在使用添加硒胱氨酸的液体培养基的情况下为16.3μg-Se/g-提取液，在使用添加亚硒酸的液体培养基的情况下为4.6μg-Se/g-提取液。另外，按照DAN荧光法分析麦角硒因提取液中的总硒的当量，在使用添加硒胱氨酸的液体培养基的情况下为20.8μg-Se/g-提取液，在使用添加亚硒酸的液体培养基的情况下为8.1μg-Se/g-提取液。另外，单位湿菌体质量的麦角硒因生产量为在使用添加硒胱氨酸的液体培养基的情况下为128.93μg/g-湿菌体质量，在使用添加亚硒酸的液体培养基的情况下为43.89μg/g-湿菌体质量。根据这些结果，能够通过利用转化酱油曲霉，使用硒胱氨酸或亚硒酸而得到大量的麦角硒因。另外，DAN荧光法是一种在使用硝酸/高氯酸混合物进行湿热消解后，与2,3-二氨基萘(DAN)反应，从而利用与Se(IV)络合产生的4,5- 苯并异硒醇(Se-DAN)的荧光来确定Se的技术。该方法参照沃特金森的文献(J.H.Watkinson， Anal.Chem.，38(1)，92-97(1966)，其全部公开内容通过引用并入本文)。

[实施例8：使用转化酱油曲霉的麦角硒因的生产(2)]

除了接种酱油曲霉NBRC4239株；由基因AsEgtA转化的转化酱油曲霉；由基因AsEgtA和 AsEgtB转化的转化酱油曲霉；和由转化AsEgtA基因和AsEgtC基因的转化酱油曲霉的菌丝体，以及在160℃，30℃条件下振荡培养4天以外，与上述实施例7中的操作相同。汇总的结果如表9和表10所示。

[表9]

[表10]

根据上述结果，能够通过利用转化酱油曲霉，使用硒胱氨酸或亚硒酸而得到大量的麦角硒因。另外，令人惊讶的是得到了以下结果：由基因AsEgtA转化的转化酱油曲霉相比于由基因AsEgtA和AsEgtB转化的转化酱油曲霉以及由基因AsEgtA和AsEgtC转化的转化酱油曲霉，其硒代半胱氨酸和总硒含量更高。

[实施例9：使用转化米曲霉的麦角硒因的生产]

按照以下方式比较作为对照株的米曲霉RIB40株和由基因AoEgtA转化的转化米曲霉的各自的麦角硒因生产能力。

向200mL锥形瓶中的添加有硒胱氨酸的DPY液体培养基40ml中接种各菌株的菌丝体，在 30℃的条件下以160rpm振荡培养4天。然后在Miracloth(Calbiochem公司)上从培养后的培养物中回收菌体。用40ml蒸馏水洗涤回收的菌体后，将该菌体压在纸巾片之间以去除水分，从而得到1.84g质量的湿菌体。通过添加8ml的水并搅拌，得到菌悬浊液。在100℃、15分钟的条件下加热处理得到的菌悬浊液。在该处理后，利用0.45μm的过滤器过滤该经离心分离得到回收的作为上清液的菌体外液，以得到麦角硒因提取液。

通过上述条件的LC-MS分析所得麦角硒因提取液中存在麦角硒因。另外，麦角硒因的定量按照山下等人的文献中记载的条件，通过LC-ICP-MS来分析。

图6显示了对应于麦角硒因的m/z 278的LC-MS分析结果。在米曲霉中，从对照株中检测到相比酱油曲霉NBRC4239株稍大的峰作为麦角硒因。另一方面，由基因AoEgtA转化的转化株中在保持时间31.5分钟附近清楚地检测到麦角硒因的峰。这些结果表明，通过使用转化米曲霉可以大量生产麦角硒因。

如上所述分析麦角硒因提取液中的麦角硒因含量(硒当量)，在使用米曲霉的情况下，麦角硒因的含量为32.3μg-Se/g-提取液。另外，单位质量湿菌体的麦角硒因的生产量为316.58 μg/g-湿菌体质量。另外，通过DAN荧光测定法测定麦角硒因提取液中的总硒含量，其结果为39.1μg-Se/g-提取液。

[实施例10：硒化合物的毒性]

在DPY液体培养基中添加0mM、0.1mM、0.3mM或者1.0mM硒代胱氨酸或亚硒酸。在这些培养基中分别接种作为对照株的酱油曲霉NBRC4239菌株、或者由基因AsEgtA和AsEgtC转化的转化酱油曲霉菌的菌丝体，在30℃的条件下以160rpm振荡培养4天。然后在Miracloth (Calbiochem公司)上从培养后的培养物中回收菌体。用40ml蒸馏水洗涤回收的菌体后，将该菌体压在纸巾片之间以去除水分，以测定湿菌体的重量。

关于硒化合物的各自的浓度，图7和图8分别表示转化株相对于对照株的湿菌体重量的相对量。如图7和8中所示，转化株对每种硒化合物都显示出抗性。

[实施例11：转化酱油曲霉的确认]

向试管内的10ml的DPY液体培养基中分别接种作为对照株的酱油曲霉NBRC4239株；由基因AsEgtA、AsEgtB和AsEgtC之一转化的转化酱油曲霉；以及由基因AsEgtA和AsEgtB或和AsEgtC转化的转化酱油曲霉的各菌丝体，并且在30℃的条件下振荡培养3天后回收菌体。使用珠细胞破碎装置(MS-100R；Tomy精工公司)在冷冻条件下研磨回收的菌体，得到研磨菌体粉末，并将其悬浊于0.1％(w/v)SDS水溶液中以得到SDS悬浊液。向得到的SDS悬浊液中加入1/4体积的样品缓冲液(Lane Marker Reducing Sample Buffer，ImmunoPure(5X)； Thermo Fisher Scientific)并搅拌，然后将混合物在98℃的条件下热处理3分钟。经过该处理之后，通过离心分离收集上清液，然后将相当于0.2mg菌体的上清液施加到丙烯酰胺凝胶上并进行电泳以进行SDS-PAGE。结果如图9所示。

如图9所示，AsEgtA蛋白质从氨基酸序列估计的预期分子量为95.7kDa，在SDS-PAGE中显示为90kDa附近的两条带。同样地，AsEgtB蛋白质从氨基酸序列估计的预期分子量为 56.4kDa，在SDS-PAGE中显示为略少于50kDa的带。此外，AsEgtC蛋白质从氨基酸序列估计的预期分子量为51.2kDa，在SDS-PAGE中显示为50kDa的带。

如图9所示，对照株几乎没有表达AsEgtA蛋白质、AsEgtB蛋白质和AsEgtC蛋白质，而 (AsEgtA+AsEgtB)转化株和(AsEgtA+AsEgtC)转化株则表达了AsEgtA蛋白质和AsEgtB蛋白质或和AsEgtC蛋白质。另外，AsEgtA转化株、AsEgtB转化株和AsEgtC转化株分别表达对应的AsEgtA蛋白质、AsEgtB蛋白质和AsEgtC蛋白质。

[实施例12：转化大肠杆菌的制作]

基于AsEgtA和AsEgtC各自的氨基酸序列，从密码子、二级结构和GC含量等观点看来，优化了基因序列以适于在大肠杆菌中表达，通过将EcoRV序列(GATATC)连接到基因的上游和将SpeI序列(ACTAGT)连接到基因的下游，获得EcEgtA(SEQ ID NO：27)和EcEgtC(SEQ ID NO：28)。

构建pUTE120K'作为表达载体。换而言之，用NheI和HpaI消化公开号为特开平06-292584 的日本专利申请中记载的pUTE100K'，以去除lac启动子。接下来，将具有NheI位点的 pKK223-3(GE公司)的Tac启动子区域连接到3'，连接到5'末端的EcoRV位点被PCR扩增和纯化。接下来，当NheI消化后，插入到lac启动子原本位于pUTE100K'的位点，以制作pUTE120K'。

用限制性酶EcoRV和SpeI处理pUTE120K'。然后，连接EcEgtA或EcEgtC以制作插入了 EcEgtA或EcEgtC的质粒pUTE120K'-EcEgtA和pUTE120K'-EcEgtC。

利用上述用于构建体的质粒来培养转化大肠杆菌，并纯化质粒pUTE120K'-EcEgtA和 pUTE120K'-EcEgtC。接下来，利用限制酶BamHI和SpeI处理pUTE120K'-EcEgtC，切除含有基因EcEgtC的片段，并纯化。另外，用限制酶BamHI和NheI处理pUTE120K'-EcEgtA，并插入含有上述基因EcEgtC的片段，制作质粒pUTE120K'-EcEgtA-EcEgtC。利用该质粒转化大肠杆菌JM109菌株，从而得到转化大肠杆菌。

利用含有1mM硒代胱氨酸或1mM亚硒酸和0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)的TY培养基(1％(w/v)细菌用胰蛋白胨、0.5％(w/v)Bacto酵母提取物，0.5％ (w/v)NaCl，pH7.0)，在25℃的条件下培养转化大肠杆菌16小时，由此在全体培养液和回收菌体的热水提取液中均检测到了麦角硒因。

[实施例13：插入基因AnEgtA的DNA构建体的制作]

(1)搜索对象蛋白质

基于Non-redundant protein sequences(nr)数据库，使用酱油曲霉的AsEgtA蛋白质的氨基酸序列作为查询序列搜索具有高序列同一性的蛋白质。搜索使用了Blastp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastp&PAGE_TYPE＝BlastSearch&L INK_LOC＝blasthome)。

结果从与AsEgtA蛋白质的氨基酸序列具有高度序列同一性的蛋白质中，发现了XP_001397117.2(SEQ ID NO：30)是黑曲霉Aspergillus niger CBS 513.88菌株的同源蛋白质。XP_001397117.2被认为与AsEgtA蛋白具有73％的序列同一性。从黑曲霉的基因组DNA中特定出编码XP_001397117.2的基因，将其命名为AnEgtA基因(SEQ ID NO：29)，以示其为源自黑曲霉的egtA基因。

(2)黑曲霉IAM2533株的染色体DNA的提取

除了使用黑曲霉IAM2533株的菌丝体之外，按照与上述实施例1-(2)相同的方法进行。

(3)用于构建体的质粒的制作

使用上述实施例1-(3)中制作的载体片段。

(4)制作用于插入对象基因的构建体

除了对象基因是AnEgtA基因并且使用上文获得的黑曲霉IAM2533株的染色体DNA作为模板DNA之外，按照与上述实施例1-(4)相同的方法进行。另外,用于扩增AnEgtA基因的引物和PCR条件如下表11所示。

[表11]

另外,与上述实施例1-(4)相同，通过确定插入到被提取的质粒DNA中的DNA的碱基序列，确定得到了插入基因AnEgtA的DNA构建体。

确认克隆的基因AnEgtA的序列与被公开基因组信息的黑曲霉CBS 513.88菌株的推定基因(ANI_1_792134)的序列相匹配(对应的氨基酸序列是XP_001397117.2)。

[实施例14：转化酱油曲霉的制作(2)]

除了使用其中插入基因AnEgtA的DNA构建体之外，按照与实施例2-(1)和(2)相同的方法进行。

[实施例15：使用转化酱油曲霉生产麦角硒因(3)]

除了接种作为对照的酱油曲霉NBRC4239菌株和由基因AnEgtA转化的转化酱油曲霉的菌丝体以外，按照与上述实施例7相同的方法进行。关于从所得的麦角硫因提取液和主培养后的培养物(已经通过0.45μm过滤器过滤)获得的培养物上清液，按照山下等人的文献中所述的条件，通过LC-ICP-MS分析来定量麦角硒因。对照株与转化酱油曲霉的麦角硒因的生产量的比较结果如表12所示。

[表12]

如表12所示，与由基因AsEgtA转化的转化酱油曲霉一样，由基因AnEgtA转化的转化酱油曲霉相比未经转化的对照株，在使用任意一种培养基的情况下，提取液和培养液中的麦角硒因的生产量都多。这些结果可知，用源自不同来源的生物体的异源基因AnEgtA所转化的转化酱油曲霉也可以高效地生产麦角硒因。

[实施例16：使用转化大肠杆菌的麦角硒因生产]

如下表13所示，作为对照株的导入了用于表达的载体pUTE120K'的大肠杆菌；由基因 EcEgtA或EcEgtC转化的转化大肠杆菌；以及由基因EcEgtA和基因EcEgtC转化的转化大肠杆菌的各自麦角硒因的生产能力的比较结果如下。

[表13]

将表13中所示的各菌株接种到在19ml试管中的2.5ml的TY培养基中，在37℃、180rpm 振荡的条件下进行16小时的种子培养。将种子培养后的20μl的培养液接种到在19ml试管中的2.5ml的含有氨苄青霉素和0.5mM IPTG的TY培养基中。另外，用于主培养中的TY培养基准备了以下三个系统：含有0.1mM硒代胱氨酸(TY++)的TY培养基；含有0.01mM硒代胱氨酸(TY+)的TY培养基；以及在开始培养的6小时后添加硒胱氨酸至0.01mM的TY培养基 (TY+○)。

另外，除了上述培养外，还将种子培养后的20μl的培养液接种到在19ml试管中的含有氨苄青霉素和0.5mM IPTG的0.6ml的TY培养基中，在25℃、180rpm振荡的条件下进行25 小时的主培养。此时，在添加了硒胱氨酸至0.01mM后，从培养开始经过20.5小时后，添加10μl的2.5mM的硒胱氨酸，继续培养4.5小时(TY+++)。

从培养后的培养物中通过离心分离(12,000rpm、4℃、10分钟)以回收作为沉淀物的菌体。向从1ml的TY+++、TY+和TY+○培养液中得到的菌体，以及从0.6ml的TY+++培养液中得到的菌体添加0.2ml的水，得到菌悬浊液。在98℃、10分钟的条件下加热处理得到的菌悬浊液。在该处理后，利用0.45μm的过滤器过滤该经离心分离得到回收的作为上清液的菌体外液，以得到麦角硒因提取液。

关于从所得的麦角硒因提取液和主培养后的培养物(已经通过0.45μm过滤器过滤)获得的培养物上清液，按照下述的条件，通过LC-MS-MS分析来定量麦角硒因。麦角硒因的定量结果如表14所示。

LC装置；ACQUITY UPLC(Waters公司)

质谱仪；Micromass Quattromicro API(Waters公司)

柱；COSMOSIL 2.5HILIC(3.0×100毫米)

洗脱液；乙腈+0.1％甲酸：水+0.1％甲酸＝80:20(v/v)

流量；500μl/ml

检测；ESI阳性

注射；2μl

温度；40℃

量化方法；使用硒代葡萄糖样品(米曲霉产物)的校正曲线法

[表14]

如表14所示，在任何培养系统中，对照株和EcEgtC转化株的不论是在培养上清液还是在麦角硒因提取物中都没有检测到麦角硒因。由此可知，对照株和EcEgtC转化株不具有生产麦角硒因的能力，或者只具有非常微弱的生产麦角硒因的能力。

另一方面，EcEgtA转化株和(EcEgtA+EcEgtC)转化株都表现出生产麦角硒因的能力。另外，由(EcEgtA+EcEgtC)转化株生产的麦角硒因的量高于EcEgtA转化株的量，并且两者的差异在培养上清液中非常显着。另外，比较向培养基添加硒代胱氨酸的效果表明，通过当开始培养并经过足够的时间后向培养基添加硒代胱氨酸，EcEgtA转化株和(EcEgtA+EcEgtC)转化株的麦角硒因的生产量均得到增加。此外，由于在培养初期存在的高浓度的硒代胱氨酸导致生长抑制等，所以降低了TY++系统的麦角硒因的量。由此可知，在培养初期优选添加相对于菌体浓度足够小的硒代胱氨酸，而在培养过程中或随着菌体浓度增加而优选增加添加的硒代胱氨酸的量。

由上述结果可知，尽管EcEgtA转化株生产的麦角硒因的量多，但是无法检测出EcEgtC 转化株的麦角硒因的生产量，因此(EcEgtA+EcEgtC)转化株相对于EcEgtA转化株具有增强的麦角硒因生产能力，其生产能力呈倍数增加而非相加增加。

[实施例17：使用将硒酵母作为培养基的转化酱油曲霉的麦角硒因的生产]

在200mL锥形瓶中，将由基因AsEgtA转化的转化酱油曲霉的菌丝体分别接种到40ml的硒酵母液体培养基(1.5％(w/v)硒酵母、2％(w/v)糊精、0.5％(w/v)KH₂PO₄、0.05％(w/v) MgSO₄·7H₂O，pH未调节)中，且在30℃的条件下以160rpm振荡培养5天。

然后在Miracloth(Calbiochem公司)上从培养后的培养物中回收菌体。用40ml的蒸馏水洗涤回收的菌体，通过添加8ml的水并搅拌，得到菌悬浊液。在100℃、15分钟的条件下加热处理得到的菌悬浊液。在该处理后，利用0.45μm的过滤器过滤该经离心分离得到回收的作为上清液的菌体外液，以得到麦角硒因提取液。

通过LC-MS/MS分析来定量所得的麦角硒因提取液和未接种生产株的培养基中的麦角硒因。麦角硒因的定量结果如表15所示。确认了转化酱油曲霉能够利用硒酵母中的硒来生产麦角硒因。

[表15]

	麦角硒因(ppm)
		硒酵母培养基	n.d.
提取液	3.39ppm

[实施例18：使用将金枪鱼/鲣鱼提取物(Bacterio-N-KN)作为培养基的转化酱油曲霉的麦角硒因的生产]

在200mL锥形瓶中，将由基因AsEgtA转化的转化酱油曲霉的菌丝体接种到40ml的金枪鱼/鲣鱼提取液(2.0％(w/v)Bacterio-N-KN(Maruha Nichiro公司)、2％(w/v)糊精、0.5％(w/v)KH₂PO₄、0.05％(w/v)MgSO₄·7H₂O，pH值未调节)，在30℃的条件下以160rpm 振荡培养5天。

然后在Miracloth(Calbiochem公司)上从培养后的培养物中回收菌体。用40ml的蒸馏水洗涤回收的菌体后，通过添加4ml的水并搅拌，得到菌悬浊液。在100℃、15分钟的条件下加热处理得到的菌悬浊液。在该处理后，利用0.45μm的过滤器过滤该经离心分离得到回收的作为上清液的菌体外液，以得到麦角硒因提取液。

关于所得的麦角硒因提取液和未接种生产株的培养基，通过LC-MS/MS分析来定量麦角硒因。麦角硒因的定量结果如表16所示。确认了转化酱油曲霉能够利用金枪鱼/鲣鱼提取物中的硒来生产麦角硒因。

[表16]

	麦角硒因(ppm)
		鲣鱼/金枪鱼液体培养基	n.d.
提取液	0.345ppm

产业上的利用可能性

作为本发明一实施例的制造方法和转化株可用于大量生产被认为具有1000倍于麦角硫因的抗氧化活性的麦角硒因。因此，本发明可以用于工业规模地生产用于制造具有抗氧化活性的化妆品或添加剂等抗氧化产品的原料。

序列表

<110> 龟甲万株式会社

<120> 麦角硒因的制造方法

<130> 15DF0420PCT

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2925

<212> DNA

<213> 酱油曲霉

<400> 1

atgtcacctt tggctctctc tcctaagacc gttgacattg tcaacatctt tcagaatgat 60

gtggagttct ccctcgtaaa tgagatccat aagggtatta gtcctcccgc tggcgttagg 120

aagtcaatgc caacgatgct tctttacgat gccaatggcc tcaagctttt tgagaacatc 180

acctatgtga aggagtatta tctaacaaat gcggaaattg aggtcttgga gacaaattcc 240

aggaggatag ttgaacggat tccagacaat gcgcaactgc ttgaattagg tagcgggtgc 300

gtcatccttc caaatcaaat cgtaaccttt caggctgcgt agcgtatcat taccgttctc 360

cggttttaac cgccttttag gaatcttcgg aaaattgaga ttctgctacg ggagtttgag 420

cgcgtgggaa agcgcgtgga ttattatgcc ctggacctgt ctctatcaga actgcagcgc 480

acattcgcag aggtgtccat tgatgattac acacacgttg gcctccatgg tctccatgga 540

acctacgatg atgccgtcac ttggcttaac agccccgaaa acaggaagcg gcccacggtg 600

atcatgtcta tgggttcctc tttagggaac tttgaccgtc ccggcgcagc aaagtttctc 660

tcgcagtatg ctagccttct tggtccatcc gatatgatga tcattggtct ggatggctgc 720

aaggacccgg gcaaagtata cagggcatac aatgattcag aaggtgttac acggcagttc 780

tacgagaacg gactagtgca tgcaaatgtt gttcttggat acgaagcctt caaatctgat 840

gagtgggaag tagtgactga ctacgatacc gtggagggac gacactgggc agcctactca 900

cccaagaagg acgtcactat caacggggtc cttcttaaga agggtgagaa acttttcttt 960

gaagaggcgt acaagtacgg accagaggaa cgcgatcaac tgtggcgtga tgccaagtta 1020

attcagtcta cggaaatggg caatgggtct gacgattacc gtgagtagca aatggctgcc 1080

tcatttcaat agacgtgtat gctgactctg gcttttcgca aaatagatct ccatcttctg 1140

acatcggcta ccctcaacct ccccacgtct ccctctcaat atgcagctca tcctataccc 1200

agctttgaag aatggcagtc cctgtggaca gcatgggata atgctacaaa ggctatggtc 1260

cctcgcgagg agcttctgtc aaagccgatc aagctacgga actctttgat cttctatctg 1320

ggacacattc ctacattctt gggttagtct acatggctta ctattcccaa cacatagctt 1380

gatgctaatt atgcaaacag acatccatct gacccgagcc ctgcgcggaa aattaacaga 1440

gccaaagtct tataaactaa ttttcgaacg tgggattgat cctgatgtag atgaccccga 1500

gaagtgccac tcccatagcg agatcccaga cgagtggcca gctcttgatg acattctaga 1560

ctaccaagag cgagtcagaa gcagagttag atccatctac caaatcgagg gccttgcaga 1620

gaacagaatc ctgggtgagg cgctttggat tggatttgag cacgaagtga tgcacctcga 1680

gacattcctg tacatgttga tccagagcga aaggatactt cccccgcccg ccactgagcg 1740

gccggacttc aaaaaactgt atcaagaagc tcggagaagc atgaaagcaa atgagtggtt 1800

ctctgttcct gaacagacac ttactattgg ccttgatggt gctgatacca acgacgtacc 1860

cccaacgacc tatgggtggg acaatgagaa acctgcgaga acagtcacgg ttccagcatt 1920

tgaggcgcag ggcaggccca tcaccaatgg tgagtacgcc aagtacttgc aagcgaatca 1980

gtcgcgcaga aggccagcat catgggtcct gacccattcg gatgaagact acgccatacc 2040

tatggcggtc aacggaagca gtgtcggggc tacgcaggac tttatgtcca actttgctgt 2100

ccgtacggtc ttcggcccag ttccacttga atttgctcag gactggcctg tgatggcgtc 2160

atatgatgaa ttagctgaat acgccgaatg ggtgggttgc aggatcccaa ccttcgaaga 2220

gacaaggagt atctatctgc actcagcgct attgaaggaa agaggtggcg tgaatcataa 2280

tggggagccc aacggccata ggttagtgca gcctcattat aacaccacat tcgggattaa 2340

gctgagctaa cggctgtcag tttgaacggc gatctgaatg gggtgaatgg aaatggttac 2400

tcgaagatca acccaggcaa acctcgtaag ccggatcacc agcctgtaca atatccttcc 2460

cgagacgccc tgccagtgtt ccttgatctg cacggtctca acgtcgggtt caagcactgg 2520

caccccaccc cagttatcca gaacggcgat cgactcgccg gtcagggtga actgggaggc 2580

gcatgggagt ggactagcac gccattagcg ccacacgatg gctttaaagc catggagatc 2640

tacccgggat acacctgtaa gtaccagtcc cgttatcggg taccctctaa aagtctatca 2700

ttacatacta attccgcaca gccgatttct tcgacggtaa acataatatc atcctgggtg 2760

gttcttgggc tactcatccc cgcgtcgctg ggcgtaccac tttgtaagtt taccggtata 2820

gaactcgggg cactataaga tgctgacatc acctctagcg tcaattggta ccagcacaac 2880

tatccttaca cctgggcagg agcacgcctg gtgcgggatc tttag 2925

<210> 2

<211> 1770

<212> DNA

<213> 酱油曲霉

<400> 2

atgtctaatg ttacccaatc agccttgaga caggcaactc gcgcctacgc tcgccgactg 60

ccatcgacgc agcatggctc cttcgcttcc gcccttccca gacgggcgct cgccactcca 120

tacagacggt tctatgtctc cgaaactaag gctggaaatg ctcaggtttc ggtagatacc 180

gctatgaagc aggagcagaa ggaattcatg aaacaaactg gggtgcagcc gcagaaggtg 240

gagctcccta gttctggtgt ttccggcgat gcctcgatga gcccgtctgc cggcatcctc 300

aagcaggcca ctgtcatgga ccaaggaacg cgaccgatct atctcgatat gcaggccaca 360

accccaacgg atccccgtgt tctcgacgcc atgctcccct tcttgaccgg aatttacggc 420

aaccctcatt cgagaaccca tgcatacggt tgggagtcag aaaaggcagt cgagcaatcc 480

cgagagcata tcgccaagct gatcggcgcg gacccgaaag agatcatctt cactagcggt 540

gctactgaga gtaacaacat gagcattaag ggtgtggcga ggttttttgg gcgctccggc 600

aaaaaaaacc acatcatcac aacgcagacc gagcacaagt gtgttcttga cagctgtcgg 660

catcttcagg atgagggcta cgaggttacg tatctccccg tgcagaacaa cggcttgatt 720

cggatggaag acctcgaggc cgccattcgc cctgaaacgg ccctggtcag catcatggcc 780

gtcaacaatg agatcggtgt tatccagccc ctggaacaga ttggaaagtt gtgccgctcc 840

aagaagattt tcttccacac ggacgctgca caggccgtgg gaaagatccc gttggatgtg 900

aataaattga atattgattt gatgtctatt tcgagccaca agatttacgg ccccaagggt 960

attggagctt gctatgtcag acgtcgtccc agggttcgcc ttgaccctct cattactgga 1020

ggtggacagg agcgaggcct gcgcagtggt actcttgctc ctcatctggt cgttgggttc 1080

ggtgaggcct gccggatcgc cgcccaagat atggaggtac gttctatttt tcttttgttt 1140

ctgcttactt gcaatccctt ttctattttc cgatgattat atactgcaaa tatggatttc 1200

cgagaccggt gggggtagct gcacgcctaa cgcgtgaccc atgggcctat gacgtctcag 1260

caggggtgat gagttgacta ttgctttgtt tgccttgttt gcctcatgcg gctatgcgtc 1320

agtggacatc gctaatcgag ttggcagtat gacaccaagc acattgatcg tttgtccaag 1380

cgcctgaccg acgggctcct atccatggag cacacacacc tcaacggaga ccctgaacat 1440

cactacccgg gatgtgtcaa tgtctccttt gcctacatcg aaggagagtc tctcctgatg 1500

gccttgaaag acattgctct gtcgtcgggt agtgcctgta cctctgcgtc attggagccc 1560

agctacgtcc ttcgtgcctt gggtagcagt gacgagagcg cccatagcag tatccggttt 1620

ggaattggac gattcacttc ggatagcgaa attgactacg tgctgaaggc ggtacaggac 1680

cgcgttcatt tcctacgcga gctgagcccc ttgtgggaat tggtgcagga aggtatcgac 1740

ctgaacacga tcgaatggag tcaacattaa 1770

<210> 3

<211> 1529

<212> DNA

<213> 酱油曲霉

<400> 3

atgaccactc ccttcggagc tcccatgaga gagcacttcc tctttgacac caacttcaaa 60

aacctcaacc atggtatagt atcctactcc agtaacaagt accaacatta gctaactata 120

aaccaggctc cttcggcaca tacccccgtg ccgtccagac agtcctccgc caacaccaac 180

actccgccga ggcccgtcca gacctcttct accgcatcac ccgcggccaa ggcatcgacg 240

gatcgcgccg catcgtagcc aacctgctca acatccccgt caacgaatgt gtcttcgtca 300

agaacgcaac cacgggggtc gccaccgtgc tccgtaatct agtcttccag aagggagacg 360

cagtcgtgta cttcgacact atctatggcg ctgtggagaa gaatgtacac tctattatgg 420

aggctagtcc tgtgactact cgaaaggttg agtgtgcgtt acccgttagc catgaggacc 480

tggtgaaacg gttcagggat gtcgtgagtc gtgcaagagg ggaagggctg catgtgaaag 540

ttgcggtgtt tgacaccatc gtcagtgtgc ctggggtcag gttcccgttc gagaccttgg 600

taggggtctg tcgggaggag ggtatactca gtcttatcga tggggcgcat ggtattggac 660

atataccgtt ggatttgggg actttgaggc cggatttctt tactagtaac ctgcataagt 720

atgttccttt cccctttctt tctttctttc gtttgattac tgtgtgagga tcttgtatgc 780

tgatatagag caaaaaaaaa agatggctat tcgtcccccg cggctgcgca gttctccacg 840

tcccactccg caaccaacat ctcatccgca ccacattccc aacctcatgg ggatacatcc 900

cccctccctc atccggggag ataaccccca ccgccacgca gggtaaatcc gccttcgaat 960

atctcttcga acacatctcc acaaccgacg acacgccctg gctatgcgtc cccgccgcca 1020

tgaaattccg aactgaagtc tgcggcggcg aagaccgcat ctacgcttac ctggagaccc 1080

tagcccgcga ggccggggat atcgttgccc gcgccctcgg gacggaagtc atgcaggagc 1140

ccgggttgaa ggagggagag gtgagtcagc ttaggaggtg tgggatggct actgtgcggt 1200

tgccgattgc tgtgacttct tcttcttctt ctgattctgg gtctggtaat ggtgggggtg 1260

ctgttatgag ggtgcagggt gaggatggga gttcgtattt gcgaatccag acgtctttgg 1320

tggggactgt gagtaattgg tttcgggata cgttgtttga taagtacgag acgtttgtgc 1380

cggtgttcca gcatgggggg tggttgtgga cgagactcag tgcgcaggtt tatttggaga 1440

agggggattt tgagtggttg gggggtgttt tgagggagtg ttgtgagagg gttgagaggg 1500

aggttggggt ttcttctgcg aagctttga 1529

<210> 4

<211> 845

<212> PRT

<213> 酱油曲霉

<400> 4

Met Ser Pro Leu Ala Leu Ser Pro Lys Thr Val Asp Ile Val Asn Ile

1 5 10 15

Phe Gln Asn Asp Val Glu Phe Ser Leu Val Asn Glu Ile His Lys Gly

20 25 30

Ile Ser Pro Pro Ala Gly Val Arg Lys Ser Met Pro Thr Met Leu Leu

35 40 45

Tyr Asp Ala Asn Gly Leu Lys Leu Phe Glu Asn Ile Thr Tyr Val Lys

50 55 60

Glu Tyr Tyr Leu Thr Asn Ala Glu Ile Glu Val Leu Glu Thr Asn Ser

65 70 75 80

Arg Arg Ile Val Glu Arg Ile Pro Asp Asn Ala Gln Leu Leu Glu Leu

85 90 95

Gly Ser Gly Asn Leu Arg Lys Ile Glu Ile Leu Leu Arg Glu Phe Glu

100 105 110

Arg Val Gly Lys Arg Val Asp Tyr Tyr Ala Leu Asp Leu Ser Leu Ser

115 120 125

Glu Leu Gln Arg Thr Phe Ala Glu Val Ser Ile Asp Asp Tyr Thr His

130 135 140

Val Gly Leu His Gly Leu His Gly Thr Tyr Asp Asp Ala Val Thr Trp

145 150 155 160

Leu Asn Ser Pro Glu Asn Arg Lys Arg Pro Thr Val Ile Met Ser Met

165 170 175

Gly Ser Ser Leu Gly Asn Phe Asp Arg Pro Gly Ala Ala Lys Phe Leu

180 185 190

Ser Gln Tyr Ala Ser Leu Leu Gly Pro Ser Asp Met Met Ile Ile Gly

195 200 205

Leu Asp Gly Cys Lys Asp Pro Gly Lys Val Tyr Arg Ala Tyr Asn Asp

210 215 220

Ser Glu Gly Val Thr Arg Gln Phe Tyr Glu Asn Gly Leu Val His Ala

225 230 235 240

Asn Val Val Leu Gly Tyr Glu Ala Phe Lys Ser Asp Glu Trp Glu Val

245 250 255

Val Thr Asp Tyr Asp Thr Val Glu Gly Arg His Trp Ala Ala Tyr Ser

260 265 270

Pro Lys Lys Asp Val Thr Ile Asn Gly Val Leu Leu Lys Lys Gly Glu

275 280 285

Lys Leu Phe Phe Glu Glu Ala Tyr Lys Tyr Gly Pro Glu Glu Arg Asp

290 295 300

Gln Leu Trp Arg Asp Ala Lys Leu Ile Gln Ser Thr Glu Met Gly Asn

305 310 315 320

Gly Ser Asp Asp Tyr His Leu His Leu Leu Thr Ser Ala Thr Leu Asn

325 330 335

Leu Pro Thr Ser Pro Ser Gln Tyr Ala Ala His Pro Ile Pro Ser Phe

340 345 350

Glu Glu Trp Gln Ser Leu Trp Thr Ala Trp Asp Asn Ala Thr Lys Ala

355 360 365

Met Val Pro Arg Glu Glu Leu Leu Ser Lys Pro Ile Lys Leu Arg Asn

370 375 380

Ser Leu Ile Phe Tyr Leu Gly His Ile Pro Thr Phe Leu Asp Ile His

385 390 395 400

Leu Thr Arg Ala Leu Arg Gly Lys Leu Thr Glu Pro Lys Ser Tyr Lys

405 410 415

Leu Ile Phe Glu Arg Gly Ile Asp Pro Asp Val Asp Asp Pro Glu Lys

420 425 430

Cys His Ser His Ser Glu Ile Pro Asp Glu Trp Pro Ala Leu Asp Asp

435 440 445

Ile Leu Asp Tyr Gln Glu Arg Val Arg Ser Arg Val Arg Ser Ile Tyr

450 455 460

Gln Ile Glu Gly Leu Ala Glu Asn Arg Ile Leu Gly Glu Ala Leu Trp

465 470 475 480

Ile Gly Phe Glu His Glu Val Met His Leu Glu Thr Phe Leu Tyr Met

485 490 495

Leu Ile Gln Ser Glu Arg Ile Leu Pro Pro Pro Ala Thr Glu Arg Pro

500 505 510

Asp Phe Lys Lys Leu Tyr Gln Glu Ala Arg Arg Ser Met Lys Ala Asn

515 520 525

Glu Trp Phe Ser Val Pro Glu Gln Thr Leu Thr Ile Gly Leu Asp Gly

530 535 540

Ala Asp Thr Asn Asp Val Pro Pro Thr Thr Tyr Gly Trp Asp Asn Glu

545 550 555 560

Lys Pro Ala Arg Thr Val Thr Val Pro Ala Phe Glu Ala Gln Gly Arg

565 570 575

Pro Ile Thr Asn Gly Glu Tyr Ala Lys Tyr Leu Gln Ala Asn Gln Ser

580 585 590

Arg Arg Arg Pro Ala Ser Trp Val Leu Thr His Ser Asp Glu Asp Tyr

595 600 605

Ala Ile Pro Met Ala Val Asn Gly Ser Ser Val Gly Ala Thr Gln Asp

610 615 620

Phe Met Ser Asn Phe Ala Val Arg Thr Val Phe Gly Pro Val Pro Leu

625 630 635 640

Glu Phe Ala Gln Asp Trp Pro Val Met Ala Ser Tyr Asp Glu Leu Ala

645 650 655

Glu Tyr Ala Glu Trp Val Gly Cys Arg Ile Pro Thr Phe Glu Glu Thr

660 665 670

Arg Ser Ile Tyr Leu His Ser Ala Leu Leu Lys Glu Arg Gly Gly Val

675 680 685

Asn His Asn Gly Glu Pro Asn Gly His Ser Leu Asn Gly Asp Leu Asn

690 695 700

Gly Val Asn Gly Asn Gly Tyr Ser Lys Ile Asn Pro Gly Lys Pro Arg

705 710 715 720

Lys Pro Asp His Gln Pro Val Gln Tyr Pro Ser Arg Asp Ala Leu Pro

725 730 735

Val Phe Leu Asp Leu His Gly Leu Asn Val Gly Phe Lys His Trp His

740 745 750

Pro Thr Pro Val Ile Gln Asn Gly Asp Arg Leu Ala Gly Gln Gly Glu

755 760 765

Leu Gly Gly Ala Trp Glu Trp Thr Ser Thr Pro Leu Ala Pro His Asp

770 775 780

Gly Phe Lys Ala Met Glu Ile Tyr Pro Gly Tyr Thr Ser Asp Phe Phe

785 790 795 800

Asp Gly Lys His Asn Ile Ile Leu Gly Gly Ser Trp Ala Thr His Pro

805 810 815

Arg Val Ala Gly Arg Thr Thr Phe Val Asn Trp Tyr Gln His Asn Tyr

820 825 830

Pro Tyr Thr Trp Ala Gly Ala Arg Leu Val Arg Asp Leu

835 840 845

<210> 5

<211> 512

<212> PRT

<213> 酱油曲霉

<400> 5

Met Ser Asn Val Thr Gln Ser Ala Leu Arg Gln Ala Thr Arg Ala Tyr

1 5 10 15

Ala Arg Arg Leu Pro Ser Thr Gln His Gly Ser Phe Ala Ser Ala Leu

20 25 30

Pro Arg Arg Ala Leu Ala Thr Pro Tyr Arg Arg Phe Tyr Val Ser Glu

35 40 45

Thr Lys Ala Gly Asn Ala Gln Val Ser Val Asp Thr Ala Met Lys Gln

50 55 60

Glu Gln Lys Glu Phe Met Lys Gln Thr Gly Val Gln Pro Gln Lys Val

65 70 75 80

Glu Leu Pro Ser Ser Gly Val Ser Gly Asp Ala Ser Met Ser Pro Ser

85 90 95

Ala Gly Ile Leu Lys Gln Ala Thr Val Met Asp Gln Gly Thr Arg Pro

100 105 110

Ile Tyr Leu Asp Met Gln Ala Thr Thr Pro Thr Asp Pro Arg Val Leu

115 120 125

Asp Ala Met Leu Pro Phe Leu Thr Gly Ile Tyr Gly Asn Pro His Ser

130 135 140

Arg Thr His Ala Tyr Gly Trp Glu Ser Glu Lys Ala Val Glu Gln Ser

145 150 155 160

Arg Glu His Ile Ala Lys Leu Ile Gly Ala Asp Pro Lys Glu Ile Ile

165 170 175

Phe Thr Ser Gly Ala Thr Glu Ser Asn Asn Met Ser Ile Lys Gly Val

180 185 190

Ala Arg Phe Phe Gly Arg Ser Gly Lys Lys Asn His Ile Ile Thr Thr

195 200 205

Gln Thr Glu His Lys Cys Val Leu Asp Ser Cys Arg His Leu Gln Asp

210 215 220

Glu Gly Tyr Glu Val Thr Tyr Leu Pro Val Gln Asn Asn Gly Leu Ile

225 230 235 240

Arg Met Glu Asp Leu Glu Ala Ala Ile Arg Pro Glu Thr Ala Leu Val

245 250 255

Ser Ile Met Ala Val Asn Asn Glu Ile Gly Val Ile Gln Pro Leu Glu

260 265 270

Gln Ile Gly Lys Leu Cys Arg Ser Lys Lys Ile Phe Phe His Thr Asp

275 280 285

Ala Ala Gln Ala Val Gly Lys Ile Pro Leu Asp Val Asn Lys Leu Asn

290 295 300

Ile Asp Leu Met Ser Ile Ser Ser His Lys Ile Tyr Gly Pro Lys Gly

305 310 315 320

Ile Gly Ala Cys Tyr Val Arg Arg Arg Pro Arg Val Arg Leu Asp Pro

325 330 335

Leu Ile Thr Gly Gly Gly Gln Glu Arg Gly Leu Arg Ser Gly Thr Leu

340 345 350

Ala Pro His Leu Val Val Gly Phe Gly Glu Ala Cys Arg Ile Ala Ala

355 360 365

Gln Asp Met Glu Tyr Asp Thr Lys His Ile Asp Arg Leu Ser Lys Arg

370 375 380

Leu Thr Asp Gly Leu Leu Ser Met Glu His Thr His Leu Asn Gly Asp

385 390 395 400

Pro Glu His His Tyr Pro Gly Cys Val Asn Val Ser Phe Ala Tyr Ile

405 410 415

Glu Gly Glu Ser Leu Leu Met Ala Leu Lys Asp Ile Ala Leu Ser Ser

420 425 430

Gly Ser Ala Cys Thr Ser Ala Ser Leu Glu Pro Ser Tyr Val Leu Arg

435 440 445

Ala Leu Gly Ser Ser Asp Glu Ser Ala His Ser Ser Ile Arg Phe Gly

450 455 460

Ile Gly Arg Phe Thr Ser Asp Ser Glu Ile Asp Tyr Val Leu Lys Ala

465 470 475 480

Val Gln Asp Arg Val His Phe Leu Arg Glu Leu Ser Pro Leu Trp Glu

485 490 495

Leu Val Gln Glu Gly Ile Asp Leu Asn Thr Ile Glu Trp Ser Gln His

500 505 510

<210> 6

<211> 463

<212> PRT

<213> 酱油曲霉

<400> 6

Met Thr Thr Pro Phe Gly Ala Pro Met Arg Glu His Phe Leu Phe Asp

1 5 10 15

Thr Asn Phe Lys Asn Leu Asn His Gly Ser Phe Gly Thr Tyr Pro Arg

20 25 30

Ala Val Gln Thr Val Leu Arg Gln His Gln His Ser Ala Glu Ala Arg

35 40 45

Pro Asp Leu Phe Tyr Arg Ile Thr Arg Gly Gln Gly Ile Asp Gly Ser

50 55 60

Arg Arg Ile Val Ala Asn Leu Leu Asn Ile Pro Val Asn Glu Cys Val

65 70 75 80

Phe Val Lys Asn Ala Thr Thr Gly Val Ala Thr Val Leu Arg Asn Leu

85 90 95

Val Phe Gln Lys Gly Asp Ala Val Val Tyr Phe Asp Thr Ile Tyr Gly

100 105 110

Ala Val Glu Lys Asn Val His Ser Ile Met Glu Ala Ser Pro Val Thr

115 120 125

Thr Arg Lys Val Glu Cys Ala Leu Pro Val Ser His Glu Asp Leu Val

130 135 140

Lys Arg Phe Arg Asp Val Val Ser Arg Ala Arg Gly Glu Gly Leu His

145 150 155 160

Val Lys Val Ala Val Phe Asp Thr Ile Val Ser Val Pro Gly Val Arg

165 170 175

Phe Pro Phe Glu Thr Leu Val Gly Val Cys Arg Glu Glu Gly Ile Leu

180 185 190

Ser Leu Ile Asp Gly Ala His Gly Ile Gly His Ile Pro Leu Asp Leu

195 200 205

Gly Thr Leu Arg Pro Asp Phe Phe Thr Ser Asn Leu His Lys Trp Leu

210 215 220

Phe Val Pro Arg Gly Cys Ala Val Leu His Val Pro Leu Arg Asn Gln

225 230 235 240

His Leu Ile Arg Thr Thr Phe Pro Thr Ser Trp Gly Tyr Ile Pro Pro

245 250 255

Pro Ser Ser Gly Glu Ile Thr Pro Thr Ala Thr Gln Gly Lys Ser Ala

260 265 270

Phe Glu Tyr Leu Phe Glu His Ile Ser Thr Thr Asp Asp Thr Pro Trp

275 280 285

Leu Cys Val Pro Ala Ala Met Lys Phe Arg Thr Glu Val Cys Gly Gly

290 295 300

Glu Asp Arg Ile Tyr Ala Tyr Leu Glu Thr Leu Ala Arg Glu Ala Gly

305 310 315 320

Asp Ile Val Ala Arg Ala Leu Gly Thr Glu Val Met Gln Glu Pro Gly

325 330 335

Leu Lys Glu Gly Glu Val Ser Gln Leu Arg Arg Cys Gly Met Ala Thr

340 345 350

Val Arg Leu Pro Ile Ala Val Thr Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Gly

355 360 365

Ser Gly Asn Gly Gly Gly Ala Val Met Arg Val Gln Gly Glu Asp Gly

370 375 380

Ser Ser Tyr Leu Arg Ile Gln Thr Ser Leu Val Gly Thr Val Ser Asn

385 390 395 400

Trp Phe Arg Asp Thr Leu Phe Asp Lys Tyr Glu Thr Phe Val Pro Val

405 410 415

Phe Gln His Gly Gly Trp Leu Trp Thr Arg Leu Ser Ala Gln Val Tyr

420 425 430

Leu Glu Lys Gly Asp Phe Glu Trp Leu Gly Gly Val Leu Arg Glu Cys

435 440 445

Cys Glu Arg Val Glu Arg Glu Val Gly Val Ser Ser Ala Lys Leu

450 455 460

<210> 7

<211> 748

<212> DNA

<213> 酱油曲霉

<400> 7

tgtggaccag acaggcgcca ctcggccggg ccacaactgc ttgggttttg accgggagcg 60

gaccaattaa ggactcgaac gaccgcgggg ttcaaatgca aacaagtaca acacgcagca 120

aacgaagcag cccaccactg cgttgatgcc cagtttgtct gtccgaaatc caccggaaag 180

gtggaaacat actatgtaac aatcagaggg aagaaaaatt ttttatcgac gaggcaggat 240

agtgactgat ggtggggtca tggtcgggtc tccgagcgaa agagaaccaa ggaaacaaga 300

tcaacgaggt tggtgtaccc aaaaggccgc agcaacaaga gtcatcgccc aaaagtcaac 360

agtctggaag agactccgcc gtgcagattc tgcgtcggtc ccgcacatgc gtggtggggg 420

cattacccct ccatgtccaa tgataagggc ggcggtcgag ggcttaagcc cgcccactaa 480

ttcgccttct cgcttgcccc tccatataag gattcccctc cttcccctcc cacaactttt 540

ttcctctttc tctcttcgtc cgcatcagta cgtatatctt tcccccctac ctctttctca 600

ctcttcctcg attcattcca ctcttctcct tactgacatc tgttttgctc agtacctcta 660

cgcgatcagc cgtagtatct gagcaagctt ttttacagaa tctttctagt atcttacaaa 720

gaactacaaa gttcgcacca ccttcaaa 748

<210> 8

<211> 800

<212> DNA

<213> 酱油曲霉

<400> 8

gtaccaggag tacattggag agttctacca ttgttgctgg aatacaatga tgattagaaa 60

ccgaagagtg ttatgattcg gacggatata cgcatggcac gcatacagcg tgatacatag 120

gctgtttgct caagaattag gattttatct gaatccatgt acagagttta cttatgttag 180

tagtcaatga aatcttggct ttctaatttt gtccgatcta caaggggtag tcgatcacag 240

aacgaactag atgtgcaggg aacgatgatc acccgctctt agcaagacct ctagtagttt 300

tcgaccatag ctttaacgcg aatcatgacc ctactatttt ctagattgca gaccaagtca 360

catgacaatg tcctctttga agtaggatca gtagctgatt agattccggg aaatgaatta 420

gggctggcgt tccaactact ggggagtgcc gatgttgctg tatgaaagat agtaagatta 480

ctagtgcaca gctgtagtaa ttatttactc tagattatat attccaaata ataagtaatc 540

taagatagta gacagtccta tgatatagct ccgggttcga agtcggcaaa agatatgcaa 600

tcacctgtcg ggatgatata tgtatatctg aaataccgac atcaaccatc cagtcggatc 660

agctaaacga agtatcactt ctttcgccac tgccaatcac tacttctatt aaagttcatg 720

ttacagtata agccacaaga cttatctcca gaactaactt gtgcatagga gctctgccga 780

tagccgggtg gttggatcgg 800

<210> 9

<211> 1838

<212> DNA

<213> 酱油曲霉

<400> 9

ttgggcttat tgctatgtcc ctgaaaggat atcaaaagca ggcaaaaagc caggcataac 60

cccgcgcgga tggtacccta aggataagcc ctaatcttat ctacatgtga ctgcgtcgat 120

gtgtttggtc caaatgaggc atgtggctca ccccacaggc ggagaaacgt gtggctagtg 180

catgacggtc ccctccatag attcaattta atttttcgcg gcaattgtcg tgcagtttgt 240

atctaccgtt cattctacat attaagggtt agtaattgga catcctgatt actttgtcta 300

attactgaaa actcgaagta ctaacctact aaataagtca gtttcaacca ctaagtactc 360

atttatacaa tagttgcaga accccgcgct acccctccat tgccaacatg tcttccaagt 420

cgcaattgac ctacagcgca cgcgctagca agcaccccaa tgcgctcgtg aagaagctct 480

tcgaggttgc cgaggccaag aaaaccaatg tcaccgtttc cgccgacgtg acaaccacca 540

aagagctgct ggatttggct gaccgtatgc gcaccgggga tgccacttac atatgatcta 600

gtaatggtta atggtggaat atataacagg actcggtccg tacattgccg tgatcaaaac 660

tcacatcgat atcctctccg atttcagcga agagaccatc atcggtctga aggcccttgc 720

agagaagcac aatttcctca tcttcgaaga tcgcaagttc atcgatatcg gaaacacagt 780

ccaaaagcag taccatggcg gcactctgcg catctctgag tgggcccaca tcatcaactg 840

cagtattctg cccggtgagg gtatcgtcga ggctctggcc cagactgctt cggccgagga 900

cttcccctat ggctctgaga ggggcctttt gatccttgcg gagatgacat ccaagggatc 960

tttggctacc ggtcaatata ctacttcttc tgttgactat gcccggaagt ataagaagtt 1020

tgtgatggga ttcgtctcga cgcgtcacct gggcgaggtt cagtctgaag ttagctcgcc 1080

ttcggaggag gaggatttcg tcgtcttcac gacaggtgtc aacctctcct cgaagggaga 1140

caaactggga cagcaatacc agactcctga gtctgctgtt ggacgcggtg ccgactttat 1200

cattgctggt cgtggaattt atgctgctcc tgatcccgtg gaggcagcga agcggtacca 1260

gaaagaggga tgggatgcat accagaagcg tgttggtgcg caataagtag tggtgaatac 1320

gtgctctttt tatggcagta tatcgcaagt atgatgcgat tcataaattc agcagtcgaa 1380

ttctacgaga gaacgatgct aagagatacc ctctctatat gaataatatg cctgcctcga 1440

gatatggaca tattcaagat cagagttaag ggtcatgttt caaaatcaca ccaatctcca 1500

acatagacga gaatttttac cggattgtct gaaggtgcag ctggagattg gtctattttc 1560

taagagtggg gtatcactaa tgtacagtcg gtcactatcg tacaaacaat cacaattata 1620

tacaagattt cccatcaccc cttactctaa catggcactt ttatccatcg agtccgagcc 1680

tagccaccat ttggtgcttt cgtagagacc aaagtataac cctgatccga cagcggccat 1740

aaacgtgttg atagcacacc ctcggaatag tcctctcggg ccatctgttc gtataatctc 1800

ccgtacggta ttgatcatcc ttttcttctg aggtgcgg 1838

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

cggtacccgg ggatctgtgg accagacagg cgccactc 38

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

atgtactcct ggtactttga aggtggtgcg aactttgtag 40

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

gtaccaggag tacattggag agttctac 28

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

ccgatccaac cacccggcta tcg 23

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

gggtggttgg atcggttggg cttattgcta tgtccctgaa agg 43

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

cgactctaga ggatcccgca cctcagaaga aaaggatga 39

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

tttgaaggtg gtgcgaactt tgtag 25

<210> 17

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

cgcaccacct tcaaaatgtc acctttggct ctctctcc 38

<210> 18

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

atgtactcct ggtacctaaa gatcccgcac caggcgt 37

<210> 19

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

cgcaccacct tcaaaatgtc taatgttacc caatcagcct tgag 44

<210> 20

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

atgtactcct ggtacttaat gttgactcca ttcgatcgtg ttcag 45

<210> 21

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

cgcaccacct tcaaaatgac cactcccttc ggagct 36

<210> 22

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

atgtactcct ggtactcaaa gcttcgcaga agaaacccca acc 43

<210> 23

<211> 2917

<212> DNA

<213> 米曲霉

<400> 23

atgtcaccgt tggctctttc tcctaagacc gttgacattg tcaacatctt tcagaatgac 60

gtggagttct ccctcgtaaa tgagatccat aagggcatta gtcctcccgc tggcgttagg 120

aagtcaatgc caacgatgct tctttacgat gccaatggcc tcaagctttt tgagaaaatc 180

acctatgtga aggagtatta tctaacaaat gcggaaatcg aggtcttgga gacaaattcc 240

aggaggatag ttgaacggat tccagacaat gcgcaactgc ttgaattagg tagcgggtgc 300

gtcatccttc caaatcaaat cgtaaccttt caggctgcgt agcgtatcat taccgttctc 360

cggttttaac cgccttttag gaatcttcgg aaaattgaga ttctgctacg ggagtttgag 420

cgcgtgggaa agcgcgtgga ttattatgcc cttgacctgt ctctatcaga actgcagcgc 480

acattcgcag aggtgtccat tgatgattac acacacgttg gcctccatgg tctccatgga 540

acctacgacg atgccgtcac ttggcttaac agccccgaaa acaggaagcg gcccacggtg 600

atcatgtcta tgggttcctc tttagggaac tttgaccgtc ctggcgcagc aaagtttctc 660

tcgcagtatg ctagccttct tggtccatcc gatatgatga tcattggtct ggatggctgc 720

aaggacccgg gcaaagtata cagggcatac aatgattcag aaggtgttac acggcagttc 780

tatgagaacg gactagtgca tgcaaatgtt gttcttggat acgaagcctt caaacctgat 840

gagtgggaag tagtgactga ctacgatgcc gtggagggac gacactgggc agcctactca 900

cccaggaggg acgtcactat caacggggtc cttcttaaga agggggagaa actcttcttt 960

gaagaggcgt acaagtacgg accagaggaa cgcgatcaac tgtggcgtga tgccaagtta 1020

ctccagtcta cggaagtggg caatgggtct gacgattacc gtgagtagca aatggctgcc 1080

tcatttcagt agacgtgtat gctaaatctg gcttttcgca aaatagatct ccatcttctg 1140

acatccgctg ccctcaacct ccccacgtct ccctctcaat atgcagctca tcctataccc 1200

agctttgaag aatggcagtc cctgtggaca gcatgggata atgctacaaa ggctatggtc 1260

cctcgcgagg agcttctgtc aaagccgatc aagctacgga actctttaat cttctatctg 1320

gggcacattc ctacattctt gggttagtct acatggctta ctattcccaa cacataactt 1380

gatgctaatt atgcaaacag acatccatct gacccgagcc ctgcgcggaa aactgacaga 1440

gccaaagtct tataaactaa ttttcgaacg tgggattgat cctgatgtag atgaccccca 1500

gaagtgccac tcccatagcg agatcccaga cgagtggcca gctcttgatg acattctaga 1560

ctaccaagag cgagtcagaa gcagagttag atccatctac cagatcgagg gccttgcaga 1620

aaacagaatc ctgggtgagg cgctttggat tggatttgag cacgaagtga tgcacctcga 1680

gacattcctg tacatgttga tccagagcga aaggatactt cccccgcccg ccactgaacg 1740

gccggacttc aaaaaactgt accaagacgc tcggagaagc atgaaaacaa atgagtggtt 1800

ctccgttcct gaacagacac ttactattgg ccttgatggt gctgatacca acgacgtacc 1860

cccaacgacc tatgggtggg acaatgagaa acctgcgaga acagtgacgg ttccagcatt 1920

tgaggcgcag ggcaggccca tcaccaatgg tgagtacgcc aagtacttgc aagcgaatca 1980

gtcgcgcaga aggccagcat catgggtcct gacccattcg gatgaaaact accccatacc 2040

tatggccgtc aacggaagca gtgtcggggc tacgcaggac tttatgtcca actttgctgt 2100

ccgtactgtc ttcggcccag ttccacttga atttgctcag gactggcctg tgatggcgtc 2160

atatgatgaa ttagccgaat atgccgaatg ggtgggttgc agaatcccaa ccttcgaaga 2220

gacaaggagt atctatctgc actcagcgct actgaaggaa agaggtggcg taaatcataa 2280

tggggagccc aatggccata ggttagtgca gcctcattat aacgccacat tccggggatt 2340

gagctgagct aacggctttc agtgtgaacg gctatctgaa cgggatgaat ggaaatagct 2400

actcgaagat caacccaggc aaacctcgta cgccggacca ccagcctgta caatatcctt 2460

cccgggacgc cttgccagtg ttccttgatc tggacggtct caacgtcggg ttcaagcact 2520

ggcaccccac cccagttatc cagaacggcg atcgactcgc cggtcagggt gaactgggag 2580

gcgcatggga gtggactagc acgccattag cgccacacga tggctttaaa gccatggaga 2640

tctacccggg atacacctgt aagtaccagt cccgttatcg ggtaccctct cattacatac 2700

taattccgca cagccgattt cttcgacggt aaacataaca tcatcctggg tggttcttgg 2760

gctactcatc cccgcgttgc tgggcgtacc actttgtaag tttaccggta tagaacccgg 2820

ggcactataa gatgctgaca acacctctag cgtcaattgg taccagcaca actatcctta 2880

cacctgggca ggagcacgcc tagtgcggga tctttag 2917

<210> 24

<211> 845

<212> PRT

<213> 米曲霉

<400> 24

Met Ser Pro Leu Ala Leu Ser Pro Lys Thr Val Asp Ile Val Asn Ile

1 5 10 15

Phe Gln Asn Asp Val Glu Phe Ser Leu Val Asn Glu Ile His Lys Gly

20 25 30

Ile Ser Pro Pro Ala Gly Val Arg Lys Ser Met Pro Thr Met Leu Leu

35 40 45

Tyr Asp Ala Asn Gly Leu Lys Leu Phe Glu Lys Ile Thr Tyr Val Lys

50 55 60

Glu Tyr Tyr Leu Thr Asn Ala Glu Ile Glu Val Leu Glu Thr Asn Ser

65 70 75 80

Arg Arg Ile Val Glu Arg Ile Pro Asp Asn Ala Gln Leu Leu Glu Leu

85 90 95

Gly Ser Gly Asn Leu Arg Lys Ile Glu Ile Leu Leu Arg Glu Phe Glu

100 105 110

Arg Val Gly Lys Arg Val Asp Tyr Tyr Ala Leu Asp Leu Ser Leu Ser

115 120 125

Glu Leu Gln Arg Thr Phe Ala Glu Val Ser Ile Asp Asp Tyr Thr His

130 135 140

Val Gly Leu His Gly Leu His Gly Thr Tyr Asp Asp Ala Val Thr Trp

145 150 155 160

Leu Asn Ser Pro Glu Asn Arg Lys Arg Pro Thr Val Ile Met Ser Met

165 170 175

Gly Ser Ser Leu Gly Asn Phe Asp Arg Pro Gly Ala Ala Lys Phe Leu

180 185 190

Ser Gln Tyr Ala Ser Leu Leu Gly Pro Ser Asp Met Met Ile Ile Gly

195 200 205

Leu Asp Gly Cys Lys Asp Pro Gly Lys Val Tyr Arg Ala Tyr Asn Asp

210 215 220

Ser Glu Gly Val Thr Arg Gln Phe Tyr Glu Asn Gly Leu Val His Ala

225 230 235 240

Asn Val Val Leu Gly Tyr Glu Ala Phe Lys Pro Asp Glu Trp Glu Val

245 250 255

Val Thr Asp Tyr Asp Ala Val Glu Gly Arg His Trp Ala Ala Tyr Ser

260 265 270

Pro Arg Arg Asp Val Thr Ile Asn Gly Val Leu Leu Lys Lys Gly Glu

275 280 285

Lys Leu Phe Phe Glu Glu Ala Tyr Lys Tyr Gly Pro Glu Glu Arg Asp

290 295 300

Gln Leu Trp Arg Asp Ala Lys Leu Leu Gln Ser Thr Glu Val Gly Asn

305 310 315 320

Gly Ser Asp Asp Tyr His Leu His Leu Leu Thr Ser Ala Ala Leu Asn

325 330 335

Leu Pro Thr Ser Pro Ser Gln Tyr Ala Ala His Pro Ile Pro Ser Phe

340 345 350

Glu Glu Trp Gln Ser Leu Trp Thr Ala Trp Asp Asn Ala Thr Lys Ala

355 360 365

Met Val Pro Arg Glu Glu Leu Leu Ser Lys Pro Ile Lys Leu Arg Asn

370 375 380

Ser Leu Ile Phe Tyr Leu Gly His Ile Pro Thr Phe Leu Asp Ile His

385 390 395 400

Leu Thr Arg Ala Leu Arg Gly Lys Leu Thr Glu Pro Lys Ser Tyr Lys

405 410 415

Leu Ile Phe Glu Arg Gly Ile Asp Pro Asp Val Asp Asp Pro Gln Lys

420 425 430

Cys His Ser His Ser Glu Ile Pro Asp Glu Trp Pro Ala Leu Asp Asp

435 440 445

Ile Leu Asp Tyr Gln Glu Arg Val Arg Ser Arg Val Arg Ser Ile Tyr

450 455 460

Gln Ile Glu Gly Leu Ala Glu Asn Arg Ile Leu Gly Glu Ala Leu Trp

465 470 475 480

Ile Gly Phe Glu His Glu Val Met His Leu Glu Thr Phe Leu Tyr Met

485 490 495

Leu Ile Gln Ser Glu Arg Ile Leu Pro Pro Pro Ala Thr Glu Arg Pro

500 505 510

Asp Phe Lys Lys Leu Tyr Gln Asp Ala Arg Arg Ser Met Lys Thr Asn

515 520 525

Glu Trp Phe Ser Val Pro Glu Gln Thr Leu Thr Ile Gly Leu Asp Gly

530 535 540

Ala Asp Thr Asn Asp Val Pro Pro Thr Thr Tyr Gly Trp Asp Asn Glu

545 550 555 560

Lys Pro Ala Arg Thr Val Thr Val Pro Ala Phe Glu Ala Gln Gly Arg

565 570 575

Pro Ile Thr Asn Gly Glu Tyr Ala Lys Tyr Leu Gln Ala Asn Gln Ser

580 585 590

Arg Arg Arg Pro Ala Ser Trp Val Leu Thr His Ser Asp Glu Asn Tyr

595 600 605

Pro Ile Pro Met Ala Val Asn Gly Ser Ser Val Gly Ala Thr Gln Asp

610 615 620

Phe Met Ser Asn Phe Ala Val Arg Thr Val Phe Gly Pro Val Pro Leu

625 630 635 640

Glu Phe Ala Gln Asp Trp Pro Val Met Ala Ser Tyr Asp Glu Leu Ala

645 650 655

Glu Tyr Ala Glu Trp Val Gly Cys Arg Ile Pro Thr Phe Glu Glu Thr

660 665 670

Arg Ser Ile Tyr Leu His Ser Ala Leu Leu Lys Glu Arg Gly Gly Val

675 680 685

Asn His Asn Gly Glu Pro Asn Gly His Ser Val Asn Gly Tyr Leu Asn

690 695 700

Gly Met Asn Gly Asn Ser Tyr Ser Lys Ile Asn Pro Gly Lys Pro Arg

705 710 715 720

Thr Pro Asp His Gln Pro Val Gln Tyr Pro Ser Arg Asp Ala Leu Pro

725 730 735

Val Phe Leu Asp Leu Asp Gly Leu Asn Val Gly Phe Lys His Trp His

740 745 750

Pro Thr Pro Val Ile Gln Asn Gly Asp Arg Leu Ala Gly Gln Gly Glu

755 760 765

Leu Gly Gly Ala Trp Glu Trp Thr Ser Thr Pro Leu Ala Pro His Asp

770 775 780

Gly Phe Lys Ala Met Glu Ile Tyr Pro Gly Tyr Thr Ser Asp Phe Phe

785 790 795 800

Asp Gly Lys His Asn Ile Ile Leu Gly Gly Ser Trp Ala Thr His Pro

805 810 815

Arg Val Ala Gly Arg Thr Thr Phe Val Asn Trp Tyr Gln His Asn Tyr

820 825 830

Pro Tyr Thr Trp Ala Gly Ala Arg Leu Val Arg Asp Leu

835 840 845

<210> 25

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

cgcaccacct tcaaaatgtc accgttggct ctttctcc 38

<210> 26

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

atgtactcct ggtacctaaa gatcccgcac taggcgtg 38

<210> 27

<211> 2550

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成基因

<400> 27

gatatcatga gcccgctggc gctgagcccg aagaccgtgg acattgtgaa catttttcag 60

aacgacgtgg agtttagcct ggtgaacgag attcataaag gcatcagccc gccggcgggt 120

gttcgtaaaa gcatgccgac catgctgctg tacgatgcga acggtctgaa gctgttcgaa 180

aacattacct atgtgaaaga gtactatctg accaacgcgg agatcgaagt gctggaaacc 240

aacagccgtc gtatcgttga gcgtattccg gacaacgcgc agctgctgga actgggtagc 300

ggcaacctgc gtaagatcga gattctgctg cgtgagttcg aacgtgtggg caaacgtgtt 360

gattactatg cgctggacct gagcctgagc gaactgcaac gtacctttgc ggaagtgagc 420

attgacgatt acacccacgt tggtctgcac ggcctgcacg gtacctatga cgatgcggtt 480

acctggctga acagcccgga aaaccgtaag cgtccgaccg tgatcatgag catgggcagc 540

agcctgggta acttcgatcg tccgggtgcg gcgaaatttc tgagccaata tgcgagcctg 600

ctgggtccga gcgacatgat gatcattggc ctggatggtt gcaaggaccc gggtaaagtg 660

taccgtgcgt ataacgacag cgaaggcgtt acccgtcaat tctacgagaa cggtctggtg 720

cacgcgaacg tggttctggg ctatgaagcg tttaagagcg atgagtggga agtggttacc 780

gactacgata ccgttgaggg tcgtcactgg gcggcgtata gcccgaagaa agacgtgacc 840

attaacggcg ttctgctgaa gaaaggtgaa aagctgttct ttgaggaagc gtacaaatat 900

ggcccggagg aacgtgatca gctgtggcgt gacgcgaagc tgatccaaag caccgagatg 960

ggtaacggca gcgacgatta ccacctgcac ctgctgacca gcgcgaccct gaacctgccg 1020

accagcccga gccagtatgc ggcgcacccg attccgagct tcgaggaatg gcaaagcctg 1080

tggaccgcgt gggataacgc gaccaaagcg atggttccgc gtgaggaact gctgagcaag 1140

ccgatcaaac tgcgtaacag cctgatcttc tacctgggtc acattccgac ctttctggac 1200

atccacctga cccgtgcgct gcgtggcaag ctgaccgaac cgaagagcta taaactgatc 1260

tttgagcgtg gcattgaccc ggatgtggac gatccggaaa aatgccacag ccacagcgaa 1320

attccggatg agtggccggc gctggacgac atcctggact accaggagcg tgtgcgtagc 1380

cgtgttcgta gcatctatca aattgaaggt ctggcggaga accgtattct gggcgaagcg 1440

ctgtggatcg gtttcgagca cgaagtgatg cacctggaga cctttctgta catgctgatt 1500

caaagcgaac gtatcctgcc gccgccggcg accgagcgtc cggatttcaa gaaactgtat 1560

caggaagcgc gtcgtagcat gaaggcgaac gaatggttta gcgttccgga gcaaaccctg 1620

accatcggcc tggacggtgc ggataccaac gacgtgccgc cgaccaccta cggttgggac 1680

aacgaaaaac cggcgcgtac cgttaccgtt ccggcgtttg aagcgcaggg tcgtccgatt 1740

accaacggcg agtacgcgaa atatctgcag gcgaaccaaa gccgtcgtcg tccggcgagc 1800

tgggttctga cccacagcga cgaagattac gcgatcccga tggcggtgaa cggcagcagc 1860

gttggtgcga cccaggactt catgagcaac tttgcggtgc gtaccgtttt cggtccggtt 1920

ccgctggagt ttgcgcaaga ttggccggtg atggcgagct acgacgagct ggcggaatat 1980

gcggagtggg tgggctgccg tattccgacc ttcgaggaaa cccgtagcat ctacctgcac 2040

agcgcgctgc tgaaggaacg tggtggcgtt aaccacaacg gcgagccgaa cggtcacagc 2100

ctgaacggcg atctgaacgg tgtgaacggt aacggctaca gcaaaatcaa cccgggcaag 2160

ccgcgtaaac cggaccacca gccggttcaa tatccgagcc gtgatgcgct gccggtgttc 2220

ctggacctgc acggtctgaa cgttggtttt aaacactggc acccgacccc ggtgattcag 2280

aacggtgatc gtctggcggg tcaaggtgaa ctgggtggcg cgtgggagtg gaccagcacc 2340

ccgctggcgc cgcacgacgg cttcaaggcg atggagatct acccgggcta taccagcgat 2400

ttctttgacg gtaaacacaa catcattctg ggtggcagct gggcgaccca cccgcgtgtg 2460

gcgggtcgta ccacctttgt taactggtat caacacaatt atccgtacac ctgggcgggt 2520

gcgcgtctgg ttcgtgacct gtaaactagt 2550

<210> 28

<211> 1404

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成基因

<400> 28

gatatcatga ccacgccgtt tggtgcgccg atgcgtgaac attttctgtt cgataccaac 60

ttcaaaaacc tgaatcacgg ttccttcggc acgtatccgc gtgcggtcca gaccgtgctg 120

cgtcagcatc aacactcagc agaagctcgc ccggacctgt tttatcgtat tacccgcggt 180

caaggcatcg acggttctcg tcgcattgtc gcgaacctgc tgaatatccc ggtgaacgaa 240

tgcgttttcg tcaaaaatgc caccacgggc gttgcaaccg tcctgcgtaa cctggtgttt 300

cagaaaggtg atgcagtggt ttatttcgac accatctacg gcgctgtgga gaaaaacgtt 360

cattctatta tggaagcaag tccggtcacc acgcgcaaag tggaatgtgc tctgccggtt 420

tctcatgaag atctggtcaa acgttttcgc gacgtcgtga gtcgtgcgcg cggtgaaggc 480

ctgcacgtga aagttgccgt cttcgatacg attgtgtcgg ttccgggcgt tcgttttccg 540

ttcgaaaccc tggtcggtgt gtgccgcgaa gaaggcattc tgagcctgat cgatggtgcg 600

catggtattg gccacattcc gctggatctg ggtaccctgc gtccggactt tttcacctct 660

aacctgcata aatggctgtt tgtgccgcgc ggttgtgccg tgctgcatgt tccgctgcgt 720

aatcagcacc tgatccgcac cacgttcccg accagttggg gttatattcc gccgccgagc 780

tctggcgaaa ttaccccgac ggcaacccag ggcaaatcgg cttttgaata cctgttcgaa 840

cacattagca ccacggatga tacgccgtgg ctgtgtgttc cggccgcaat gaaatttcgt 900

accgaagtgt gtggcggtga agatcgcatc tatgcatacc tggaaacgct ggcacgtgaa 960

gctggtgaca ttgttgcccg tgcactgggt accgaagtga tgcaggaacc gggtctgaaa 1020

gaaggcgaag ttagccaact gcgtcgctgc ggtatggcca ccgtgcgtct gccgatcgcc 1080

gttaccagtt cctcatcgag cgatagcggt agcggtaatg gcggtggcgc cgtcatgcgt 1140

gtgcagggtg aagacggctc tagttatctg cgcattcaaa cgtccctggt tggcaccgtc 1200

tcaaattggt ttcgcgatac gctgttcgac aaatatgaaa cctttgttcc ggtcttccag 1260

catggtggct ggctgtggac ccgtctgtcc gcacaagtgt acctggaaaa gggtgatttt 1320

gaatggctgg gtggcgttct gcgcgaatgc tgtgaacgtg tggaacgcga agtgggcgtt 1380

tcctcagcta aactgtaaac tagt 1404

<210> 29

<211> 2890

<212> DNA

<213> 黑曲霉

<400> 29

atgtcaccct tatgtccggt cgtcaagggc gttgacatcg tcgatatccg tcaaaatgac 60

gtggagtttt ccctggtaaa tgatatccag cgaggtatag atcctccggc aggaacttgc 120

cgatccatgc ccacaatgct tctttacgat gctcaggggc tcaagctgtt cgaggacatt 180

acgtacctgg aggaatacta tctcacaaat gcggagattg acgttctacg gacacatgcg 240

aagaggattg ttgaacgcat cccggacaat gcgcaattac tggaactagg cagtgggtgc 300

gtcttccttc cgcttggagc atgtatagag tatagggtac agacacggga ttctaacata 360

cggtagcaat ctgcgcaaga ttgagatcct tctccaggaa ttcgaagcag cgagcaaaaa 420

agtggactac tatgccttgg atctgtcgct ctcagagttg gagcgcacat tctcggaagt 480

gtccctcgat caatatcaat atgtcaagct ccacggcctg catggcacgt acgacgacgc 540

cctcacctgg ctagaaaacc ccgcgaatcg aaaggtccca acggtgatca tgtcaatggg 600

ctcgtcgata ggaaattttg atcgtcctgc agcggcaaaa ttcttgtcgc aatttgccag 660

gctcttaggg ccgtcggatt tgatggtgct cggtttggat agttgcacgg actcggataa 720

agtgtacaag gcatacaatg attccaaggg tatcacacgg cagttctacg agaacgggtt 780

gttgcatgcg aacgctgtgc ttggatacga agcattcaaa ctcgatgaat gggatatcgt 840

gacggagtac gataacgtcg aagggcggca ccaggcgttc tacgcgccaa accgggacgt 900

gactataaac ggggtactac ttcagaaagg cgagaagcta atttttgagg aggcattcaa 960

atatgatccc gagcagtgcg atcagctctg gcatgatgcg ggtttaattg aggacgctga 1020

gtttggcaat gagtctgggg attaccgtat gtcatccttt ggcaatgtgc tactctgcat 1080

gtcatgttgc actgcattgt gtaaaaacat gttacaccag ttgagaccat catactaaca 1140

taatctgtcg agcagttatc cacgtgctct cttcggcttc tctcaacttt tcaacgagac 1200

catcacagta tgcggctcaa tctattccga gctttgagga attccagtca ctgtggacag 1260

catgggacat tgtcaccaag gccatggttc ctagagagga acttctttcg aagccaatca 1320

aattgcgcaa tgcattaatc ttctacctcg gtcacatacc tacgtttctc ggtcagtgtt 1380

ctgcttggct atttgtggag tgcaagtata ggggtcagca tattgacaag cgcagatgtt 1440

catttgaccc gagcattggg cgaaaagcca acgcacccca agtcatatcg actcattttc 1500

gaacgcggaa tcgaccccga tgtggatgac cccgaaaagt gccattctca cagcgagatt 1560

ccagacgaat ggcctgccct tggagacatc ttggactacc aagtgcgggt tcgaagtagg 1620

gtgaggtcca tttttcagaa gcataatgtg gctgagaata gggtgcttgg tgaagcactc 1680

tggatcgggt ttgagcatga agccatgcat ctggaaacgt tcctttacat gcttatccag 1740

agtgaaagaa cacttccgcc ccccgccgtt ccgcgccccg attttaggaa gtttttccac 1800

gatgcccggc aagagtcaag accaaacgag tggttttcga ttcccgagaa gacgctttcg 1860

gttggattac atgatgatgg acattcagtt cctcgtgact cttttggctg ggacaacgaa 1920

aagccccaga gaaagataac cgttaaagca ttcgaagctc aagcgcgacc aataacaaat 1980

ggagagtacg cgaagtatct acaggcgaat cagctgcccc agaagccaga gtcctgggtc 2040

ttgatcaagc ccgagacgta cccgacttgc aatggtgtca gtcaagacgg tagctacgct 2100

acgaatgaat tcatggcaca ctttgccgtt cgcactgtgt ttggctccgt cccgctcgag 2160

ctagcccagg actggccggt tatcgcgtcg tacgatgaat tggccaagta tgccaagtgg 2220

gtggactgca ggataccaac cttcgaagag gcaaagagta tctacgcgca tgcagctcgg 2280

ctgaaggaaa ctagccacgg cctgaacggt cacaggtaag cataccgctt ccactagatg 2340

cacaggactt actgtcatag tgaaacgaac ggagtcaacg ggcacgaaca tagcgagacc 2400

aaccccctac ggcctcgcac cccggaccac caaccggtac agcacccttc gcaagaatct 2460

ctgccggtgt ttgttgagct cgacaattgc aacgtcggct tcaaacactg gcaccctacc 2520

ccggtcatcc agaacggcga ccgactcgcc ggtcatggag agctgggagg cgtctgggag 2580

tggacgagca cggaacttgc accccacgaa gggttcgagg ccatgcaaat ctaccccgga 2640

tatacatgta agcttgctgt gtgagatata tgaacacaag ctaactgaga acagccgact 2700

tcttcgacgg aaaacacaat atcatcctcg gagggtcatg ggcgacgcat ccacggatcg 2760

ccggccgcac taccttgtaa gtccgtatgc aagactagcg ggttcatgag ctaatctgtt 2820

cagtgtcaat tggtaccagc ggaactaccc atacccctgg gctggtgccc ggctggtgcg 2880

ggatgtctga 2890

<210> 30

<211> 835

<212> PRT

<213> 黑曲霉

<400> 30

Met Ser Pro Leu Cys Pro Val Val Lys Gly Val Asp Ile Val Asp Ile

1 5 10 15

Arg Gln Asn Asp Val Glu Phe Ser Leu Val Asn Asp Ile Gln Arg Gly

20 25 30

Ile Asp Pro Pro Ala Gly Thr Cys Arg Ser Met Pro Thr Met Leu Leu

35 40 45

Tyr Asp Ala Gln Gly Leu Lys Leu Phe Glu Asp Ile Thr Tyr Leu Glu

50 55 60

Glu Tyr Tyr Leu Thr Asn Ala Glu Ile Asp Val Leu Arg Thr His Ala

65 70 75 80

Lys Arg Ile Val Glu Arg Ile Pro Asp Asn Ala Gln Leu Leu Glu Leu

85 90 95

Gly Ser Gly Asn Leu Arg Lys Ile Glu Ile Leu Leu Gln Glu Phe Glu

100 105 110

Ala Ala Ser Lys Lys Val Asp Tyr Tyr Ala Leu Asp Leu Ser Leu Ser

115 120 125

Glu Leu Glu Arg Thr Phe Ser Glu Val Ser Leu Asp Gln Tyr Gln Tyr

130 135 140

Val Lys Leu His Gly Leu His Gly Thr Tyr Asp Asp Ala Leu Thr Trp

145 150 155 160

Leu Glu Asn Pro Ala Asn Arg Lys Val Pro Thr Val Ile Met Ser Met

165 170 175

Gly Ser Ser Ile Gly Asn Phe Asp Arg Pro Ala Ala Ala Lys Phe Leu

180 185 190

Ser Gln Phe Ala Arg Leu Leu Gly Pro Ser Asp Leu Met Val Leu Gly

195 200 205

Leu Asp Ser Cys Thr Asp Ser Asp Lys Val Tyr Lys Ala Tyr Asn Asp

210 215 220

Ser Lys Gly Ile Thr Arg Gln Phe Tyr Glu Asn Gly Leu Leu His Ala

225 230 235 240

Asn Ala Val Leu Gly Tyr Glu Ala Phe Lys Leu Asp Glu Trp Asp Ile

245 250 255

Val Thr Glu Tyr Asp Asn Val Glu Gly Arg His Gln Ala Phe Tyr Ala

260 265 270

Pro Asn Arg Asp Val Thr Ile Asn Gly Val Leu Leu Gln Lys Gly Glu

275 280 285

Lys Leu Ile Phe Glu Glu Ala Phe Lys Tyr Asp Pro Glu Gln Cys Asp

290 295 300

Gln Leu Trp His Asp Ala Gly Leu Ile Glu Asp Ala Glu Phe Gly Asn

305 310 315 320

Glu Ser Gly Asp Tyr Leu Ile His Val Leu Ser Ser Ala Ser Leu Asn

325 330 335

Phe Ser Thr Arg Pro Ser Gln Tyr Ala Ala Gln Ser Ile Pro Ser Phe

340 345 350

Glu Glu Phe Gln Ser Leu Trp Thr Ala Trp Asp Ile Val Thr Lys Ala

355 360 365

Met Val Pro Arg Glu Glu Leu Leu Ser Lys Pro Ile Lys Leu Arg Asn

370 375 380

Ala Leu Ile Phe Tyr Leu Gly His Ile Pro Thr Phe Leu Asp Val His

385 390 395 400

Leu Thr Arg Ala Leu Gly Glu Lys Pro Thr His Pro Lys Ser Tyr Arg

405 410 415

Leu Ile Phe Glu Arg Gly Ile Asp Pro Asp Val Asp Asp Pro Glu Lys

420 425 430

Cys His Ser His Ser Glu Ile Pro Asp Glu Trp Pro Ala Leu Gly Asp

435 440 445

Ile Leu Asp Tyr Gln Val Arg Val Arg Ser Arg Val Arg Ser Ile Phe

450 455 460

Gln Lys His Asn Val Ala Glu Asn Arg Val Leu Gly Glu Ala Leu Trp

465 470 475 480

Ile Gly Phe Glu His Glu Ala Met His Leu Glu Thr Phe Leu Tyr Met

485 490 495

Leu Ile Gln Ser Glu Arg Thr Leu Pro Pro Pro Ala Val Pro Arg Pro

500 505 510

Asp Phe Arg Lys Phe Phe His Asp Ala Arg Gln Glu Ser Arg Pro Asn

515 520 525

Glu Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys Thr Leu Ser Val Gly Leu His Asp

530 535 540

Asp Gly His Ser Val Pro Arg Asp Ser Phe Gly Trp Asp Asn Glu Lys

545 550 555 560

Pro Gln Arg Lys Ile Thr Val Lys Ala Phe Glu Ala Gln Ala Arg Pro

565 570 575

Ile Thr Asn Gly Glu Tyr Ala Lys Tyr Leu Gln Ala Asn Gln Leu Pro

580 585 590

Gln Lys Pro Glu Ser Trp Val Leu Ile Lys Pro Glu Thr Tyr Pro Thr

595 600 605

Cys Asn Gly Val Ser Gln Asp Gly Ser Tyr Ala Thr Asn Glu Phe Met

610 615 620

Ala His Phe Ala Val Arg Thr Val Phe Gly Ser Val Pro Leu Glu Leu

625 630 635 640

Ala Gln Asp Trp Pro Val Ile Ala Ser Tyr Asp Glu Leu Ala Lys Tyr

645 650 655

Ala Lys Trp Val Asp Cys Arg Ile Pro Thr Phe Glu Glu Ala Lys Ser

660 665 670

Ile Tyr Ala His Ala Ala Arg Leu Lys Glu Thr Ser His Gly Leu Asn

675 680 685

Gly His Ser Glu Thr Asn Gly Val Asn Gly His Glu His Ser Glu Thr

690 695 700

Asn Pro Leu Arg Pro Arg Thr Pro Asp His Gln Pro Val Gln His Pro

705 710 715 720

Ser Gln Glu Ser Leu Pro Val Phe Val Glu Leu Asp Asn Cys Asn Val

725 730 735

Gly Phe Lys His Trp His Pro Thr Pro Val Ile Gln Asn Gly Asp Arg

740 745 750

Leu Ala Gly His Gly Glu Leu Gly Gly Val Trp Glu Trp Thr Ser Thr

755 760 765

Glu Leu Ala Pro His Glu Gly Phe Glu Ala Met Gln Ile Tyr Pro Gly

770 775 780

Tyr Thr Ser Asp Phe Phe Asp Gly Lys His Asn Ile Ile Leu Gly Gly

785 790 795 800

Ser Trp Ala Thr His Pro Arg Ile Ala Gly Arg Thr Thr Phe Val Asn

805 810 815

Trp Tyr Gln Arg Asn Tyr Pro Tyr Pro Trp Ala Gly Ala Arg Leu Val

820 825 830

Arg Asp Val

835

<210> 31

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

cgcaccacct tcaaaatgtc acccttatgt ccggtcgtca ag 42

<210> 32

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

atgtactcct ggtactcaga catcccgcac cagcc 35

Claims

1.麦角硒因的制造方法，包括使组氨酸和硒化合物作用于转化株以得到麦角硒因的步骤，所述转化株是酱油曲霉作为宿主生物；

其中所述转化株被插入作为外源基因的编码下述(1)的酶的基因，并且将被插入的基因过量表达：

(1)在存在S-腺苷甲硫氨酸和铁(II)的条件下，催化从组氨酸和硒代半胱氨酸生成下述式〔I〕

[化1]

所示的海西宁硒半胱氨酸的反应的酶，编码所述(1)的酶的基因是序列表中SEQ IDNO：1所示碱基序列的基因；或者所述(1)的酶是序列表中SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的酶。

2.根据权利要求1所述的制造方法，所述硒化合物是从有机硒化合物、无机硒化合物及它们的盐组成的组群中选出的至少一种硒化合物。

3.根据权利要求1所述的制造方法，所述硒化合物是从硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸、硒蛋氨酸、Se-(甲基)硒基-L-半胱氨酸、硒肽、硒蛋白及它们的盐，以及硒酵母组成的组群中选出的至少一种硒化合物，和/或所述硒化合物是从硒酸、亚硒酸、氯化硒、硫化硒、二甲硒、硒代磷酸盐、二氧化硒及它们的盐组成的组群中选出的至少一种硒化合物。

4.根据权利要求1所述的制造方法，所述转化株被插入编码下述(2)的酶的基因，并且将被插入的基因过量表达，

(2)将5'-磷酸吡哆醛作为辅酶，催化从下述式〔I〕

[化2]

所示的海西宁硒半胱氨酸生成麦角硒因的反应的酶，编码所述(2)的酶的基因选自序列表中SEQ ID NO：2所示碱基序列的基因以及序列表中SEQ ID NO：3所示碱基序列的基因；或者所述(2)的酶选自序列表中SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的酶以及序列表中SEQ IDNO：6所示氨基酸序列的酶。

5.根据权利要求1所述的制造方法，所述转化株是将表达由硒酸还原酶、硒代半胱氨酸裂解酶和丝氨酸脱水酶组成的组群中选出的至少一种酶的酱油曲霉作为宿主生物。

6.根据权利要求1所述的制造方法，所述转化株是与宿主生物相比编码所述(1)的酶的基因的表达被增强以增加麦角硒因的量的转化株。

7.根据权利要求1所述的制造方法，所述转化株是编码所述(1)的酶的基因的表达被增强的转化株，以使得利用适于宿主生物生长的含有硒胱氨酸的培养基，在30℃的条件下培养转化株5天期间的情况下，麦角硒因的量为每1克湿菌体质量10μg以上。

8.麦角硒因的制造方法，包括使组氨酸和硒化合物作用于转化株以得到麦角硒因的步骤，所述转化株是米曲霉作为宿主生物；

[化1]

所示的海西宁硒半胱氨酸的反应的酶，编码所述(1)的酶的基因是序列表SEQ ID NO：23所示碱基序列的基因；或者所述(1)的酶是序列表SEQ ID NO：24所示氨基酸序列的酶。

9.根据权利要求8所述的制造方法，所述硒化合物是从有机硒化合物、无机硒化合物及它们的盐组成的组群中选出的至少一种硒化合物。

10.根据权利要求8所述的制造方法，所述硒化合物是从硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸、硒蛋氨酸、Se-(甲基)硒基-L-半胱氨酸、硒肽、硒蛋白及它们的盐，以及硒酵母组成的组群中选出的至少一种硒化合物，和/或所述硒化合物是从硒酸、亚硒酸、氯化硒、硫化硒、二甲硒、硒代磷酸盐、二氧化硒及它们的盐组成的组群中选出的至少一种硒化合物。

11.根据权利要求8所述的制造方法，所述转化株是将表达由硒酸还原酶、硒代半胱氨酸裂解酶和丝氨酸脱水酶组成的组群中选出的至少一种酶的米曲霉作为宿主生物。

12.根据权利要求8所述的制造方法，所述转化株是与宿主生物相比编码所述(1)的酶的基因的表达被增强以增加麦角硒因的量的转化株。

13.根据权利要求8所述的制造方法，所述转化株是编码所述(1)的酶的基因的表达被增强的转化株，以使得利用适于宿主生物生长的含有硒胱氨酸的培养基，在30℃的条件下培养转化株5天期间的情况下，麦角硒因的量为每1克湿菌体质量10μg以上。