CN108138163A - 肿瘤的判定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供肿瘤的判定方法。一种包括以下工序的肿瘤的判定方法：1)将由受检组织或细胞制备的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理的工序(该受检组织或细胞来自罹患肿瘤并且(i)该肿瘤在MSI检查中被判定为MSI‑H、和/或该肿瘤在免疫组织化学检查中被判定为MLH1的表达消失或降低且(ii)通过遗传学检查被判定为在MLH1没有发现变异的患者)；2)从该亚硫酸氢盐处理DNA中将包含MLH1启动子区域的一部分或全部的DNA进行PCR扩增的工序；3)将该PCR扩增产物供于离子交换色谱，获得检测信号的工序；4)判定该检测信号的峰是否为表示高甲基化DNA的峰的工序；5)该峰被判定为表示高甲基化DNA的峰的情况下，将该肿瘤判定为来自非林奇综合征的患者的肿瘤的工序。

Description

肿瘤的判定方法

技术领域

本发明涉及利用基于离子交换色谱的甲基化DNA检测来判定肿瘤的方法。

背景技术

近年来，清楚地知道了DNA的异常甲基化深度参与癌化，受到了关注。作为肿瘤中的特征性表观遗传异常，已知有部分的基因启动子区域中的CpG岛的异常DNA甲基化。CpG岛是介由磷酸二酯键(p)的胞嘧啶(C)-鸟嘌呤(G)二碱基序列高频出现的区域，大多存在于基因上游的启动子区域。CpG岛的异常DNA甲基化通过使抑癌基因失活等而参与癌变。在大肠癌、胃癌等中，已经报告了与临床病理学因素相关的CpG岛的DNA甲基化亢进(非专利文献1～4)。

作为已经确立的甲基化DNA的分析方法，有利用亚硫酸氢盐(重亚硫酸盐、酸性亚硫酸盐、bisulfite)反应的方法。该方法在甲基化DNA的分析中是最常用的方法。如果用亚硫酸氢盐处理单链DNA，则胞嘧啶经过磺化、水解脱氨化、脱磺化而转变成尿嘧啶。另一方面，由于被甲基化的胞嘧啶最初发生的磺化的反应速度极其缓慢，所以在实际进行的亚硫酸氢盐处理的反应时间中仍保持为甲基化胞嘧啶。因此，如果使用经亚硫酸氢盐处理过的DNA进行PCR(Polymerase Chain Reaction：聚合酶链式反应)，则甲基化胞嘧啶仍保持为胞嘧啶，但非甲基化胞嘧啶被从尿嘧啶替换成胸腺嘧啶而扩增。利用该PCR扩增产物的序列中产生的胞嘧啶和胸腺嘧啶这样的碱基的差异来分析甲基化状态。以此为基本原理通用的方法有专利文献1、非专利文献5中记载的Methylation-Specific PCR(MSP)法、以及非专利文献6、7中记载的Combined Bisulfite Restriction Analysis(COBRA)法。MSP法和COBRA法从无需特别的装置就能够进行甲基化DNA的定量分析这点来看现在仍是广泛使用的甲基化DNA分析方法，但从分析中利用电泳法这点和COBRA法中还需要限制性内切酶处理这点来看存在耗费精力和时间这样的课题。

作为其它的甲基化DNA分析方法，有焦磷酸测序(非专利文献8、9)。在该方法中，将经亚硫酸氢盐处理过的DNA的PCR扩增产物供于焦磷酸测序，检测替换成胸腺嘧啶的甲基化胞嘧啶。但是，由于焦磷酸测序是需要专用测序仪的逐个读取碱基的方法，所以存在分析耗费时间以及需要昂贵的试剂这样的课题。

最近，提出了通过将经亚硫酸氢盐处理过的DNA的PCR扩增产物供于离子交换色谱，基于该色谱的检测信号的保留时间判定DNA的甲基化率的方法(专利文献2)。该方法与以往的利用电泳、焦磷酸测序的甲基化DNA分析方法相比，具有分析时间大幅缩短这样的优点。另外，提出了采用专利文献2的方法判定肾细胞癌的预后的方法(专利文献3)。

作为遗传性大肠癌的一种的遗传性非息肉病性大肠癌(hereditary non-polyposis colorectal cancer：HNPCC)也被称为林奇综合征(Lynch syndrome)，与一般的大肠癌相比在青少年时期发病，且为多发性(同时性、异时性)，好发于右侧结肠。另外，与散发性大肠癌相比具有如下组织学特征：低分化腺癌的频率高，观察到粘液癌·印戒细胞样分化、肿瘤内淋巴细胞浸润等。由于属于林奇综合征的大肠癌缺乏临床特征，所以会与非遗传性散发性大肠癌无区别地处置，其中的很多被漏掉的可能性高。另外林奇综合征患者罹患妇科癌症、消化道癌等除大肠癌以外的各种恶性肿瘤的风险高，因此林奇综合征的诊断是重要的。作为用于诊断林奇综合征的筛查检查，采用微卫星不稳定性(MicrosatelliteInstability：MSI)检查和错配修复(mismatch repair：MMR)相关蛋白的免疫组织化学是有用的，前者已经纳入保险适用范围(非专利文献10)。

在DNA中1～几个碱基的碱基序列重复出现的区域即微卫星是容易产生DNA复制错误的部分。微卫星不稳定性(MSI)是指由于错配修复机构的功能降低导致微卫星的重复次数在肿瘤组织和正常组织间产生差别。MSI在约90％的被诊断为林奇综合征的大肠癌组织中被发现。

MSI以用BAT25、BAT26、D2S123、D5S346和D17S250这5种微卫星标志物(microsatellite marker)检测出的重复序列的不稳定性为基准，被分类成MSS(稳定)、MSI-L(低度)、MSI-H(高度)(非专利文献11)。更具体而言，MSI阳性(高MSI：MSI-H)是指用上述微卫星标志物中的至少2个标志物认定为MSI。用1个肿瘤标志物认定为MSI的情况被称作MSI阴性(低MSI：MSI-L)。关于全部5种标志物判定为MSI阴性的情况被称作微卫星稳定(Microsatellite stable：MSS)。另外，当使用包含上述5种标志物的6种以上的标志物进行MSI检查时，被全部标志物中的30-40％以上认定为MSI的情况下判定为MSI-H，其以下的情况判定为MSI-L。已知MSI是由于作为错配修复基因的MLH1、MSH2、MSH6或PMS2的生殖细胞系变异而引起的。

在日本成为MSI-H的大肠癌占全部大肠癌的6-7％(非专利文献12和13)。另一方面，林奇综合征患者占全部大肠癌的2-3％。因此，在MSI-H病例中，1/2-2/3的病例不是林奇综合征，认为是MLH1的启动子区域的后天甲基化所致的失活(非专利文献14)。为了将这样的甲基化病例从疑似为林奇综合征的患者中排除，设置了贝塞斯达标准(非专利文献15)，还认为对满足该标准的病例进行MSI检查是有效的。另一方面，贝塞斯达标准被指出遗漏了50岁到60岁之间发病的低外显率的林奇综合征，最近，还提出了对全部大肠癌病例(或者小于70岁的大肠癌)进行免疫组织化学或MSI检查以挑出林奇综合征(非专利文献16)。特别是对于在免疫组织化学中被认定为MLH1的表达消失且为MSI-H的病例，有时可以根据既往史及家族史优先实行遗传学检查。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:美国专利第5786146号公报

专利文献2:国际公开公报第2014/136930号公报

专利文献3:国际公开公报第2015/129916号公报

非专利文献

非专利文献1:Nat.Rev.Cancer,4,988-993(2004)

非专利文献2:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96,8681-8686(1999)

非专利文献3:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,104,18654-18659(2007)

非专利文献4:Cancer Res.,59,5438-5442(1999)

非专利文献5:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93,9821-9826(1996)

非专利文献6:Nucleic Acids Res.,24,5058-5059(1996)

非专利文献7:Nucleic Acids Res.,25,2532-2534(1997)

非专利文献8:Science.,281,363-365(1998)

非专利文献9:Genome Research.,11,3-11(2001)

非专利文献10:平成19年6月1日卫生部事务联络及平成20年4月诊疗报酬改定

非专利文献11:Nat.Rev.Clin.Oncol.,7,153-162(2010)

非专利文献12:Cancer Lett.,216,55-62(2004)

非专利文献13:Carcinogenesis.,30,494-499(2009)

非专利文献14:Cancer Res.,57,808-811(1997)

非专利文献15:J.Natl.Cancer Inst.,96,261-268(2004)

非专利文献16:Gut.,62,812-823(2013)

非专利文献17:Electrophoresis.,23,4072-4079(2002)

发明内容

为了进行更准确的大肠癌诊断，需要在更多的大肠癌病例中进行MLH1启动子区域的甲基化分析。目前，MLH1启动子区域的甲基化分析是通过将DNA经过亚硫酸氢盐处理后，进行PCR直接测序法、MSP法、RFLP法(识别甲基化的酶限制性内切酶多态性)等而实施的。临床上，应用了采用焦磷酸测序的甲基化筛查法(非专利文献17)。但是，焦磷酸测序的难点在于耗费成本和时间，寻求开发一种更低成本且通用性好的方法。

本发明人等发现将经亚硫酸氢盐处理过的DNA的PCR扩增产物供于离子交换色谱而得到的信号在微卫星不稳定性阳性(MSI-H)的肿瘤中对于林奇综合征患者和非林奇综合征患者而言是不同的。

因此，本发明提供以下内容。

〔1〕一种肿瘤的判定方法，包括以下工序：

(1)将由受检组织或细胞制备的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理的工序，

其中，该受检组织或细胞是来自以下罹患肿瘤且判定为下述(i)(ii)情况的患者的组织或细胞，

(i)该肿瘤在MSI检查中被判定为MSI-H、和/或该肿瘤在免疫组织化学检查中被判定为MLH1的表达消失或降低，且，

(ii)通过遗传学检查被判定为在MLH1没有发现变异；

(2)从工序(1)中得到的经亚硫酸氢盐处理过的DNA中，将包含MLH1启动子区域的一部分或全部的DNA通过PCR进行扩增的工序；

(3)将工序(2)中得到的PCR扩增产物供于离子交换色谱，获得检测信号的工序；

(4)判定工序(3)中得到的检测信号的峰是否为表示高甲基化DNA的峰的工序；

(5)在工序(4)中，该峰被判定为表示高甲基化DNA的峰的情况下，将该肿瘤判定为来自非林奇综合征的患者的肿瘤的工序。

〔2〕根据〔1〕所述的方法，其中，上述受检组织或细胞是包含肿瘤的组织或细胞。

〔3〕根据〔2〕所述的方法，其中，上述肿瘤是大肠、子宫内膜、胃、卵巢、小肠、胆道、胰脏、肾盂、输尿管、脑或者皮脂腺中的肿瘤。

〔4〕根据〔1〕～〔3〕中任一项所述的方法，其中，在上述工序(2)中，代替包含上述MLH1启动子区域的一部分或全部的DNA而将包含MLH1的启动子区域和/或Intron1区域的一部分或全部的DNA通过PCR进行扩增。

〔5〕根据〔1〕～〔4〕中任一项所述的方法，其中，上述离子交换色谱为阴离子交换色谱。

〔6〕根据〔1〕～〔5〕中任一项记载的方法，其中，上述离子交换色谱中使用的色谱柱填充剂在表面具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团这两者。

针对在现有的MSI检查等中疑似为林奇综合征但在遗传学检查中没有观察到MLH1异常的患者，本发明的方法在用于否定林奇综合征的可能性的鉴别诊断中有用。另外根据本发明的方法，能够更迅速、简便且高精度地判定林奇综合征的可能性，因此能够为患者选择适当的治疗方法。因此本发明有助于提高患者的生存率。

附图说明

图1是针对区域DfCr的来自患者ID：S-1的T样本和N样本以及阴性对照和阳性对照的色谱图。横轴为色谱的保留时间。

图2是针对区域DfCr的来自患者ID：S-2的T样本和N样本以及阴性对照和阳性对照的色谱图。横轴为色谱的保留时间。

图3是针对区域DfCr的来自患者ID：S-3的T样本和N样本以及阴性对照和阳性对照的色谱图。横轴为色谱的保留时间。

图4是针对区域DfCr的来自患者ID：S-4的T样本和N样本以及阴性对照和阳性对照的色谱图。横轴为色谱的保留时间。

图5是针对区域A的来自患者ID：S-2的T样本和N样本以及阴性对照和阳性对照的色谱图。横轴为色谱的保留时间。

图6是针对区域B的来自患者ID：S-2的T样本和N样本以及阴性对照和阳性对照的色谱图。横轴为色谱的保留时间。

图7是针对区域C的来自患者ID：S-2的T样本和N样本以及阴性对照和阳性对照的色谱图。横轴为色谱的保留时间。

图8是针对区域D的来自患者ID：S-2的T样本和N样本以及阴性对照和阳性对照的色谱图。横轴为色谱的保留时间。

图9是针对区域E的来自患者ID：S-2的T样本和N样本以及阴性对照和阳性对照的色谱图。横轴为色谱的保留时间。

具体实施方式

本说明书中，“林奇综合征(Lynch syndrome)”是指以错配修复基因的生殖细胞系变异为原因的常染色体显性遗传性疾病，是针对下述林奇综合征相关肿瘤的肿瘤易感综合征。“林奇综合征”一般被作为与属于遗传性大肠癌的一种的遗传性非息肉病性大肠癌(hereditary non-polyposis colorectal cancer：HNPCC)相同的疾病来对待，但林奇综合征患者的肿瘤不仅生长在大肠，有时在子宫内膜、胃、卵巢、小肠、胆道、胰脏、肾盂·输尿管、脑、皮脂腺等各种组织也产生肿瘤。在林奇综合征患者中发现的这些肿瘤被称为林奇综合征相关肿瘤。本发明中的“林奇综合征相关肿瘤”不仅限于大肠癌，还包含在上述的林奇综合征患者中发现的在各种组织产生的肿瘤。

“表突变(Epimutation)”是指在不会导致累及基因的DNA序列变化的情况下，通常引起活性基因的转录沉默(transcriptional silencing)、或者通常引起沉默基因的活化的表观遗传异常。

“组成性表突变(Constitutional epimutation)”存在于个体的正常细胞中(其中可以不存在于生殖细胞)，是成为疾病的表型的原因的表突变。

“生殖细胞系表突变(Germ line epimutaion)”是存在于(不受表观遗传的改变影响)配子中的对单个亲本的等位基因有影响的表突变。

本说明书中，“肿瘤”包含良性肿瘤和恶性肿瘤(癌)。

本说明书中，“CpG位点”是指在DNA中胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)之间进行磷酸二酯键合(p)的部位。另外，本说明书中，CpG岛是指介由磷酸二酯键(p)的胞嘧啶(C)-鸟嘌呤(G)二碱基序列高频出现的区域。CpG岛大多存在于基因上游的启动子区域。本说明书中，“(某一)基因的CpG位点或CpG岛”是指存在于接近该基因的编码区的位置的CpG岛、或者该CpG岛所含的CpG位点，优选指存在于该基因的启动子区域的CpG位点或CpG岛。特定基因的CpG位点或CpG岛可以基于MassARRAY法、焦磷酸测序等方法进行鉴定。

本说明书中，“DNA甲基化”是指在DNA中，胞嘧啶的5位的碳被甲基化的状态。另外，本说明书中，DNA的“检测甲基化”是指测定该DNA中甲基化DNA是否存在或存在量、存在量之比、或者该DNA的甲基化率。本说明书中，“DNA甲基化率”是指作为检测对象的特定DNA中CpG位点的胞嘧啶被甲基化的比例，例如，可以由作为检测对象的特定DNA区域中的、甲基化胞嘧啶数与胞嘧啶总数(甲基化胞嘧啶和非甲基化胞嘧啶)的比率来表示。

本说明书中，“高甲基化DNA(或者也简称为甲基化DNA)”是指甲基化率例如为50％以上、优选为70％以上、更优选为90％以上的DNA。另外，“低甲基化DNA(或者也称为非甲基化DNA)”是指DNA甲基化率例如低于50％、优选为20％以下、更优选为10％以下、进一步优选为5％以下的DNA。另外本说明书中，“表示高甲基化DNA(或者简称为甲基化DNA)的峰”是指由高甲基化DNA得到的色谱检测信号的峰，另外“表示低甲基化DNA(或者非甲基化DNA)的峰”是指由低甲基化DNA得到的色谱检测信号的峰。DNA甲基化率可以由焦磷酸测序等公知的方法来决定，本发明方法中的“高甲基化DNA”和“低甲基化DNA”的判定是基于按照后述步骤由离子交换色谱的色谱图算出的DNA甲基化率而进行的。

本说明书中“保留时间”是指在柱色谱等色谱中，从物质被导入色谱柱到被洗脱为止的时间，换言之，是指物质在色谱柱被保留的时间。另外，有时也将保留时间称为洗脱时间。离子交换色谱的检测信号的保留时间(洗脱时间)与DNA甲基化率相关(参照专利文献2)。因此，通过测定离子交换色谱的检测信号的保留时间(洗脱时间)，能够算出DNA甲基化率。更详细而言，由具有已知的甲基化率的标准DNA制成色谱检测信号的保留时间的校正曲线，将试样DNA的色谱检测信号的保留时间套用到该校正曲线中，由此能够算出该试样DNA的甲基化率。由出现多个检测信号(峰)的色谱图计算DNA甲基化率时，例如，如专利文献3所公开，可以首先算出检测信号的保留时间的平均值，接着换算成DNA甲基化率的平均值。

在一个实施方式中，本发明提供一种肿瘤的判定方法，包括以下工序：

(1)将由受检组织或细胞制备的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理的工序，

其中，该受检组织或细胞是来自以下罹患肿瘤且判定为下述(i)(ii)情况的患者的组织或细胞，

(i)该肿瘤在MSI检查中被判定为MSI-H、和/或该肿瘤在免疫组织化学检查中被判定为MLH1的表达消失或降低，且，

(ii)通过遗传学检查被判定为在MLH1没有发现变异；

(2)从工序(1)中得到的经亚硫酸氢盐处理过的DNA中，将包含MLH1启动子区域的一部分或全部的DNA通过PCR进行扩增的工序；

(3)将工序(2)中得到的PCR扩增产物供于离子交换色谱，获得检测信号的工序；

(4)判定工序(3)中得到的检测信号的峰是否为表示高甲基化DNA的峰的工序；

(5)在工序(4)中，该峰被判定为表示高甲基化DNA的峰的情况下，将该肿瘤判定为来自非林奇综合征的患者的肿瘤的工序。

在另一实施方式中，本发明提供一种肿瘤患者的判定方法，包括以下工序：

(1)将由受检组织或细胞制备的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理的工序，

其中，该受检组织或细胞是来自以下罹患肿瘤且判定为下述(i)(ii)情况的患者的组织或细胞，

(i)该肿瘤在MSI检查中被判定为MSI-H、和/或该肿瘤在免疫组织化学检查中被判定为MLH1的表达消失或降低，且，

(ii)通过遗传学检查被判定为在MLH1没有发现变异；

(2)从工序(1)中得到的经亚硫酸氢盐处理过的DNA中，将包含MLH1启动子区域的一部分或全部的DNA通过PCR进行扩增的工序；

(3)将工序(2)中得到的PCR扩增产物供于离子交换色谱，获得检测信号的工序；

(4)判定工序(3)中得到的检测信号的峰是否为表示高甲基化DNA的峰的工序；

(5)在工序(4)中，该峰被判定为表示高甲基化DNA的峰的情况下，将该患者判定为非林奇综合征的患者的工序。

在另一实施方式中，本发明提供一种用于从肿瘤患者中判定非林奇综合征的患者的甲基化DNA的测定方法，包括以下工序：

(1)将由受检组织或细胞制备的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理的工序，

其中，该受检组织或细胞是来自以下罹患肿瘤且判定为下述(i)(ii)情况的患者的组织或细胞，

(i)该肿瘤在MSI检查中被判定为MSI-H、和/或该肿瘤在免疫组织化学检查中被判定为MLH1的表达消失或降低，且，

(ii)通过遗传学检查被判定为在MLH1没有发现变异；

(2)从工序(1)中得到的经亚硫酸氢盐处理过的DNA中，将包含MLH1启动子区域的一部分或全部的DNA通过PCR进行扩增的工序；

(3)将工序(2)中得到的PCR扩增产物供于离子交换色谱，获得检测信号的工序；

(4)判定工序(3)中得到的检测信号的峰是否为表示高甲基化DNA的峰的工序，

在该工序(4)中，该峰被判定为表示高甲基化DNA的峰的情况下，将该患者判定为非林奇综合征的患者。

此外，在另一实施方式中，本发明提供一种获得用于判定肿瘤的数据的方法，包括以下工序：

(1)将由受检组织或细胞制备的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理的工序，

其中，该受检组织或细胞是来自以下罹患肿瘤且判定为下述(i)(ii)情况的患者的组织或细胞，

(i)该肿瘤在MSI检查中被判定为MSI-H、和/或该肿瘤在免疫组织化学检查中被判定为MLH1的表达消失或降低，且，

(ii)通过遗传学检查被判定为在MLH1没有发现变异；

(2)从工序(1)中得到的经亚硫酸氢盐处理过的DNA中，将包含MLH1启动子区域的一部分或全部的DNA通过PCR进行扩增的工序；

(3)将工序(2)中得到的PCR扩增产物供于离子交换色谱，获得检测信号的工序；

(4)获取工序(3)中得到的检测信号的峰是否为表示高甲基化DNA的峰作为用于判定该肿瘤是否为来自非林奇综合征的患者的肿瘤的数据的工序。

作为适用上述本发明的实施方式的受检者，可举出罹患肿瘤的患者，并且想要确认该肿瘤并非林奇综合征所致的肿瘤的患者。更详细而言，受检者是罹患肿瘤且判定为下述(i)(ii)情况的患者，(i)该肿瘤在MSI检查中被判定为MSI-H、和/或该肿瘤在免疫组织化学检查中被判定为MLH1的表达消失或降低，且(ii)通过遗传学检查被判定为在MLH1没有发现变异。作为肿瘤，没有特别限定，例如，可举出口腔、舌、咽喉、食道、胃、十二指肠、小肠、大肠、肝脏、胰脏、胆囊、胆道、肾脏、肾盂、肾上腺、输尿管、乳腺、前列腺、睾丸、卵巢、子宫、肺、脑、皮脂腺、皮肤、血液、淋巴、骨髄等中的肿瘤，优选举出大肠、子宫内膜、胃、卵巢、小肠、胆道、胰脏、肾盂、输尿管、脑或者皮脂腺中的肿瘤。更优选上述肿瘤为大肠肿瘤。

本实施方式中使用的受检组织或细胞是来自上述受检者的包含上述肿瘤的组织或细胞，优选为包含大肠、子宫内膜、胃、卵巢、小肠、胆道、胰脏、肾盂、输尿管、脑或者皮脂腺中的肿瘤的组织或细胞。或者，本实施方式中使用的受检组织或细胞也可以为来自上述受检者的非肿瘤组织或细胞。使用非肿瘤组织或细胞的本实施方式的方法能够判定发生表突变所致的DNA甲基化的患者。

在又一实施方式中，本发明提供一种鉴别来自林奇综合征和来自非林奇综合征的组织或细胞的方法，包括以下工序：

(1)将由受检组织或细胞制备的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理的工序；

(2)从工序(1)中得到的经亚硫酸氢盐处理过的DNA中，将包含MLH1启动子区域的一部分或全部的DNA通过PCR进行扩增的工序；

(3)将工序(2)中得到的PCR扩增产物供于离子交换色谱，获得甲基化DNA的检测信号的工序；

(4)将工序(3)中得到的甲基化DNA的检测信号的峰值与对照组的峰值进行比较，测量变动量的工序。

在又一实施方式中，本发明提供一种组织或细胞的判定方法，包括以下工序：

(1)将由受检组织或细胞制备的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理的工序；

(2)从工序(1)中得到的经亚硫酸氢盐处理过的DNA中，将包含MLH1启动子区域的一部分或全部的DNA通过PCR进行扩增的工序；

(3)将工序(2)中得到的PCR扩增产物供于离子交换色谱，获得检测信号的工序；

(4)判定工序(3)中得到的检测信号的峰是表示低甲基化DNA的峰还是表示高甲基化DNA的峰的工序；

(5)(i)在工序(4)中，该峰被判定为表示高甲基化DNA的峰的情况下，将该组织或细胞判定为从没有罹患林奇综合征相关肿瘤或者患病的可能性低的患者得到的组织或细胞，或者，

(ii)在工序(4)中，该峰被判定为表示低甲基化DNA的峰的情况下，将该组织或细胞判定为从罹患林奇综合征相关肿瘤或者患病的可能性高的患者得到的组织或细胞的工序。

在又一实施方式中，本发明提供一种判定林奇综合征相关肿瘤的患病可能性的方法，包括以下工序；

(1)将由来自受检者的组织或细胞制备的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理的工序；

(2)从工序(1)中得到的经亚硫酸氢盐处理过的DNA中，将包含MLH1启动子区域的一部分或全部的DNA通过PCR进行扩增的工序；

(3)将工序(2)中得到的PCR扩增产物供于离子交换色谱，获得检测信号的工序；

(4)判定工序(3)中得到的检测信号的峰是表示低甲基化DNA的峰还是表示高甲基化DNA的峰的工序；

(5)(i)在工序(4)中，该峰被判定为表示高甲基化DNA的峰的情况下，将该受检者判定为没有罹患林奇综合征相关肿瘤或者患病的可能性低的人，或者，

(ii)在工序(4)中，该峰被判定为表示低甲基化DNA的峰的情况下，将该受检者判定为罹患林奇综合征相关肿瘤或者患病的可能性高的人的工序。

在又一实施方式中，本发明提供一种用于判定林奇综合征相关肿瘤的患病可能性的甲基化DNA的测定方法，包括以下工序：

(1)将由来自受检者的组织或细胞制备的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理的工序；

(2)从工序(1)中得到的经亚硫酸氢盐处理过的DNA中，将包含MLH1启动子区域的一部分或全部的DNA通过PCR进行扩增的工序；

(3)将工序(2)中得到的PCR扩增产物供于离子交换色谱，获得检测信号的工序；

(4)判定工序(3)中得到的检测信号的峰是表示低甲基化DNA的峰还是表示高甲基化DNA的峰的工序，

在该工序(4)中，该峰被判定为表示高甲基化DNA的峰的情况下，将该受检者判定为没有罹患林奇综合征相关肿瘤或者患病的可能性低的人，在该工序(4)中，该峰被判定为表示低甲基化DNA的峰的情况下，将该受检者判定为罹患林奇综合征相关肿瘤或者患病的可能性高的人。

在又一实施方式中，本发明提供获得用于判定林奇综合征相关肿瘤的患病可能性的数据的方法，包括以下工序：

(1)将由来自受检者的组织或细胞制备的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理的工序；

(2)从工序(1)中得到的经亚硫酸氢盐处理过的DNA中，将包含MLH1启动子区域的一部分或全部的DNA通过PCR进行扩增的工序；

(3)将工序(2)中得到的PCR扩增产物供于离子交换色谱，获得检测信号的工序；

(4)获取工序(3)中得到的检测信号的峰是表示低甲基化DNA的峰还是表示高甲基化DNA的峰作为用于判定该受检者是否罹患林奇综合征相关肿瘤、或者是患病的可能性高的人或低的人的数据的工序。

在又一实施方式中，本发明提供一种肿瘤的鉴别方法，包括以下工序：

(1)将由包含肿瘤的受检组织或细胞制备的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理的工序；

(2)从工序(1)中得到的经亚硫酸氢盐处理过的DNA中，将包含MLH1启动子区域的一部分或全部的DNA通过PCR进行扩增的工序；

(3)将工序(2)中得到的PCR扩增产物供于离子交换色谱，获得检测信号的工序；

(4)判定工序(3)中得到的检测信号的峰是表示低甲基化DNA的峰还是表示高甲基化DNA的峰的工序；

(5)(i)在工序(4)中，该峰被判定为表示高甲基化DNA的峰的情况下，将该肿瘤判定为由非林奇综合征的患者得到的肿瘤，或者，

(ii)在工序(4)中，该峰被判定为表示低甲基化DNA的峰的情况下，将该肿瘤判定为由疑似林奇综合征的患者得到的肿瘤的工序。

在又一实施方式中，本发明提供一种肿瘤患者的鉴别方法，包括以下工序：

(1)将由来自受检者的包含肿瘤的组织或细胞制备的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理的工序；

(2)从工序(1)中得到的经亚硫酸氢盐处理过的DNA中，将包含MLH1启动子区域的一部分或全部的DNA通过PCR进行扩增的工序；

(3)将工序(2)中得到的PCR扩增产物供于离子交换色谱，获得检测信号的工序；

(4)判定工序(3)中得到的检测信号的峰是表示低甲基化DNA的峰还是表示高甲基化DNA的峰的工序；

(5)(i)在工序(4)中，该峰被判定为表示高甲基化DNA的峰的情况下，将该受检者判定为并不患有林奇综合征，或者，

(ii)在工序(4)中，该峰被判定为表示低甲基化DNA的峰的情况下，将该受检者判定为疑似患有林奇综合征的工序。

在又一实施方式中，本发明提供一种用于判定肿瘤患者的甲基化DNA的测定方法，包括以下工序：

(1)将由来自受检者的包含肿瘤的组织或细胞制备的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理的工序；

(2)从工序(1)中得到的经亚硫酸氢盐处理过的DNA中，将包含MLH1启动子区域的一部分或全部的DNA通过PCR进行扩增的工序；

(3)将工序(2)中得到的PCR扩增产物供于离子交换色谱，获得检测信号的工序；

(4)判定工序(3)中得到的检测信号的峰是表示低甲基化DNA的峰还是表示高甲基化DNA的峰的工序，

在该工序(4)中，该峰被判定为表示高甲基化DNA的峰的情况下，将该受检者判定为并不患有林奇综合征，在该工序(4)中，该峰被判定为表示低甲基化DNA的峰的情况下，将该受检者判定为疑似患有林奇综合征。

在又一实施方式中，本发明提供一种获得用于鉴别肿瘤的数据的方法，包括以下工序：

(1)将由包含肿瘤的受检组织或细胞制备的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理的工序；

(2)从工序(1)中得到的经亚硫酸氢盐处理过的DNA中，将包含MLH1启动子区域的一部分或全部的DNA通过PCR进行扩增的工序；

(3)将工序(2)中得到的PCR扩增产物供于离子交换色谱，获得检测信号的工序；

(4)获取工序(3)中得到的检测信号的峰是表示低甲基化DNA的峰还是表示高甲基化DNA的峰作为用于鉴别该肿瘤是否为由疑似林奇综合征的患者得到的肿瘤的数据的工序。

作为适用上述本发明的又一实施方式的受检者，可举出疑似林奇综合征相关肿瘤的患者。例如，作为受检者，可举出在大肠、子宫内膜、胃、卵巢、小肠、胆道、胰脏、肾盂、输尿管、脑或者皮脂腺等观察到肿瘤的患者或者实施了该肿瘤的治疗的患者，且需要判定该肿瘤是否为林奇综合征相关肿瘤的人。或者，作为受检者，可举出现在还没有罹患林奇综合征相关肿瘤但需要判定将来罹患林奇综合征相关肿瘤的可能性(患病风险)的人。在优选的实施方式中，作为上述受检者，可举出具有大肠肿瘤的患者，并且需要判定是否为林奇综合征的患者。

本实施方式中使用的受检组织或细胞只要为来自上述受检者的组织或细胞即可，优选为大肠、子宫内膜、胃、卵巢、小肠、胆道、胰脏、肾盂、输尿管、脑或者皮脂腺的组织或细胞。这些肿瘤可以为包含肿瘤的组织或细胞，也可以为非肿瘤组织或细胞。为了判定从受检者观察到的肿瘤是否为林奇综合征相关肿瘤，使用包含肿瘤的组织或细胞。判定林奇综合征相关肿瘤的患病风险的情况下，可以使用包含肿瘤的组织或细胞以及非肿瘤组织或细胞中的任一种。

在上述的任一实施方式中，上述受检组织或细胞例如可以为在活检、外科手术等中采集的组织或细胞、它们的冷冻物或固定标本(福尔马林固定、石蜡包埋、石蜡块等)、或者培养细胞。作为非肿瘤组织或细胞，可以使用血液。本发明的方法以体外(in vitro)或者离体(ex vivo)的方式进行。

作为由上述组织或细胞制备基因组DNA的方法，没有特别限制，可以适当地选择使用公知的方法。作为制备DNA的公知方法，可举出使用酚氯仿法或者使用市售的DNA提取试剂盒的DNA提取方法等，市售的DNA提取试剂盒例如有QIAamp(注册商标)DNA Mini kit(Qiagen公司制)、QIAamp(注册商标)DNA FFPE Tissue Kit(QIAGEN公司制)、QIAamp(注册商标)DNA Blood Maxi Kit(QIAGEN公司制)、Clean Columns(NexTec公司制)、AquaPure(Bio-Rad公司制)、ZR Plant/Seed DNA Kit(Zymo Research公司制)、prepGEM(ZyGEM公司制)、BuccalQuick(TrimGen公司制)。

接下来，将提取的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理。作为DNA的亚硫酸氢盐处理的方法，没有特别限制，可以适当地选择使用公知的方法。作为用于亚硫酸氢盐处理的公知方法，例如，可举出使用EpiTect(注册商标)Bisulfite Kit(48)(Qiagen公司制)、MethylEasy(Human Genetic Signatures Pty公司制)、Cells-to-CpG Bisulfite Conversion Kit(Applied Biosystems公司制)、CpGenome Turbo Bisulfite Modification Kit(MERCKMILLIPORE公司制)等市售试剂盒的方法。

接下来，将经亚硫酸氢盐处理过的基因组DNA供于PCR，将靶DNA进行扩增。作为PCR扩增的方法，没有特别限制，可以根据扩增对象的靶DNA的序列、长度、量等适当地选择使用公知的方法。

在林奇综合征中，几乎没有发现MLH1启动子区域中的DNA甲基化。因此，本发明的方法中被PCR扩增的靶DNA优选以能够检测上述MLH1启动子区域中的DNA甲基化的方式选择，更优选以能够检测上述MLH1启动子区域的CpG岛或CpG位点的甲基化的方式选择。例如，靶DNA为包含MLH1的启动子区域的一部分或全部的DNA。更优选为包含上述MLH1启动子区域的CpG岛的一部分或全部的DNA。

MLH1为由RefSeq ID：NG＿007109.2特定的基因。MLH1启动子区域是由表1所示的序列号1表示的碱基序列构成的DNA。因此，本发明的方法中被PCR扩增的靶DNA优选为由序列号1表示的碱基序列的全长或其部分序列构成的DNA。作为该靶DNA的更优选的例子，可举出包含序列号1表示的碱基序列的第470～568位碱基区域、第1～182位碱基区域、第159～363位碱基区域、第336～568位碱基区域、第470～704位碱基区域或者第684～841位碱基区域的DNA，作为进一步优选的例子，有由序列号1表示的碱基序列的第470～568位碱基区域、第1～182位碱基区域、第159～363位碱基区域、第336～568位碱基区域、第470～704位碱基区域或者第684～841位碱基区域构成的DNA。本发明中，该靶DNA包含其0～100％甲基化的DNA。

[表1]

下划线为CpG位点

PCR扩增的靶DNA的链长可以考虑PCR的扩增时间的缩短以及离子交换色谱中的分析时间的缩短、分离性能的维持等要素而适当地选择。本发明的方法中PCR扩增的靶DNA的链长优选为1000bp以下，更优选为700bp以下，进一步优选为500bp以下，进而优选为300bp以下。另一方面，为了避免PCR中的非特异性杂交，靶DNA的链长优选为30～40bp以上。在更优选的实施方式中，靶DNA的链长为50～500bp，进一步优选为70～300bp。

因此，在优选的实施方式中，本发明的方法中被PCR扩增的靶DNA为由序列号1表示的碱基序列构成的DNA。在另一优选的实施方式中，本发明的方法中被PCR扩增的靶DNA为由序列号1表示的碱基序列的部分序列构成且碱基长度为50～500bp、优选为70～300bp的DNA。在另一优选的实施方式中，本发明的方法中被PCR扩增的靶DNA是由序列号1表示的碱基序列构成的DNA中的、被由序列号6和7、序列号18和19、序列号20和22、序列号25和26、序列号29和28或者序列号30和32表示的碱基序列构成的引物组扩增的区域。

或者，怀疑由后天因素导致的MLH1蛋白质缺失的情况下，以能够检测MLH1启动子区域和/或Intron1区域(序列号33)(Cell oncol.，36，411-419，2013)的CpG岛或CpG位点的DNA甲基化的方式来选择靶DNA。例如，靶DNA是包含MLH1的启动子区域和/或Intron1区域的一部分或全部的DNA。更优选为包含上述MLH1启动子区域和/或Intron1区域的CpG岛的一部分或全部的DNA。

在优选的实施方式中，优选靶DNA以相对于其碱基总数的CpG位点的胞嘧啶数为2％以上、更优选为5％以上的方式来决定区域和链长。

接着，将得到的PCR扩增产物作为样品DNA，供于离子交换色谱。本发明中进行的离子交换色谱优选为阴离子交换色谱。作为本发明中进行的离子交换色谱所使用的色谱柱的填充剂，只要为表面具有强阳离子性基团的基材粒子就没有特别限定，优选国际公开公报第2012/108516号所示的在填充剂表面具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团这两者的基材粒子。

本说明书中，上述强阳离子性基团是指在pH为1～14的宽范围内解离的阳离子性基团。即，上述强阳离子性基团不受水溶液的pH影响而能够保持解离的(阳离子化的)状态。

作为上述强阳离子性基团，可举出季铵基团。具体而言，例如，可举出三甲基铵基、三乙基铵基、二甲基乙基铵基等三烷基铵基等。另外，作为上述强阳离子性基团的反离子，例如，可举出氯化物离子、溴化物离子、碘化物离子等卤化物离子。

向上述基材粒子表面导入的上述强阳离子性基团量没有特别限定，相对于填充剂的干燥重量的优选的下限为1μeq/g，优选的上限为500μeq/g。如果上述强阳离子性基团量小于1μeq/g，则有时保持力弱且分离性能变差。如果上述强阳离子性基团量超过500μeq/g，则有时出现保持力变得过强而不容易将样品DNA洗脱，分析时间变得过长等问题。

本说明书中，上述弱阳离子性基团是指pka为8以上的阳离子性基团。即，上述弱阳离子性基团受到水溶液的pH的影响，解离状态发生变化。即，如果pH比8高，则上述弱阳离子性基团的质子解离，不具有正电荷的比例增加。相反，如果pH比8低，则上述弱阳离子性基团质子化，具有正电荷的比例增加。

作为上述弱阳离子性基团，例如，可举出叔氨基、仲氨基、伯氨基等。其中，优选叔氨基。

向上述基材粒子表面导入的上述弱阳离子性基团量没有特别限定，相对于填充剂的干燥重量的优选的下限为0.5μeq/g，优选的上限为500μeq/g。如果上述弱阳离子性基团量小于0.5μeq/g，则过少有时分离性能无法提高。如果上述弱阳离子性基团量超过500μeq/g，则与强阳离子性基团同样地，有时出现保持力变得过强而不容易将样品DNA洗脱，分析时间变得过长等问题。

上述基材粒子表面的强阳离子性基团或弱阳离子性基团量可以通过定量氨基所含的氮原子来进行测定。作为对氮进行定量的方法，例如可举出凯氏定氮法。在本发明(实施例)记载的填充剂的情况下，首先，将聚合后强阳离子性基团所含的氮进行定量，接着，将导入弱阳离子性基团后的强阳离子性基团和弱阳离子性基团所含有的氮进行定量，由此能够算出后导入的弱阳离子性基团量。通过这样进行定量，在制备填充剂时，能够将强阳离子性基团量和弱阳离子性基团量调整到上述范围内。

作为上述基材粒子，例如，可使用利用聚合性单体等得到的合成高分子微粒、二氧化硅系等无机微粒等，但优选为由合成有机高分子构成的疏水性交联聚合物粒子。

上述疏水性交联聚合物可以是将至少1种疏水性交联性单体与至少1种具有反应性官能团的单体进行共聚而得的疏水性交联聚合物、将至少1种疏水性交联性单体与至少1种具有反应性官能团的单体及至少1种疏水性非交联性单体进行共聚而得的疏水性交联聚合物中的任一个。

作为上述疏水性交联性单体，只要为1分子单体中具有2个以上的乙烯基的单体就没有特别限定，例如，可举出乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚丙二醇二(甲基)丙烯酸酯等二(甲基)丙烯酸酯，三羟甲基甲烷三(甲基)丙烯酸酯、四羟甲基甲烷三(甲基)丙烯酸酯等三(甲基)丙烯酸酯或者四(甲基)丙烯酸酯，或者二乙烯基苯、二乙烯基甲苯、二乙烯基二甲苯、二乙烯基萘等芳香族系化合物。应予说明，本说明书中上述(甲基)丙烯酸酯是指丙烯酸酯或者甲基丙烯酸酯，(甲基)丙烯酸是指丙烯酸或者甲基丙烯酸。

作为上述具有反应性官能团的单体，可举出(甲基)丙烯酸缩水甘油酯、异氰酸酯(甲基)丙烯酸乙酯等。

作为上述疏水性非交联性单体，只要为具有疏水性的性质的非交联性的聚合性有机单体就没有特别限定，例如，可举出(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸叔丁酯等(甲基)丙烯酸酯，苯乙烯、甲基苯乙烯等苯乙烯系单体。

上述疏水性交联聚合物为将上述疏水性交联性单体与上述具有反应性官能团的单体进行共聚而得的聚合物时，上述疏水性交联聚合物中的来自上述疏水性交联性单体的链段的含有比例的优选的下限为10重量％，更优选的下限为20重量％。

本发明中使用的离子交换色谱用填充剂优选为在上述基材粒子的表面具有聚合物层的填充剂，该聚合物层具有上述强阳离子性基团和上述弱阳离子性基团。另外，在具有上述强阳离子性基团和上述弱阳离子性基团的聚合物中，优选上述强阳离子性基团和上述弱阳离子性基团分别来自独立的单体。具体而言，本发明中使用的离子交换色谱用填充剂优选为在被覆聚合物粒子的表面导入弱阳离子性基团而成的填充剂，该被覆聚合物粒子由上述疏水性交联聚合物粒子和共聚于上述疏水性交联聚合物粒子表面的具有强阳离子性基团的亲水性聚合物的层构成。

上述具有强阳离子性基团的亲水性聚合物由具有强阳离子性基团的亲水性单体构成，可以含有1种以上的来自具有强阳离子性基团的亲水性单体的链段。即，作为制造上述具有强阳离子性基团的亲水性聚合物的方法，可举出将具有强阳离子性基团的亲水性单体均聚的方法、使2种以上的具有强阳离子性基团的亲水性单体共聚的方法、使具有强阳离子性基团的亲水性单体与不具有强阳离子性基团的亲水性单体共聚的方法等。

作为上述具有强阳离子性基团的亲水性单体，优选具有季铵基团的单体。具体而言，例如，可举出甲基丙烯酸乙酯三乙基氯化铵、甲基丙烯酸乙酯二甲基乙基氯化铵、甲基丙烯酸乙酯二甲基苄基氯化铵、丙烯酸乙酯二甲基苄基氯化铵、丙烯酸乙酯三乙基氯化铵、丙烯酸乙酯二甲基乙基氯化铵、丙烯酰胺乙基三甲基氯化铵、丙烯酰胺乙基三乙基氯化铵、丙烯酰胺乙基二甲基乙基氯化铵等。

作为在上述被覆聚合物粒子的表面导入上述弱阳离子性基团的方法，可使用公知的方法。具体而言，例如作为导入叔氨基作为上述弱阳离子性基团的方法，可举出如下方法：在由具备来自具有缩水甘油基的单体的链段的疏水性交联聚合物构成的疏水性交联聚合物粒子的表面将上述具有强阳离子性基团的亲水性单体进行共聚，接着，使具有叔氨基的试剂与缩水甘油基反应的方法；在由具备来自具有异氰酸酯基的单体的链段的疏水性交联聚合物构成的疏水性交联聚合物粒子的表面将上述具有强阳离子性基团的亲水性单体进行共聚，接着，使具有叔氨基的试剂与异氰酸酯基反应的方法；在上述疏水性交联聚合物粒子的表面使上述具有强阳离子性基团的亲水性单体与具有叔氨基的单体共聚的方法；使用具有叔氨基的硅烷偶联剂，在具备上述具有强阳离子性基团的亲水性聚合物的层的被覆聚合物粒子的表面导入叔氨基的方法；在由具备来自具有羧基的单体的链段的疏水性交联聚合物构成的疏水性交联聚合物粒子的表面将上述具有强阳离子性基团的亲水性单体进行共聚，接着，使用碳二亚胺使羧基与具有叔氨基的试剂缩合的方法；在由具备来自具有酯键的单体的链段的疏水性交联聚合物构成的疏水性交联聚合物粒子的表面将上述具有强阳离子性基团的亲水性单体进行共聚，将酯键部分水解后，接着，使用碳二亚胺使通过水解生成的羧基与具有叔氨基的试剂缩合的方法等。其中，优选如下方法：在由具备来自具有缩水甘油基的单体的链段的疏水性交联聚合物构成的疏水性交联聚合物粒子的表面将上述具有强阳离子性基团的亲水性单体进行共聚，接着，使具有叔氨基的试剂与缩水甘油基反应的方法；在由具备来自具有异氰酸酯基的单体的链段的疏水性交联聚合物构成的疏水性交联聚合物粒子的表面将上述具有强阳离子性基团的亲水性单体进行共聚，接着，使具有叔氨基的试剂与异氰酸酯基反应的方法。

作为与缩水甘油基或异氰酸酯基等反应性官能团反应的上述具有叔氨基的试剂，只要是具有叔氨基和能够与反应性官能团反应的官能团的试剂，就没有特别限定。作为能够与上述反应性官能团反应的官能团，例如，可举出伯氨基、羟基等。其中，优选在末端具有伯氨基的基团。作为具有该官能团的具体试剂，可举出N,N-二甲基氨基甲胺、N,N-二甲基氨基乙胺、N,N-二甲基氨基丙胺、N,N-二甲基氨基丁胺、N,N-二乙基氨基乙胺、N,N-二乙基氨基丙基乙胺、N,N-二乙基氨基丁胺、N,N-二乙基氨基戊胺、N,N-二乙基氨基己胺、N,N-二丙基氨基丁胺、N,N-二丁基氨基丙胺等。

上述强阳离子性基团优选为季铵盐与上述弱阳离子性基团优选为叔氨基的相对位置关系，优选上述强阳离子性基团与上述弱阳离子性基团相比位于距离基材粒子的表面远的位置，即位于外侧。例如，优选上述弱阳离子性基团位于距离基材粒子表面以内，上述强阳离子性基团位于距离基材粒子表面以内且与弱阳离子性基团相比位于外侧。

本发明中使用的离子交换色谱用填充剂所用的上述基材粒子的平均粒径没有特别限定，优选的下限为0.1μm，优选的上限为20μm。如果上述平均粒径小于0.1μm，则有时色谱柱内压力变得过高而引起分离不良。如果上述平均粒径超过20μm，则有时色谱柱内的无效体积变得过大而引起分离不良。应予说明，本说明书中上述平均粒径表示体积平均粒径，可以使用粒度分布测定装置(AccuSizer780/Particle Sizing Systems公司制等)进行测定。

作为本发明中进行的离子交换色谱所用的洗脱液的组成，可以使用公知的条件。

作为上述洗脱液中使用的缓冲液，优选使用公知的含有盐化合物的缓冲液类、有机溶剂类，具体而言，例如，可举出Tris-盐酸缓冲液、由Tris和EDTA构成的TE缓冲液、由Tris、硼酸和EDTA构成的TBA缓冲液等。

上述洗脱液的pH没有特别限定，优选的下限为5，优选的上限为10。认为通过设定在该范围，上述弱阳离子性基团也能有效地作为离子交换基团(阴离子交换基团)发挥作用。上述洗脱液的pH的更优选的下限为6，更优选的上限为9。

作为上述洗脱液所含有的盐，例如，可使用氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾等由卤化物和碱金属构成的盐；氯化钙、溴化钙、氯化镁、溴化镁等由卤化物和碱土金属构成的盐；高氯酸钠、高氯酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、硝酸钠、硝酸钾等无机酸盐等。另外，还可使用乙酸钠、乙酸钾、琥珀酸钠、琥珀酸钾等有机酸盐。上述盐可以单独使用任一个或组合使用。

作为上述洗脱液的盐浓度，可以根据分析条件适当地调整，优选的下限为10mmol/L，优选的上限为2000mmol/L，更优选的下限为100mmol/L，更优选的上限为1500mmol/L。

此外，为了进一步提高分离性能，本发明中使用的离子交换色谱所用的洗脱液中含有反离液离子。反离液离子具有与离液离子相反的性质，具有使水合结构稳定化的作用。因此，具有增强填充剂与核酸分子之间的疏水性相互作用的效果。本发明中使用的离子交换色谱的主要相互作用是静电相互作用，除此之外，也利用疏水性相互作用的效果来提高分离性能。

作为上述洗脱液中含有的反离液离子，可举出磷酸根离子(PO₄ ^3-)、硫酸根离子(SO₄ ^2-)、铵根离子(NH₄ ⁺)、钾离子(K⁺)、钠离子(Na⁺)等。在这些离子的组合中，优选使用硫酸根离子和铵根离子。上述反离液离子可以单独使用任一种或者组合使用。应予说明，上述的反离液离子的一部分含有上述洗脱液所含的盐、缓冲液的成分。使用这样的成分时，由于具备作为洗脱液所含的盐的性质或者缓冲能力及作为反离液离子的性质这两者，所以适于本发明。

本发明中使用的离子交换色谱用洗脱液中的反离液离子在分析时的浓度可以根据分析对象物适当地调整，作为反离液盐，优选为2000mmol/L以下。具体而言，可举出在反离液盐的浓度为0～2000mmol/L的范围进行梯度洗脱的方法。因此，分析开始时的反离液盐的浓度无需为0mmol/L，另外，分析结束时的反离液盐的浓度也无需为2000mmol/L。上述梯度洗脱的方法可以为低压梯度法，也可以为高压梯度法，优选边利用高压梯度法进行精密的浓度调整边洗脱的方法。

上述反离液离子可以仅添加到1种洗脱所使用的洗脱液中，也可以添加到多种洗脱液中。另外上述反离液离子可以具备增强填充剂与样品DNA之间的疏水性相互作用的效果或缓冲能力以及将样品DNA从色谱柱洗脱的效果这两者的作用。

本发明中进行的用离子交换色谱分析样品DNA时的色谱柱温度优选为30℃以上，更优选为40℃以上，进一步优选为45℃以上。如果离子交换色谱的色谱柱温度低于30℃，则填充剂与样品DNA之间的疏水性相互作用变弱，难以得到所希望的分离效果。离子交换色谱的色谱柱温度低于45℃时，甲基化DNA的亚硫酸氢盐处理物的PCR扩增产物(甲基化DNA样品)与非甲基化DNA的亚硫酸氢盐处理物的PCR扩增产物(非甲基化DNA样品)的保留时间之差小。并且，色谱柱温度为60℃以上时，甲基化DNA样品与非甲基化DNA样品之间的保留时间之差进一步扩大，并各个峰也变得更明显，因此能够精度更好地检测DNA的甲基化。

此外，如果离子交换色谱的色谱柱温度变高，则甲基化DNA样品与非甲基化DNA样品被明显地分离，所以基于靶DNA中的甲基化DNA和非甲基化DNA的存在比率，两者的保留时间的峰面积或者峰高度容易产生差异。因此，如果色谱柱温度变高，则更容易基于甲基化DNA样品和非甲基化DNA样品之间的保留时间的峰面积或者高度来测定靶DNA中的甲基化DNA和非甲基化DNA各自的存在量、存在比率。

另一方面，如果离子交换色谱的色谱柱温度为90℃以上，则样品DNA中的核酸分子的双链解离，因而在分析上不优选。并且，如果色谱柱温度为100℃以上，则可能发生洗脱液的沸腾，因而在分析上不优选。因此，本发明中进行的用离子交换色谱分析样品DNA时的色谱柱温度只要为30℃以上且低于90℃即可，优选为40℃以上且低于90℃，更优选为45℃以上且低于90℃，进一步优选为55℃以上且低于90℃，更进一步优选为55℃～85℃，进而优选为60℃～85℃。

对上述离子交换色谱的色谱柱的试样注入量没有特别限定，根据色谱柱的离子交换容量和试样浓度适当地调整即可。流速优选为0.1mL/min～3.0mL/min，更优选为0.5mL/min～1.5mL/min。如果流速变慢，则可期待分离的提高，但如果变得过慢，则分析需要长时间，或者可能因峰的展宽化导致分离性能的降低。相反，如果流速变快，则在分析时间缩短方面有优势，但由于峰被压缩，所以导致分离性能降低。由此，虽然是根据色谱柱的性能适当调整的参数，但优选设定在上述流速的范围内。各样品的保留时间可通过对各样品进行预备实验而预先确定。送液方法可使用线性梯度洗脱法、阶梯式洗脱法等公知的送液方法，作为本发明中的送液方法，优选线性梯度洗脱法。对于梯度(gradient)的大小，可以将洗脱所使用的洗脱液在0％～100％的范围内根据色谱柱的分离性能和分析对象物(此处为样品DNA)的特性进行适当调整。

本发明中，将按照上述步骤进行了亚硫酸氢盐处理的靶DNA的PCR扩增产物(即样品DNA)供于离子交换色谱。

对DNA进行亚硫酸氢盐处理时，该DNA中的非甲基化胞嘧啶被转换成尿嘧啶，但甲基化胞嘧啶仍为胞嘧啶。如果将经亚硫酸氢盐处理过的DNA进行PCR扩增，则来自非甲基化胞嘧啶的尿嘧啶进一步被替换成胸腺嘧啶，因此在甲基化DNA与非甲基化DNA之间，胞嘧啶和胸腺嘧啶的存在比率产生差异。因此，样品DNA具有与原始的靶DNA的甲基化率对应的不同序列。如果将该样品DNA供于离子交换色谱，则根据其碱基序列，得到显示不同信号的色谱图。因此，基于样品DNA的离子交换色谱中得到的检测信号，能够检测靶DNA的甲基化。

例如，通过将来自靶DNA的亚硫酸氢盐处理物的PCR扩增产物(即样品DNA)的检测信号跟来自与靶DNA碱基序列相同但未甲基化的DNA的亚硫酸氢盐处理物的PCR扩增产物(以下，称为阴性对照)的检测信号、或者来自与靶DNA碱基序列相同且甲基化率已知(例如，100％)的DNA的亚硫酸氢盐处理物的PCR扩增产物(以下，称为阳性对照)的检测信号进行比较，能够测定样品DNA中有无甲基化DNA的存在。

或者，将来自样品DNA的检测信号跟来自阴性和阳性对照的检测信号进行比较，能够测定靶DNA中的甲基化DNA的存在量、以及与非甲基化DNA的存在量之比。再者，通过将来自由与靶DNA碱基序列相同且甲基化率已知的多个DNA的亚硫酸氢盐处理物得到的多个PCR扩增产物(以下，称为标准)的检测信号跟来自样品DNA的检测信号进行比较，能够测定靶DNA中的甲基化DNA的甲基化率、存在量、以及与非甲基化DNA的存在量之比。

因此，通过将上述色谱中得到的来自样品DNA的检测信号与来自阴性或阳性对照或者标准的检测信号进行比较，基于两者的检测信号的差异，能够检测靶DNA的甲基化。

作为上述阴性对照、阳性对照和标准的DNA，可以使用化学或者基因工程合成的DNA。另外，阴性对照、阳性对照和标准的制备也可以使用市售品，例如可以使用EpiTect(注册商标)Control DNAand Control DNA Set(Qiagen公司制)。

例如，在上述离子交换色谱中，可以将上述样品DNA和上述阴性对照或阳性对照、或者上述标准分别独立地供于离子交换色谱分析。通过使用多个洗脱液将吸附于色谱柱的试样进行梯度洗脱，从而能够将样品DNA和阴性对照或阳性对照或者标准根据DNA甲基化率以不同保留时间进行洗脱。

来自阴性对照的检测信号可以通过使用与靶DNA碱基序列相同但未甲基化的DNA代替样品DNA并按照上述步骤进行亚硫酸氢盐处理和PCR，将得到的PCR扩增产物供于离子交换色谱而获得。来自阳性对照的检测信号可以通过使用与靶DNA碱基序列相同且甲基化率已知的(例如100％)DNA代替样品DNA并按照上述步骤进行亚硫酸氢盐处理和PCR，将得到的PCR扩增产物供于离子交换色谱而获得。或者，可以通过将上述的合成DNA、市售DNA作为阴性或者阳性对照而供于离子交换色谱，从而得到来自阴性或者阳性对照的检测信号。

例如，如果由样品DNA得到的检测信号的峰的保留时间偏离阴性对照的峰的保留时间，则可判定靶DNA发生甲基化。并且此时，保留时间的偏离越大，可推断甲基化率越大。相反，由样品DNA得到的检测信号的峰的保留时间越偏离100％甲基化阳性对照的峰的保留时间，可推断靶DNA的甲基化率越小。

来自标准的检测信号可以通过使用与靶DNA碱基序列相同且甲基化率已知的多个DNA代替样品DNA并按照上述步骤进行亚硫酸氢盐处理和PCR，将得到的多个PCR扩增产物分别供于离子交换色谱而获得。并且，可以由得到的各个检测信号制作校正曲线。或者，可以通过将上述的合成DNA、市售DNA作为标准而供于离子交换色谱，得到来自标准的检测信号。根据上述校正曲线，能够使DNA甲基化率与保留时间相关联。因此，基于该校正曲线，能够求出DNA甲基化率。

另外例如，通过将由样品DNA得到的检测信号的峰的高度或者峰面积跟由甲基化DNA的甲基化率和混合比已知的DNA的亚硫酸氢盐处理物的PCR扩增产物得到的检测信号的峰的高度或者峰面积进行比较，能够确认靶DNA中的甲基化DNA的存在比率(例如非甲基化DNA的存在比率、以特定比例被甲基化的DNA的存在比率等)。

在一个实施方式中，本发明的方法中的DNA甲基化率的判定可以将通过阳性对照(100％甲基化DNA)和阴性对照(0％甲基化DNA)的峰的保留时间与DNA甲基化率的关联而制成的二点校正曲线作为标准。此时，将阳性对照和阴性对照的保留时间的平均值作为甲基化率50％的DNA的保留时间(标准值)，由样本DNA得到的检测信号的峰的保留时间为标准值以下时，可以将该DNA判定为高甲基化DNA，比标准值长时，可以将该DNA判定为低甲基化DNA。

判定峰时，根据色谱检测信号，并基于JIS K 0127：2013离子色谱通则，求出定量限，优选求出检测限。峰的形状由峰的分离度和色谱图的斜率来判定。作为判定有无色谱的检测信号的峰的方法，可举出使用已有的数据处理软件例如LCsolution(岛津制作所)、GRAMS/AI(Thermo Fisher Scientific公司)、Igor Pro(WaveMetrics公司)等的峰检测。例示使用LCsolution判定有无峰的方法，具体而言，首先指定要检测峰的保留时间的区间。接下来，为了除去噪音等不必要的峰，设定各种参数。例如，可举出使参数“WIDTH”大于不需要的峰的半峰宽，使参数“SLOPE”大于不需要的峰的上升斜率，通过改变参数“DRIFT”的设定从而选择垂直分割或基线分割分离度低的峰等。对于参数值而言，由于根据分析条件、选择的基因标志物的种类、样本的量等而得到不同的色谱图，所以根据色谱图设定适当的值即可。峰的判定优选由包括DNA甲基化率为0％的峰和100％的峰各自的上升和下降的保留时间的范围来判定。由样本DNA检测多个峰时，可以采用与阳性对照的峰最接近的峰的保留时间作为样本DNA的保留时间，也可以采用各峰的保留时间的平均值作为样本DNA整体的保留时间。

保留时间即峰顶的时间可以用上述的数据处理软件自动算出。例如，可以将色谱图进行一阶微分，获得微分系数从正数变化为负数的时间作为峰顶的时间。

基于上述色谱的检测信号的保留时间，可以筛查受检者是否为林奇综合征。例如，样本DNA的色谱结果是如图1的T样本所示的在早的保留时间得到具有峰的检测信号的情况下，靶DNA的甲基化率高。这表示靶DNA来自包含因甲基化而沉默的肿瘤的组织或细胞。另一方面，样本DNA的色谱结果是如图2的T样本所示的在迟的保留时间得到具有峰的检测信号的情况下，靶DNA的甲基化率低。这表示靶DNA来自包含没有因甲基化而沉默的肿瘤的组织或细胞。

根据本发明，基于通过上述步骤得到的来自从包含肿瘤的受检组织或细胞提取的样本DNA的色谱检测信号的峰，能够判定该肿瘤是否为林奇综合征相关肿瘤。例如，上述检测信号的峰为表示高甲基化DNA的峰的情况下，将上述肿瘤判定为并非林奇综合征相关肿瘤。另一方面，上述检测信号的峰不是表示高甲基化DNA的峰的情况下(例如为表示低甲基化DNA的峰的情况下)，将上述肿瘤判定为疑似林奇综合征相关肿瘤。或者，上述检测信号的峰为表示高甲基化DNA的峰的情况下，将具有上述肿瘤的受检者判定为并非林奇综合征。另一方面，上述检测信号的峰不是表示高甲基化DNA的峰的情况下(例如为表示低甲基化DNA的峰的情况下)，将具有上述肿瘤的受检者判定为疑似林奇综合征。

或者，基于通过上述步骤得到的从受检者的非肿瘤组织或细胞提取的样本DNA的色谱中得到的检测信号的峰，可以判定该受检者的林奇综合征相关肿瘤的患病风险。例如，上述检测信号的峰为表示高甲基化DNA的峰的情况下，判定上述受检者的林奇综合征相关肿瘤患病风险低。另一方面，上述检测信号的峰不是表示高甲基化DNA的峰的情况下(例如为表示低甲基化DNA的峰的情况下)，判定上述受检者的林奇综合征相关肿瘤患病风险高。

因此，在本发明中，色谱检测信号的峰为表示高甲基化DNA的峰的样本DNA作为不是来自罹患林奇综合征相关肿瘤或其患病风险高的受检者的DNA或者不是来自该受检者的组织或细胞的DNA的候选而被选择。另一方面，色谱检测信号的峰不是表示高甲基化DNA的峰的样本DNA作为来自罹患林奇综合征或其患病风险高的受检者的DNA或者来自该受检者的组织或细胞的DNA的候选而被选择。

本发明中的肿瘤或受检者是否为林奇综合征的判定以及林奇综合征相关肿瘤的患病风险的判定中，除了上述DNA甲基化测定以外，还可以对从上述受检者采集的肿瘤实施MSI检查。根据该MSI检查的结果，如果肿瘤为微卫星不稳定性阳性(MSI-H)，则上述受检者为林奇综合征患者的可能性进一步提高。因此，通过组合上述DNA甲基化测定和MSI检查，能够更精确地判定受检者是否为林奇综合征，或者受检者的林奇综合征相关肿瘤的患病风险。

在MSI检查中，将分别从受检者的肿瘤组织或细胞以及非肿瘤组织或细胞采集的基因组DNA供于MSI检查。在MSI检查中，在肿瘤组织或细胞与非肿瘤组织或细胞之间，比较被微卫星标志物检测的微卫星重复次数。只要被任一个标志物检测到在肿瘤与非肿瘤之间不同的重复次数则判断该肿瘤为MSI，针对2种以上的标志物如果为MSI，则判断该肿瘤为MSI-H。MSI检查的结果是该肿瘤为MSI-H且上述色谱中得到的检测信号的峰为表示低甲基化DNA的峰的情况下，将上述受检者判定为林奇综合征患者，或者将该受检者的组织或细胞判定为由林奇综合征患者得到的组织或细胞。或者，将上述受检者判定为林奇综合征相关肿瘤的患病风险高。上述MSI检查中使用的微卫星标志物只要为临床MSI检查中通常使用的微卫星标志物就没有特别限定，优选为BAT25、BAT26、D2S123、D5S346和D17S250。

供于上述MSI检查的肿瘤组织或细胞的基因组DNA可以是为了上述亚硫酸氢盐处理而制备的基因组DNA，也可以是由相同的受检者重新制备的基因组DNA。重新制备时使用的受检者的组织或细胞只要为包含肿瘤的组织即可，可以是与上述亚硫酸氢盐处理用基因组DNA的制备中使用的组织或细胞同种的组织或细胞，也可以是不同种类的组织或细胞。另外上述MSI检查可以在上述DNA甲基化测定之前实施，也可以在之后实施。

或者，可以进行肿瘤的免疫组织化学检查代替上述MSI检查，或者可以在上述MSI检查的基础上进行肿瘤的免疫组织化学检查。在肿瘤组织或细胞的免疫组织化学检查中被判定为MLH1的表达消失或降低的情况下，将上述受检者判定为林奇综合征患者，或者将该受检者的组织或细胞判定为由林奇综合征患者得到的组织或细胞。或者，将上述受检者判定为林奇综合征相关肿瘤的患病风险高。供于上述免疫组织化学检查的肿瘤组织或细胞可以是与上述亚硫酸氢盐处理用基因组DNA的制备中使用的组织或细胞相同的组织或细胞，也可以是由相同的受检者重新制备的组织或细胞。

再者，可以基于阿姆斯特丹标准II或者贝塞斯达指南修订版实施林奇综合征的筛查来代替上述MSI检查和/或免疫组织化学检查。在这些筛查结果显示林奇综合征的可疑性且上述色谱中得到的检测信号的峰为表示低甲基化DNA的峰的情况下，将上述受检者判定为林奇综合征患者，或者将该受检者的组织或细胞判定为由林奇综合征患者得到的组织或细胞。或者，将上述受检者判定为林奇综合征相关肿瘤的患病风险高。

通过上述色谱与MSI检查和/或免疫组织化学检查的组合判定而被判定为林奇综合征患者的受检者可以进一步经过遗传学检查进行确诊。如遗传性大肠癌诊疗指南所示，林奇综合征的确诊可以通过错配修复基因的遗传学检查(生殖细胞系的基因分析)鉴定致病性变异来诊断(大肠癌研究会“遗传性大肠癌诊疗指南2012年版”金原出版，2012)。错配修复基因的遗传学检查中使用的生物样本只要是包含该基因的组织就没有限定，但从侵袭性低的观点考虑，一般使用通过采血得到的淋巴细胞。该基因的分析方法一般采用直接测序法。在没有观察到变异的情况下，有可能基因的一部分大幅缺损或重复、或者重排，所以可以进一步采用MLPA(Multiplex ligation-dependent probe amplification：多重连接探针扩增)法、Southern印迹等分析该基因。

在本发明的方法的受检者为罹患肿瘤的患者，并且(i)该肿瘤在MSI检查中被判定为MSI-H、和/或该肿瘤在免疫组织化学检查中被判定为MLH1的表达消失或降低，且(ii)通过遗传学检查被判定为在MLH1没有发现变异的情况下，本发明的方法可用于确认该受检者不是林奇综合征。即，在上述色谱中得到的来自样本DNA的检测信号的峰为表示高甲基化DNA的峰的情况下，将上述肿瘤判定为并非林奇综合征相关肿瘤，或者，将具有上述肿瘤的受检者判定为并非林奇综合征。或者，将该色谱检测信号的峰为表示高甲基化DNA的峰的样本DNA作为并非来自林奇综合征患者的DNA而进行选择。该方法对用于否定在现有的遗传学检查中没有发现MLH1异常的患者罹患林奇综合征的可能性的鉴别诊断有用。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行详细说明，但本发明不限于以下的实施例。

〔患者和组织样本〕

将癌研有明医院(日本东京都江东区)保有的从4名患者得到的大肠癌手术标本(Tumor：以下，设为T样本或者T)和末梢血(Normal：以下，设为N样本或者N)分别进行分析。应予说明，T样本为石蜡块。各患者分别被分类成下述的1组～4组。各组通过利用焦磷酸测序的DNA甲基化分析，弄清楚了1组和4组为甲基化阳性组，2组和3组为甲基化阴性组。

1组：患者ID：S-1

组成性表突变病例的大肠癌患者。

确认了该患者的生殖细胞系的MLH1为高甲基化。该患者的T样本中，确认了一个等位基因具有高甲基化，并且另一个等位基因具有高甲基化或者LOH(Loss ofHeterozygosity：杂合性缺失)所致的缺损。该患者的N样本中，确认了仅一个等位基因具有高甲基化。

2组：患者ID：S-2

林奇综合征患者。

该患者的微卫星不稳定性检查为阳性(MSI-H)，几乎没有MLH1的甲基化，确认了MLH1的变异。

3组：患者ID：S-3

通常病例的大肠癌患者。

确认了该患者的微卫星不稳定性检查为阴性(MSS)，几乎没有MLH1甲基化。

4组：患者ID：S-4

大肠癌患者。

该患者的微卫星不稳定性检查为阳性(MSI-H)，通过免疫组织化学确认了MLH1蛋白的表达消失，并且通过焦磷酸测序仪确认了MLH1启动子区域的高甲基化。

〔实施例1〕利用离子交换色谱检测甲基化DNA

(1)阴离子交换色谱柱的制备

向带有搅拌机的反应器中的3重量％聚乙烯醇(日本合成化学公司制)水溶液2000mL中，添加四乙二醇二甲基丙烯酸酯(新中村化学工业公司制)200g、三乙二醇二甲基丙烯酸酯(新中村化学工业公司制)100g、甲基丙烯酸缩水甘油酯(和光纯药工业公司制)100g以及过氧化苯甲酰(KISHIDA化学公司制)1.0g的混合物。边搅拌边加热，在氮气氛下以80℃聚合1小时。接下来，将作为具有强阳离子性基团的亲水性单体的、甲基丙烯酸乙酯三甲基氯化铵(和光纯药工业公司制)100g溶解于离子交换水。将其添加至相同的反应器，同样地边搅拌边在氮气氛下以80℃聚合2小时。通过用水和丙酮清洗得到的聚合组合物，从而得到表面具备具有季铵基的亲水性聚合物的层的被覆聚合物粒子。使用粒度分布测定装置(AccuSizer780/Particle Sizing Systems公司制)对得到的被覆聚合物粒子进行测定，结果平均粒径为10μm。

使得到的被覆聚合物粒子10g分散在离子交换水100mL中，准备反应前浆料。接着，边搅拌该浆料，边添加N,N-二甲基氨基丙胺(和光纯药工业公司制)10mL，在70℃反应4小时。反应结束后，使用离心分离机(日立制作所公司制，“Himac CR20G”)除去上清液，用离子交换水清洗。清洗后，使用离心分离机除去上清液。进一步重复4次该利用离子交换水的清洗，得到在基材粒子的表面具有季铵基和叔氨基的离子交换色谱用填充剂。

将上述离子交换色谱用填充剂填充于液相色谱系统的不锈钢制色谱柱(色谱柱尺寸：内径4.6mm×长度20mm)。

(2)基因组DNA的提取和亚硫酸氢盐处理

使用QIAamp DNAFFPE Tissue Kit(QIAGEN公司制)处理各患者的T样本，提取高分子量DNA。使用QIAamp DNA Blood Maxi Kit(QIAGEN公司制)处理各患者的N样本，提取高分子量DNA。使用EpiTect Bisulfite Kits(QIAGEN公司制)对各DNA500ng进行亚硫酸氢盐处理。

(3)PCR

将上述(2)中得到的亚硫酸氢盐处理基因组DNA进行PCR扩增。扩增区域设为MLH1启动子的表2记载的被PCR引物夹着的99bp区域(区域DfCr)。PCR用含有模板DNA 10ng、GeneAmp 1×PCR缓冲液(Life Technologies公司制)、200μmol/L的GeneAmp dNTP Mix(Life Technologies公司制)、0.75U AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Life Technologies公司制)、0.25μmol/L的正义和反义引物的25μL的反应液进行。应予说明，由于模板DNA中的引物结合区域包含CpG位点，所以上述引物是将非甲基DNA对应引物与甲基DNA对应引物以成为摩尔比50:50的方式进行混合使用。在PCR中，在95℃进行5分钟初始热变性后，将94℃30秒→57℃30秒→72℃40秒作为1个循环，持续45个循环，进一步在72℃进行10分钟的延伸反应。在PCR结束后，在反应液5μL中混合上样染料溶液(loading dye solution)1μL后，在添加了溴化乙锭的3％琼脂糖凝胶中上样而进行电泳，确认了得到目标PCR扩增产物。作为阳性对照(100％甲基化DNA)和阴性对照(0％甲基化DNA)，使用市售的Control DNA(EPITECT(注册商标)PCR control DNA，QIAGEN)。将0％和100％甲基化DNA的PCR扩增产物的序列及各PCR引物的序列示于表2。

[表2]

下划线为引物结合部位

粗斜体字为CpG位点

(4)HPLC分析

使用(1)中准备的阴离子交换色谱柱，按照以下的条件进行离子交换色谱，将(3)中得到的各PCR扩增产物进行分离检测。

系统：LC-20A系列(岛津制作所公司制)

洗脱液：洗脱液A 25mmol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)

洗脱液B 25mmol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)

+1mol/L硫酸铵

分析时间：15分钟

洗脱法：按照以下的梯度条件使洗脱液B的混合比率线性增加。

0分钟(洗脱液B40％)→10分钟(洗脱液B100％)

样本：(2)中得到的PCR扩增产物

流速：1.0mL/min

检测波长：260nm

试样注入量：5μL

色谱柱温度：70℃

DNA甲基化率的判定是使阳性对照(100％甲基化DNA)和阴性对照(0％甲基化DNA)的峰的保留时间与DNA甲基化率相关联，制作二点校正曲线而进行的。将阳性对照与阴性对照的保留时间的平均值算作甲基化率50％的DNA的保留时间(标准值)。样本DNA的检测信号的峰的保留时间为标准值以下时，将该DNA判定为“高甲基化DNA”，比标准值长时，将该DNA判定为“低甲基化DNA”。

(5)基于色谱图判定包含大肠癌的组织

将由患者ID：S-1得到的HPLC色谱图示于图1，将由患者ID：S-2得到的HPLC色谱图示于图2，将由患者ID：S-3得到的HPLC色谱图示于图3，将由患者ID：S-4得到的HPLC色谱图示于图4。

由于患者ID：S-1的T样本是一个等位基因被高甲基化且另一个等位基因也高甲基化或者LOH所致的缺损的样本，所以认为检测到高甲基化率的峰。另外，由于N样本中仅一个等位基因被甲基化，所以认为检测到表示高甲基化DNA的峰和表示非甲基化DNA的峰这两者。在HPLC分析结果中，对于T样本而言，在与阳性对照(100％甲基化DNA)几乎相同的洗脱时间(4.08分钟附近)检测到峰。对于N样本而言，在比阳性对照稍迟的洗脱时间(4.13分钟附近)和与阴性对照(0％甲基化DNA)的峰几乎相同的洗脱时间(4.25分钟附近)分别检测到峰，实质上得到二个峰的色谱图。根据本结果，利用HPLC，能够确认T样本的该DNA区域几乎100％被甲基化，N样本的该DNA区域为非甲基/高甲基的杂合。即，根据T样本的HPLC色谱图，能够判定患者ID：S-1不是林奇综合征患者。另外，根据N样本的HPLC色谱图，能够判定至少MLH1区域的DNA被半甲基化，可以判定为疑似组成性表突变病例的患者。

由于患者ID：S-2的T样本是MSI检查为MSI-H且几乎没有MLH1的甲基化的样本，所以认为检测到低甲基化DNA的峰。另外，由于N样本也几乎没有MLH1的甲基化，所以认为检测到表示低甲基化DNA的峰。在HPLC分析结果中，T样本和N样本这两者都是在与阴性对照(0％甲基化DNA)的峰几乎相同的洗脱时间(4.28分钟附近)分别检测到峰。根据本结果，利用HPLC，能够确认T样本和N样本这两者在该DNA区域为低甲基化。即，根据T样本的HPLC色谱图，能够判定患者ID：S-2可能为林奇综合征患者。

由于患者ID：S-3的T样本是MSI检查为MSS且几乎没有MLH1的甲基化的样本，所以认为检测到低甲基化率的峰。另外，由于N样本也几乎没有MLH1的甲基化，所以认为检测到表示低甲基化DNA的峰。在HPLC分析结果中，T样本和N样本这两者都是在与阴性对照(0％甲基化DNA)的峰几乎相同的洗脱时间(4.25分钟附近)分别检测到峰。根据本结果，利用HPLC，能够确认T样本和N样本这两者在该DNA区域为低甲基化。即，根据T样本的HPLC色谱图，判定患者ID：S-3可能为林奇综合征患者。但是，通过组合T样本的HPLC色谱图和MSI检查，能够判定患者ID：S-3不是林奇综合征患者。

由于患者ID：S-4的T样本是MSI检查为MSI-H且通过免疫组织化学确认了MLH1蛋白的表达消失、通过焦磷酸测序仪确认了MLH1启动子区域的高甲基化的样本，所以认为检测到高甲基化率的峰。另外，由于N样本几乎没有MLH1的甲基化，所以认为检测到表示低甲基化DNA的峰。在HPLC分析结果中，对于T样本而言，在与阳性对照(100％甲基化DNA)几乎相同的的洗脱时间(4.10分钟附近)检测到峰。对于N样本而言，在与阴性对照(0％甲基化DNA)的峰几乎相同的洗脱时间(4.25分钟附近)检测到峰。根据本结果，利用HPLC，能够确认T样本的该DNA区域几乎100％被甲基化，N样本在该DNA区域为低甲基化。即，根据T样本的HPLC色谱图，能够判定患者ID：S-4不是林奇综合征患者。

〔实施例2〕

针对林奇综合征患者、即患者ID：S-2样本，使用与实施例1不同的引物，研究通过HPLC色谱图能否判定MLH1基因启动子的不同区域的甲基化。色谱柱使用实施例1(1)的色谱柱。按照实施例1(2)～(4)的步骤，将DNA供于亚硫酸氢盐处理、PCR和HPLC。在PCR中，将作为MLH1基因启动子区域的一部分的5个区域(区域A～E)进行扩增。并且，对于上述PCR扩增区域的甲基化率为0％(阴性对照)和100％(阳性对照)的DNA，也分别按照同样的步骤进行HPLC分析。将0％和100％甲基化DNA的各PCR扩增产物的序列示于表3和表4，将各PCR引物的序列示于表5。由于区域B～E在模板DNA中的引物结合区域包含CpG位点，所以将非甲基DNA对应引物和甲基DNA对应引物以成为摩尔比50:50的方式混合使用。

[表3]

下划线为引物结合部位

粗斜体字为CpG位点

[表4]

下划线为引物结合部位

粗斜体字为CpG位点

[表5]

将针对区域A的HPLC色谱图示于图5，将针对区域B的HPLC色谱图示于图6，将针对区域C的HPLC色谱图示于图7，将针对区域D的HPLC色谱图示于图8，将针对区域E的HPLC色谱图示于图9。如图5～9所示，在区域A～E的任一区域中，均由T样本得到表示低甲基化DNA的峰。即，对序列号1表示的MLH1启动子区域中的区域A、B、C、D、E中的任一区域的DNA甲基化进行分析时，都能够判定患者ID：S-2可能为林奇综合征。因此，表明了对于患者的T样本，通过用HPLC色谱图判定MLH1启动子区域的1个以上的CpG位点的甲基化状态，能够判定具有林奇综合征的可能性的患者。

在本实施例中，示出了通过利用色谱分析测定MLH1启动子区域的甲基化，能够高精度地辨别林奇综合征和非林奇综合征的患者。相对于利用焦磷酸测序法的现有的甲基化分析需要花费数日左右而言，本发明的方法用大约10分钟就能得到色谱图，因此能够迅速且容易地进行林奇综合征的筛查。针对在现有的MSI检查等中疑似林奇综合征但在遗传学检查中没有发现MLH1异常的患者，本发明的方法对用于否定林奇综合征的可能性的鉴别诊断有用。

序列表

<110> 公益财团法人癌研究会

积水医疗株式会社

<120> 肿瘤的判定方法

<130> DC0102

<150> JP 2015-199819

<151> 2015-10-07

<160> 33

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 855

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

ctcttcagga gtgaaggagg ccacgggcaa gtcgccctga cgcagacgct ccaccagggc 60

cgcgcgctcg ccgtccgcca cataccgctc gtagtattcg tgctcagcct cgtagtggcg 120

cctgacgtcg cgttcgcggg tagctacgat gaggcggcga cagaccaggc acagggcccc 180

atcgccctcc ggaggctcca ccaccaaata acgctgggtc cactcgggcc ggaaaactag 240

agcctcgtcg acttccatct tgcttctttt gggcgtcatc cacattctgc gggaggccac 300

aagagcaggg ccaacgttag aaaggccgca aggggagagg aggagcctga gaagcgccaa 360

gcacctcctc cgctctgcgc cagatcacct cagcagaggc acacaagccc ggttccggca 420

tctctgctcc tattggctgg atatttcgta ttccccgagc tcctaaaaac gaaccaatag 480

gaagagcgga cagcgatctc taacgcgcaa gcgcatatcc ttctaggtag cgggcagtag 540

ccgcttcagg gagggacgaa gagacccagc aacccacaga gttgagaaat ttgactggca 600

ttcaagctgt ccaatcaata gctgccgctg aagggtgggg ctggatggcg taagctacag 660

ctgaaggaag aacgtgagca cgaggcactg aggtgattgg ctgaaggcac ttccgttgag 720

catctagacg tttccttggc tcttctggcg ccaaaatgtc gttcgtggca ggggttattc 780

ggcggctgga cgagacagtg gtgaaccgca tcgcggcggg ggaagttatc cagcggccag 840

ctaatgctat caaag 855

<210> 2

<211> 99

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

tgaaccaata ggaagagtgg acagtgatct ctaatgtgca agtgcatatc cttctaggta 60

gtgggcagta gctgcttcag ggagggatga agagaccca 99

<210> 3

<211> 99

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

cgaaccaata ggaagagcgg acagcgatct ctaacgcgca agcgcatatc cttctaggta 60

gcgggcagta gccgcttcag ggagggacga agagaccca 99

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成引物序列

<400> 4

cgaattaata ggaagagcgg atag 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成引物序列

<400> 5

taaatctctt cgtccctccc 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成引物序列

<400> 6

tgaattaata ggaagagtgg atag 24

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成引物序列

<400> 7

taaatctctt catccctccc 20

<210> 8

<211> 182

<212> DNA

<213> 智人

<400> 8

ctcttcagga gtgaaggagg ccatgggcaa gttgccctga tgcagatgct ccaccagggc 60

tgtgtgcttg ctgtctgcca catactgctt gtagtatttg tgctcagcct tgtagtggtg 120

cctgatgttg tgtttgtggg tagctatgat gaggtggtga cagaccaggc acagggcccc 180

at 182

<210> 9

<211> 182

<212> DNA

<213> 智人

<400> 9

ctcttcagga gtgaaggagg ccacgggcaa gtcgccctga cgcagacgct ccaccagggc 60

cgcgcgctcg ccgtccgcca cataccgctc gtagtattcg tgctcagcct cgtagtggcg 120

cctgacgtcg cgttcgcggg tagctacgat gaggcggcga cagaccaggc acagggcccc 180

at 182

<210> 10

<211> 205

<212> DNA

<213> 智人

<400> 10

gacagaccag gcacagggcc ccattgccct ctggaggctc caccaccaaa taatgctggg 60

tccacttggg ctggaaaact agagccttgt tgacttccat cttgcttctt ttgggtgtca 120

tccacattct gtgggaggcc acaagagcag ggccaatgtt agaaaggctg caaggggaga 180

ggaggagcct gagaagtgcc aagca 205

<210> 11

<211> 205

<212> DNA

<213> 智人

<400> 11

gacagaccag gcacagggcc ccatcgccct ccggaggctc caccaccaaa taacgctggg 60

tccactcggg ccggaaaact agagcctcgt cgacttccat cttgcttctt ttgggcgtca 120

tccacattct gcgggaggcc acaagagcag ggccaacgtt agaaaggccg caaggggaga 180

ggaggagcct gagaagcgcc aagca 205

<210> 12

<211> 233

<212> DNA

<213> 智人

<400> 12

agaggaggag cctgagaagt gccaagcacc tcctctgctc tgtgccagat cacctcagca 60

gaggcacaca agcctggttc tggcatctct gctcctattg gctggatatt ttgtattccc 120

tgagctccta aaaatgaacc aataggaaga gtggacagtg atctctaatg tgcaagtgca 180

tatccttcta ggtagtgggc agtagctgct tcagggaggg atgaagagac cca 233

<210> 13

<211> 233

<212> DNA

<213> 智人

<400> 13

agaggaggag cctgagaagc gccaagcacc tcctccgctc tgcgccagat cacctcagca 60

gaggcacaca agcccggttc cggcatctct gctcctattg gctggatatt tcgtattccc 120

cgagctccta aaaacgaacc aataggaaga gcggacagcg atctctaacg cgcaagcgca 180

tatccttcta ggtagcgggc agtagccgct tcagggaggg acgaagagac cca 233

<210> 14

<211> 235

<212> DNA

<213> 智人

<400> 14

tgaaccaata ggaagagtgg acagtgatct ctaatgtgca agtgcatatc cttctaggta 60

gtgggcagta gctgcttcag ggagggatga agagacccag caacccacag agttgagaaa 120

tttgactggc attcaagctg tccaatcaat agctgctgct gaagggtggg gctggatggt 180

gtaagctaca gctgaaggaa gaatgtgagc atgaggcact gaggtgattg gctga 235

<210> 15

<211> 235

<212> DNA

<213> 智人

<400> 15

cgaaccaata ggaagagcgg acagcgatct ctaacgcgca agcgcatatc cttctaggta 60

gcgggcagta gccgcttcag ggagggacga agagacccag caacccacag agttgagaaa 120

tttgactggc attcaagctg tccaatcaat agctgccgct gaagggtggg gctggatggc 180

gtaagctaca gctgaaggaa gaacgtgagc acgaggcact gaggtgattg gctga 235

<210> 16

<211> 158

<212> DNA

<213> 智人

<400> 16

ggcactgagg tgattggctg aaggcacttc tgttgagcat ctagatgttt ccttggctct 60

tctggtgcca aaatgttgtt tgtggcaggg gttatttggt ggctggatga gacagtggtg 120

aactgcattg tggtggggga agttatccag tggccagc 158

<210> 17

<211> 158

<212> DNA

<213> 智人

<400> 17

ggcactgagg tgattggctg aaggcacttc cgttgagcat ctagacgttt ccttggctct 60

tctggcgcca aaatgtcgtt cgtggcaggg gttattcggc ggctggacga gacagtggtg 120

aaccgcatcg cggcggggga agttatccag cggccagc 158

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成引物序列

<400> 18

ttttttagga gtgaaggagg 20

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成引物序列

<400> 19

ataaaaccct atacctaatc tatc 24

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成引物序列

<400> 20

gatagattag gtatagggtt ttat 24

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成引物序列

<400> 21

tacttaacgc ttctcaaact cct 23

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成引物序列

<400> 22

tacttaacac ttctcaaact cct 23

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成引物序列

<400> 23

agaggaggag tttgagaagc gtt 23

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成引物序列

<400> 24

taaatctctt cgtccctccc 20

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成引物序列

<400> 25

agaggaggag tttgagaagt gtt 23

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成引物序列

<400> 26

taaatctctt catccctccc 20

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成引物序列

<400> 27

cgaattaata ggaagagcgg atag 24

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成引物序列

<400> 28

tcaaccaatc acctcaatac c 21

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成引物序列

<400> 29

tgaattaata ggaagagtgg atag 24

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成引物序列

<400> 30

ggtattgagg tgattggttg a 21

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成引物序列

<400> 31

actaaccgct aaataacttc ccc 23

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 合成引物序列

<400> 32

actaaccact aaataacttc ccc 23

<210> 33

<211> 2955

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<223> MLH1 Intron 1

<400> 33

gtacggaggg agtcgagccg ggctcactta agggctacga cttaacgggc cgcgtcactc 60

aatggcgcgg acacgcctct ttgcccgggc agaggcatgt acagcgcatg cccacaacgg 120

cggaggccgc cgggttccct gacgtgccag tcaggccttc tccttttccg cagaccgtgt 180

gtttctttac cgctctcccc cgagaccttt taagggttgt ttggagtgta agtggaggaa 240

tatacgtagt gttgtcttaa tggtaccgtt aactaagtaa ggaagccact taatttaaaa 300

ttatgtatgc agaacatgcg aagttaaaag atgtataaaa gcttaagatg gggagaaaaa 360

ccttttttca gagggtactg tgttactgtt ttcttgcttt tcattcattc cagaaatcat 420

ctgttcacat ccaaaggcac aattcatttt gagtttcttt caaaacaaat cgtttgtagt 480

tttaggacag gctgatgcac tttgggcttg acttctgatt accctattgt taaattagtg 540

acccctctta gtgttttcct gtcctttatt tcggaggacg cacttcgaag ataccagatt 600

ttatgggtca tccttggatt ttgaagctta taactgtgac aaaaaatgtg aagggaagag 660

atttgaaaca tgtggaagga aaagtgagtg cagactataa acttccaaaa agacaagccc 720

aaaatacacc taaacgttat gtcagattat tttgttaaaa tcagttgtta gtgacgtccg 780

tacgttaata gaaaaaagaa tgcttcagtt tggagtggta ggtttctaga gggatttatt 840

gtgaaagtat aaactattca gggcaatggg actgagagaa cagtgggtag aaaggaccac 900

tgaaggaaag gaagagaatt ggaaggtaga tgaaagaagg agcaagaacc tggggatgtt 960

ttttcctttt cacttgtaat agtagtaaca gaagcaatgg cagactggct tttgtttcta 1020

ctgtgttaga atgaattgac aggacaactg ggcctattat tgtactgtgc cagaatactg 1080

taaaacaaaa ctaaacatac tagcttggtg gcttgtaatt aattacttaa gtggagattt 1140

ttattttttt tttatttttt ttttagacgg agtctcactt tgtcacccag gctggagtgc 1200

agtggcgcga tctcagctga ctgcaacctc ctcctcacag gttcaaggga gattctcctg 1260

cctcagcctc ccgagtagct aggactatag gcatgtgcca ccacacctgg ctaattttgt 1320

atttttagta gagatgggat ttctccatgt tggtcaggct ggtgtcaaaa ctctcgatct 1380

caggtgaacc gcctgcctca gccttccaaa gtgctgggat tacaggcgtg agccaccgcg 1440

ccctgcagtt ttttgtattt ttaatagaga cagggtttca ccatgttagc caggatggtc 1500

tcgatttcct gacctcaggt gatctgcccg ctttggcctc ccaaagtgct gggattacaa 1560

gcatgagcca ccgcgcccgg ctcaagtgga gatttttata tggagtccag ttatactctt 1620

tttaatatat aagttgagat gactaataca acttcaatac aggggctcat gagaaatgtc 1680

tgtaatattt aagtaactta ttgtcttctt tctttttttt ttaagatgaa gtcttactct 1740

gttgcccagg cggaagtgca gtggcgtgat cttggctcag ggcaacctct gcctcctggt 1800

ttcaagcgat cttcctgcct cagcctcccg agtagctggg agtacaggcg tgcatgacca 1860

cacccggcta atttttttat ttttagtaga gacggggttt ctccatgttg gccgggctgg 1920

tcttgaactc ctgacctcag gtgatccgcc cacctcagcc tccccaagtg ttgggattac 1980

aggtgtgagc ccccgtgccc agcctattat cttatttctg aataaagaat tgtctgtgtg 2040

gggaatagat aactctttct catgcagccc ctgctagaaa atttgttttc tctagcagtt 2100

ggtctgtgct tataggctac tctttgaaag cacaaaaaat ttattgactt cttttttttg 2160

ggtttttttt tttttttgag acagagtttt gcccttgttg cccaggttgg agtgcaatgg 2220

cgcgatctca gctcaccgca acctccacct cctgggttca agtgattctc ctgccttagc 2280

ctcctgagta gctgggatta caggcatgcg tcaccatgcc tggctaattt tgtattttta 2340

gtacaaatgg ggtttctcca tgttggtcag gctggtctca aactcctgac ctcaggtgat 2400

ccacccgcct tggcctccca aagtgctggg attatgggtg tgagccattg cgcctggcca 2460

gaaaattcat tgacttccta aagatttatt aactttctgc attacttttt tttttcccct 2520

ccatcgtaaa tataaaaggg aatagtagag aaaatcattc agaattttat tttttagtga 2580

cattatttag tgacatttta ttagagtcac ttaggaacct gaggctgaat aaagttcagg 2640

taaaagtaaa attagttgag aagagacatc tgccaaaaga aatctatttt taacttcact 2700

tgctgtcttt cctagaggaa cagaaatagt gctgaatgtc ctattagaaa tgatggttgc 2760

tctgcccgtc tcttccctct ctctcacaca atatgtaaac tcatacagtg tatgagcctg 2820

taagacaaag gaaaaacacg ttaatgaggc actattgttt gtatttggag tttgttatca 2880

ttgcttggct catattaaaa tatgtacatt agagtagttg cagactgata aattattttc 2940

tgtttgattt gccag 2955

Claims (12)

1.一种肿瘤的判定方法，包括以下工序：

(1)将由受检组织或细胞制备的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理的工序，

其中，该受检组织或细胞是来自以下罹患肿瘤且判定为下述(i)(ii)情况的患者的组织或细胞，

(i)该肿瘤在MSI检查中被判定为MSI-H、和/或该肿瘤在免疫组织化学检查中被判定为MLH1的表达消失或降低，且，

(ii)通过遗传学检查被判定为在MLH1没有发现变异；

(2)从工序(1)中得到的经亚硫酸氢盐处理过的DNA中，将包含MLH1启动子区域的一部分或全部的DNA通过PCR进行扩增的工序；

(3)将工序(2)中得到的PCR扩增产物供于离子交换色谱，获得检测信号的工序；

(4)判定工序(3)中得到的检测信号的峰是否为表示高甲基化DNA的峰的工序；

(5)在工序(4)中，该峰被判定为表示高甲基化DNA的峰的情况下，将该肿瘤判定为来自非林奇综合征的患者的肿瘤的工序。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述受检组织或细胞是包含肿瘤的组织或细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述肿瘤是大肠、子宫内膜、胃、卵巢、小肠、胆道、胰脏、肾盂、输尿管、脑或者皮脂腺中的肿瘤。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，在所述工序(2)中，代替包含所述MLH1启动子区域的一部分或全部的DNA而将包含MLH1的启动子区域和/或Intron1区域的一部分或全部的DNA通过PCR进行扩增。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述离子交换色谱为阴离子交换色谱。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，所述离子交换色谱中使用的色谱柱填充剂在表面具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团这两者。

7.一种获得用于判定肿瘤的数据的方法，包括以下工序：

(1)将由受检组织或细胞制备的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理的工序，

其中，该受检组织或细胞是来自以下罹患肿瘤且判定为下述(i)(ii)情况的患者的组织或细胞，

(i)该肿瘤在MSI检查中被判定为MSI-H、和/或该肿瘤在免疫组织化学检查中被判定为MLH1的表达消失或降低，且

(ii)通过遗传学检查被判定为在MLH1没有发现变异；

(2)从工序(1)中得到的经亚硫酸氢盐处理过的DNA中，将包含MLH1启动子区域的一部分或全部的DNA通过PCR进行扩增的工序；

(3)将工序(2)中得到的PCR扩增产物供于离子交换色谱，获得检测信号的工序；

(4)获取工序(3)中得到的检测信号的峰是否为表示高甲基化DNA的峰作为用于判定该肿瘤是否为来自非林奇综合征的患者的肿瘤的数据的工序。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述受检组织或细胞是包含肿瘤的组织或细胞。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述肿瘤是大肠、子宫内膜、胃、卵巢、小肠、胆道、胰脏、肾盂、输尿管、脑或者皮脂腺中的肿瘤。

10.根据权利要求7～9中任一项所述的方法，其中，在所述工序(2)中，代替包含所述MLH1启动子区域的一部分或全部的DNA而将包含MLH1的启动子区域和/或Intron1区域的一部分或全部的DNA通过PCR进行扩增。

11.根据权利要求7～10中任一项所述的方法，其中，所述离子交换色谱为阴离子交换色谱。

12.根据权利要求7～11中任一项所述的方法，其中，所述离子交换色谱中使用的色谱柱填充剂在表面具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团这两者。