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CN108130326A - miRNA反义核苷酸的用途及修饰的间充质干细胞及修饰方法 - Google Patents

miRNA反义核苷酸的用途及修饰的间充质干细胞及修饰方法 Download PDF

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CN108130326A
CN108130326A CN201711452910.3A CN201711452910A CN108130326A CN 108130326 A CN108130326 A CN 108130326A CN 201711452910 A CN201711452910 A CN 201711452910A CN 108130326 A CN108130326 A CN 108130326A
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CN
China
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mir205
mesenchymal stem
nucleotide
antisense
cells
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CN201711452910.3A
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朱凌燕
肖向玮
龚甜
黄霞
徐积兄
刘建英
周小江
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First Affiliated Hospital of Nanchang University
Original Assignee
First Affiliated Hospital of Nanchang University
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Abstract

本发明公开了一种miRNA反义核苷酸的用途及修饰的间充质干细胞及修饰方法，为miR205‑5p的反义核苷酸，通过类腺病毒转染间充质干细胞来制备基因药物，来增加VEGF蛋白表达，进而促进新的血管生成。

Description

miRNA反义核苷酸的用途及修饰的间充质干细胞及修饰方法
技术领域
本发明涉及内源性的非编码miRNA的反义核苷酸的新药用途，以及其载体的新药用途，尤其涉及一种内源性的非编码miRNA反义核苷酸制备用于治疗缺血性脑血管病的基因药物中的用途。
背景技术
缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular disease)又称脑缺血性疾病(ischemic cerebral diseases)，是一不同程度的缺血性脑血管疾病的总称。缺血性脑血管病(ICVD)的病因繁多，病理机制复杂，但不同的病因都可能涉及到三个基本的病理过程：血管壁病变、血液成分改变和血流动力学变化。所有影响到血管壁的结构和功能、血液成分及血流动力学的各种因素，都可能成为ICVD的病因。主要疾病有：①高血压动脉硬化；②动脉粥样硬化；③动脉炎；④动脉肌纤维发育不良；⑤血管痉挛；⑥其他：血管异常(动-静脉畸形、大脑基底异常血管网病、锁骨下动脉盗血综合征)、心脏疾病(瓣膜病、心内膜炎、心脏黏液瘤)、血液系统疾病(恶性淋巴瘤血管性病变、红细胞增多症)等均可导致脑缺血性疾病的发生。
间充质干细胞，即MSCs，是源于发育早期中胚层的多能干细胞，因其高度自我更新能力和多向分化潜能，而在细胞替代治疗及组织工程修复方面显示了极大的临床应用价值。近年来针对ICVD的MSCs治疗研究日益受到重视，并成为了应用于ICVD治疗的新手段。
MSCs一方面具有分化为血管内皮细胞(Endothelial cells，ECs)的能力，另一方面还具有调节炎症反应、抗纤维化及促进血管修复等作用。首先，MSCs可修复受损的细胞和组织，并具有向受损的组织细胞(包括ECs)分化的潜能，可通过调节免疫而改善局部微环境；其次，MSCs分泌多种细胞因子，可以调节炎症反应、抑制纤维化的形成以及促进血管的修复和重建，基于此可有效的改善ICVD，促进生长新的微小血管；再次，MSCs不属于造血干细胞系，具有“免疫豁免”的特性，由于其来源于成体组织或新生儿组织，因而没有类似胚胎干细胞的伦理争议。
目前对于MSCs在ICVD治疗的分子机制方面的研究表明，促进血管再生和修复的作用是其改善ICVD愈后的主要手段。在调控血管新生和修复的一系列因子中，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是最强且最有效的一个。在现有发现中得知，ICVD患者局部病变部位VEGF表达下降。
VEGF是最强的血管修复和再生因子。然而，局部注射的VEGF因为半衰期短、难以控制剂量以及注射局部外视网膜病变影响等原因，在临床运用中受到了很大的限制和影响，而运用细胞载体的自然分泌的移植方法则能得到有效的改善并防止其对于糖尿病视网膜病变的影响。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明是提供一种调控血管内壁生长因子表达的小分子RNA，促进血管内皮生长因子的表达，并将其应用到制备治疗缺血性脑血管病的基因药物中。
本发明的第一个目的在于提供一种增加间充质干细胞表达血管内皮生长因子的小分子RNA；
下文所述的miR均等同于miRNA，MSCs为间充质细胞的简称，ECs为血管内皮细胞的简称，VEGF为血管内壁生长因子的简称，本发明中仅涉及VEGF-A的165亚型，ICVD为缺血性脑血管病的简称；
所述miRNA核苷酸的种类为miR205-5p，所述miR205-5p反义核苷酸的序列为下述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列：
3’-AGGAAGUAAGGUGGCCUCAGAC-5’。
经试验发现miR205-5p能与VEGF mRNA结合而抑制其蛋白合成，经as-miR-205-5p拮抗后的miR205-5p功能丧失，VEGF蛋白翻译增多，并有效促进微细血管新生。
本发明的又一个目的在于提供一种单链非编码miRNA反义核苷酸修饰的间充质干细胞，所述间充质干细胞含有miR205-5p反义核苷酸和载体，所述miR205-5p反义核苷酸的序列为下述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列：
3’-AGGAAGUAAGGUGGCCUCAGAC-5’；所述载体为类腺病毒。
本发明的又一个目的在于提供一种制取作为用于制备治疗ICVD转基因药物的间充质干细胞的方法，其步骤包括：
(1)间充质干细胞的提取、分离、筛选、培养；
(2)通过类腺病毒制备表达miR205-5p反义核苷酸；
(3)携带miR205-5p反义核苷酸的类腺病毒修饰转染间充质细胞。
作为本发明的进一步改进，培养间充质干细胞的培养基含有以下组分：
DMEM培养基10-20％、
牛血清5-10％、
白介素6 0.08-0.15％、
干细胞生长因子0.05-0.08％、
水凝胶颗粒0.6-1.5％、
BSA 0.5-1％，
其余为去离子水。
作为本发明的进一步改进，水凝胶颗粒的组成成分为：
海藻酸9-20份
银耳多糖79-90份
交联剂1-12份；
本发明的又一个目的在于提供一种单链非编码miRNA反义核苷酸在用于制备增加血管内皮生长因子药物的用途；
本发明的又一个目的在于提供一种单链非编码miRNA反义核苷酸在用于制备预防或治疗糖尿病药物中的用途；
本发明的又一个目的在于提供一种间质干细胞在制备预防或治疗ICVD药物中的用途。
通过miR205-5p反义核苷酸修饰过后的间充质细胞增强了VEGF的表达水平，促进分化为ECs的能力，应用miR205-5p反义核苷酸制备促进血管内皮细胞表达的药物，由于其通过细胞分泌产生的内源性VEGF，用于治疗血管内皮细胞减少，促进微细血管生成，避免了外源性重组VEGF因为半衰期短、难以控制剂量以及造成局部外视网膜病变影响，进一步应用miR205-5p反义核苷酸或miR205-5p反义核苷酸修饰过后的间充质细胞制备治疗ICVD的药物，在促进VEGF表达的基础上，促进血管再生，增加血循环。
附图说明
图1为实施例和对比例的MSCs的细胞内VEGF水平；
图2为观察组和对照组的小鼠脑切片的血管密度图；
图3为实验组1-3和对照组培养下的间充质干细胞分化为血管内皮细胞的转化率。
具体实施方式
下面将结合附图所给出的实施例对本发明做进一步的详述。
本发明所用的试剂若未明确指明，则均购至美国Sigma公司，采用的小鼠购至美国jackson公司；
除非特别指明，以下实施例所用的试验方法均为本领域中所用的常规方法。
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。
1、miR205-5p反义核苷酸的制备
miR205-5p的序列为5′-UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG-3′，针对miR205-5p设计反义序列，其反义序列为3′-AGGAAGUAAGGUGGCCUCAGAC-5′，
miR205-5p反义核苷酸的合成步骤如下：
1)总RNA提取
(1)从志愿者骨髓中提取用间充质干细胞，进行体外培养分离，吸净细胞培养液，无菌PBS洗三遍。
(2)加入1ml TRIzol试剂，冰上放置3min后刮下细胞，冰浴2min。
(3)加入200ul氯仿，上下颠倒充分混匀，冰上静置至分层。
(4)4℃，13000g，离心15min；小心吸取上层清液约600ul置于新EP管中。
(5)加入等体积异丙醇，充分混匀，-20℃沉淀RNA 15min。
(6)4℃，13000g，离心15min，弃去上清。
(7)加入1ml 75％乙醇(DEPC水配制)，重悬RNA沉淀。
(8)4℃，13000g，离心10min；弃上清。
(9)室温干燥RNA，使白色沉淀半透明时加入20ul DEPC水，溶解RNA沉淀。
(10)溶解的RNA放于-80℃冻存。
2)RNA定量
利用酶标仪测量吸光值的方法，计算RNA浓度。具体地，取1ul RNA样品，置于比色杯中，在加入199ul DEPC水，混匀后上机读数，计算RNA含量。
3)miR205-5p逆转录反应(茎环法)，逆转录反应体系和相应引物序列信息如下表所示
逆转条件：16℃，30min→42℃，60min→85℃，5min。
4)将逆转好的cDNA样品按所定购的Taq酶的说明配置成实验样本，设定PCR条件。逆转录过程中所用microRNA实时定量PCR条件如下表所示。逆转录中所用基因引物序列信息如下表所示，均由德国Qiagen公司合成。
上述miR205-5p反义核苷酸的设计合成也可以通过委托德国Qiagen公司完成，合成后进行干燥处理成干粉。
经发明人研究结果表明miR205-5p参与VEGF表达过程中的调控，miR205-5p能与VEGF mRNA结合而抑制其蛋白合成。经miR-205-5p反义核苷酸拮抗后的miR205-5p功能丧失，VEGF蛋白翻译增多，进而有效促进脑部血管栓塞部位周围的微细血管新生。
2、制备miR-205-5p反义核苷酸修饰的间充质干细胞的方法
步骤一、提取、分离、筛选、培养间充质干细胞
(1)提取和分离步骤如下：
从志愿者骨髓中提取用间充质。
新鲜骨髓加入适当量DMEM培养液稀释，离心去脂肪层。
加入5mL DEME培养液，充分混匀，打散细胞，制成细胞悬液。
利用比重1.073的Percoll淋巴细胞分离液分离，500g离心25min。
离心后可见中间有一层约1-2mm厚的白色层，用吸管吸取界面。
加入3mL PBS离心洗涤。
弃上清，加入培养液调整细胞密度，以1×106个/mL的密度接种于培养瓶中(P0)。
将P0细胞置37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中静置培养。
24小时后换液，去除非贴壁细胞。
(2)鉴定、培养步骤如下：
将MSCs通过向成脂细胞和成骨细胞体外分化处理，并分别进行油红O染色、VonKossa染色，通过显微镜观察上述步骤中的间充质干细胞分化为成脂细胞、成骨细胞的能力。
1)向脂肪细胞诱导分化
(1)以每孔1.0×103cm“的密度接种于4个培养皿；
(2)当细胞达80％融合时，取其中2个培养皿加入成脂诱导分化液：体积分数10％FBS、10“mol/L地塞米松、0.5mmol/LIBMX、60umoL/L吲哚美辛及5mg/L胰岛素的LG-DMEM培养基，另2个培养皿作对照。
(3)每3-4d换液1次。
(4)第14天采用油红O染色，于倒置显微镜下观察脂肪滴的形成情况。
油红O染色的步骤如下：
(1)弃掉培养夜，PBS漂洗细胞3次。
(2)4％多聚甲醛固定30min，PBS漂洗细胞3次。
(3)稀释油红储存液，过滤，室温放置10min。
(4)加入油红O工作液，染色10min。
(5)脱色，60％异丙醇漂洗除去多余的染料。
(6)自来水洗，复染，苏木素染细胞核2min。
(7)自来水洗至细胞核蓝化。
(8)甘油明胶封固，显微镜观察，成像。
2)向成骨细胞诱导分化
(1)细胞以每孔1.0×105cm的密度接种于4个培养皿；
(2)当细胞达80％-90％融合时，取其中2个培养皿加入成骨诱导液：含体积分数10％FBS，10-7mol/L地塞米松、50mg/L维生素C及10mmol/L β-甘油磷酸钠的LG-DMEM培养基，另2个培养皿作对照。
(3)每3～4d换液1次。
(4)第14天用碱性磷酸酶染色检测钙化基质沉淀。
碱性磷酸酶染色的步骤如下：
(1)用PBS漂洗细胞3次。
(2)加入4％多聚甲醛固定5分钟，双蒸水漂洗3次。
(3)向培养皿中加入5％硝酸银溶液1ml，敞开培养皿盖，在紫外灯下照射1小时。
(4)吸走残留的硝酸银溶液，蒸馏水漂洗3遍。
(5)向培养皿中加入5％硫代硫酸钠溶液1ml，用以中和残留的硝酸银溶液，吸出残液。
(6)室温下晾干。
3)通过流式细胞技术检测第3代骨髓间充质干细胞中CD29，CD34，CD44，CD45，CD166，HLA-DR的表达情况，验证上述步骤中间充质干细胞的分化能力。
(1)用0.25％的胰酶消化培养的MSC细胞。
(2)PBS洗涤细胞2次，再用PBS悬浮细胞。
(3)取100μl细胞悬液(约1×106个细胞)，加入一抗混匀，室温下避光反应30min。
(4)用PBS洗涤细胞2次，1000rpm离心5min，弃掉上清液。
(5)用100μl PBS重悬细胞，再加入FITC或PE荧光标记的相应抗体(用量参照说明书)混匀，室温下反应30min。
(6)用PBS再洗涤细胞2次，加入500μl PBS重悬成单细胞悬液，上机检测。
通过以上步骤鉴定分离的间充质干细胞，在验证其具备分化能力后，培养2天后更换培养基以去除悬浮细胞，待细胞生长至90％融合时，使用胰酶溶液消化传代。
4)传代培养步骤如下：
(1)传代时先吸出全部培养液后，PBS液洗涤二次；
(2)加入37℃预热的0.25％胰蛋白酶消化1～2分钟；
(3)倒置显微镜下观察，细胞开始皱缩时(细胞开始变圆)加入完全培养液(3ml)终止胰酶作用；
(4)吸管反复吹打后将细胞收集于15ml离心管中；
(5)1000r/min离心5分钟后弃上清；
(6)加入5ml培养液于离心管中，充分混匀，打散细胞，制成细胞悬液；
(7)将离心管中的细胞悬液以1∶3的比例移至培养瓶中；
(8)将培养瓶置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中静置培养。
培养过程中所使用的培养液的配方为：DMEM培养基10-20％、牛血清5-10％、白介素6 0.08-0.15％、干细胞生长因子0.05-0.08％、水凝胶颗粒0.6-1.5％、BSA 0.5-1％％，其余为去离子水。
以上自制的培养能够在间充质干细胞培养过程中保持间充质干细胞的分化特性，促进其分化为血管内皮细胞，并且缩短其传代时间。
其水凝胶颗粒的成分为：
海藻酸9-20份
银耳多糖79-90份
交联剂1-12份。
其交联剂可以采用2-乙基-4甲基咪唑。
银耳多糖的提取过程：将干燥的银耳干燥粉碎，依次用乙酸乙酯、丙酮使用索氏提取法去除脂肪，然后将去脂肪后的银耳浸泡在生理盐水中，在高压120℃离心取提取液，冷却提取液后再离心且收集残渣；残渣用去离子水离心清洗且冷冻干燥得到银耳多糖，银耳多糖粒径不大于60目。
在培养基的配置过程中，先将海藻酸和银耳多糖溶于去离子水中，搅拌12h得到混合溶液，将培养基其他组分和2-乙基-4甲基咪唑溶解于混合溶液中，快速搅拌5min，在37℃温度下交联反应10min～20min，再在紫外灯(λ＝368)下照射2.5小时。
水凝胶在培养基中起到了缓释营养物质的作用，其银耳多糖能够在诱导间充质细胞分化为血管内皮细胞。
取上述步骤中提取、分离的间充质干细胞，在本实施例公开的培养基中培养，实验组1培养基的组分如下：
200mg/l的DMEM培养基、100mg/l牛血清、0.8mg/1白介素6、0.8mg/l干细胞生长因子、15mg/l水凝胶颗粒、5mg/lBSA，其余为去离子水；
实验组2培养基的组分如下：
150mg/l的DMEM培养基、50mg/l牛血清、1.5mg/l白介素6、0.5mg/l干细胞生长因子、15mg/l水凝胶颗粒、5mg/lBSA，其余为去离子水；
实验组3培养基的组分如下：
100mg/l的DMEM培养基、50mg/l牛血清、0.8mg/l白介素6、O.8mg/l干细胞生长因子、6mg/l水凝胶颗粒、5mg/lBSA，其余为去离子水；
从第二天开始每天通过流式细胞技术检测在上述培养基中的间充质干细胞中CD31的表达情况，验证上述步骤中间充质干细胞的分化能力，计算其转化率。
(1)用0.25％的胰酶消化上述培养的间充质干细胞细胞。
(2)PBS洗涤细胞2次，再用PBS悬浮细胞。
(3)取100μl细胞悬液(约1×106个细胞)，加入一抗混匀，室温下避光反应30min。
(4)用PBS洗涤细胞2次，1000rpm离心5min，弃掉上清液。
(5)用100μl PBS重悬细胞，再加入FITC或PE荧光标记的CD31抗体(用量参照说明书)混匀，室温下反应30min。
(6)用PBS再洗涤细胞2次，加入500μl PBS重悬成单细胞悬液，上机检测。对照组的培养基为：在DMEM培养基中加入10％的牛血清；
通过监测实验组1-3和对照组的CD31的表达情况，可以看出从第二天起实验组的CD31的表达高于对照组的CD31的表达，并且实验组1-3均在第9天其转化率达到稳定高水平，其具体数据如表1和图3所示：
2d 3d 4d 5d 6d 7d 8d 9d 10d
实验组1 10.2％ 23.5％ 59.3％ 68.7％ 75.6％ 78.7％ 84.1％ 88.7％ 88.6％
实验组2 12.2％ 26.3％ 45.6％ 55.8％ 67.2％ 72.1％ 73.2％ 78.8％ 78.6％
实验组3 8.2％ 19.6％ 35.4％ 50.2％ 52.1％ 54.8％ 64.8％ 69.7％ 70.4％
对照组 1.3％ 1.2％ 1.8％ 1.8％ 1.9％ 1.7％ 1.9％ 2.2％ 2.2％
在第9天去实验组1-3的间充质干细胞倒置显微镜下观察其细胞形态，呈现内皮细胞典型的折光性强、“铺路石”样等特点。
本发明所述公开的自制培养基能够定向诱导分化间充质干细胞为血管内皮细胞，使得在通过经培养基培养后的间充质干细胞或本发明所公开的经过as-miR-205-5p修饰的间充质干细胞应用至制备治疗缺血性疾病的药物时，能够诱导加快其血管内皮生长因子表达，加快其血管修复的速率。
2)通过类腺病毒(AAV)制备表达as-miR-205-5p，AAV-as-miR-205-5p修饰转染MSCs
1.1主要试剂：Trizol Reagent，LipofectamineTM2000(美国Invitrogen公司)；逆转录酶DNA合成试剂盒(美国Fermentas公司)；T4DNA连接酶(美国MBI公司)；PCR Kit(Qiagen公司)；BamHI和Xho I限制性内切酶(Promega公司)；引物合成、核苷酸序列测定(Qiagen公司)；DMEM培养基(Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)。
1.2病毒载体、细胞株及菌种pAAV-CMV-GFP质粒及AAV-293、AAV-HT1080细胞(Stratagene公司)，DH5宿主菌由本室制备保存。
2.1AAV-as-miR-205-5p重组AAV载体的构建
德国Qiagen公司合成的as-miR-205-5p包含上游引物和下游引物，上、下游引物经5’端修饰分别引入限制性内切酶BamHI和XhoI位点。扩增产物经BamHI和XhoI酶切后定向克隆入pAAV-CMV-GFP载体多克隆位点。重组质粒AAV-as-miR-205-5p经双酶切鉴定正确后，进行测序。
2.2重组AAV-as-miR-205-5p的包装
采用Qiagen试剂盒大量提取超纯质粒AAV-as-miR-205-5p、pHelper和pAAV-RC质粒，分别测定OD值，并用TE溶液调整质粒浓度为1g/L。含10％的牛胎血清DMEM培养基培养AAV-as-miR-205-5p，细胞融合至90％时，用磷酸钙转染法将AAV-as-miR-205-5p质粒与AAV包装质粒pAAV-RC、AAV辅助质粒pHelper三质粒共转染MSCs。转染后于培养箱中培养6h后换新鲜培养基，再培养66～72h后回收病毒。
2.3应用嘌呤霉素对感染后的MSCs细胞进行药物筛选稳定病毒感染72小时后，细胞加入3-6μg/ml浓度的Puromycin(购自Sigma-Aldrich公司)，此后每2-3天更换一次含有Puromycin的新鲜培养基，将不同组别的细胞克隆用胰酶消化，转移至24孔板。待孔内细胞长至70～80％密度时再经胰酶消化转移至6孔板内培养。待6孔板内细胞生长至70～80％时转移至培养瓶中继续培养，得到稳定转染的细胞至铺满培养瓶，后续进行细胞的常规培养。显微镜下观察细胞形态变化。
miR-205-5p分子的转染终浓度可以为10-100nM，优选为50nM，Lipofectamine2000的转染终浓度可以为10-100μL/mL，优选为50μL/mL。转染时间为24-84hours，优选为48hours。
所述培养的条件可以为温度为35-38℃、CO2浓度为5-15％(体积百分含量)、饱和湿度、培养的时间是3-4天；所述温度优选为37℃，所述CO2浓度优选为5％。
3.1转染细胞因为表达GFP而呈现为绿色，通过流式细胞仪分选，纯化成功经此miRNA的反义核酸修饰的MSCs。
3.2检验经过as-miR-205-5p修饰后的MSCs的分化能力，通过上述细胞体外诱导和流式细胞技术鉴定鉴定MSCs的分化能力；
流式细胞术结果显示，在敲低miR-205-5p的间充质干细胞中，CD29，CD34，CD44，CD45，CD166，HLA-DR的表达情况与对照组相比无显著差异；体外诱导分化实验也结果显示，敲低miR-205-5p后间充质干细胞维持向成骨细胞，软骨细胞和脂肪细胞分化的良好潜能。
3.3使用ELISA技术检测转染后的MSCs的VEGF蛋白水平
采用细胞裂解液将as-miR-205-5p修饰后的MSCs裂解，取上清液，利用Abcam公司的VEGF-ELISA试剂盒检测其上清液中的VEGF蛋白水平；
(1)加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入上述步骤中的上清液50ul于反应孔内；立即加入50ul的生物素标记的抗体；盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。
(2)甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次；每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。
(3)甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次；每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。
(4)取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后，在450nm波长处测定各孔的OD值。
对比例一：将从健康志愿者骨髓中提取MSCs扩增几代后的子代进行培养，同上步骤采用ELISA技术检测MSCs的VEGF蛋白水平。
如图1所示，未经过as-miR-205-5p修饰的间充质干细胞分泌的VEGF水平明显低于经过as-miR-205-5p修饰后的MSCs的细胞内VEGF水平，可以表明通过as-miR-205-5p修饰的间充质干细胞，进而敲低间充质干细胞中的miR-205-5p水平，有效的促进VEGF的翻译，进而增强了间充质干细胞改善局部血管新生的疗效。
3)miR205-5p反义核苷酸在用于制备预防或治疗缺血性脑血管病药物中的用途
脑缺血大鼠模型的制备：免疫缺陷NOD/SCID小鼠(购自美国jackson公司)术前禁食12h、禁水4h，用10％水合氯醛(0.30ml/100g)腹腔注射麻醉，仰卧固定于木制手术台上。颈前部备皮，酒精、碘酒消毒后，沿腹侧颈正中切开，依次钝性分离皮下脂肪、胸骨舌骨肌和胸锁乳头肌，再分别分离暴露左、右侧颈总动脉及气管，于近心端和远心端双重结扎后从中间剪断，然后逐层缝合肌肉、皮肤。正常对照组大鼠同法行颈前皮肤切开，分离皮下脂肪。
通过采用免疫缺陷小鼠避免小鼠对人源MSCs移植排斥对实验的影响。
观察组a：对脑缺血大鼠模型头部皮下注射(106个细胞/只)经过miR205-5p反义核苷酸修饰的MSCs，连续观察4周。
对照组b：对脑缺血大鼠模型头部皮下注射(106个细胞/只)MSCs，连续观察4周。
对照组c：对脑缺血大鼠模型，连续观察4周。
对照组d：对未经任何处理的小鼠，连续观察4周。
通过对观察组a、观察组b、对照组c、对照组d、对照组e进行血管密度检测，评估血管新生情况，如图2所示，可以得出经过as-miR-205-5p修饰的间充质干细胞能显著的增加血管密度，使其新生微细血管，减缓缺血性脑血管疾病。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种增加间充质干细胞表达血管内皮生长因子的小分子RNA，其特征在于，所述小分子RNA分子为miR205-5p反义核苷酸，所述miR205-5p反义核苷酸的序列为下述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列：
3′-AGGAAGUAAGGUGGCCUCAGAC-5′。
2.一种单链非编码miRNA反义核苷酸修饰的间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞含有miR205-5p反义核苷酸和载体，所述miR205-5p反义核苷酸的序列为下述SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列：
3′-AGGAAGUAAGGUGGCCUCAGAC-5′；
所述载体为类腺病毒。
3.一种单链非编码miRNA修饰的间充质干细胞的方法，其步骤包括：
(1)提取、分离、鉴定、培养间充质干细胞，
(2)通过类腺病毒制备表达miR205-5p反义核苷酸，所述miR205-5p反义核苷酸的序列为下述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列：
3′-AGGAAGUAAGGUGGCCUCAGAC-5′；
(3)携带miR205-5p反义核苷酸的类腺病毒修饰转染间充质细胞。
4.根据权利要求3所述的一种单链非编码miRNA修饰的间充质干细胞的方法，其特征在于，其培养间充质干细胞的培养基含有以下组分：
DMEM培养基 10-20％、
牛血清 5-10％、
白介素6 0.08-0.15％、
干细胞生长因子 0.05-0.08％、
水凝胶颗粒 0.6-1.5％、
BSA 0.5-1％，
其余为去离子水。
5.根据权利要求4所述的一种单链非编码miRNA修饰的间充质干细胞的方法，其特征在于，水凝胶颗粒的组成成分为：
海藻酸 9-20份
银耳多糖 79-90份
交联剂 1-12份。
6.一种单链非编码miRNA反义核苷酸在用于制备增加血管内皮生长因子药物的用途，其特征在于：所述miRNA核苷酸的种类为miR205-5p，所述miR205-5p反义核苷酸的序列为下述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列：
3′-AGGAAGUAAGGUGGCCUCAGAC-5′。
7.一种单链非编码miRNA反义核苷酸在用于制备预防或治疗缺血性脑血管病药物中的用途，其特征在于，所述miRNA核苷酸的种类为miR205-5p，所述miR205-5p反义核苷酸的序列为下述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列：
3′-AGGAAGUAAGGUGGCCUCAGAC-5′。
8.如权利要求2所述的间质干细胞在制备预防或治疗缺血性脑血管病药物中的用途。
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