CN108102877A - 一种集成单细胞捕获与筛选功能的微流控芯片与筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种集成单细胞捕获与筛选功能的微流控芯片。该芯片包括依次层叠设置的液体层、薄膜层与控制层。液体层上设有液体流道、筛选流道和贯通液体层的通孔。控制层包含可以独立驱动的压力管道。压力管道可以使筛选流道与压力管道相交区域的薄膜朝筛选流道的方向凹陷形成微阀门。薄膜的变形大小可通过改变压力进行精确调节。本发明可以确定性的捕获单个细胞，捕获效率可高达百分之百，同时应用前、后膜片的变形实现了捕获后单细胞的精确筛选。此外，通过调节前膜片与后膜片的凹陷距离，可以改变细胞的筛选范围，实现利用同一个芯片就可以对筛选出的细胞大小进行动态调节的目的。

Description

一种集成单细胞捕获与筛选功能的微流控芯片与筛选方法

技术领域

本发明涉及微流控芯片领域，尤其是涉及一种利用压力管道精确控制薄膜变形从而实现单个细胞捕获、细胞大小动态筛选的微流控芯片，以及实现单细胞大小精确筛选的方法。

背景技术

荧光激活细胞分选和有限稀释是两种应用最为广泛的单细胞分离方法，然而这两种方法均存在不足：前者需要特殊的设备和专业的人员，而且分离极少量细胞时的效率低；利用后者将细胞接种到标准孔板上时，只有三分之一的孔内有单个细胞。此外，以上两种方法都无法对细胞大小进行筛选。

微流控芯片因能够精确控制微量液体和单个细胞而被广泛用于单细胞分离、捕获和后续分析，其中利用蛇形管道中带缺口的U型微结构产生的流体动力学圈闭来捕获单细胞的方法既简单又高效，捕获效率可高达百分之百，然而现有技术中的微流控芯片不具备动态筛选功能，同一个芯片输出的细胞大小分布是确定的、不变的，无法实时调节。此外，现有的基于微流控芯片的单细胞捕获装置，很难将所得到的大量单细胞进行可寻址性回收，因而无法与现有的细胞培养和分析装置兼容。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提出一种集成单细胞捕获与动态筛选功能的微流控芯片，用于解决现有微流控芯片不具备高通量单个细胞大小动态筛选的问题。

本发明解决其技术问题所采用的方案是：

一种集成单细胞捕获与筛选功能的微流控芯片，包括从下向上依次层叠设置的液体层、薄膜层与控制层，其中

液体层上设有液体流道，液体流道上设有与液体流道连通的筛选流道，筛选流道上远离液体流道的一端设有贯通液体层的通孔；

控制层上对应每条筛选流道设置有靠近液体流道的前压力管道和靠近通孔的后压力管道，前、后压力管道独立驱动，且前、后压力管道与对应的筛选流道在层叠方向上的投影相互交叉；

薄膜层上对应前、后压力管道与筛选流道相交的区域分别为前膜片和后膜片，前膜片的下方与液体流道之间的筛选流道为单细胞捕获区域，前膜片和后膜片之间的筛选流道为筛选区域；

前、后压力管道可以分别驱动前、后膜片朝筛选流道的方向变形，且前、后膜片的变形大小可通过改变前、后压力管道内的压力以进行调节。

作为上述方案的进一步改进方式，还兼容标准孔板，通孔一一对应于标准孔板上的孔，筛选流道内的液体和细胞可以经通孔流入标准孔板上相应的孔内。

作为上述方案的进一步改进方式，液体流道包括主流道，以及与主流道连通的若干分支流道，分支流道的两侧均连通有若干筛选流道。

作为上述方案的进一步改进方式，位于分支流道同一侧的所有筛选流道由同一条前、后压力管道进行统一控制。

作为上述方案的进一步改进方式，分支流道并列分布，相邻分支流道的相邻侧的筛选流道由同一条前、后压力管道统一控制。

作为上述方案的进一步改进方式，前膜片的凹陷距离大于后膜片的凹陷距离。

作为上述方案的进一步改进方式，前压力管道与后压力管道的一端设置有用于与外部气源连接的进气孔，另一端封闭。

一种应用上述集成单细胞捕获与筛选功能的微流控芯片的筛选方法，包括以下步骤：

S10驱动前膜片与后膜片凹陷，此时前膜片与筛选流道的下壁之间的距离为D1，后膜片与筛选流道的下壁之间的距离为 D2，D1小于D2；

S20在液体流道内通入混合有待筛选细胞的悬浮液，筛选流道的单细胞捕获区域内捕获直径d小于筛选流道的高度D及宽度，并大于D1的单个细胞；

S30在液体流道内通入不含有细胞的液体进行管道冲洗，使管道内没有未被捕获的细胞后，然后使前膜片复位，被捕获的细胞通过前膜片下方的筛选流道，进入筛选区域内；

如果被捕获细胞的直径d小于D2，则该细胞继续通过后膜片下方的筛选流道，经过通孔流出，以筛选出直径d满足 D1<d<D2的细胞；

如果被捕获细胞的直径d大于D2，则该细胞被后膜片阻挡在筛选区域内。

作为上述方案的进一步改进方式，还包括将筛选出的直径 d满足D1<d<D2的细胞一一对应的导入细胞培养装置中的步骤。

作为上述方案的进一步改进方式，细胞培养装置为标准孔板。

本发明的有益效果是：

本发明可以确定性的捕获单个细胞，捕获效率可高达百分之百，同时应用前、后膜片的变形实现了捕获后单细胞的精确筛选。此外，通过调节前膜片与后膜片的凹陷距离，可以改变细胞的筛选范围，实现利用同一个芯片就可以对筛选出的细胞大小进行动态调节的目的。

本发明可以实现单细胞的可寻址回收，通过在筛选流道的末端设置通孔，可以将筛选出的细胞一一导至外部的细胞培养孔板中。该方法确保实现准确识别每个细胞的来源。

此外，本发明将筛选出的单细胞接种到标准孔板上，因此使后续的细胞培养和分析与传统设备兼容，可以显著降低单细胞分析的成本。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步说明。

图1是本发明微流控芯片一个实施例的俯视图；

图2是本发明液体层一个实施例的俯视图；

图3是本发明薄膜层一个实施例的俯视图；

图4是本发明控制层一个实施例的俯视图；

图5是本发明筛选流道与变形后前、后膜片的截面示意图；

图6是本发明捕获单个细胞时各膜片的状态示意图；

图7是本发明筛选单个细胞时各膜片的状态示意图；

图8是图1中A区域的放大示意图。

具体实施方式

以下将结合实施例和附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

需要说明的是，如无特殊说明，当某一特征被称为“固定”、“连接”在另一个特征，它可以直接固定、连接在另一个特征上，也可以间接地固定、连接在另一个特征上。此外，本发明中所使用的上、下、左、右、前、后等描述仅仅是相对于附图中本发明各组成部分的相互位置关系来说的。

此外，除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与本技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例，而不是为了限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的组合。

参照图1，示出了本发明微流控芯片一个实施例的俯视图。如图所示，微流控芯片包括控制层100、薄膜层200与液体层 300。

控制层100、薄膜层200与液体层300依次层叠设置，具体如图中所示，液体层300位于底部，控制层100位于顶部，薄膜层200位于控制层100与液体层300之间。

参照图2，示出了本发明液体层一个实施例的俯视图。如图所示，液体层300上设有液体流道，液体流道的两端分别设有液体入口301和液体出口302，细胞悬浮液与培养液均可以由液体入口301进入液体流道，并由液体出口302排出。

优选地，为了增加捕获和筛选效率，并使之与标准孔板兼容，本实施例中的液体流道分为主流道303与分支流道304，其中主流道303逐级分叉，末端与分支流道304连通。分支流道304并列设置，每一分支流道304的两侧分别设有若干的筛选流道305，优选是每一分支流道304的一侧设有三条并列的筛选流道305，筛选流道305的末端设置有通孔306。

参照图3，示出了本发明薄膜层一个实施例的俯视图。如图所示，薄膜层200优选为弹性膜，其可以在外部压力的驱动下发生变形，从而结合液体层300上的筛选流道305形成微阀门。

薄膜层200上设有通孔201与通孔202，其中通孔201的位置与液体入口301对应，通孔202的位置与液体出口302对应。

参照图4，示出了本发明控制层一个实施例的俯视图。如图所示，控制层100上设有通孔101与通孔102，其中通孔101 的位置与液体入口301对应，通孔102的位置与液体出口302 对应。

控制层100优选采用气压或者液压作为动力，其上还设置有多条压力管道103，每一压力管道103的一端均设有用于与外部气源连接的进气孔104，另一端封闭。

回到图1，控制层100、薄膜层200与液体层300按照从上往下的方向依次堆叠，液体入口301、通孔201与通孔101 上下连通，液体出口302、通孔202与通孔102上下连通，用于微流控芯片的进液与出液。

薄膜层200覆盖在液体层300上，控制层100驱动薄膜层 200上的膜片形成微阀门。其中，每一筛选流道305的上方均有两条压力管道103经过，包括靠近分支流道304的前压力管道和靠近通孔306的后压力管道，且前、后压力管道与对应的筛选流道在层叠方向上的投影相互交叉，薄膜层200上对应前、后压力管道与筛选流道相交的区域分别为前膜片和后膜片，该两条压力管道103配合前、后膜片在同一筛选流道305上形成两个微阀门，由于压力管道103之间相互独立，故两个微阀门的调节也相互独立。

参照图5，示出了本发明筛选流道与微阀门的截面示意图。如图所示，前膜片203与后膜片204分别形成前后两个微阀门，其中前膜片203更靠近液体流道，前膜片203凹陷时与筛选流道305的下壁之间的距离为D1，后膜片204凹陷时与筛选流道 305的下壁之间的距离为D2，且D1值小于D2值。

前膜片203与液体流道之间间隔一段距离，此间的筛选流道称为单细胞捕获区域，间隔的距离值保证有且仅有单个细胞能滞留在单细胞捕获区域内。前膜片203与后膜片204之间的筛选流道称为筛选区域。

如图所示，混合有待捕获细胞的悬浮液由图5中空心箭头的方向从液体流道流入筛选流道，直径d大于筛选流道305宽度或者高度D的单个细胞无法进入筛选流道305，通过液体流道排到出口302。直径d小于D1的细胞无阻碍的通过全部的微阀门，由筛选流道经通孔306排走。

直径d小于D，并大于D1的细胞则滞留在单细胞捕获区域内，实现单个细胞的捕获，此时可以筛选出D1＜d＜D的细胞。本发明在此基础上还可以进行细胞大小的精确筛选。当单细胞捕获区域捕捉到单个细胞后，在液体流道内通入不含细胞的培养液进行清洗，至管道内不含未被捕获的细胞后，前膜片 203复位，单细胞捕获区域内的单个细胞随培养液通过前阀门，如果单个细胞的直径d大于D2，则该细胞被后阀门阻挡，滞留在筛选区域内；如果单个细胞的直径d小于D2，则该细胞无阻碍的通过后阀门，经通孔306导入至标准孔板上的相应孔中。如此可以筛选出D1＜d＜D2的细胞。通过调节前膜片203与后膜片204的凹陷距离，可以改变细胞的筛选范围，实现使用同一芯片进行细胞大小分布的动态调节。

参照图6，示出了本发明捕获单个细胞时各阀门的状态示意图，图中点状填充表示前膜片处于凹陷状态，线状填充表示后膜片处于凹陷状态，无填充表示前膜片、后膜片复位，阀门处于打开状态，箭头表示液体的流动方向。

如图所示，a步骤时前膜片203凹陷，后膜片204处于自然状态，液体流道内注入细胞悬浮液，细胞流经筛选流道305 和分支流道304衔接处时，会被确定性的捕获到单细胞捕获区域1内。

b步骤时在液体流道内通入不含有细胞的培养液进行冲洗，冲走除被捕获细胞之外的其他细胞。

c步骤时前膜片203复位，被捕获的细胞进一步随培养液通过膜片204和通孔306流入标准孔板的相应孔内。

参照图7，示出了本发明筛选单个细胞时各阀门的状态示意图，图中填充物与箭头的含义与图6相同。

如图所示，a步骤时前膜片203凹陷，后膜片204凹陷，后膜片204的凹陷值小于前膜片203的凹陷值，液体流道内注入细胞悬浮液，单个细胞被捕获在单细胞捕获区域1内。

b步骤时在液体流道内通入不含有细胞的培养液进行冲洗，冲走除被捕获细胞之外的其他细胞。

c步骤时前膜片203复位。如果细胞的直径大于D2，则细胞将滞留在筛选区域2内。而直径小于D2的细胞随培养液通过后膜片204，最后经通孔306流入标准孔板的相应孔内，实现细胞的筛选。

参照图8，图8是图1中A区域的放大示意图。如图所示，分支流道304并列设置，每一侧均设有三个筛选流道305，为减少压力管道103的数量，位于分支流道304同一侧的筛选流道305均由两条压力管道103(即上述前、后压力管道)统一控制，具体如图8所示，压力管道103a(前压力管道)与压力管道103b(后压力管道)共同控制e1侧的三个筛选流道305，压力管道103a与压力管道103b相互平行，并逐一地从三个筛选流道305的上方经过。

为进一步减少压力管道103的数量，相邻分支流道304的相邻侧的筛选流道305也由两条压力管道统一控制，具体如图 8所述，e2侧的三个筛选流道305与e3侧的三个筛选流道305 均由压力管道103c与压力管道103d统一控制，压力管道103c 与压力管道103d均近似为沿矩形的三个周边环绕，并逐一地从e2侧与e3侧的六个筛选流道305的上方经过。如此，除开两端的筛选流道外，e2侧与e3侧的筛选范围相同，e4侧与e5 侧的筛选范围相同，依次类推。

当然，也可以是每个筛选流道都单独控制。

本发明还公开了一种应用上述集成单细胞捕获与动态筛选功能的微流控芯片的筛选方法，其包括以下步骤：

首先通过控制层100驱动前膜片与后膜片凹陷，此时前膜片与筛选流道的下壁之间的距离为D1，后膜片与筛选流道的下壁之间的距离为D2，D1小于D2；

然后在液体流道内通入混合有待筛选细胞的悬浮液，筛选流道的单细胞捕获区域内捕获直径d小于筛选流道的高度D和宽度，并大于D1的单个细胞；

再然后在液体流道内通入不含有细胞的液体进行冲洗，至管道内没有未被捕获的细胞后，将标准孔板与微流控芯片进行连接。前膜片复位，被捕获的细胞通过前膜片，进入筛选区域内；

如果被捕获细胞的直径d小于D2，则该细胞继续通过后膜片，经过通孔流到芯片下方的标准孔板上的相应孔中，实现对直径d符合D1＜d＜D2的细胞进行精确筛选；

如果被捕获细胞的直径d大于D2，则该细胞被后膜片阻挡在筛选区域内。

以上是对本发明的较佳实施进行的具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可做出种种的等同变形或替换，这些等同的变形或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (10)

1.一种集成单细胞捕获与筛选功能的微流控芯片，其特征在于，包括从下向上依次层叠设置的液体层、薄膜层与控制层，其中

所述液体层上设有液体流道，所述液体流道上设有与所述液体流道连通的筛选流道，所述筛选流道上远离所述液体流道的一端设有贯通所述液体层的通孔；

所述控制层上对应每条所述筛选流道设置有靠近所述液体流道的前压力管道和靠近所述通孔的后压力管道，所述前、后压力管道独立驱动，且所述前、后压力管道与对应的所述筛选流道在层叠方向上的投影相互交叉；

所述薄膜层上对应所述前、后压力管道与所述筛选流道相交的区域分别为前膜片和后膜片，所述前膜片的下方与所述液体流道之间的筛选流道为单细胞捕获区域，所述前膜片和后膜片之间的筛选流道为筛选区域；

所述前、后压力管道可以分别驱动所述前、后膜片朝所述筛选流道的方向变形，且所述前、后膜片的变形大小可通过改变所述前、后压力管道内的压力以进行调节。

2.根据权利要求1所述的集成单细胞捕获与筛选功能的微流控芯片，其特征在于，还兼容标准孔板，所述通孔一一对应于所述标准孔板上的孔，所述筛选流道内的液体和细胞可以经通孔流入标准孔板上相应的孔内。

3.根据权利要求1或2所述的集成单细胞捕获与筛选功能的微流控芯片，其特征在于，所述液体流道包括主流道，以及与所述主流道连通的若干分支流道，所述分支流道的两侧均连通有若干所述筛选流道。

4.根据权利要求3所述的集成单细胞捕获与筛选功能的微流控芯片，其特征在于，位于所述分支流道同一侧的所有筛选流道由同一条所述前、后压力管道进行统一控制。

5.根据权利要求4所述的集成单细胞捕获与筛选功能的微流控芯片，其特征在于，所述分支流道并列分布，相邻所述分支流道的相邻侧的所述筛选流道由同一条所述前、后压力管道统一控制。

6.根据权利要求1或2所述的集成单细胞捕获与筛选功能的微流控芯片，其特征在于，所述前膜片的凹陷距离大于所述后膜片的凹陷距离。

7.根据权利要求1或2所述的集成单细胞捕获与筛选功能的微流控芯片，其特征在于，所述前压力管道与后压力管道的一端设置有用于与外部气源连接的进气孔，另一端封闭。

8.一种应用权利要求1至6中任一项所述的集成单细胞捕获与筛选功能的微流控芯片的筛选方法，包括以下步骤：

S10驱动所述前膜片与后膜片凹陷，此时所述前膜片与所述筛选流道的下壁之间的距离为D1，所述后膜片与所述筛选流道的下壁之间的距离为D2，D1小于D2；

S20在所述液体流道内通入混合有待筛选细胞的悬浮液，所述筛选流道的单细胞捕获区域内捕获直径d小于所述筛选流道的高度D及宽度，并大于D1的单个细胞；

S30在所述液体流道内通入不含有细胞的液体进行管道冲洗，使管道内没有未被捕获的细胞后，使所述前膜片复位，被捕获的细胞通过所述前膜片下方的筛选流道，进入所述筛选区域内；

如果被捕获细胞的直径d小于D2，则该细胞继续通过所述后膜片下方的筛选流道，经过所述通孔流出，以筛选出直径d满足D1<d<D2的细胞；

如果所述被捕获细胞的直径d大于D2，则该细胞被所述后膜片阻挡在所述筛选区域内。

9.根据权利要求8所述的筛选方法，其特征在于，还包括将筛选出的直径d满足D1<d<D2的细胞一一对应的导入细胞培养装置中的步骤。

10.根据权利要求9所述的筛选方法，其特征在于，所述细胞培养装置为标准孔板。