CN108094686A - 可有效提高水产动物抗病能力的复合制剂及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可有效提高水产动物抗病能力的复合制剂及制备方法，复合制剂各组分及质量配比如下：微生物菌粉55~65，黄芪多糖10~15，酵母细胞壁10~15，植物精油5~10，维生素B6 1~5；各组分相互配合能够重整肠道菌群结构、改变肠道产酸菌代谢产物中不饱和脂肪酸比例，抑制肠道病原菌及其他有害物质，修复肠道黏膜，促进营养消化吸收，同时可使机体非特异性免疫增强，抗应激性增强，对外来病毒、病菌、寄生虫及污染环境有更强的抵抗能力，综合提高机体饵料利用率和成活率，减少残饵，净化粪便，优化和规范集约化养殖模式。

Description

可有效提高水产动物抗病能力的复合制剂及制备方法

技术领域

本发明属于应用生物技术领域，具体涉及一种可有效提高水产动物抗病能力的复合制剂及制备方法。

背景技术

随着集约化养殖模式在行业的不断深入，高密度养殖技术越来越受到水产领域的关注。但是由于放养密度过高、饵料投喂过量、滥用渔药等不规范操作，使得水体中和底泥中的粪便、残饵、残药等有害物质不断累积，各种病毒病、细菌病、寄生虫病在养殖环境中不断滋生。为了预防和治疗水体中各种各样的疾病，很多养殖户选择投放抗生素药物，严重地破坏了自然水体和动物肠道的微生态系统平衡，使水体自净能力和养殖动物抗病能力都大幅度降低。目前，为了更好地提高动物抗病能力，减少抗生素使用，采用了对生物体外加免疫增强剂来提高生物非特异性免疫的手段，但是从外部添加的免疫增强剂在肠道内不易消化吸收，因此水产动物的抗病能力提高有限。

发明内容

本发明为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可有效提高水产动物抗病能力的复合制剂及制备方法。

本发明的技术解决方案是：一种可有效提高水产动物抗病能力的复合制剂，其特征在于各组分及质量配比如下：微生物菌粉55~65，黄芪多糖10~15，酵母细胞壁10~15，植物精油5~10，维生素B6 1~5；所述微生物菌粉是由地顶孢霉菌粉（Acremonium terricola）与丁酸梭菌粉（Clostridium butyricum）按质量比35~50：15~30混合而成，所述酵母细胞壁为含30％β-葡聚糖的面包酵母细胞壁，所述植物精油由桂皮醛、百里香酚、熏衣草精油按质量比2~4：2~4：1~2混合而成；所述复合制剂中地顶孢霉菌粉有效成分≥200mg/g，丁酸梭菌粉活菌数≥5×10⁸CFU/g，所述地顶孢霉菌保藏编号ATCC13215（NBRC30538）并经中国菌种保藏管理中心 CICC鉴定，所述丁酸梭菌保藏编号为CICCNo.M 23847。

一种上述可有效提高水产动物抗病能力的复合制剂的制备方法，其特征在于具体步骤如下：

A 制备微生物菌粉

（1）制备地顶孢霉菌粉

a. 菌种活化

将地顶孢霉菌冻干粉接种至PDA培养基上，25℃培养7天；

b. 种子培养

将活化后的菌种以2％的接种量转接于摇瓶中，25℃恒温摇床振荡培养24~36h得种子培养液，液体培养基组分的质量百分比为：白砂糖1.4％、蚕蛹粉2.3％、酵母粉1.2％、水余量，pH值为6.5；

c. 发酵罐培养

种子培养液以20％的接种量接入50L发酵罐，装量系数为70％，经48~60h通气培养即可放罐，发酵罐培养基组分的质量百分比为：黄豆粉2.8%、白砂糖2.5%、酵母粉1.3%、蚕蛹粉2.5%、MgSO₄ 0.05%、KH₂PO₄ 0.05%、消泡剂0.05%，水余量，用饱和NaOH调pH值为6.5；

d.固体发酵培养

将c步骤得到的发酵菌液以20%（v/m）的接种量接入灭菌后的固体发酵培养基上，固体培养基的组分质量百分比为：玉米粉55%、豆粕32%、麦麸13%；培养条件为：25℃，湿度70％，发酵时间72h；

e. 地顶孢霉培养物的收集

待固体发酵结束后，收集培养物，直接60~80℃烘干至水分＜10％，然后将其粉碎并过40目筛，即为含多糖94mg/g、多肽28mg/g及生物量35mg/g等有效成分的地顶孢霉菌粉。

（2）制备丁酸梭菌菌粉

a .菌种活化

挑取丁酸梭菌冻干粉接入活化培养基，静置厌氧培养；培养基组成：蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏3g，葡萄糖10g，NaCl 5g，NaAc 3g，盐酸半胱氨酸0.5g，CaCO₃ 3g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，37℃培养24h，以2%的接种量转接于新的活化培养基，相同条件下培养48h；

b.种子培养

将菌液以10％的接种量接入10L种子罐，装量系数为70％，种子培养基组成为：蛋白胨5~10g，牛肉浸膏5~10g，酵母浸膏3~10g，葡萄糖5~10g，NaCl 5g，NaAc1~3g，CaCO₃ 1~3g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，37℃静置厌氧培养20h；

c. 发酵罐培养

种子培养液以10％的接种量接入100L发酵罐，装量系数为70％，发酵罐培养基组成为：蛋白胨5~10g，酵母浸膏3~10g，葡萄糖5~15g，淀粉0.5~1g，NaCl 5g，NaAc 1~3g，CaCO₃ 3~10g，水定容至1000mL，pH 7.0，37℃静置厌氧培养24h；

d. 菌体收集

收集发酵液，离心后弃上清，获得湿菌体；将丁酸梭菌湿菌体与干淀粉以质量比1∶0.5~5混合，50℃干燥24h，粉碎机粉碎，过60目筛，调节丁酸梭菌的活菌数≥1×10¹⁰CFU/g，即为丁酸梭菌原菌粉；

B 分别将黄芪多糖、酵母细胞壁、维生素B₆粉碎后过60目筛，之后将黄芪多糖、酵母细胞壁、维生素B₆、地顶孢霉培养物、丁酸梭菌粉及植物精油放入搅拌设备，搅拌均匀即可。

本发明是由地顶孢霉、丁酸梭菌、黄芪多糖、酵母细胞壁、植物精油和维生素B₆混合而成，各组分相互配合能够重整肠道菌群结构、改变肠道产酸菌代谢产物中不饱和脂肪酸比例，抑制肠道病原菌及其他有害物质，修复肠道黏膜，促进营养消化吸收，同时可使机体非特异性免疫增强，抗应激性增强，对外来病毒、病菌、寄生虫及污染环境有更强的抵抗能力，综合提高机体饵料利用率和成活率，减少残饵，净化粪便，优化和规范集约化养殖模式。

具体实施方式

实施例1：

本发明的可有效提高水产动物抗病能力的复合制剂，各组分及质量配比如下：微生物菌粉65，黄芪多糖15，酵母细胞壁15，植物精油10，维生素5；所述微生物菌粉是由地顶孢霉菌粉（Acremonium terricola）与丁酸梭菌粉（Clostridium butyricum）按质量比50：30混合而成，所述酵母细胞壁为含30％β-葡聚糖的面包酵母细胞壁，所述植物精油由桂皮醛、百里香酚、熏衣草精油按质量比2：2：1混合而成；所述复合制剂中地顶孢霉菌粉有效成分≥200mg/g，丁酸梭菌粉活菌数≥5×10⁸CFU/g，所述地顶孢霉菌保藏编号ATCC13215（NBRC30538），并经中国菌种保藏管理中心 CICC鉴定，所述丁酸梭菌保藏编号为CICCNo.M23847。

一种上述可有效提高水产动物抗病能力的复合制剂的制备方法，其特征在于具体步骤如下：

A 制备微生物菌粉

（1）制备地顶孢霉菌粉

a. 菌种活化

将地顶孢霉菌冻干粉（外购）接种至PDA培养基上，25℃培养7天，即待产生大量孢梗束后进行转接；

b. 种子培养

将活化后的菌种以2％的接种量转接于摇瓶中，25℃恒温摇床振荡培养24~36h得种子培养液，液体培养基组分的质量百分比为：白砂糖1.4％、蚕蛹粉2.3％、酵母粉1.2％、水余量，pH值为6.5；

c. 发酵罐培养

种子培养液以20％的接种量接入50L发酵罐，装量系数为70％，经48~60h通气培养，即菌丝大量生长并开始产孢即可放罐，发酵罐培养基组分的质量百分比为：黄豆粉2.8%、白砂糖2.5%、酵母粉1.3%、蚕蛹粉2.5%、MgSO₄ 0.05%、KH₂PO₄ 0.05%、消泡剂0.05%，水余量，用饱和NaOH调pH值为6.5；

d. 固体发酵培养

将c步骤得到的发酵菌液以20%（v/m）的接种量接入灭菌后的固体发酵培养基上，固体培养基的组分质量百分比为：玉米粉55%、豆粕32%、麦麸13%；培养条件为：25℃，湿度70％，发酵时间72h；

e. 地顶孢霉培养物的收集

待固体发酵结束后，收集培养物，直接60~80℃烘干至水分＜10％，然后将其粉碎并过40目筛，即为含多糖94mg/g、多肽28mg/g及生物量35mg/g等有效成分的地顶孢霉菌粉。

（2）制备丁酸梭菌菌粉

a .菌种活化

挑取丁酸梭菌冻干粉（外购）接入活化培养基，静置厌氧培养；培养基组成：蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏3g，葡萄糖10g，NaCl 5g，NaAc 3g，盐酸半胱氨酸0.5g，CaCO₃ 3g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，37℃培养24h，以2%的接种量转接于新的活化培养基，相同条件下培养48h，镜检，90％以上菌体形成芽孢；

b.种子培养

将菌液以10％的接种量接入10L种子罐，装量系数为70％，种子培养基组成为：蛋白胨5~10g，牛肉浸膏5~10g，酵母浸膏3~10g，葡萄糖5~10g，NaCl 5g，NaAc1~3g，CaCO₃ 1~3g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，37℃静置厌氧培养20h；

c. 发酵罐培养

种子培养液以10％的接种量接入100L发酵罐，装量系数为70％，发酵罐培养基组成为：蛋白胨5~10g，酵母浸膏3~10g，葡萄糖5~15g，淀粉0.5~1g，NaCl 5g，NaAc 1~3g，CaCO₃ 3~10g，水定容至1000mL，pH 7.0，37℃静置厌氧培养24h，镜检，90％以上菌体形成芽孢，即放罐结束培养；

d. 菌体收集

收集发酵液，离心后弃上清，获得湿菌体；

将丁酸梭菌湿菌体与干淀粉以质量比1∶0.5~5混合，50℃干燥24h，粉碎机粉碎，过60目筛，调节丁酸梭菌的活菌数≥1×10¹⁰CFU/g，即为丁酸梭菌原菌粉；

B 分别将黄芪多糖、酵母细胞壁、维生素B₆粉碎后过60目筛，之后将黄芪多糖、酵母细胞壁、维生素B₆、地顶孢霉培养物、丁酸梭菌粉及植物精油放入搅拌设备，搅拌均匀即可。

实施例2：

本发明的可有效提高水产动物抗病能力的复合制剂，其特征在于各组分及质量配比如下：微生物菌粉55，黄芪多糖10，酵母细胞壁10，植物精油5，维生素B6 1；所述微生物菌粉是由地顶孢霉菌粉（Acremonium terricola）与丁酸梭菌粉（Clostridium butyricum）按质量比35：15混合而成，所述酵母细胞壁为含30％β-葡聚糖的面包酵母细胞壁，所述植物精油由桂皮醛、百里香酚、熏衣草精油按质量比2：2：1混合而成；所述复合制剂中地顶孢霉菌粉有效成分≥200mg/g，丁酸梭菌粉活菌数≥5×10⁸CFU/g，所述地顶孢霉菌保藏编号ATCC13215（NBRC30538），并经中国菌种保藏管理中心 CICC鉴定，所述丁酸梭菌保藏编号为CICCNo.M23847。

制备方法同实施例1。

实施例3：

本发明的可有效提高水产动物抗病能力的复合制剂，其特征在于各组分及质量配比如下：微生物菌粉60，黄芪多糖12，酵母细胞壁13，植物精油8，维生素B6 3；所述微生物菌粉是由地顶孢霉菌粉（Acremonium terricola）与丁酸梭菌粉（Clostridium butyricum）按质量比40：20混合而成，所述酵母细胞壁为含30％β-葡聚糖的面包酵母细胞壁，所述植物精油由桂皮醛、百里香酚、熏衣草精油按质量比3：3：2混合而成；所述复合制剂中地顶孢霉菌粉有效成分≥200mg/g，丁酸梭菌粉活菌数≥5×10⁸CFU/g，所述地顶孢霉菌保藏编号ATCC13215（NBRC30538），并经中国菌种保藏管理中心 CICC鉴定，所述丁酸梭菌保藏编号为CICCNo.M23847。

制备方法同实施例1。

本发明的复合制剂用于水产饲料添加剂，使用方法如下：添加量为饲料总质量的0.05%～0.3%，可直接添加到水产动物饲料中，或与载体混合制成预混剂；或与其它饲料添加剂或饲料原料混合制成预混料、浓缩料形式饲喂水产动物。

实验例一：

选择规格相近的鲤鱼，随机分为四组：复合组、菌粉组、免疫剂组和空白对照组，于室内水族箱水温20~25℃下饲喂，每组100条，饲喂周期为100天。各组饲喂同样的基础商品饲料。复合组添加0.06％本发明实施例的复合制剂，菌粉组添加0.06％的本发明实施例1中的微生物菌粉，免疫剂组添加黄芪0.025％、酵母细胞壁0.025％、植物精油0.01％，空白对照组只添加基础商品饲料，其他饲养条件相同。记录鱼生长情况及水质状况，见表1。

表1

组别	鱼体增重率（%）	鱼体成活率（%）	饵料系数	鱼体活力	水色
						复合组	80	99	2.21	活跃	清爽
菌粉组	70	95	2.30	较活跃	清爽
						免疫强化剂	65	94	2.52	活跃	浑浊
空白对照组	60	90	2.55	呆滞	浑浊

试验结果表明，添加本发明实施例复合制剂的复合组鱼体增重、成活率等明显高于其他组（菌粉组、免疫强化组及空白对照组），饵料系数显著低于对照组。说明本发明饲料添加剂能促进鲤鱼消化，利于进食，从而促进身体增长。与对照组相比，实验组水质较好，水色稳定，

实验例二：

选择规格相近的银鲫鱼，随机分为四组:复合组、菌粉组、免疫剂组和空白对照组，每组200条，养殖条件同实验例一。各组添加同样的基础商品饲料，复合组添加0.1％本发明实施例1的复合制剂，菌粉组添加0.1％的本发明实施例1中的微生物菌粉，免疫剂组添加黄芪0.045％、酵母细胞壁0.045％、植物精油0.01％，空白对照组只添加基础商品饲料，其他饲养条件相同。记录鱼生长情况、水质状况并对银鲫鱼的品质等做进一步检测分析，结果见表2。

表2

试验结果表明：与对照组比较，复合组银鲫日增重和存活率提有不同程度的提高，肉中粗脂肪含量显著下降，血清中超氧化物歧化酶活性较对照组有很大提高。由此说明，本发明复合制剂能有效促进银鲫的摄食和消化能力，增加存活率，并能显著提高免疫力。

实验例三：

将400条大小均匀、体重相当的虹鳟随机放入4口养殖缸中，每缸100条，4口缸随机分为四组: 复合组、菌粉组、免疫剂组和空白对照组。复合组添加0.1％本发明实施例2复合制剂，菌粉组、免疫剂组和空白对照组同实验例二。详细记录摄食量，水温控制在16~18℃，保持连续充氧。经过35天养殖后，禁食24小时，逐条称重，量体长，结果见表3。

表3

组别	鱼体增重率（%）	鱼体成活率（%）	饵料系数	鱼体活力	水色
						复合组	85	100	1.87	活跃	清爽
菌粉组	72	97	1.89	较活跃	清爽
						免疫强化剂	66	95	2.11	活跃	浑浊
对照组	59	89	2.32	呆滞	浑浊

试验结果表明：复合组中虹鳟的增重和存活率均不同程度的高于对照组，说明发明复合制剂能有效的提高虹鳟的生长性能，且复合组的饵料系数较对照组更低，说明本发明所提供的复合制剂能更好的提高饲料利用率。

实验例四：

按照0.3％和0.1％的配比将本发明实施例2的复合制剂添加到南美白对虾饲料中，饲养期100天。实验结果显示:添加0.3％的复合组比对照组成活率提高了18.9％，饵料系数降低了0.16；添加0.1％饲料添加剂组比对照组成活率提高了13.2％，饵料系数降低了0.12。该试验经方差分析，复合组与对照组差异达显著水平（P＜0.05）实验结果见表4。

表4

组别	虾体增重率（%）	虾体成活率（%）	饵料系数	虾体活力	水色
						0.3％组	81	99.9	2.01	活跃	清爽
0.1%组	76	94.2	2.15	较活跃	清爽
						对照组	68	81.0	2.17	呆滞	浑浊

实验例五

选取某养殖场四个水池，饲养体重大小相当的米鱼，分为四个组: 复合组、菌粉组、免疫剂组和空白对照组。复合组添加0.1％本发明实施例3的复合制剂，菌粉组、免疫剂组和空白对照组同实施例二。四组养殖条件完全相同，试验周期为100天，统计每组中米鱼的存活率、平均重量并记录水质情况，同时对米鱼的品质等进一步检测分析，结果见表5。

表5

组别	鱼体增重率（%）	鱼体成活率（%）	脂肪含量	鱼体活力	水色
						复合组	87	100	14.34	活跃	清爽
菌粉组	71	95	14.44	较活跃	清爽
						免疫强化剂组	66	90	15.56	活跃	浑浊
对照组	51	69	15.79	呆滞	浑浊

试验结果显示：复合组米鱼存活率和平均体重均明显高于对照组，脂肪含量明显低于对照组，复合组在养殖过程中没有出现鱼苗死亡的情况，同时菌剂对于池底清污能力较强，减少换水量，水质比较稳定。而对照池养殖后期鱼苗出现肠胃问题，鱼苗出现大量死亡。从而说明本发明复合制剂有利于米鱼生长，能有效提高成活率，并显著提高抗病能力。

实验例六：

在某养殖场做临场试验，添加本发明实施例3的复合制剂用于治疗虹鳟鱼感染的鳗弧菌病，病鱼表现：鳍部及鳃部充血发红，肌肉组织有弥撒性或点状出血，解剖检验时有黄色粘稠腹水，肠粘膜组织损伤，部分鱼肝脏坏死。鱼池死亡率为5％。将本发明实施例3的复合制以0.3％的添加量添加到鱼基础饲料中，每天投喂3次，连续使用30天，治疗有效率达到70~85％，未出现死鱼现象。

Claims (2)

1.一种可有效提高水产动物抗病能力的复合制剂，其特征在于各组分及质量配比如下：微生物菌粉55~65，黄芪多糖10~15，酵母细胞壁10~15，植物精油5~10，维生素B6 1~5；所述微生物菌粉是由地顶孢霉菌粉（Acremonium terricola）与丁酸梭菌粉（Clostridium butyricum）按质量比35~50：15~30混合而成，所述酵母细胞壁为含30％β-葡聚糖的面包酵母细胞壁，所述植物精油由桂皮醛、百里香酚、熏衣草精油按质量比2~4：2~4：1~2混合而成；所述复合制剂中地顶孢霉菌粉有效成分≥200mg/g，丁酸梭菌粉活菌数≥5×10⁸CFU/g，所述地顶孢霉菌保藏编号ATCC13215（NBRC30538）并经中国菌种保藏管理中心 CICC鉴定，所述丁酸梭菌保藏编号为CICC No.M 23847。

2.一种如权利要求1所述可有效提高水产动物抗病能力的复合制剂的制备方法，其特征在于具体步骤如下：

A 制备微生物菌粉

（1）制备地顶孢霉菌粉

a. 菌种活化

将地顶孢霉菌冻干粉接种至PDA培养基上，25℃培养7天；

b. 种子培养

将活化后的菌种以2％的接种量转接于摇瓶中，25℃恒温摇床振荡培养24~36h得种子培养液，液体培养基组分的质量百分比为：白砂糖1.4％、蚕蛹粉2.3％、酵母粉1.2％、水余量，pH值为6.5；

c. 发酵罐培养

种子培养液以20％的接种量接入50L发酵罐，装量系数为70％，经48~60h通气培养即可放罐，发酵罐培养基组分的质量百分比为：黄豆粉2.8%、白砂糖2.5%、酵母粉1.3%、蚕蛹粉2.5%、MgSO₄ 0.05%、KH₂PO₄ 0.05%、消泡剂0.05%，水余量，用饱和NaOH调pH值为6.5；

d.固体发酵培养

将c步骤得到的发酵菌液以20%（v/m）的接种量接入灭菌后的固体发酵培养基上，固体培养基的组分质量百分比为：玉米粉55%、豆粕32%、麦麸13%；培养条件为：25℃，湿度70％，发酵时间72h；

e. 地顶孢霉培养物的收集

待固体发酵结束后，收集培养物，直接60~80℃烘干至水分＜10％，然后将其粉碎并过40目筛，即为含多糖94mg/g、多肽28mg/g及生物量35mg/g等有效成分的地顶孢霉菌粉；

（2）制备丁酸梭菌菌粉

a .菌种活化

挑取丁酸梭菌冻干粉接入活化培养基，静置厌氧培养；培养基组成：蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏3g，葡萄糖10g，NaCl 5g，NaAc 3g，盐酸半胱氨酸0.5g，CaCO₃ 3g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，37℃培养24h，以2%的接种量转接于新的活化培养基，相同条件下培养48h；

b.种子培养

将菌液以10％的接种量接入10L种子罐，装量系数为70％，种子培养基组成为：蛋白胨5~10g，牛肉浸膏5~10g，酵母浸膏3~10g，葡萄糖5~10g，NaCl 5g，NaAc1~3g，CaCO₃ 1~3g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，37℃静置厌氧培养20h；

c. 发酵罐培养

种子培养液以10％的接种量接入100L发酵罐，装量系数为70％，发酵罐培养基组成为：蛋白胨5~10g，酵母浸膏3~10g，葡萄糖5~15g，淀粉0.5~1g，NaCl 5g，NaAc 1~3g，CaCO₃ 3~10g，水定容至1000mL，pH 7.0，37℃静置厌氧培养24h；

d. 菌体收集

收集发酵液，离心后弃上清，获得湿菌体；将丁酸梭菌湿菌体与干淀粉以质量比1∶0.5~5混合，50℃干燥24h，粉碎机粉碎，过60目筛，调节丁酸梭菌的活菌数≥1×10¹⁰CFU/g，即为丁酸梭菌原菌粉；

B 分别将黄芪多糖、酵母细胞壁、维生素B₆粉碎后过60目筛，之后将黄芪多糖、酵母细胞壁、维生素B₆、地顶孢霉培养物、丁酸梭菌粉及植物精油放入搅拌设备，搅拌均匀即可。