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CN108066816B - 一种聚阴离子改性纤维内仿生矿化材料、制备方法及应用 - Google Patents

一种聚阴离子改性纤维内仿生矿化材料、制备方法及应用 Download PDF

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CN108066816B CN201711241916.6A CN201711241916A CN108066816B CN 108066816 B CN108066816 B CN 108066816B CN 201711241916 A CN201711241916 A CN 201711241916A CN 108066816 B CN108066816 B CN 108066816B
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Abstract

本发明公开了一种聚阴离子改性纤维内仿生矿化材料、制备方法及应用，具体涉及利用具有阴离子特性的高分子量聚电解质——如聚天冬氨酸、聚丙烯酸、聚谷氨酸等模拟生物体非内胶原蛋白诱导生物矿化的功能，在胶原支架材料表面交联高分子量聚阴离子电解质以形成表面带有功能性官能团的改性胶原，并进一步诱导纤维内仿生矿化的构建方法。该方法包括将不同类型的经过聚阴离子表面改性的胶原支架在磷酸钙矿化溶液中进行处理，得到具有纤维内矿化特征的仿生矿化胶原支架材料。本发明通过高分子量聚阴离子电解质对胶原支架材料的表面改性作用诱导纤维内仿生矿化，构建了与天然骨组织结构类似、具有优异的机械性能和生物相容性的新型仿生矿化胶原支架材料。

Description

一种聚阴离子改性纤维内仿生矿化材料、制备方法及应用
技术领域
本发明属于仿生矿化材料及组织工程支架材料领域，涉及一种聚阴离子改性纤维内仿生矿化材料、制备方法及应用。
背景技术
创伤、感染、肿瘤及先天性疾患等常造成不同类型的骨缺损，全世界每年约有220万的病人需要进行骨移植修复，是目前临床上除输血以外应用最广泛的组织移植。自体骨、异体骨仍是目前主要的骨缺损修复材料，然而其来源有限、免疫排斥等缺陷催生了骨再生修复材料研究的不断探索。理想的再生修复材料应该具有和缺损组织完全一致的结构和功能，因此目前骨再生材料领域的研究热点之一就是模拟天然骨组织的成分和结构，构建纤维内仿生矿化胶原支架材料。
天然骨组织的形成是无机矿物质元素在生物体精密控制下，选择性沉积在I型胶原上,从而形成有机/无机分子高度有序排列的过程。而骨组织的仿生矿化，是指采用人工合成的方法，在体外利用非胶原蛋白及其类似物调控生物矿化的过程，使矿物质前体在I型胶原分子内有序排列，形成具有多分级结构的有机无机复合材料的过程。这种人工合成材料表现出与天然骨组织类似的强度和良好的断裂韧性，是高度仿生的骨缺损修复材料。
传统的仿生矿化技术为了模拟自然硬组织的纤维内矿化形式，往往需要在矿化液中添加非胶原蛋白类似物如聚天冬氨酸、聚丙烯酸、聚谷氨酸等高分子量的聚电解质，以稳定矿化液中的矿物质离子，形成具有流动性及纳米尺寸的无定形磷酸钙前体，这是实现羟磷灰石晶体在胶原内沉积的关键因素。但是这些聚电解质有较强的阴离子特性，游离状态下，有一定的毒性；同时，矿化液体内应用时，很快被体液稀释，而难以保证局部聚电解质的有效作用浓度，导致无法发挥诱导纤维内矿化的作用。因此，传统的仿生矿化模式不可避免的存在着生物相容性差、易引起生物体刺激反应、体内应用困难等缺陷。
发明内容
针对现有技术中的缺陷或不足，本发明的目的在于提供一种聚阴离子改性纤维内仿生矿化材料、制备方法及应用，本发明在国际上首次提出通过化学交联的方法直接将非胶原蛋白类似物的功能性官能团加载到胶原支架材料上，而矿化液仅仅提供钙、磷离子来源，利用经过聚阴离子改性后的胶原自身携带有大量羧基的特点，诱导纤维内矿化的形成。
为达到上述目的，本发明采取的技术方案包括：
根据本发明的第一个目的，本发明的一种聚阴离子改性纤维内仿生矿化材料，包括将表面交联有聚阴离子的胶原支架材料在磷酸钙矿化液中进行矿化处理，即得聚阴离子改性纤维内仿生矿化材料。
可选的，所述的聚阴离子选自聚天冬氨酸、聚丙烯酸和聚谷氨酸中的一种，且聚阴离子的分子量大于40kDa。
根据本发明的第二个目的，本发明的一种聚阴离子改性纤维内仿生矿化材料的制备方法，包括在胶原支架材料表面通过共价键合的方法交联聚阴离子，得到表面交联有聚阴离子的胶原支架材料，再将表面交联有聚阴离子的胶原支架材料在磷酸钙矿化液中进行矿化处理，即得聚阴离子改性纤维内仿生矿化材料。
可选的，所述的聚阴离子选自聚天冬氨酸、聚丙烯酸和聚谷氨酸中的一种或一种以上的混合物，且聚阴离子的分子量大于40kDa。
可选的，所述的共价键合的方法中所用的交联剂选自1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、戊二醛、双亚胺酸酯和马来酰亚胺中的一种或一种以上的混合物。
可选的，所述的共价键合的方法中所用的聚电解质溶剂为2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液，2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液的pH＝5.5～7.4。
可选的，所述的磷酸钙矿化液的pH值为7.4。
可选的，包括：
(1)将聚阴离子于聚电解质溶剂中形成浓度为2～10mg/mL的聚电解质溶液，调节聚电解质溶液的pH＝6.0；
(2)将交联剂溶解于上述聚电解质溶液中,常温下静置1～15分钟,以使所述聚阴离子上的羧基在交联剂的作用下形成酯活化,后调节pH＝7.0得到待交联聚电解质溶液；优选的，交联剂选自1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、戊二醛、双亚胺酸酯和马来酰亚胺中的一种，以5～10mg/mL(EDC)和/或5～15mg/mL(NHS)、戊二醛1.0％、双亚胺酸酯2.0％、马来酰亚胺0.1mM的浓度溶解于上述聚电解质溶液中；
(3)将胶原支架材料置于所述待交联聚电解质溶液中，常温下反应1～15分钟以使聚阴离子上的羧基通过共价键结合的方式牢固交联在胶原支架材料的胶原分子上；去除胶原支架材料表面游离的聚阴离子，获得表面交联有聚阴离子的胶原支架材料；
(4)再将表面交联有聚阴离子的胶原支架材料在磷酸钙矿化液中进行矿化处理，即得聚阴离子改性纤维内仿生矿化材料。
根据本发明的第三个目的，本发明的聚阴离子改性纤维内仿生矿化材料作为硬组织缺损修复材料的应用。
或者根据本发明的第三个目的，本发明的聚阴离子改性纤维内仿生矿化材料的制备方法制备得到的材料作为硬组织缺损修复材料的应用。
本发明所形成的纤维内仿生矿化方法相比于传统的矿化方法具有明显的优越性，体现在：
(1)传统方法是要将大分子的聚阴离子溶解于矿化液中，导致体内应用困难，聚阴离子利用率不高，并存在一定的生物毒性，而本发明中通过将聚阴离子共价结合在胶原支架材料上，矿化液仅仅提供钙、磷离子来源，解决了体内应用困难及生物毒性的问题；
(2)由于将大量的聚阴离子官能团直接交联在胶原分子上，极大的提高了聚阴离子的利用效率，从而形成了更加快速、均匀、广泛的纤维内矿化，解决了现有矿化模式矿化周期长、矿化程度受限的问题；
(3)传统仿生矿化中使用的是完全裸露、不经修饰的胶原基质，虽然形成了一定程度的纤维内矿化，但是其矿化过程与机理均与生物矿化迥异：在自然硬组织的矿化过程中，成骨细胞分泌矿化相关的非胶原蛋白—如骨涎蛋白、骨桥蛋白、骨粘连蛋白、牙本质涎磷蛋白、牙本质基质蛋白等，这些非胶原蛋白通过静电吸附、疏水性吸附以及范德华力等作用力选择性的结合在胶原基质上的特定区域,沿着胶原支架材料长轴方向形成周期性排列的连续的成核位点，从而促进羟基磷灰石晶体的成核，并控制它们的取向和生长。本研究通过在I型胶原上交联大量羧基，模拟了生物矿化过程中结合在胶原分子上的非胶原蛋白的功能性片段，从而更高程度地模拟了胶原、非胶原蛋白、矿物质三者之间的相互作用关系，为探索非胶原蛋白调控生物矿化的机制提供了重要线索；
(4)大量存在于纤维内的羟基磷灰石晶体显著增强了胶原支架材料的机械强度，并且具有良好的生物相容性，能够为细胞生长提供更好的内环境。同时纳米羟基磷灰石具有骨传导性及运载基因或各种生物分子的能力，其强吸附性使得材料的可修饰性强，且不同的修饰位点及修饰机理有利于对材料实现多重功能化改性，是理想的骨缺损再生修复材料；
(5)本发明采用胶原支架材料改性的方法，利用共价结合在胶原分子上的大量羧基稳定并引导超饱和磷酸钙矿化液，实现了胶原支架材料内部的有序矿化，模拟了自然骨组织胶原支架材料与矿物质有序排列的纤维内矿化形式，而这种纤维内矿化形式是构成自然骨组织7级分级结构的基础，不仅决定了骨组织在纳米尺度上的力学性能，更对其整体机械和生物学特性起着决定性作用。
附图说明
图1为实施例1构建的聚阴离子改性胶原支架材料矿化后的透射电镜图；其中，图1中的a图表示低倍观察下，未经染色的整个胶原支架材料束呈现高电子密度的状态，胶原支架材料内部充满了无机矿物质晶体；图1中的b图显示高倍观察下，羟基磷灰石晶体沿着胶原支架材料长轴有序排列；
图2为实施例1构建的聚阴离子改性胶原支架仿生矿化处理前后的扫描电镜对比图，其中，图2中的a图为矿化后胶原支架；图2中的b图表示矿化前胶原支架；
图3为通过亚甲蓝吸附实验和2，4，6-三硝基苯磺酸实验分别测定聚阴离子改性前后胶原分子上的羧基与氨基的含量，其中，图3中的a图为通过亚甲蓝吸附实验后测定聚阴离子改性前后胶原分子上的羧基与氨基的含量；图3中的b图为通过2，4，6-三硝基苯磺酸实验后测定聚阴离子改性前后胶原分子上的羧基与氨基的含量；
图4为胶原支架仿生矿化处理后的热重分析图；其中，图4中的a图为实施例1构建的聚阴离子改性胶原支架材料矿化后的热重变化图；图4中的b图为使用传统仿生再矿化方法矿化的胶原支架的热重变化图；图中PAA-聚丙烯酸，CaP-磷酸钙溶液，PAA-CaP-添加了聚丙烯酸的磷酸钙溶液；
图5为实施例1构建的聚阴离子改性胶原支架仿生矿化处理后的X射线衍射图；
图6为使用原子力显微镜分析胶原支架仿生矿化处理前后的机械性能变化；其中，图6中的a图为实施例1构建的聚阴离子改性胶原支架材料矿化后的杨氏模量；图6中的b图为使用传统仿生再矿化方法矿化的胶原支架的杨氏模量；图6中的c图为矿化之前胶原支架的杨氏模量；
图7为实施例1构建的聚阴离子改性胶原支架在改性前后的生物相容性对比；图7中的a图为改性胶原对人骨髓间充质干细胞线粒体琥珀酸脱氢酶活性的影响；图7中的b为改性胶原对人骨髓间充质干细胞凋亡性能的影响；
以下结合说明书附图和具体实施方式对本发明做具体说明。
具体实施方式
针对现有仿生矿化方法存在的缺陷，本研究在国际上首次提出通过化学交联的方法直接将非胶原蛋白类似物的功能性官能团加载到胶原支架材料上，而矿化液仅仅提供钙、磷离子来源，利用经过聚阴离子改性后的胶原自身携带有大量羧基的特点，诱导纤维内矿化的形成。根据经典的仿生矿化理论—抑制剂排斥假说，胶原支架材料自身具有选择渗透性。分子量大于40kDa的粒子会被完全排斥在胶原分子外，分子量小于6kDa的粒子可以自由通过胶原支架材料内的空间，介于二者之间的粒子可以部分进入胶原支架材料内部。本课题组又在大量实验上提出了基于渗透压和电荷双平衡(即Gibbs-donnan平衡)的纤维内仿生矿化新理论：由于高分子量的聚电解质不能渗入胶原支架材料内的空间里，这些聚电解质在纤维外环境中通过吸引异性离子排斥同性离子改变了纤维内、外环境的渗透压和电荷分布，这种渗透压和电荷的不平衡促使具有流体性质的磷酸钙纳米前体大量渗透进入纤维内，随着磷酸钙纳米前体在纤维内的有序沉积并发生一系列的相转换，最终形成了纤维内矿化。
基于上述理论基础，本研究选用分子量大于40kDa的长链聚电解质并将其交联到胶原表面，利用聚电解质在胶原支架材料内、外环境形成的渗透压差和电荷差诱导纤维内矿化。
综上所述，我们用仿生合成的方法，通过对I型胶原进行聚阴离子改性，实现了羟基磷灰石在改性I型胶原支架材料内的有序沉积，恢复了自然矿化单位中胶原分子与矿物质从微观水平到介观水平再到宏观水平分级有序的结合形式。其中羟基磷灰石是广泛存在于人体内硬组织的无机矿物质成分，因此与人体组织具有良好的生物相容性；I型胶原蛋白是脊椎动物骨、牙等硬组织中的主要有机基质，具有来源广泛、合成简单、生物相容性好、韧性较强等特点；而加载在胶原分子表面的聚天冬氨酸、聚丙烯酸等聚阴离子的功能性官能团可以发挥模拟非胶原蛋白调控生物矿化的作用，稳定并引导纳米级的磷酸钙无定形液相前体渗透进入I型胶原支架材料内，实现羟磷灰石晶体在胶原内的沉积。这种矿化方式一方面省去了在矿化液中添加非胶原蛋白类似物的步骤，避免了大分子聚电解质可能引起的生物体刺激反应及生物不相容的问题；另一方面由于直接将聚阴离子电解质的功能性基团交联在胶原分子上，从而更高效率地利用其模拟非胶原蛋白诱导纤维内矿化的功能，极大地提高了矿化速度，形成了具有优良机械性能和生物相容性的新型硬组织修复材料。
如何用仿生合成的方法，实现I型胶原支架材料内的快速有效矿化，恢复自然矿化单位中胶原分子与矿物质从微观水平到介观水平再到宏观水平分级有序的结合形式，使材料具有优异的物理、化学及生物学性能，是硬组织修复领域的研究热点和难点，国际上针对该问题也形成了一系列的矿化方案和机制分析。研究表明，在人体矿化组织中，除了胶原支架材料和羟基磷灰石以外，还存在大量酸性非胶原蛋白，如骨桥蛋白、骨涎蛋白、骨粘连蛋白、牙本质涎磷蛋白、牙本质基质蛋白等。硬组织的矿化主要受这些非胶原蛋白的调控。非胶原蛋白通过静电吸附、疏水性吸附以及范德华力等作用力结合在胶原的间隙区，进而通过其一级结构中大量的羧基和磷酸化丝氨酸中的磷酸根捕获大量的钙离子，同时通过锚定分子及提供大量的成核位点等作用，促使羟基磷灰石晶体的成核，并控制着磷灰石晶体的尺度和迭序。虽然有实验致力于这些蛋白大分子的提纯、功能验证及仿生应用，但是该方法费时费力，限制了其应用。因此大量研究转而使用能够模拟这些蛋白功能结构域的拟生态类似物——如同样富含羧基的聚天冬氨酸、聚丙烯酸等高分子电解质来促进胶原的仿生矿化。在传统的仿生矿化策略中，通常以裸露的、未经修饰的I型胶原支架材料为有机模板，在超饱和矿化液中添加非胶原蛋白类似物作为钙磷成核抑制剂，稳定钙磷离子形成无定形磷酸钙前体从而促进其对胶原支架材料的渗透、沉积。这种方式虽然实现了一定程度的纤维内矿化，但是存在着不可避免的缺陷：第一，传统仿生矿化使用的有机模板与生物体内经过非胶原蛋白分子表面修饰的胶原基质迥然不同，这就为探索胶原、非胶原蛋白、羟基磷灰石之间的空间关系及相互作用关系造成了困难，进而影响生物矿化机制的揭示。第二，这些聚电解质富含羧酸，具有很强的阴离子特性，并有一定的毒性，体内应用需要考虑生物相容性问题。第三，相比非胶原蛋白分子选择性的结合在胶原分子上的特定区域，将聚电解质溶解于矿化液中极大的降低了其利用效率，导致矿化周期过长、矿化程度有限等问题。
针对传统仿生矿化仿生的上述缺陷，结合生物矿化过程中的非胶原蛋白富含谷氨酸、天冬氨酸和磷酸化的丝氨酸，而表现出强的阴离子特性。因此本发明选用高分子量的长链聚阴离子电解质作为非胶原蛋白类似物。首先将聚阴离子电解质通过共价结合的方法交联到胶原分子表面，根据经典的抑制剂排斥假说和Gibbs-donnan平衡理论，高分子量的聚电解质由于分子量过大而被排斥在胶原分子外部，同时其强阴离子的特性会形成纤维内、外环境的渗透压和电荷分布的不平衡，进而促使具有流体性质的磷酸钙纳米前体大量渗透进入纤维内，随着磷酸钙纳米前体在纤维内的有序沉积并发生一系列的相转换，最终形成了纤维内矿化。
本发明在国际上首次利用经过高分子量聚阴离子表面改性的胶原进行纤维内矿化，与传统仿生矿化方法相比，这种矿化模式更高程度地模拟了天然硬组织的矿化过程，因此对于生物矿化的机制研究具有重要的意义。此外，与既往研究在矿化液中引入聚阴离子电解质相比，将其功能性官能团直接共价交联在胶原表面不仅解决了聚电解质的生物毒性及体内应用困难等问题，更极大的提高了非胶原蛋白类似物的利用效率，成功实现了更快速度、更高程度的纤维内矿化，为解决当前仿生矿化研究存在的矿化周期长、矿化深度有限等难题提供了有效的解决路径。
综上所述，本发明通过高度模拟生物矿化过程合成了矿化速度快、免疫原性低、机械强度好、生物相容性高的有机/无机复合材料，具有传统仿生矿化方法不可比拟的优越性，从而为骨组织、牙体组织等硬组织缺损的修复提供了更好的解决方案。胶原支架材料包括胶原海绵或是完全脱矿的骨胶原、完全脱矿的牙本质胶原、鼠尾胶原、完全脱矿的鱼鳞胶原。
以下是发明人提供的具体实施例，以对本发明的技术方案作进一步解释说明。
实施例1：
(1)将高分子量阴离子电解质聚丙烯酸(分子量450kDa)溶解于2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液中，形成浓度为10mg/mL的聚电解质溶液，用低浓度的NaOH溶液将聚电解质溶液的PH值调至6。
(2)将1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)以10mg/mL的浓度溶解于上述聚电解质溶液。
(3)将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以15mg/mL的浓度溶解于上述聚电解质溶液。
(4)常温下静置15分钟以使上述长链聚电解质上的羧基在EDC和NHS的作用下形成酯活化。
(5)用低浓度的NaOH溶液将上述聚电解质溶液的PH值调至7.0。
(6)将胶原海绵或是完全脱矿的骨胶原基质置于上述聚电解质溶液中，常温下反应15分钟以使大量羧基通过共价键结合的方式牢固交联在胶原分子上。
(7)将胶原支架材料从聚电解质溶液中取出，去离子水反复冲洗，每次10分钟，重复6次。再置于震荡器上震荡20分钟，以彻底去除材料表面游离的聚电解质分子，获得聚阴离子改性的胶原支架材料。
(8)分别将CaCl2和K2HPO4·3H2O溶于10mM HEPES缓冲液，得到浓度为9mM的CaCl2溶液和浓度为4.2mM的K2HPO4·3H2O溶液，再将二者等体积混合，制得磷酸钙溶液；
(9)将上述聚阴离子改性胶原支架置于磷酸钙溶液中进行矿化处理，每天更换新鲜的磷酸钙矿化液。3-7天后将材料取出，蒸馏水反复冲洗后，置于37℃恒温箱中干燥24小时，最终制得胶原支架材料内仿生矿化材料。
按照实施例1所述，本发明所构建新型仿生钙化胶原支架材料具有以下特点：
如图1所示，透射电镜检测结果表明，实施例1构建的聚阴离子改性胶原诱导的纤维内仿生矿化胶原支架材料呈现高电子密度的状态，羟基磷灰石晶体在胶原支架材料内部沿着纤维长轴有序排列，胶原支架材料内部实现了完全矿化。
如图2所示，扫描电镜结果显示，与矿化处理之前的胶原海绵(图2中的b图)相比，聚阴离子改性的胶原海绵(图2中的a图)在矿化后出现体积膨胀，同时胶原支架材料特有的周期性横纹结构消失，提示纤维内、外的空间均被无机矿物质占据，导致纤维体积增大、特征性的横纹结构被覆盖。
如图3所示，聚阴离子改性之后的胶原分子上羧基含量显著升高(图3中的a图)，而氨基含量显著下降(图3中的b图)。
如图4所示，热重分析对比显示，聚阴离子改性胶原支架(图4中的a图)矿化处理后其矿物质含量达到77.03％，高于使用传统仿生矿化方法矿化的未经改性的胶原支架(66.07％，图4中的b图)。
如图5所示，广角X射线衍射检测发现聚阴离子改性的胶原支架材料矿化后出现了矿物质晶体的衍射峰，在衍射角(2θ)＝25.86°、31.5°、32.2°、32.8°、34.0°、39.5°、46.6°处出现的002、211、112、300、202、310、222特征性衍射峰表明纤维内矿物质的主要形式为羟基磷灰石(Ca5(PO4)3(OH))。
如图6所示，通过原子力显微镜分析胶原支架材料仿生矿化处理前后的机械性能变化。聚阴离子改性的胶原支架材料矿化后其横轴和纵轴的杨氏模量分别为16.09GPa和17.4GPa(图6中的a图)，远高于矿化之前的胶原支架材料(图6中的c图，横轴杨氏模量：2.85GPa；纵轴杨氏模量：3.90GPa)。与传统仿生再矿化方法所矿化的未经改性的胶原支架材料相比(图6中的b图，横轴杨氏模量：14.22GPa；纵轴杨氏模量：16.43GPa)，机械性能也有所增高，差异有统计学意义。
如图7所示，分别使用MTT比色法(图7中的a图)和流式细胞技术(图7中的b图)对比胶原支架在聚阴离子改性前后的生物相容性。MTT比色法结果显示，当人骨髓间充质干细胞分别暴露于未经改性的胶原支架(左)和聚阴离子改性的胶原支架(右)之后，细胞的琥珀酸脱氢酶活性无显著差异；流式细胞分析结果进一步表明，两组的细胞存活率无统计学差异。上述结果证明，在胶原支架材料上交联聚阴离子电解质之后，材料仍然具有良好的生物相容性。
实施例2：
该实施例与实施例1不同之处在于：
(1)将高分子量聚天冬氨酸(180kDa)溶解于2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液中，形成浓度为5mg/mL的聚电解质溶液，用低浓度的NaOH溶液将聚电解质溶液的PH值调至6.0。
(2)将胶原海绵置于聚天冬氨酸电解质溶液中，常温下反应2分钟以使大量羧基通过共价键结合的方式牢固交联在胶原分子上，取出胶原海绵，去离子水反复冲洗，每次10分钟，重复6次。再置于震荡器上震荡20分钟，以彻底去除材料表面游离的聚电解质分子，获得聚阴离子改性的胶原支架材料。
实施例3：
该实施例与实施例1不同之处在于：
(1)将高分子量聚谷氨酸(分子量700kDa)溶解于2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液中，形成浓度为7mg/mL的聚电解质溶液，用低浓度的NaOH溶液将聚电解质溶液的PH值调至6.0。
(2)将胶原海绵置于聚天冬氨酸电解质溶液中，常温下反应10分钟以使大量羧基通过共价键结合的方式牢固交联在胶原分子上，取出胶原海绵，去离子水反复冲洗，每次10分钟，重复6次。再置于震荡器上震荡20分钟，以彻底去除材料表面游离的聚电解质分子，获得聚阴离子改性的胶原支架材料。
实施例4：
该实施例与实施例1不同之处在于：
(1)将高分子量聚阴离子电解质聚丙烯酸(分子量450kDa)溶解于2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液中，形成浓度为5mg/mL的聚电解质溶液，用低浓度的NaOH溶液将聚电解质溶液的PH值调至6.0。
(2)将完全脱矿的骨胶原基质置于聚丙烯酸电解质溶液中，常温下反应10分钟以使大量羧基通过共价键结合的方式牢固交联在胶原分子上，去离子水反复冲洗，获得聚阴离子改性的骨胶原支架材料。
实施例5：
该实施例与实施例1不同之处在于：
(1)将高分子量聚阴离子电解质聚丙烯酸(分子量450kDa)溶解于2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液中，形成浓度为5mg/mL的聚电解质溶液，用低浓度的NaOH溶液将聚电解质溶液的PH值调至6.0。
(2)将完全脱矿的牙本质胶原置于聚丙烯酸电解质溶液中，常温下反应2分钟以使大量羧基通过共价键结合的方式牢固交联在胶原分子上，去离子水反复冲洗，获得聚阴离子改性的牙本质胶原支架材料。
实施例6：
该实施例与实施例1不同之处在于：
(1)将高分子量聚阴离子电解质聚丙烯酸(分子量450kDa)溶解于2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液中，形成浓度为5mg/mL的聚电解质溶液，用低浓度的NaOH溶液将聚电解质溶液的PH值调至6.0。
(2)将鼠尾胶原置于聚丙烯酸电解质溶液中，常温下反应2分钟以使大量羧基通过共价键结合的方式牢固交联在胶原分子上，去离子水反复冲洗，获得聚阴离子改性鼠尾胶原支架材料。
实施例7：
该实施例与实施例1不同之处在于：
(1)将高分子量聚阴离子电解质聚丙烯酸(分子量450kDa)溶解于2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液中，形成浓度为10mg/mL的聚电解质溶液，用低浓度的NaOH溶液将聚电解质溶液的PH值调至6.0。
(2)将完全脱矿的鱼鳞胶原置于聚丙烯酸电解质溶液中，常温下反应15分钟以使大量羧基通过共价键结合的方式牢固交联在胶原分子上，去离子水反复冲洗，获得聚阴离子改性鱼鳞胶原支架材料。
实施例8：
该实施例与实施例1不同之处在于：
(1)将高分子量阴离子电解质聚丙烯酸(分子量450kDa)溶解于2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液中，形成浓度为5mg/mL的聚电解质溶液，用低浓度的NaOH溶液将聚电解质溶液的PH值调至6。
(2)将戊二醛以1.0％的浓度加入上述聚电解质溶液。
(4)常温下静置1分钟以使上述长链聚电解质上的羧基在戊二醛交联剂的作用下形成酯活化。
(6)将胶原海绵或完全脱矿的骨胶原基质置于上述聚电解质溶液中，常温下反应10分钟以使大量羧基通过共价键结合的方式牢固交联在胶原分子上。
实施例9：
该实施例与实施例1不同之处在于：
(1)将高分子量阴离子电解质聚丙烯酸(分子量450kDa)溶解于2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液中，形成浓度为10mg/mL的聚电解质溶液，用低浓度的NaOH溶液将聚电解质溶液的PH值调至6.0。
(2)将双亚胺酸酯以2.0％的浓度加入上述聚电解质溶液。
(4)常温下静置5分钟以使上述长链聚电解质上的羧基在双亚胺酸酯交联剂的作用下形成酯活化。
(6)将胶原海绵或是完全脱矿的骨胶原基质置于上述聚电解质溶液中，常温下反应10分钟以使大量羧基通过共价键结合的方式牢固交联在胶原分子上。
实施例10：
该实施例与实施例1不同之处在于：
(1)将高分子量阴离子电解质聚丙烯酸(分子量450kDa)溶解于三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液中，形成浓度为10mg/mL的聚电解质溶液，用低浓度的NaOH溶液将聚电解质溶液的PH值调至6.0。
(2)将1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)以10mg/mL的浓度溶解于上述聚电解质溶液。
(3)将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以15mg/mL的浓度溶解于上述聚电解质溶液。
(4)常温下静置15分钟以使上述长链聚电解质上的羧基在EDC和NHS的作用下形成酯活化。
(5)用低浓度的NaOH溶液将上述聚电解质溶液的PH值调至7.0。
(6)将胶原海绵或是完全脱矿的骨胶原基质置于上述聚电解质溶液中，常温下反应15分钟以使大量羧基通过共价键结合的方式牢固交联在胶原分子上。
以上实施例2～10最终得到的矿化材料的实验效果与实施例1中制备得到的矿化材料的实验效果无明显区别，说明本发明限定的制备方法得到的矿化材料效果稳定，可以应用到硬组织缺损修复，包括胶原海绵或是完全脱矿的骨胶原、完全脱矿的牙本质胶原、鼠尾胶原、完全脱矿的鱼鳞胶原等。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施方式仅限于此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定专利保护范围。

Claims (3)

1.一种聚阴离子改性纤维内仿生矿化材料的制备方法，其特征在于，包括在胶原支架材料表面通过共价键合的方法交联聚阴离子，得到表面交联有聚阴离子的胶原支架材料，再将表面交联有聚阴离子的胶原支架材料在磷酸钙矿化液中进行矿化处理，即得聚阴离子改性纤维内仿生矿化材料；
所述的聚阴离子选自聚天冬氨酸、聚丙烯酸和聚谷氨酸中的一种或一种以上的混合物，且聚阴离子的分子量大于40kDa；
所述的共价键合的方法包括：将聚阴离子于聚电解质溶剂中形成聚电解质溶液，交联剂溶解于聚电解质溶液中得到待交联聚电解质溶液，胶原支架材料置于所述待交联聚电解质溶液中获得表面交联有聚阴离子的胶原支架材料；
所述的共价键合的方法中所用的交联剂选自1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、戊二醛、双亚胺酸酯和马来酰亚胺中的一种或一种以上的混合物；
所述的共价键合的方法中所用的聚电解质溶剂为2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液，2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液的pH＝5.5～7.4；
所述的磷酸钙矿化液的pH值为7.4。
2.如权利要求1所述的聚阴离子改性纤维内仿生矿化材料的制备方法，其特征在于，包括：
(1)将聚阴离子于聚电解质溶剂中形成浓度为2～10mg/mL的聚电解质溶液，调节聚电解质溶液的pH＝6.0；
(2)将交联剂溶解于上述聚电解质溶液中,常温下静置1～15分钟,以使所述聚阴离子上的羧基在交联剂的作用下形成酯活化,后调节pH＝7.0得到待交联聚电解质溶液；
(3)将胶原支架材料置于所述待交联聚电解质溶液中，常温下反应1～15分钟以使聚阴离子上的羧基通过共价键结合的方式牢固交联在胶原支架材料的胶原分子上；去除胶原支架材料表面游离的聚阴离子，获得表面交联有聚阴离子的胶原支架材料；
(4)再将表面交联有聚阴离子的胶原支架材料在磷酸钙矿化液中进行矿化处理，即得聚阴离子改性纤维内仿生矿化材料。
3.权利要求1-2任一权利要求所述的聚阴离子改性纤维内仿生矿化材料的制备方法制备得到的材料在制备硬组织缺损修复材料中的应用。
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