CN108059684A - 一种牛病毒性腹泻重组蛋白、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牛病毒性腹泻重组蛋白，包括牛病毒性腹泻抗原和牛病毒性腹泻单链抗体：牛病毒性腹泻抗原为含有主要抗原决定簇的E2抗原；牛病毒性腹泻单链抗体为scFv。本发明还公开了该牛病毒性腹泻重组蛋白的制备方法及应用。本发明制备了结合牛病毒性腹泻抗体和抗原的高活性、高灵敏度和高特异性的重组蛋白，避免原料间的交叉反应同时减少了生产成本的投入。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种牛病毒性腹泻重组蛋白、其制备方法及应用。
背景技术
牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)是由病毒引起的传染病,各种年龄的牛都易感染、以幼龄牛易感性最高。传染来源主要是病畜。本病呈全球性分布,各养牛业发达国家均有流行,如该病已成为美国牛场中主要传染病之一。我国从进口牛当中也发现有较高的血清阳性率,并多次分离到病毒,所以认为BVDV是牛的具有重大经济意义的疾病之一,也是进口检疫中应重点防范的疾病之一。
体外诊断核心原料的开发是开发相应诊断试剂的前提,只有开发出具有高活性、高性能的抗原抗体,体外诊断试剂产品才能成为现实。因此,针对牛病毒性腹泻抗体和抗原开发出能够用以生产诊断试剂的原料迫在眉睫,从某种程度上说,原料的开发也必将成为降低牛病毒性腹泻病蔓延的首要解决问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种牛病毒性腹泻重组蛋白、其制备方法及应用，制备了结合牛病毒性腹泻抗体和抗原的高活性、高灵敏度和高特异性的重组蛋白，避免了原料间的交叉反应同时减少了生产成本的投入。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种牛病毒性腹泻重组蛋白，其特征在于，包括牛病毒性腹泻抗原和牛病毒性腹泻单链抗体：
所述牛病毒性腹泻抗原为含有主要抗原决定簇的E2抗原；
所述牛病毒性腹泻单链抗体为scFv。
一种牛病毒性腹泻重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)查找牛病毒性腹泻中含有主要抗原决定簇的E2抗原；
(2)优化牛病毒性腹泻E2抗原基因的密码子，合成核酸序列并进行表达；
(3)构建针对牛病毒性腹泻E2抗原的单链抗体，调取单链抗体scFv的基因；
(4)重组优化的牛病毒性腹泻E2抗原基因和针对牛病毒性腹泻E2抗原的单链抗体scFv的基因，并进行表达；
(5)纯化及复性牛病毒性腹泻重组蛋白。
进一步的，所述步骤(3)具体包括以下内容：
(31)单克隆抗体细胞株的获得；
(32)细胞RNA的提取；
(33)以逆转录cDNA为模板，用RT-PCR扩增重链轻链基因。
进一步的，所述步骤(4)具体包括以下内容：
(41)通过递归PCR将有牛病毒性腹泻E2抗原基因和针对牛病毒性腹泻 E2抗原的单链抗体基因连接在一起，用NdeI和XhoI限制性内切酶进行双酶切之后,插入到用相同两个酶切处理的pET30a载体中；
(42)将上述重组蛋白基因的表达载体转化至大肠杆菌BL21中，涂布于含100ug/ml硫酸卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养,挑取单克隆菌落，用含有相同浓度的硫酸卡那霉素的300mlLB培养基37℃培养至OD600达0.6后进行诱导表达；诱导之后,将培养液4℃5000rpm离心20min收集菌体。
进一步的，所述步骤(2)和步骤(4)在大肠杆菌系统中表达。
进一步的，所述步骤(2)和步骤(4)表达时的诱导温度为20℃、25℃、 28℃或37℃，诱导转速为250rpm，诱导的IPTG浓度为0.1mM。
进一步的，所述诱导温度为37℃。
进一步的，所述步骤(5)的纯化方式选自离子交换层析、凝胶过滤层析或亲和层析。
进一步的，所述步骤(5)的纯化方式为亲和层析。
一种牛病毒性腹泻重组蛋白的应用，其特征在于，所述重组蛋白用于制备牛病毒性腹泻检测试剂盒。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)首次开发针对牛病毒性腹泻主要抗原E2的单链抗体scFv。
本发明在开发单克隆抗体的基础上又进行重组抗体技术开发单链抗体, 单链抗体具有以下优点：1)具有完整的抗原结合位点,不含抗体恒定区；2)分子量小,减少了抗体的非特异性结合,降低了诊断产品的假阳性风险；3)结构简单,易于基因工程改造；4)易于在细胞中表达,可以在真核或者原核细胞中表达,可大量生产,成本较低。
(2)国内外首次开发牛病毒性腹泻主要抗原表位及针对E2抗原的scFv 重组蛋白。
由于感染牛病毒性腹泻初期不产生抗体,致使在此段时间我们检测不到相应的牛病毒性腹泻抗体,从而导致漏检,为了解决此问题必须在检测牛病毒性腹泻抗体的同时增加对抗原的检测,开发针对牛病毒性腹泻E2抗原的抗体成为关键。
(3)制备了同时结合牛病毒性腹泻抗体和抗原的高活性、高灵敏度和高特异性的重组蛋白。
在主要抗原表位和针对牛病毒性腹泻E2抗原的抗体开发出后,利用基因工程技术将筛选出的高效抗原表位(牛病毒性腹泻E2抗原的101-374aa)和针对牛病毒性腹泻E2抗原的单链抗体scFv(23-30aa)重组,制备成具有同时结合牛病毒性腹泻抗体和抗原的高活性、高灵敏度和高特异性的重组蛋白,该重组蛋白具有以下优点：1)在快诊试剂条中只需要使用一种原料即可,这样可以避免多种原料间的交叉反应；2)在原料的生产上,只需要稳定一种原料的生产工艺即可,这样可以减少生产成本的投入,缩短原料生产周期,降低生产批间差；3)节省了开发牛病毒性腹泻诊断试剂的成本。
附图说明
图1为cDNA第一链的合成示意图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例提供一种牛病毒性腹泻重组蛋白，包括牛病毒性腹泻抗原和牛病毒性腹泻单链抗体：
所述牛病毒性腹泻抗原为含有主要抗原决定簇的E2抗原；
所述牛病毒性腹泻单链抗体为scFv。
本实施例提供一种牛病毒性腹泻重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)查找牛病毒性腹泻中含有主要抗原决定簇的E2抗原；
(2)优化牛病毒性腹泻E2抗原基因的密码子，合成核酸序列并进行表达；于本实施例中，其具体内容如下：
从NCBI查找E2抗原基因GenBank：EU159703.1，其101-374aa蛋白质序列如下：
FGLCPCDAKPLVRGKFNTTLLNGPAFQMVCPIGWTGTVSCALANKDTLALTVVRTYTRHKPFPYRQGCITQKTIGEDLYNCDLGGNWTCIPGDQLRYVDGPVESCKWCGYNFYKSEGLPHFPIGKCKLKNESGYRQVDETSCNRDGVAIVLHGRVKCKIGDTVVQVIAMDDRLGPMPCIPHEIIPSEGPVEKTACTFNYTKTLKNKYYEPRDNYFQQYMLKGEYQYWFDLEVTDHHKDYFAESLLVIVVALLGGRYVLWLLVTYMIISEQTTLG
经过密码子优化后序列如下：
TTTGGCCTGTGCCCGTGCGATGCGAAACCGCTGGTGCGCGGCAAATTTAACACCACCCTGCTGAACGGCCCGGCGTTTCAGATGGTGTGCCCGATTGGCTGGACCGGCACCGTGAGCTGCGCGCTGGCGAACAAAGATACCCTGGCGCTGACCGTGGTGCGCACCTATACCCGCCATAAACCGTTTCCGTATCGCCAGGGCTGCATTACCCAGAAAACCATTGGCGAAGATCTGTATAACTGCGATCTGGGCGGCAACTGGACCTGCATTCCGGGCGATCAGCTGCGCTATGTGGATGGCCCGGTGGAAAGCTGCAAATGGTGCGGCTATAACTTTTATAAAAGCGAAGGCCTGCCGCATTTTCCGATTGGCAAATGCAAACTGAAAAACGAAAGCGGCTATCGCCAGGTGGATGAAACCAGCTGCAACCGCGATGGCGTGGCGATTGTGCTGCATGGCCGCGTGAAATGCAAAATTGGCGATACCGTGGTGCAGGTGATTGCGATGGATGATCGCCTGGGCCCGATGCCGTGCATTCCGCATGAAATTATTCCGAGCGAAGGCCCGGTGGAAAAAACCGCGTGCACCTTTAACTATACCAAAACCCTGAAAAACAAATATTATGAACCGCGCGATAACTATTTTCAGCAGTATATGCTGAAAGGCGAATATCAGTATTGGTTTGATCTGGAAGTGACCGATCATCATAAAGATTATTTTGCGGAAAGCCTGCTGGTGATTGTGGTGGCGCTGCTGGGCGGCCGCTATGTGCTGTGGCTGCTGGTGACCTATATGATTATTAGCGAACAGACCACCCTGGGC
设计引物如下：
P1u：CCCATATGTTTGGCCTGTGCCCGTGCGATGCGAAACCGCTGGTGCGCGGCAAATTTAACACC
P1d：CGGGCACACCATCTGAAACGCCGGGCCGTTCAGCAGGGTGGTGTTAAATTTGCCG
P2u：CAGATGGTGTGCCCGATTGGCTGGACCGGCACCGTGAGCTGCGCGCTGGCGAACA
P2d：GGGTATAGGTGCGCACCACGGTCAGCGCCAGGGTATCTTTGTTCGCCAGCGCGC
P3u：TGCGCACCTATACCCGCCATAAACCGTTTCCGTATCGCCAGGGCTGCATTACCCAGA
P3d：GCCCAGATCGCAGTTATACAGATCTTCGCCAATGGTTTTCTGGGTAATGCAGCCC
P4u：AACTGCGATCTGGGCGGCAACTGGACCTGCATTCCGGGCGATCAGCTGCGCTATGT
P4d：TAGCCGCACCATTTGCAGCTTTCCACCGGGCCATCCACATAGCGCAGCTGATC
P5u：CAAATGGTGCGGCTATAACTTTTATAAAAGCGAAGGCCTGCCGCATTTTCCGATTGGC
P5d：CTGGCGATAGCCGCTTTCGTTTTTCAGTTTGCATTTGCCAATCGGAAAATG
P6u：AGCGGCTATCGCCAGGTGGATGAAACCAGCTGCAACCGCGATGGCGTGGCGATTGTG
P6d：CGGTATCGCCAATTTTGCATTTCACGCGGCCATGCAGCACAATCGCCACGCC
P7u：AAATTGGCGATACCGTGGTGCAGGTGATTGCGATGGATGATCGCCTGGGCCCGATGC
P7d：GGCCTTCGCTCGGAATAATTTCATGCGGAATGCACGGCATCGGGCCCAGGCG
P8u：TTCCGAGCGAAGGCCCGGTGGAAAAAACCGCGTGCACCTTTAACTATACCAAAACCCT
P8d：TGAAAATAGTTATCGCGCGGTTCATAATATTTGTTTTTCAGGGTTTTGGTATAG
P9u：CGATAACTATTTTCAGCAGTATATGCTGAAAGGCGAATATCAGTATTGGTTTGATCT
P9d：AGGCTTTCCGCAAAATAATCTTTATGATGATCGGTCACTTCCAGATCAAACCAATAC
P10u：TTTTGCGGAAAGCCTGCTGGTGATTGTGGTGGCGCTGCTGGGCGGCCGCTATGTGCTG
P10d：
GCCCTCGAGGCCCAGGGTGGTCTGTTCGCTAATAATCATATAGGTCACCAGCAGCCACAGCACATAGCGGCC
实验方法如下：
将引物P1u,P1d,P2u,P2d,P3u,P3d混合,进行PCR反应,所得产物命名为 W1；将引物P4u,P4d,P5u,P5d,P6u,P6d,P7u,P7d混合,进行PCR反应,所得产物命名为W2；将引物P8u,P8d,P9u,P9d,P10u,P10d混合,进行PCR反应,所得产物命名为W3；然后将上述三个产物W1,W2,W3混合做为模板,用引物 P1u,P10d进行PCR反应即得到优化后牛病毒性腹泻的E2基因。上述四个PCR (TOYOBO公司产品,货号：02510D1)反应条件如下：94℃,2分钟X 1个循环；(98℃,15秒,55℃,30秒,68℃,30秒)X30个循环；72℃,7分钟X 1个循环。测序证明序列正确后,将此PCR产物用NdeI和XhoI限制性内切酶(购自NEB 公司)进行双酶切之后,插入到用相同两个酶切处理的pET30a(Novagen产品, 货号69909-3)载体中；步骤(2)在大肠杆菌系统中表达，表达时的诱导温度为20℃、25℃、28℃或37℃，诱导转速为250rpm，诱导的IPTG浓度为0.1mM。优选诱导温度为37℃。
(3)构建针对牛病毒性腹泻E2抗原的单链抗体，调取单链抗体scFv的基因；于本实施例中，其具体内容如下：
(31)单克隆抗体(只针对结合E2抗原蛋白23-30aa的抗体)细胞株的获得
a.将构建成功的pET30a-E2载体转化至BL21表达菌种表达纯化后获得E2抗原蛋白
b.用获得的E2抗原蛋白免疫小鼠
c.用单克隆抗体技术筛选到只针对结合E2抗原蛋白23-30aa的抗体细胞株
(32)细胞RNA的提取
用TRIzol LS(invitrogen产品,货号10296-010)试剂,按照说明书操作步骤提取细胞总RNA。
cDNA第一链的合成请参照图1
(33)以逆转录cDNA为模板，按照以下引物，用RT-PCR扩增重链轻链基因。
mHVu1:GATGTGAAGCTTCAGGAGTC
mHVu2:CAGGTGCAGCTGAAGGAGTC
mHVu3:CAGGTGCAGCTGAAGCAGTC
mHVu4:CAGGTTACTCTGAAAGAGTC
mHVu5:AAGGTCCAGCTGCAACAATC
mHVu6:GAGGTCCAGCTGCAGCAGTC
mHVu7:CAGGTCCAACTGCAGCAGCC
mHVu8:GAGGTGAAGCTGGTGGAGTC
mHVu9:GAGGTGAAGCTGGTGGAATC
mHVu10:GATGTGAACTTGGAAGTGTC
mHVd1:TGCAGAGACAGTGACCAGAGT
mHVd2:TGAGGAGACTGTGAGAGTGGT
mHVd3:TGAGGAGACGGTGACTGAGGT
mHVd4:TGAGGAGACGGTGACCGTGGT
mKVu1:GATGTTTTGATGACCCAAACT
mKVu2:GATATTGTGATGACGCAGGCT
mKVu3:GATATTGTGATAACCCAG
mKVu4:GACATTGTGCTGACCCAATCT
mKVu5:GACATTGTGATGACCCAGTCT
mKVu6:GATATTGTGCTAACTCAGTCT
mKVu7:GATATCCAGATGACACAGACT
mKVu8:GACATCCAGCTGACTCAGTCT
mKVu9:CAAATTGTTCTCACCCAGTCT
mKVd1:CCGTTTCAGCTCCAGCTTG
mKVd2:CCGTTTTATTTCCAGCTTGGT
mKVd3:CCGTTTTATTTCCAACTTTG
用引物mHVu1—mHVu10分别与mHVd1—mHVd4组合；mKVu1—mKVu9分别与 mKVd1—mKVd4组合做PCR反应。
PCR反应体系25μl,其中cDNA 0.5μl,上游引物0.25μl下游引物 0.25μl,Taq酶0.2μl dNTP 2μl 10×buffer 2.5μl。
PCR(TOYOBO公司产品,货号：02510D1),PCR条件为：94℃,2分钟X 1 个循环；(98℃,5秒,55℃,30秒,68℃,25秒)X30个循环；72℃,7分钟X 1 个循环。
经测序验证后确定重链和轻链基因,然后通过递归PCR将重链和轻链基因连接起来,此重组基因为rscFv。
(4)重组优化的牛病毒性腹泻E2抗原基因(101-374aa)和针对牛病毒性腹泻E2抗原的单链抗体scFv的基因(23-30aa)，并进行表达；于本实施例中，其具体内容如下：
(41)通过递归PCR将有牛病毒性腹泻E2抗原基因(101-374aa)和针对牛病毒性腹泻E2抗原的单链抗体基因(23-30aa)连接在一起，用NdeI和XhoI 限制性内切酶(购自NEB公司)进行双酶切之后,插入到用相同两个酶切处理的pET30a(Novagen产品,货号69909-3)载体中；
(42)将上述重组蛋白基因的表达载体转化至大肠杆菌BL21中，涂布于含100ug/ml硫酸卡那霉素(上海生工生物工程服务有限公司,货号：KB0286) 的LB平板上，37℃过夜培养,挑取单克隆菌落，用含有相同浓度的硫酸卡那霉素的300mlLB培养基37℃培养至OD600达0.6左右，用浓度为0.1mM的IPTG (生工,货号：IB0168)进行诱导表达；诱导条件如下，诱导温度为20℃、25℃、 28℃或37℃，诱导转速为250rpm，诱导时间为5h，于本实施例中，优选诱导温度为37℃。诱导之后,将培养液4℃5000rpm离心20min收集菌体。
(5)纯化及复性牛病毒性腹泻重组蛋白；于本实施例中，其具体内容如下：
将菌体用50ml包涵体抽提液(20mM Tris-HCl，0.5MUrea pH 7.5，0.5M NaCl，2％Triton X-100)重悬，然后超声破碎，条件为每次超声3s，间隔 6s，共180次，12000rpm，4℃离心收集包涵体沉淀。用上样缓冲液Binding Buffer(50mM Tris，8M Urea，0.5M Nacl，20mM咪唑pH8.0)50ml破碎包涵体，上柱纯化，纯化方式选自离子交换层析、凝胶过滤层析或亲和层析。于本实施例优选纯化方式为亲和层析；用洗脱缓冲液Elution Buffer(50mMTris，8M Urea，0.5M Nacl，300mM咪唑pH8.0)洗脱目的蛋白。将纯化后的重组蛋白用透析缓冲液(1mM氧化型谷胱甘肽GSSH，2mM还原型谷胱甘肽GSH， 2mMEDTA，20mM Tris，pH8.5)透析，每隔48h换一次透析液。取出透析后的蛋白液，经据乙醇-20000进行浓缩，于-20℃保存备用。
本实施例提供一种牛病毒性腹泻重组蛋白的应用，将重组蛋白制备牛病毒性腹泻检测试剂盒用于牛病毒性腹泻免疫的检测。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
Claims (10)
1.一种牛病毒性腹泻重组蛋白，其特征在于，包括牛病毒性腹泻抗原和牛病毒性腹泻单链抗体：
所述牛病毒性腹泻抗原为含有主要抗原决定簇的E2抗原；
所述牛病毒性腹泻单链抗体为scFv。
2.一种如权利要求1所述的牛病毒性腹泻重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)查找牛病毒性腹泻中含有主要抗原决定簇的E2抗原；
(2)优化牛病毒性腹泻E2抗原基因的密码子，合成核酸序列并进行表达；
(3)构建针对牛病毒性腹泻E2抗原的单链抗体，调取单链抗体scFv的基因；
(4)重组优化的牛病毒性腹泻E2抗原基因和针对牛病毒性腹泻E2抗原的单链抗体scFv的基因，并进行表达；
(5)纯化及复性牛病毒性腹泻重组蛋白。
3.根据权利要求2所述的牛病毒性腹泻重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括以下内容：
(31)单克隆抗体细胞株的获得；
(32)细胞RNA的提取；
(33)以逆转录cDNA为模板，用RT-PCR扩增重链轻链基因。
4.根据权利要求2所述的牛病毒性腹泻重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)具体包括以下内容：
(41)通过递归PCR将有牛病毒性腹泻E2抗原基因和针对牛病毒性腹泻E2抗原的单链抗体基因连接在一起，用NdeI和XhoI限制性内切酶进行双酶切之后,插入到用相同两个酶切处理的pET30a载体中；
(42)将上述重组蛋白基因的表达载体转化至大肠杆菌BL21中，涂布于含100ug/ml硫酸卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养,挑取单克隆菌落，用含有相同浓度的硫酸卡那霉素的300mlLB培养基37℃培养至OD600达0.6后进行诱导表达；诱导之后,将培养液4℃5000rpm离心20min收集菌体。
5.根据权利要求2所述的牛病毒性腹泻重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(4)在大肠杆菌系统中表达。
6.根据权利要求2所述的牛病毒性腹泻重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(4)表达时的诱导温度为20℃、25℃、28℃或37℃，诱导转速为250rpm，诱导的IPTG浓度为0.1mM。
7.根据权利要求6所述的牛病毒性腹泻重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述诱导温度为37℃。
8.根据权利要求2所述的牛病毒性腹泻重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)的纯化方式选自离子交换层析、凝胶过滤层析或亲和层析。
9.根据权利要求8所述的牛病毒性腹泻重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)的纯化方式为亲和层析。
10.一种如权利要求1所述的牛病毒性腹泻重组蛋白的应用，其特征在于，所述重组蛋白用于制备牛病毒性腹泻检测试剂盒。
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