CN108034585B - 一种功能梯度类脑组织体外构建系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种功能梯度类脑组织体外构建系统及方法，包括组织支架成形装置，沿组织支架成形装置的四周设置有灌流系统，灌流系统采用对侧等压灌注的方式向组织支架成形装置内灌流培养液，支架成形装置连接有电磁场刺激装置，电磁场刺激装置用于调控支架成形装置内支架成形后种植的细胞。利用纤维性蛋白在电场下形成分层结构凝胶的特点，制造出具有梯度层状结构的支架，来模拟神经元细胞在大脑皮质内部的基质结构环境，系统可以形成具有梯度层状结构的支架来模拟神经元在大脑皮质内部的的基质结构环境，利用灌流系统，不仅可以为组织提供新鲜的营养物质，带走代谢废物，还可以提供具有梯度浓度分布的生化因子刺激条件。电磁场的存在可以更加真实的模拟大脑所处环境。

Description

一种功能梯度类脑组织体外构建系统及方法

技术领域

本发明属于组织工程与生物制造技术领域，具体涉及一种功能梯度类脑组织体外构建系统及方法。

背景技术

大脑作为中枢神经系统的核心部分，是调节机体功能的器官，同时也是语言、运动、听觉、视觉、情感等高级神经活动的物质基础。

大脑具有复杂的宏观和微观结构，其结构直接影响脑的功能。在宏观结构上，脑分左右两个半球，大脑皮质(灰质)覆盖着每个大脑半球的大部分。大脑皮层的内部组织是由神经纤维或髓鞘构成的白质，外部表面是大量深浅不等的褶皱状沟回结构，使大脑皮质表面积大为增加(人类大脑皮层表面积可达2200cm²)。

在微观结构上，大脑皮质是一个高度褶叠的神经组织板。大脑皮质平均厚约2～3毫米，是神经细胞聚集的部分，按照细胞排列次序、种类和大小不同，大体形成六个结构层次，每层厚度从200μm到1000μm不等，并且不同功能区域六层结构的厚度也有所不同，神经细胞在垂直方向聚合形成圆柱形的细胞柱排列，构成了大脑皮层最基本的机能单位并组合成一个个“块状”的功能联合体。

大脑皮质的分层结构已经被确定，但关于这种分层结构是如何形成的研究十分缺乏。传统的研究主要基于微流道的方法，将神经元细胞和星形胶质细胞分别在两个培养小室中培养，中间通过微通道相连，在二维层面上研究神经元细胞和星形胶质细胞的相互作用，但这种方式不能很好的模拟神经元在大脑皮层内部的微环境，无法提供神经元分层发生所必要的刺激环境(如生化因子、梯度基质结构以及电磁场环境等)，不能很好的研究分层结构的形成机理。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种功能梯度类脑组织体外构建系统及方法，该系统将支架形成与灌流培养相结合，制造出了具有梯度层状结构的支架，为在体外构建功能梯度类脑组织提供了如梯度浓度的生化因子、电磁场等多种刺激环境。

本发明采用以下技术方案：

一种功能梯度类脑组织体外构建系统，包括组织支架成形装置，沿组织支架成形装置的四周设置有灌流系统，灌流系统采用对侧等压灌注的方式向组织支架成形装置内灌流培养液，支架成形装置连接有电磁场刺激装置，电磁场刺激装置用于调控支架成形装置内支架成形后种植的细胞。

具体的，灌流系统包括分别设置在组织支架成形装置四周的第一注射泵、第一废液池、第二注射泵和第二废液池，第一注射泵和第二注射泵相对设置，第一废液池和第二废液池相对设置。

进一步的，第一注射泵通过第一进口通道与组织支架成形装置连接，第一废液池通过第一出口通道与组织支架成形装置连接，第二注射泵通过第二进口通道与组织支架成形装置连接，第二废液池通过第二出口通道与组织支架成形装置连接，第一注射泵连接有用于控制注射泵压力的第一注射泵控制器，第二注射泵连接有用于控制注射泵压力的第二注射泵控制器。

具体的，组织支架成形装置由聚二甲基硅氧烷材料制成，包括上层和下层，在上层和下层的内部中心设置有支架成形区，灌流系统与支架成形区连接，在上层内设置有与支架成形区连接的样品入口通道，样品入口通道用于添加纤维性蛋白溶液。

进一步的，电磁场刺激装置包括脉冲信号产生装置和磁场产生装置，脉冲信号产生装置用于产生电场，磁场产生装置用于产生磁场，电场和磁场在组织支架成形装置内相互垂直设置，磁场与样品入口通道的方向相同。

进一步的，在支架成形区内靠近第一出口通道处设置有第一电极，靠近第二出口通道处设置有第二电极，第一电极和第二电极分别通过电线与脉冲信号产生装置内产生直流脉冲的脉冲稳压电源连接。

本发明还公开了一种功能梯度类脑组织体外构建系统的培养方法，包括以下步骤：

S1、分别对灌流系统以及组织支架成形装置的上层和下层进行灭菌处理；

S2、将纤维性蛋白溶液通过样品入口通道注入到支架成形区中，封闭样品入口，调节脉冲稳压电源电压并保持，在电极一端形成凝胶，通过第一出口通道和第二出口通道将纤维性蛋白溶液排出，重复上述过程再次加入纤维性蛋白溶液，通过改变纤维性蛋白溶液的浓度和电场强度在支架成形区形成具有梯度层状结构的支架；

S3、通过第一注射泵控制器和第二注射泵控制器分别控制第一注射泵和第二注射泵向支架成形区内注入磷酸盐缓冲溶液用于对步骤S2的层状梯度支架进行灌流冲洗，然后注入培养液浸泡20～120min；

S4、将提前培养好的细胞通过样品入口通道种植到步骤S3浸泡好的层状梯度支架上，将细胞贴附在支架上；

S5、步骤S4完成后对层状梯度支架进行灌流培养，在灌流培养过程中，分别使用梯度浓度的生化因子、脉冲电信号和磁场对细胞的生长进行调控。

具体的，步骤S2中，纤维性蛋白溶液的质量分数为2～20％，纤维性蛋白溶液的浓度为6～10wt％，脉冲稳压电源的电压值为10～100V，调节精度为0.1V，保持时间为10～60min。

具体的，步骤S3中，在室温20～25℃，用PBS溶液灌流冲洗成形的支架10～30min，第一注射泵控制器和第二注射泵控制器的注入流量为20～200ul/min，然后注入培养液浸泡时间20～120min。

具体的，步骤S5中，在支架成形区一侧灌注的培养液中加入1～10ug/ml的生化因子，当两侧灌注压力相同时，在培养区域形成一个稳定的生化因子浓度梯度；

使用脉冲信号电压为500μV～100mV的脉冲电信号对细胞的生长进行调控；

使用磁场强度为5～100mT的磁场对细胞的生长进行调控；

细胞包括神经元细胞、类神经元细胞或胶质细胞。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

本发明一种功能梯度类脑组织体外构建系统包括组织支架成形装置以及设置在包括组织支架成形装置四周的灌流培养，将组织支架的成形过程与灌流培养相结合，灌流系统采用对侧等压灌注的方式向组织支架成形装置内灌流培养液，通过电磁场刺激装置调控支架成形装置内支架成形后种植的神经元细胞，利用纤维性蛋白在电场下形成分层结构凝胶的特点，制造出具有梯度层状结构的支架，来模拟神经元细胞在大脑皮质内部的基质结构环境，系统可以形成具有梯度层状结构的支架来模拟神经元在大脑皮质内部的的基质结构环境，利用灌流系统，不仅可以为组织提供新鲜的营养物质，带走代谢废物，还可以提供具有梯度浓度分布的生化因子刺激条件。电磁场的存在可以更加真实的模拟大脑所处环境。

进一步的，灌流系统的第一注射泵和第二注射泵相对设置，第一废液池和第二废液池相对设置，第一注射泵和第二注射泵分别连接有注射泵控制器，对侧设置可以实现等压对侧灌流，利于在支架成形区域形成生化因子的梯度浓度分布。

进一步的，组织支架成形装置由聚二甲基硅氧烷材料制成，由上层、下层和支架成形区组成，支架成形区连接有用于添加纤维性蛋白溶液的样品入口通道，PDMS具有较好的生物相容性，且易于封装。样品入口通道的存在用于将支架成形原料与灌流培养液分开。

进一步的，脉冲信号产生装置产生的电场与磁场产生装置产生的磁场相互垂直设置，磁场与样品入口通道的方向相同，在电场和磁场同时存在的情况下，相互垂直设置的电场和磁场利于区分电场与磁场分别对细胞生长的影响。

进一步的，支架成形区内的第一电极)和第二电极分别通过电线与脉冲信号产生装置的脉冲稳压电源连接，脉冲脉冲稳压电源的稳压直流端与脉冲输出端可以分别为支架成形提供稳定的电压，也可以为神经元细胞刺激提供脉冲信号。

本发明还公开了一种功能梯度类脑组织体外构建系统的培养方法，先对灌流系统以及组织支架成形装置进行灭菌处理，经过多次将纤维性蛋白溶液通过样品入口通道注入到支架成形区中直至支架成形区凝胶形成支架，然后通过第一注射泵和第二注射泵向支架成形区内注入磷酸盐缓冲溶液冲洗，然后注入培养液浸泡，再将细胞种植到浸泡好的支架上，对支架进行灌流培养，在灌流培养过程中，分别使用梯度浓度的生化因子、脉冲电信号和磁场对细胞的生长进行调控。该培养方法通过控制纤维蛋白溶液浓度和电场强度控制制备的梯度层状结构，可以为构建的组织提供基质环境，具有梯度浓度分布的生化因子可以对细胞的生长进行调控，且提供可调的电磁场环境对细胞的生长进行调控，该培养方法将支架成形与灌流培养相结合，同时可以为构建的类脑组织提供多种刺激环境，相较于其他传统的神经元培养方法更真实的模拟大脑环境。

进一步的，纤维性蛋白溶液的质量分数为2～20％，脉冲稳压电源的电压值为10～100V，调节精度为0.1V，保持时间为10～60min。不同浓度的纤维性蛋白在不同的电场强度所形成的层状结构的间距不同，改变纤维性蛋白的浓度和电场强度可以形成具有梯度层状结构的支架。

进一步的，在室温下(20～25℃)，用5ml的PBS溶液灌流冲洗成形的支架10～30min。然后注入培养液浸泡时间20～120min。采用PBS溶液灌流去除在支架成形过程中剩余的溶液，培养液浸泡可以为神经元细胞的种植提供环境。

进一步的，梯度浓度分布的生化因子，脉冲电信号和磁场可以对细胞的生长进行调控。梯度浓度分布的生化因子的存在可以促进神经元细胞在体外模拟大脑皮质六层结构的发生过程，脉冲电信号可以研究神经元细胞的电生理特点，磁场的存在可以更加真实的模拟大脑所处的空间环境。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为本发明系统结构示意图；

图2为本发明支架成形装置A-A视图。

其中：1.第一废液池；2.第一出口通道；3.第一注射泵控制器；4.第一注射泵；5.第一进口通道；6.电场；7.第二出口通道；8.第二废液池；9.磁场；10.第二进口通道；11.第二注射泵；12.第二注射泵控制器；13.支架成形装置；14.电线；15.脉冲稳压电源；16.样品入口通道；17.上层；18.第一电极；19.下层；20.支架成形区；21.第二电极。

具体实施方式

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“一侧”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

本发明提供了一种功能梯度类脑组织体外构建系统及方法，集支架成形与灌流培养功能为一体，通过模拟大脑皮质的六层结构，在体外构建出具有功能梯度的类脑组织，并通过灌流系统为构建的组织提供营养环境，改变组织支架的成形条件可以控制支架的梯度结构，研究神经元细胞在不同梯度结构上的生长情况。具有浓度梯度分布的生化因子以及电场磁场的刺激可以模拟神经元在大脑内部生长的微环境，可以为在体外构建分层类脑组织提供一种合理的装置。

请参阅图1和图2，本发明一种功能梯度类脑组织体外构建系统，包括组织支架成形装置13、灌流系统和电磁场刺激装置，灌流系统设置在组织支架成形装置13的四周，灌流系统采用相对侧同时灌注的方式对组织支架成形装置13灌流培养液，使培养液均匀分布在组织支架成形装置13的支架成形区20内，将类脑组织体外构建过程与灌流培养相结合，在支架成形装置13内的支架成形之后种植细胞进行灌流培养，电磁场刺激装置与支架成形装置13连接，用于调控细胞的生长。

灌流系统包括：第一注射泵4、第二注射泵11、第一废液池1和第二废液池8。

第一注射泵4和第二注射泵11分别安装在组织支架成形装置13的上下两侧，第一注射泵4的注射器出口通过第一进口通道5与组织支架成形装置13连接，第一注射泵4连接有用于控制注射泵压力的第一注射泵控制器3；第二注射泵11的注射器出口通过第二进口通道10与组织支架成形装置13连接，第二注射泵11连接有用于控制注射泵压力的第二注射泵控制器12。

组织支架成形装置13的左右两侧分别连接有第一出口通道2和第二出口通道7，组织支架成形装置13通过左侧的第一出口通道2将废液通入第一废液池1内，通过右侧的第二出口通道7将废液通入第二废液池8。

组织支架成形装置13由聚二甲基硅氧烷PDMS制成，包括上层17、下层19和支架成形区20，支架成形区20设置在上层17和下层19的内部中心，支架成形区20分别与第一进口通道5、第二进口通道10、第一出口通道2和第二出口通道7连接，上层17内设置有与支架成形区20连接的样品入口通道16，样品入口通道16用于添加纤维性蛋白溶液。

纤维性蛋白溶液包括丝素蛋白溶液和胶原蛋白溶液。

电磁场刺激装置包括脉冲信号产生装置和磁场产生装置，脉冲信号产生装置用于产生电场6，磁场产生装置用于产生磁场9，电场6和磁场9相互垂直设置。

脉冲信号产生装置包括第一电极18、第二电极21和脉冲直流脉冲稳压电源15，第一电极18和第二电极21对应设置在支架成形区20内，第一电极18靠近第一出口通道2处，第二电极21靠近第二出口通道7处，第一电极18和第二电极21分别通过电线14与脉冲直流脉冲稳压电源15的正负极相连，用于产生脉冲电信号。

第一电极18和第二电极21可以产生微脉冲信号实现对神经元生长的调控；通过外部电磁场装置实现对神经元生长的调控，通过改变不同的连接方式，可以分别产生稳定电场来促进支架的形成以及脉冲电信号刺激细胞生长。

一种功能梯度类脑组织体外构建系统的培养方法，包括如下步骤：

S1、对制好的上下层PDMS流道进行灭菌处理，采用等离子键合工艺组装成一体，然后按照如图1所示将系统组装好；将第一电极18和第二电极21分别接入到脉冲稳压直流电源15稳压输出的正负极上；

组织支架成形装置13、第一注射泵4、第二注射泵11、第一出口通道2、第一进口通道5、第二出口通道7和第二进口通道10均需进行灭菌处理，所使用的材料也要进行灭菌处理。

S2、将8～10wt％的纤维性蛋白溶液通过样品入口通道16注入到支架成形区20中，封闭样品入口，调节直流电源电压值为25～35V，10～30min后，通过第一出口通道2和第二出口通道7将剩余的溶液排出，重新加入6～8wt％的纤维性蛋白溶液，重复上述过程，直至支架成形区20全部凝胶形成支架；

支架成形过程在稳定的电场条件下完成，纤维性蛋白溶液中的纤维在稳定的电场下会带负电荷，通过改变电场强度和纤维性蛋白溶液的浓度在电极的正极端聚集形成具有梯度层状结构的水凝胶，即支架。

S3、在室温20～25℃，通过注射泵注入5ml磷酸盐缓冲溶液(PBS)对支架进行灌流冲洗10～30min，然后注入培养液浸泡20～120min；

S4、将提前培养好的细胞通过样品入口通道16种植到步骤S3的支架上，将细胞贴附在支架上；

S5、步骤S4完成后对支架进行灌流培养，在灌流培养过程中，分别使用梯度浓度的生化因子、脉冲电信号和磁场对细胞的生长进行调控。

使用梯度浓度的生化因子刺激条件：在一侧灌注培养液中加入一定浓度的生化因子，当两侧灌注压力相同时，可以在培养区域形成一个稳定的生化因子浓度梯度。

通过对侧等压灌流来实现梯度浓度分布的生化因子对细胞的调控。

生化因子包含但不仅限于NGF。

脉冲电信号刺激条件：第一电极18和第二电极21分别通过电线14与脉冲直流脉冲稳压电源15连接，脉冲稳压电源15的脉冲信号电压范围500μV～100mV，脉冲频率可调，通过产生毫伏级电压对细胞生长进行调控。

磁场刺激条件：由特定的电磁装置提供，磁场强度范围5～100mT，磁场频率可调。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中的描述和所示的本发明实施例的组件可以通过各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

支架成形装置13为实验室自行设计和制备，灌流系统和电磁场刺激装置均由购买的相应设备组装而成。

实施例1

梯度层状结构支架的制备：在支架成形装置中完成，包括不同浓度丝素蛋白溶液的制备、电场环境的产生以及支架成形三部分。

首先，新鲜的蚕丝经煮沸脱胶、干燥、溶解、透析、浓缩得到质量分数约6％的丝素蛋白溶液备用，使用前将其稀释至质量分数分别为6％、4％、2％；

然后，将质量分数为6％的丝素蛋白溶液通过样品入口16注入到支架成形区域20中，第一电极18和第二电极21分别接入到脉冲直流脉冲稳压电源15稳压输出端，调节电压为40V，通电10～15min后，通过与支架成形装置13连接的第一出口通道2和第二出口通道7将剩余的溶液排出；

之后再加入质量分数为4％的丝素蛋白溶液，设置电压30V，10～15min(具体时间可根据成形支架要求可调)后去除剩余溶液；

最后，将质量分数为2％的丝素蛋白溶液在20V电压下10～15min(具体时间可根据成形支架要求可调)，形成的支架具有梯度层状结构。

实施例2

具有浓度梯度分布的生化因子(NGF)对神经元细胞生长的调控：基于实施例1所制造的支架，且全部材料均已灭菌处理，全部操作均在无菌环境下完成。

通过样品入口通道16向支架区域注入一定量培养液，浸泡20～120min后经第一出口通道2和第二出口通道7排出；将已培养好的神经元细胞制成细胞密度为1X10⁶个/mL的细胞悬液，经样品入口通道16种植到支架上，待细胞贴附之后，开始灌流培养。

灌流培养的具体实施方案为：第一注射泵4注入的是普通的神经元培养液，第二注射泵11注入的含有5ug/mL(可根据实际需求设置)NGF的培养液，第一注射泵控制器3和第二注射泵控制器12均设置注入流量为4ul/min(可根据实际需求设置)，采用这种灌流方式可以在支架区域产生梯度浓度分布的NGF，以此来调控神经元细胞的生长过程。

实施例3

电磁场刺激对神经元细胞生长的调控：基于实施例2，对种植有神经元细胞的支架进行普通灌流实验，不使用生化因子，在灌流过程中分别进行电场和磁场刺激。

电场刺激具体实施过程为：将第一电极18和第二电极21分别接入脉冲稳压电源15的脉冲信号输出端，通过电源设置不同的脉冲幅值，脉冲宽度等参数，对神经元细胞进行刺激。

磁场刺激具体实施过程为：将组织支架成形装置13放置于强度和频率可调的电磁装置下。

进一步的，可以同时进行电磁场刺激，以此来调控神经元细胞的生长。

实施例4

多种刺激同时对神经元细胞生长的调控：基于实施例2，结合实施例3，为该体外构建的类脑组织同时提供梯度浓度分布的生化因子刺激、电脉冲信号刺激和磁场刺激。

具体实施过程为：在灌流系统中，第一注射泵4注入的是普通的神经元培养液，第二注射泵11注入的含有5ug/mL(可根据实际需求设置)NGF的培养液，第一注射泵控制器3和第二注射泵控制器12均设置注入流量为4ul/min(可根据实际需求设置)。将第一电极18和第二电极21分别接入脉冲稳压电源15的脉冲信号输出端，通过电源设置不同的脉冲幅值，脉冲宽度等参数。将组织支架成形装置13放置于强度和频率可调的电磁装置下。

所述的灌流系统与其他的灌流系统的区别在于，第一进口5通道和第二进口通道10处于支架成形区20的上端，而第一出口通道2和第二出口通道7在支架成形区的低端，这样的设置可以使培养液充分的流经整个支架，并带走细胞代谢所产生的废物。

所述的对侧等压灌注方法不仅可以产生具有梯度浓度分布的生长因子，还可以通过注入含有不同分压气体(O₂、CO₂)的培养液来控制整个培养区域气体含量，进而调控细胞生长。

综上所述，本发明在体外构建了具有功能梯度的类脑组织，本发明制备的支架为神经元细胞提供了具有梯度结构的附着基质，为类脑组织的分层发生提供了结构基础，具有浓度梯度分布的生化因子的存在为类脑组织的分层发生提供了生物化学基础，而电磁场的刺激能够合理的模拟神经元细胞在大脑皮质所处的环境，均为在体外构建具有功能梯度的类脑组织提供了条件。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种功能梯度类脑组织体外构建系统，其特征在于，包括组织支架成形装置(13)，沿组织支架成形装置(13)的四周设置有灌流系统，灌流系统采用对侧等压灌注的方式向组织支架成形装置(13)内灌流培养液，支架成形装置(13)连接有电磁场刺激装置，电磁场刺激装置用于调控支架成形装置(13)内支架成形后种植的细胞，灌流系统包括分别设置在组织支架成形装置(13)四周的第一注射泵(4)、第一废液池(1)、第二注射泵(11)和第二废液池(8)，第一注射泵(4)和第二注射泵(11)相对设置，第一废液池(1)和第二废液池(8)相对设置，第一注射泵(4)通过第一进口通道(5)与组织支架成形装置(13)连接，第一废液池(1)通过第一出口通道(2)与组织支架成形装置(13)连接，第二注射泵(11)通过第二进口通道(10)与组织支架成形装置(13)连接，第二废液池(8)通过第二出口通道(7)与组织支架成形装置(13)连接，第一注射泵(4)连接有用于控制注射泵压力的第一注射泵控制器(3)，第二注射泵(11)连接有用于控制注射泵压力的第二注射泵控制器(12)，组织支架成形装置(13)由聚二甲基硅氧烷材料制成，包括上层(17)和下层(19)，在上层(17)和下层(19)的内部中心设置有支架成形区(20)，灌流系统与支架成形区(20)连接，在上层(17)内设置有与支架成形区(20)连接的样品入口通道(16)，样品入口通道(16)用于添加纤维性蛋白溶液，电磁场刺激装置包括脉冲信号产生装置和磁场产生装置，脉冲信号产生装置用于产生电场(6)，磁场产生装置用于产生磁场(9)，电场(6)和磁场(9)在组织支架成形装置(13)内相互垂直设置，磁场(9)与样品入口通道(16)的方向相同。

2.根据权利要求1所述的一种功能梯度类脑组织体外构建系统，其特征在于，在支架成形区(20)内靠近第一出口通道(2)处设置有第一电极(18)，靠近第二出口通道(7)处设置有第二电极(21)，第一电极(18)和第二电极(21)分别通过电线(14)与脉冲信号产生装置内产生直流脉冲的脉冲稳压电源(15)连接。

3.一种根据权利要求1或2所述功能梯度类脑组织体外构建系统的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、分别对灌流系统以及组织支架成形装置(13)的上层和下层进行灭菌处理；

S2、将纤维性蛋白溶液通过样品入口通道(16)注入到支架成形区(20)中，封闭样品入口，调节脉冲稳压电源电压并保持，在电极一端形成凝胶，通过第一出口通道(2)和第二出口通道(7)将纤维性蛋白溶液排出，重复上述过程再次加入纤维性蛋白溶液，通过改变纤维性蛋白溶液的浓度和电场强度在支架成形区(20)形成具有梯度层状结构的支架；

S3、通过第一注射泵控制器(3)和第二注射泵控制器(12)分别控制第一注射泵(4)和第二注射泵(11)向支架成形区(20)内注入磷酸盐缓冲溶液用于对步骤S2的层状梯度支架进行灌流冲洗，然后注入培养液浸泡20～120min；

S4、将提前培养好的细胞通过样品入口通道(16)种植到步骤S3浸泡好的层状梯度支架上，将细胞贴附在支架上；

S5、步骤S4完成后对层状梯度支架进行灌流培养，在灌流培养过程中，分别使用梯度浓度的生化因子、脉冲电信号和磁场对细胞的生长进行调控。

4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，步骤S2中，纤维性蛋白溶液的质量分数为2～20wt％，脉冲稳压电源的电压值为10～100V，调节精度为0.1V，保持时间为10～60min。

5.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，步骤S3中，在室温20～25℃，用PBS溶液灌流冲洗成形的支架10～30min，第一注射泵控制器(3)和第二注射泵控制器(12)的注入流量为20～200ul/min，然后注入培养液浸泡时间20～120min。

6.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，步骤S5中，在支架成形区(20)一侧灌注的培养液中加入1～10ug/ml的生化因子，当两侧灌注压力相同时，在培养区域形成一个稳定的生化因子浓度梯度；

使用脉冲信号电压为500μV～100mV的脉冲电信号对细胞的生长进行调控；

使用磁场强度为5～100mT的磁场对细胞的生长进行调控；

细胞包括神经元细胞、类神经元细胞或胶质细胞。