CN108018266B - 一种海洋来源超氧化物歧化酶及其编码基因与应用 - Google Patents
一种海洋来源超氧化物歧化酶及其编码基因与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种海洋来源超氧化物歧化酶及其编码基因与应用。本发明提供了一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。本发明通过对西南印度洋沉积物样品元基因组进行测序，发现并获得Io‑SOD1，并成功实现该基因在大肠杆菌中的表达，表达方法简单易行，表达产物易纯化，稳定性好，比活可达1315U/mg，且该酶具有良好的稳定性，本发明的Io‑SOD1将具有广阔的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种海洋来源超氧化物歧化酶及其编码基因与应用。
背景技术
氧对于生命活动极其重要，但同时由于氧的参与，细胞也不可避免的会产生氧自由基(即通常所说的活性氧)。活性氧能通过氧化应激损伤细胞大分子，引起一系列有害的生化反应，造成蛋白质损伤、脂质过氧化、DNA突变和酶的失活。早在1969年，McCord和Fridovich发现了一种血球铜蛋白能清除细胞体内氧自由基，并将其命名为超氧化物歧化酶(SOD)。研究表明SOD酶通过将氧自由基转化为H2O2，H2O2再被过氧化氢酶和氧化酶转化为水，从而达到清除细胞内氧自由基、保护细胞的目的。正是由于SOD酶在保护细胞免受氧自由基的毒害中发挥的重要作用，SOD酶在医药、食品和农业领域体现出非常广阔的应用前景。SOD的生产主要包括天然提取和微生物发酵生产两种方式。特别是伴随分子克隆技术的发展，利用基因工程细菌生产SOD越来越体现出其优势。
海洋覆盖着地球表面70％的面积。微生物遍布海洋，甚至存活于深海11000米、压力100Mpa、温度高于100的极端海洋环境。目前估计可培养的微生物仅占微生物总量的1％。因此，海洋环境中蕴藏着大量的未开发的微生物以及酶资源。通过结合微生物元基因组和高通量测序可以更大限度的开发海洋环境中蕴藏的大量未知新型酶资源。
发明内容
本发明的目的是提供一种海洋来源超氧化物歧化酶及其编码基因与应用。
本发明提供了一种蛋白质(命名为Io-SOD1蛋白)，是如下(a1)-(a5)中任一种：
(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质；
(a3)含有(a1)或(a2)的融合蛋白；
(a4)在(a1)或(a2)的末端连接含有标签的短肽得到的融合蛋白；
(a5)在(a1)或(a2)的末端连接标签得到的融合蛋白。
为了使(a1)中的蛋白质便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述(a2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
本发明还保护编码所述Io-SOD1蛋白的基因(Io-SOD1基因)。
所述基因为如下(b1)-(b4)中任一所述的DNA分子：
(b1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
(b2)序列表中序列2所示的DNA分子；
(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA序列杂交且编码超氧化物歧化酶的DNA分子；
(b4)与(b1)或(b2)或(b3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码超氧化物歧化酶的DNA分子。
上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1xSSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
本发明还保护含有Io-SOD1基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
所述重组表达载体具体可为在pET28a(+)载体的多克隆位点(例如NdeI和HindIII酶切位点间)插入序列表的序列2自5’端第1-612位所示的双链DNA分子得到的重组质粒。
本发明还保护所述Io-SOD1蛋白在作为超氧化物歧化酶中的应用。
本发明还保护一种重组菌，是将Io-SOD1基因导入宿主菌中得到的。
所述Io-SOD1基因可通过含有Io-SOD1基因的重组表达载体导入宿主菌得到重组菌。
所述重组表达载体具体可为在pET28a(+)载体的多克隆位点(例如NdeI和HindIII酶切位点间)插入序列表的序列2自5’端第1-612位所示的双链DNA分子得到的重组质粒。
所述宿主菌可为大肠杆菌，具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明还保护一种超氧化物歧化酶的制备方法，包括如下步骤：培养所述重组菌，从重组菌中得到超氧化物歧化酶。
本发明还保护所述Io-SOD1蛋白或Io-SOD1基因或所述所述重组菌或所述方法在制备超氧化物歧化酶产品中的应用。
本发明通过对西南印度洋沉积物样品元基因组进行测序，发现并获得Io-SOD1，并成功实现该基因在大肠杆菌中的表达，表达方法简单易行，表达产物易纯化，稳定性好，比活可达1315U/mg，且该酶具有良好的稳定性，本发明的Io-SOD1将具有广阔的工业应用前景。
附图说明
图1为Io-SOD1表达SDS-PAGE图谱。
图2为Io-SOD1在不同温度下的热稳定性分析。
图3为Io-SOD1在室温下的稳定性分析。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、Io-SOD1及其编码基因的获得
从来源于印度洋的沉积物中提取总DNA，对其进行大量基因组测序分析，从中发现了一种蛋白质，如序列表的序列1所示，将其命名为Io-SOD1。Io-SOD1的编码基因命名为Io-SOD1，如序列表的序列2所示。
实施例2、Io-SOD1的表达和纯化
1、采用序列表的序列2自5’端第1-612位所示的双链DNA分子替代pET28a(+)载体(Novagen公司)NdeI和HindIII酶切位点之间的小片段，得到重组表达载体pET28a(+)/Io-SOD1(已经测序验证)。
2、将步骤1得到的重组表达载体pET28a(+)/Io-SOD1导入大肠杆菌BL21(DE3)(全世金生物技术有限公司，货号：CD601-01)，得到重组菌。
3、将步骤2得到的重组菌接种至50ml含50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡培养至菌液OD600nm＝0.6，菌液中加入IPTG并使其在体系中的浓度为1mM，16℃、200rpm诱导4小时，诱导结束后12000rpm离心，收集菌体沉淀进行SDS-PAGE检测(结果如图1的泳道1)。
4、用PBS(135mMNaCl，2.7mMKCl，1.5mM KH2PO4，8mM K2HPO4，pH 7.2)重悬步骤3收集的菌体沉淀，超声(150W，破碎10s，间隔10s，20个循环)，破碎后收集全细胞裂解液，将全细胞裂解液12000rpm离心10min，分别收集上清液和沉淀。将上清液进行SDS-PAGE检测(结果如图1的泳道2)，同时将沉淀也进行SDS-PAGE检测(结果如图1的泳道3)检测结果显示经IPTG诱导，胞内表达了分子量大小约为25kD的蛋白，与SOD单亚基的理论分子量相符，表明用上述方法获得了正确表达的Io-SOD1。
5、按SNBC 3S NTA Resin(上海生能博彩生物科技有限公司)的操作方法在非变性条件下可对步骤4得到的上清液中带有His-Tag标签的表达产物进行纯化，得到纯化后的Io-SOD1蛋白溶液，蛋白浓度为0.12mg/mL，经SDS-PAGE检测结果如图1的泳道4-6。用临苯三酚自氧化法(GB/T 5009.171-2003保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定)测定Io-SOD1蛋白溶液中的SOD酶活性，其活力单位约为198U/mL培养液，比活为1315U/mg。
SOD活力单位的定义：25℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50％时所需的SOD量为一个活力单位。
实施例3、Io-SOD1稳定性分析
1、将实施例2制备的Io-SOD1蛋白溶液分别在50℃和60℃条件下静置3小时，过程中采用临苯三酚自氧化法(GB/T 5009.171-2003保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定)测定Io-SOD1蛋白溶液中的剩余酶活性(热处理前SOD酶活设为100％，经热处理后的酶活占处理前的酶活的百分比即为剩余酶活)，结果如图2所示。结果表明，Io-SOD1在50℃条件下处理3个小时，仍保留90％以上酶活，在60℃条件下处理30分钟仍可以保留80％以上酶活。
2、将实施例2制备的Io-SOD1蛋白溶液在室温(25℃)下放置半年，过程中采用临苯三酚自氧化法测定Io-SOD1蛋白溶液中的酶活性。结果如图3所示。结果表明，Io-SOD1室温下保存长达半年，仍可维持60％以上酶活
上述结果表明，Io-SOD1具有良好的稳定性。
<110> 深圳中科欣扬生物科技有限公司
<120> 一种海洋来源超氧化物歧化酶及其编码基因与应用
<160> 2
<210> 1
<211> 204
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
Met Pro Thr His Thr Leu Pro Asp Leu Pro Tyr Asp His Glu Ala Leu
1 5 10 15
Ala Pro His Ile Asp Ala Arg Thr Met Glu Ile His His Gly Lys His
20 25 30
His Gln Gly Tyr Val Asn Asn Leu Asn Ala Ala Leu Glu Gly His Pro
35 40 45
Glu Leu Gln Ala Lys Ser Val Glu Glu Leu Val Ala Gly Ile Asp Ala
50 55 60
Val Pro Glu Ala Ile Arg Thr Ala Val Arg Asn Asn Gly Gly Gly His
65 70 75 80
Ala Asn His Ser Leu Phe Trp Leu Ser Met Ser Pro Gln Gly Gly Gly
85 90 95
Ala Pro Asp Gly Ala Leu Ala Thr Ala Leu Ala Asn Thr Phe Gly Ser
100 105 110
Phe Gly Asp Phe Lys Glu Gln Leu Thr Ala Ala Ser Leu Ala Arg Phe
115 120 125
Gly Ser Gly Trp Gly Trp Leu Val Val Thr Ser Gly Gly Glu Leu Gly
130 135 140
Val Tyr Ser Thr Ala Asn Gln Asp Asn Pro Tyr Met Gln Gly Asp Val
145 150 155 160
Pro Ile Leu Gly Val Asp Val Trp Glu His Ala Tyr Tyr Leu Asn Tyr
165 170 175
Gln Asn Arg Arg Pro Asp Tyr Leu Ala Ala Trp Trp Ser Val Val Asp
180 185 190
Trp Asp Glu Val Ala Arg Arg Phe Asp Ala Thr Arg
195 200
<210> 2
<211> 615
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
atgccgactc acaccctgcc ggacctcccg tacgatcatg aagcgctggc accacacatc 60
gatgctcgca ctatggaaat ccaccacggc aaacaccacc agggttacgt gaacaacctg 120
aatgctgcac tggaaggtca cccggaactc caagctaaat ctgtggaaga actggttgca 180
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ccggactatc tggcggcatg gtggtccgtt gttgattggg atgaagttgc gcgccgtttc 600
gatgcgaccc gttaa 615
Claims (7)
1.一种蛋白质，为由序列表中SEQ ID No：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因，所述基因为序列表中SEQ ID No：2所示的DNA分子。
3.含有权利要求1所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
4.权利要求1所述的蛋白质在作为超氧化物歧化酶中的应用。
5.一种重组菌，是将权利要求2所述的基因导入宿主菌中得到的。
6.一种超氧化物歧化酶的制备方法，包括如下步骤：培养权利要求5所述的重组菌，从重组菌中得到超氧化物歧化酶。
7.权利要求1所述的蛋白质或利要求2所述的基因或权利要求5所述的重组菌或权利要求6所述的方法在制备超氧化物歧化酶产品中的应用。
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