CN108004199B

CN108004199B - 用于从hPSC生成胰腺祖细胞和功能性β细胞的方法和组合物

Info

Publication number: CN108004199B
Application number: CN201711013526.3A
Authority: CN
Inventors: 凯勒·G; 诺斯特罗·M·C; 霍尔特辛格尔·A; 萨兰奇·F
Original assignee: University Health Network
Current assignee: University Health Network
Priority date: 2012-04-30
Filing date: 2013-04-30
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2033-04-30
Also published as: IN2014DN10053A; LT2844739T; EP3594323A1; CN104411815A; JP2015519048A; WO2013163739A1; AU2013255031B2; HRP20191677T1; PT2844739T; CY1122058T1; JP6397397B2; EP2844739A1; EP2844739A4; JP6759293B2; CA2871795C; EP2844739B1; AU2013255031A1; HK1254968A1; PL2844739T3; DK2844739T3

Abstract

本发明公开了用于从内胚层细胞群产生NKX6‑1+胰腺祖细胞和/或胰岛素产生的细胞的方法和组合物，所述方法包括使内胚层细胞群与EGF组分、烟酰胺组分和/或Noggin组分接触，任选地与至少一种EGF组分和至少一种烟酰胺组分的组合接触，以诱导至少一个内胚层细胞分化为NKX6‑1+胰腺祖细胞，所述组合任选地还包含至少一种Noggin组分。

Description

用于从hPSC生成胰腺祖细胞和功能性β细胞的方法和组合物

技术领域

本发明涉及用于产生NKX6-1阳性胰腺祖细胞和功能性胰腺β细胞的方法和组合物。

背景技术

从人多能干细胞(hPSC；包括胚胎干细胞；hESC和诱导性多能干细胞； hiPSC)生成胰腺祖细胞的能力可以为以下提供人内分泌、外分泌及导管细胞来源：1)预测药物毒理学和药物发现，2)用于治疗糖尿病的移植，和3) 在体外建立正常的胰腺发育和糖尿病发展模型。为了实现上述目的，要求能够从不同的hESC和hiPSC细胞系繁殖高度富集的胰腺祖细胞群，并能够促进胰腺祖细胞在体外和体内成熟为产生胰岛素的β细胞。先前的出版物已报道，可以从hPSC生成产生胰岛素的细胞，然而生成的是多激素 (poly-hormonal)细胞。对这些产生胰岛素的细胞的分析指出，所述产生胰岛素的细胞不表达NKX6-1，这是对功能性β细胞的发育必不可少的关键转录因子。一项研究已证明从hESC生成NKX6-1+祖细胞，表明该NKX6-1+ 祖细胞被移植入免疫低下的受体后，能够分化为功能性β细胞(Kelly等 2011)。而且，该项研究数据基于两个具有分化为胰腺谱系倾向的hESC细胞系。当应用于其它细胞系时，该项研究中描述的方案并不能促使NKX6-1+ 祖细胞的有效发育(Kelly等，2011)。

发明简述

本发明的一个方面包括一种从内胚层细胞群产生NKX6-1+胰腺祖细胞的方法，该方法包含使内胚层细胞群与EGF组分、烟酰胺组分和/或Noggin 组分接触，任选为与至少一种EGF组分和至少一种烟酰胺组分的组合接触，所述组合的量足以诱导内胚层细胞群的至少一部分分化为NKX6-1+胰腺祖细胞。

在一个实施例中，EGF组分包含EGF和/或其活性缀合物和/或片段；双调蛋白(Amphiregulin，AR)和/或其活性缀合物和/或片段；转化生长因子α (TGFα)和/或其活性缀合物和/或片段；Betacellulin(BTC)和/或其活性变体和/或其片段；Epiregulin(EPR)和/或其活性变体和/或片段；神经调节蛋白(包括例如NRG1、NRG2、3NRG4)和/或其活性变体和/或片段；和/或其两种或更多种的组合。

在一个实施例中，烟酰胺组分包含烟酰胺(也被称为尼克酰胺和尼克酸酰胺)、其盐、溶剂化物和其缀合物；聚(ADP-核糖)合成酶抑制剂，如苯甲酰胺和/或3-氨基苯甲酰胺(Otonkoski等，1993)；Sir-2抑制剂，如sirtinol、 M15、splitomicin(Bitterman等，2002)；其它HDAC抑制剂，如AN-9、CI-994、 FK228、LAQ-824、MS275、SAHA、丙戊酸、TSA、丁酸钠(Bitterman等， 2002)，和/或其两种或更多种的组合。

在一个实施例中，Noggin组分包含以下中的一种或多种：Noggin和/或其活性缀合物和/或片段；BMPR1A和/或其活性缀合物和/或片段； Dorsomorphin和/或其盐或溶剂化物；LDN 193189，也被称为“DM-3189”，和/或其盐和/或溶剂化物；CHORDIN和/或其活性缀合物和/或片段；和/或其两种或更多种的任意组合。

在一个实施例中，所述组合包含至少一种Noggin组分；至少一种EGF 组分和至少一种烟酰胺组分。

在一个实施例中，至少一种Noggin组分；至少一种EGF组分和至少一种烟酰胺组分的组合包含Noggin、EGF和烟酰胺(例如NENA)。

在一个实施例中，所述方法还包括使所述细胞与Exendin-4组分接触。

在一个实施例中，所述方法诱导内胚层细胞群的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少45％、至少50％或至少 55％分化为NKX6-1+胰腺祖细胞。

在一个实施例中，所述方法首先包括产生内胚层细胞群。

在一个实施例中，所述产生内胚层细胞群的方法包括步骤(或者子步骤) a、b、c中的一个或多个；和步骤d，所述步骤包括：

a)使多能干细胞群与以下的组合接触：

I)nodal激动剂(任选为ActA)和wnt信号传导激动剂(任选为 Wnt3a或CIHR99021)；

II)nodal激动剂(任选为Act A)、FGF激动剂(任选为bFGF) 和任选的wnt信号传导激动剂(任选为Wnt3a CIHR 99021)；和

III)nodal激动剂(任选为ActA)和FGF激动剂(任选为bFGF)；以产生阶段1分化的细胞；

b)使阶段1分化的细胞与FGF激动剂(任选为FGF10)和任选的wnt 信号传导激动剂(任选为Wnt3a)和/或noggin组分(任选为Dorsomorphin) 接触，以生成阶段2分化的细胞；

c)使阶段2分化的细胞与Noggin组分(任选为Noggin)，维甲酸(RA) 或RA类似物和任选的环巴明-KAAD(Cyc)、FGF激动剂(任选为FGF10) 和/或Exendin-4组分(任选为Exendin-4)接触，以提供内胚层细胞群；和

d)使内胚层细胞群与EGF组分、烟酰胺组分和/或Noggin组分接触，任选地与包含至少一种EGF组分和至少一种烟酰胺组分的组合接触，所述组合的量足以诱发内胚层细胞群的至少一部分分化为NKX6-1+胰腺祖细胞。

在一个实施例中，产生NKX6-1胰腺祖细胞的组合还包含至少一种 Noggin组分。

另一方面，还包括一种用于生成NKX6-1+胰岛素产生细胞的方法，包括：

A)根据本文所述方法，产生包含NKX6-1阳性胰腺祖细胞的细胞群；和

b)将细胞群或者NKX6-1富集的或分离的细胞群引入受试者中。

还有一个方面包括一种用于生成胰岛素产生细胞的方法，包括：

A)生成包含NKX6-1阳性胰腺祖细胞的细胞群；

b)将NKX6-1阳性胰腺祖细胞与CD34+内皮细胞共培养一段时间，所述时间足以获得胰岛素产生细胞，任选为NKX6-1阳性胰岛素产生细胞。

在一个实施例中，所述方法还包括富集或者分离NKX6-1阳性细胞群。

在另一个实施例中，所述富集或者分离步骤包括使细胞群与HPx表位检测抗体接触，和分离或部分纯化HPx1和/或HPx2结合的细胞亚群。

另一个方面包括根据本文所述方法产生的富集的和/或分离的NKX6-1 阳性细胞群和适合的稀释剂。

在一个实施例中，富集的或分离的NKX6-1阳性细胞群包括至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少 50％、至少60％、至少70％、至少80％或直至约95％的NKX6-1阳性细胞。

还有一个方面包括一种培养基补充组合物，其包含EGF组分、烟酰胺组分和/或Noggin组分和任选的Exendin-4组分。

另一个方面还提供一种培养基组合物，其包含基础培养基和本文所述培养基补充剂。

进一步的一个实施例包括一种试剂盒，其包含：

a)EGF组分，

b)烟酰胺组分；和/或

c)Noggin组分。

还提供包含细胞群的组合物，及所述细胞群在预测药物毒理学和药物发现、移植、糖尿病治疗、组织工程和/或疾病建模中的应用。

通过以下详细说明，可以明显看出本发明其它的特点和优点。但是应理解，虽然所述详细描述和具体实例尽管指示了本发明的优选实施方案，但是它们仅以示例的方式给出，因为基于此详细描述，本发明的精神和范围内的各种改变和变形对于本领域技术人员来说均是显而易见的。

附图简述

以下结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为胰腺分化方案的例子的示意图；

图2的图显示用Noggin、EGF、烟酰胺(NENA)和Exendin-4处理后，从源自hESC的细胞诱导得到的NKX6-1:GFP+细胞百分比；

图3的一系列图显示样品研究中NKX6-1、PDX1、PTF1A和SOX9的 mRNA表达水平；

图4A的图显示，利用NKX6-1^GFP/w HESC细胞系，在Noggin、EGF、烟酰胺(含有或不含Exendin-4)的存在下培养内胚层细胞，与没有经过上述化合物各种组合的处理相比较，NKX6-1:GFP+细胞的百分比最高。

图4B的图显示，利用H1(WA01)HESC细胞系，在Noggin、EGF、烟酰胺(含有或不含Exendin-4)的存在下培养内胚层细胞，与没有经过上述化合物各种组合的处理相比较，NKX6-1+细胞的百分比最高。

图5的一系列图显示，利用“NENA处理”生成的NKX6-1细胞具有生成胰岛素产生细胞的潜力。移植H1(WA01)第14天分化的细胞后6周收获的乳腺脂肪垫中的NKX6-1和胰岛素的免疫组织化学分析(A)。移植H1 (WA01)第14天分化的细胞后6周收获的乳腺脂肪垫中的C-肽和胰高血糖素 (GCG)的免疫组织化学分析(B)。

图6为一系列流式细胞术情况图，显示了HPx可被用于富集NKX6-1 表达细胞。经过含有或不含有这三种组分的培养在三重处理(Noggin、EGF 和烟酰胺)的存在或不存在下培养的NKX6-1^GFP/w hESC细胞系分化的第13 天，流式细胞术分析单独的NKX6-1:GFP(A)，并与hPx(B)和CD142(C) 作对比。

图7A的图显示，利用荧光激活细胞分选术(FACS)分离HPx2+细胞，与没有经过分选的细胞(PS＝分选前)相比较，富集表达更高NKX6-1mRNA 水平的细胞群，这与在CD142(CD142+)富集的细胞群中发现的水平类似。

图7B的图显示，利用荧光激活细胞分选术(FACS)分离HPx2+CD142+ 双阳性细胞，与没有经过分选的细胞(PS＝分选前)相比较，富集表达更高 NKX6-1mRNA水平的细胞群。

图8A为中胚层第6天的一系列流式细胞术情况图；

图8B为CD34+细胞的相图；

图8C-D为显示乙酰化LDL摄入的细胞图像；

图8E为显示vWF免疫组织化学的图像；

图9A为一系列绘制图，上部的图为：在来自第14天培养物的活细胞中， FACS分析GFP，其中：对照单层细胞(Ctrl)，胶原上的聚集体(Col)和与源自ES的内皮细胞的共培养物(ES-E)。下部的图：细胞内FACS分析在来自每个培养条件的GFP+细胞群的c-肽。

图9B的图显示，在不同的培养条件下，实时QPCR分析胰岛素(INS) 和胰高血糖素(GCG)。数字为相对于FOXA2。

图10的图显示，利用荧光激活细胞分选术(FACS)分离HPx1+细胞，与HPx1-细胞相比较，富集表达更高NKX6-1、SOX9和PTF1a mRNA水平的细胞群。

图11的图显示，利用“NENA”处理生成的NKX6-1细胞具有生成产生胰岛素的功能性细胞的潜力。将H1(WA01)第13天分化的细胞移植入免疫功能低下小鼠后第6、12和18周，通过ELISA测量响应于葡萄糖攻击的人C- 肽分泌。

详细说明

本文描述了用于从人多能干细胞(hPSC)有效产生NKX6-1⁺胰腺祖细胞的强大、可靠平台，其中使用包括BMP抑制剂(例如Noggin)、烟酰胺和EGF信号传导通路激动剂的因子的限定组合。类似于本文所述产生的细胞，产生单激素(Monohormonal)胰岛素的β细胞为NKX6-1阳性的。本文利用小鼠移植实验，证实了根据所述方法产生的细胞为单激素和功能性的。

本文还证实，可以从不同的人多能干细胞(hPSC)群分化得到NKX6-1+ 胰腺内分泌祖细胞。

本发明的一个方面包括一种从内胚层细胞群产生NKX6-1+胰腺祖细胞的方法，所述方法包括使内胚层细胞群与EGF组分、烟酰胺组分和/或Noggin 组分接触，任选地与至少一种EGF组分和至少一种烟酰胺组分的组合接触，以诱导内胚层细胞群的至少一部分分化为NKX6-1+胰腺祖细胞。

在一个实施例中，所述组合还包括至少一种Noggin组分。

术语“接触”(例如使内胚层细胞群与一种或多种组分接触)意在包括：将一种或多种组分与细胞在体外一起孵育(例如在培养的细胞中加入所述化合物)，所述接触的步骤可以以任何合适的方式进行。例如，细胞可以贴壁培养或悬浮培养处理，在时间上，基本上同时(例如一起存在于混合物中) 或顺序(例如从添加第一组分的1个小时内)加入所述组分。所述细胞还可以与另一试剂例如生长因子或其它分化剂或环境接触，以稳定细胞或者使细胞进一步分化，并且包括在本领域已知的条件下培养细胞，所述条件例如实施例中进一步所描述的用于培养多能(和/或分化的)细胞群。

本文使用的“内胚层细胞群”是指包括至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的对应于图1阶段3 内胚层细胞的细胞群。例如，内胚层细胞对应于胚胎后前肠细胞群，其至少表达FOXA2，可以呈PDX1阴性或阳性。还可以表达其它因子。所述细胞群可以是NKX6-1阴性的(NKX6-1-)或者表达低水平NKX6-1。例如，可以采用流式细胞术和分子分析测定所述内胚层细胞群的一个或多个标志物例如FOXA2。例如所述内胚层细胞群可以为2D(单层)或3D(类胚体或其它聚集体)格式。

本文使用的术语“内胚层”是指在非常早期的胚胎中的三个主要的胚芽细胞层中的一个(其它两个胚芽细胞层为中胚层和外胚层)。所述内胚层为三个细胞层的最内层。内胚层细胞首先分化产生胚胎肠，而后产生肠道(食管、胃、肠、直肠、结肠)衬里，咽囊衍生物(扁桃体、甲状腺、胸腺、甲状旁腺)，肺，肝，胆囊和胰腺。

本文使用的术语“多能干细胞”是指具有在不同条件下分化为超过一种分化的细胞类型的能力的细胞，例如，分化三个胚芽细胞层的特征性细胞类型的能力，包括胚胎干细胞和诱导性多能干细胞。例如通过裸鼠畸胎瘤形成实验来表征多能干细胞具有分化为超过一个细胞类型的能力。通过胚胎干细胞(ES)标志物的表达，可以证实多能性。

本文使用的术语“祖细胞”是指具有这样细胞表型的细胞，相对于其能分化产生的细胞，所述细胞表型相比于完全分化的细胞处于发育途径或进展中较早期步骤。取决于发育途径和其中细胞发育及分化的环境，祖细胞能产生多个明显不同的分化细胞类型或单一的分化细胞类型。

术语“胰腺祖细胞”是指能够形成以下任意种的细胞：胰腺内分泌细胞 (例如产生胰高血糖素的α-细胞或产生胰岛素的β细胞)，或胰腺外分泌细胞(如淀粉酶+和/或胰蛋白酶+胰腺细胞)或胰腺管细胞。通过添加组分例如EGF组分和烟酰胺组分的组合和/或由于祖细胞发育的环境，可诱导胰腺内分泌细胞、胰腺外分泌细胞或胰腺管细胞中的一种或多种的形成或发育。例如，在包括内皮接触的条件下，“NKX6-1阳性胰腺多能祖细胞”能够产生功能性β细胞。同样地，体内注射NKX6-1胰腺祖细胞，能够导致此类细胞发育。还经证实的是，如实施例中所述，NKX6-1胰腺祖细胞产生胰岛素产生NKX6-1阳性β细胞和CK-19阳性导管细胞。

本文使用的术语“功能性β细胞”是指一种胰腺细胞，其在胰腺中位于成为胰岛的区域中，为NKX6-1阳性和/或PDX1阳性的，制造和释放胰岛素。

本文使用的术语“干细胞”是指未分化的细胞，其能够增殖、自我更新和产生更多祖细胞，这些祖细胞具有生成大量的母细胞而母细胞依次能够产生分化子细胞或可分化子细胞的能力。例如，子细胞能够被诱导增殖并产生后代，其后代随后分化为一个或多个成熟的细胞类型，而同时还保留一个或多个具有亲本发育潜力的细胞。

在细胞的上下文中，术语“分化的(differentiated)”或者“分化(differentiating)”是相对的术语，“分化的细胞”是指比相比较的细胞进展到沿着发育途径更进一步的细胞。因此，干细胞可以分化为谱系限制性的前体细胞(如内胚层祖细胞)，该谱系限制性的前体细胞依次可以分化为其它类型的前体细胞，沿着途径更进一步，进而再分化为终末分化的细胞，所述终末分化的细胞在某个组织类型中发挥特征性功能，其可能或不能保留进一步增殖的能力。

本文使用的“胚胎干细胞”是指胚胎囊胚内细胞团的多能干细胞(例如见美国专利No.5,843,780、No.6,200,806)。这些细胞还可以从源自体细胞核转移的囊胚内细胞团获得(例如见美国专利No.5,945,577、No.5,994,619、 No.6,235,970)。胚胎干细胞的区别特征决定了胚胎干细胞表型。因此，如果细胞具有一个或多个胚胎干细胞的独特特征，其就拥有胚胎干细胞的表型，使得可以将其与其它细胞区别开来。胚胎干细胞的示例性区别特征包括但不限于：基因表达谱，增殖能力，分化能力，染色体核型，对特定培养条件的反应性，诸如此类。

术语“表达”是指涉及产生RNA和蛋白质以及当适当时分泌蛋白的细胞过程，当适当时包括但不限于，例如转录，翻译，折叠，修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的RNA和通过从基因转录的mRNA的翻译获得的多肽。

本文使用的术语“NKX6-1阳性胰腺祖细胞”是指例如源自胰腺内胚层细胞的细胞，其具有至少分化为产生胰岛素的细胞例如胰腺β细胞的能力。 NKX6-1阳性胰腺祖细胞表达标志物NKX6-1，并且与多能干细胞(PSC)相比，其可以表达例如增加水平的PDX1、PTF1A和SOX9。

本文使用的术语“NKX6-1”是指“NK6同源盒1”基因(基因ID:4825) 的mRNA(和/或任选为cDNA)或蛋白产品，序列，包括蛋白质和mRNA 序列(和/或任选为cDNA)，所述序列通过引用并入本文。

如本文所示，使用EGF和烟酰胺处理产生NKX6-1+细胞，通过添加 Noggin(图4)增加所述NKX6-1+细胞。

相应地，在另一个实施例中，所述组合还包含Noggin组分。

本文使用的术语“Noggin组分”意为任意的多肽或BMP化合物激动剂，所述多肽或BMP化合物激动剂通过结合TGFβ家族配体抑制TGF-β/BMP 家族信号传导，包括但不限于实施例10中提供的试剂，例如包括Noggin (NOG)如具有基因识别编码(基因ID：9241)的人Noggin以及其活性缀合物和片段，包括自然存在的活性缀合物和片段；骨形态发生蛋白IA型受体(BMPR1A)，例如具有如基因识别编码(基因ID：657)的人BMPR1A 以及其活性缀合物和片段，包括自然存在的活性缀合物和片段；骨形态发生蛋白IB型受体(BMPR1B)，例如具有如基因识别编码(基因ID：658)的人BMPR1B以及其活性缀合物和片段，包括自然存在的活性缀合物和片段；小分子化学抑制剂Dorsomorphin和其盐、溶剂化物和组合；小分子化学抑制剂LDN 193189，也被称为“DM-3189”，和/或其盐和/或溶剂化物；和 CHORDIN，例如具有如基因识别编码(基因ID：8646)的人CHORDIN (CHRD)以及其活性缀合物和片段，包括自然存在的活性缀合物和片段；和/或上述两种或更多种的组合，例如包括包含Noggin的组合。每一个(例如由基因ID鉴定的每一个组分)的序列，包括蛋白质和mRNA序列，通过引用并入此处。

本文使用的术语“Noggin”是指具有基因识别编码(基因ID：9241) 的骨形态发生蛋白拮抗剂，其序列，包括蛋白质和mRNA序列，所述序列通过引用并入本文。

所述化合物“Dorsomorphin”包括通式表示的化合物：

其盐、溶剂化物和/或组合。

所述化合物“LDN”表示具有以下通式的化合物：

其盐、溶剂化物和/或组合。

在一个实施方案中，所述Noggin组分为Noggin。Noggin的浓度范围可以为例如约1ng～约500ng/ml，例如约1ng～约250ng/ml，约10ng～约250 ng/ml，约10ng～约100ng/ml。在另一个实施方案中，所述Noggin的浓度为约10ng/ml，约20ng/ml，约30ng/ml，约40ng/ml，约50ng/ml，约60ng/ml，约70ng/ml，约80ng/ml，约90ng/ml，约100ng/ml，约150ng/ml，约200ng/ml，约300ng/ml，约400ng/ml，或约500ng/ml。

本文使用的术语“EGF组分”术语意为任意的多肽或小分子，所述多肽或小分子激活以下的任意种：EGF受体家族成员(ErbB1/HER-1/EGFR，基因ID：1956；ErbB2/HER-2/neu，基因ID：2064；ErbB3/HER-3，基因ID： 2065；和/或ErbB4/HER-4，基因ID：2066)，例如包括但不限于实施例11 中提供的试剂；表皮生长因子(EGF)，例如具有如基因识别编码(基因ID:1950)的人EGF以及其活性缀合物和片段，包括自然存在的活性缀合物和片段；双调蛋白(AR)，例如具有如基因识别编码(基因ID:374)的人 AR/AREG以及其活性缀合物和片段，包括自然存在的活性缀合物和片段；转化生长因子α(TGFα)，例如具有如基因识别编码(基因ID:7039)的人 TGFα以及其活性缀合物和片段，包括自然存在的活性缀合物和片段；Betacellulin(BTC)，例如具有如基因识别编码(基因ID:685)的人BTC以及其活性缀合物和片段，包括自然存在的活性缀合物和片段；具有如基因识别编码(基因ID:1839)的肝素结合EGF-样生长因子(HB-EGF)以及其活性缀合物和片段，包括自然存在的活性缀合物和其片段；Epiregulin (EREG/ER)，例如具有如基因识别编码(基因ID:2069)的人EREG以及其活性缀合物和片段，包括自然存在的活性缀合物和其片段；神经调节蛋白 (Neuregulin)(包括例如NRG1、NRG2、NRG3、NRG4)，例如具有如基因识别编码(分别为基因ID:3084、基因ID:9542、基因ID:10718、基因ID： 145957)的人NRG以及其活性缀合物和片段，包括自然存在的活性变体和片段；和/或上述两种或更多种的组合，例如包含人EGF的组合。

在一个实施方案中，本文使用的术语“EGF”是指表皮生长(EGF)，例如具有如基因识别编码(基因ID：1950)的人EGF以及其活性缀合物和片段，包括自然存在的活性缀合物和片段。

在一个实施方案中，所述EGF组分为EGF。所述EGF的浓度范围可以为例如约1ng～约500ng/ml，例如约1ng～约250ng/ml，约10ng～约250 ng/ml，约10ng～约100ng/ml。在另一个实施方案中，所述EGF的浓度为约 10ng/ml，约20ng/ml，约30ng/ml，约40ng/ml，约50ng/ml，约60ng/ml，约70ng/ml，约80ng/ml，约90ng/ml，约100ng/ml，约150ng/ml，约200ng/ml，约300ng/ml，约400ng/ml，或约500ng/ml。

本文使用的术语“烟酰胺组分”意为Sirtuin组蛋白去乙酰化酶(HDAC) 的任意抑制剂，包括但不限于烟酰胺(也被称为尼克酰胺和尼克酸酰胺)、其盐、溶剂化物和组合；聚(ADP-核糖)合成酶抑制剂，例如苯甲酰胺和/或 3-氨基苯甲酰胺(Otonkoski等，1993)，Sir-2抑制剂例如sirtinol、M15、 splitomicin(Bitterman等，2002)；其它HDAC抑制剂，例如AN-9、CI-994、 FK228、LAQ-824、MS275、SAHA、丙戊酸、TSA、丁酸钠(Bitterman等， 2002)，和/或其两种或更多种的组合，例如包括烟酰胺的组合。例如，Bitterman 等(2002)和Otonkoski等(1993)证实了sirtinol、M15、splitomicin苯甲酰胺和/或3-氨基苯甲酰胺具有与烟酰胺相类似或更好的效果。

本文使用的术语“烟酰胺”是指水溶性维生素，也被称为尼克酰胺和尼克酸酰胺以及其盐、溶剂化物和缀合物，还称为尼克酸的酰胺(维他命B3/ 烟酸)。

在一个实施方案中，所述烟酰胺组分为烟酰胺和/或其盐、溶剂化物和/ 或缀合物。所述烟酰胺的浓度范围例如为约10μM～约100mM，例如为约 10μM～约50mM，为约1μM～约100mM，或约1μM～约50mM。在另一个实施方案中，所述烟酰胺的浓度为约1mM，约2mM，约5mM，约10mM，约15mM，约20mM，约30mM，约40mM，约50mM，约60mM，约70 mM，约80mM，约90mM，或约100mM。

本文实施例13证实了，例如，采用Noggin、EGF和烟酰胺的组合处理细胞能够诱导超过10％的经处理细胞表达NKX6-1。

因此，在一个实施方案中，所述至少一种Noggin组分、至少一种EGF 组分和至少一种烟酰胺组分的组合包含Noggin、EGF和烟酰胺(例如 NENA)。

所述烟酰胺被证实为一种人胎儿胰腺细胞中内分泌分化的有效诱导物(Otonkoski等，1993)。然而，本文披露之前，所述烟酰胺并未曾用于与 BMP抑制剂和/或EGF通路激动剂(EGF或其它EGF相关生长因子)组合来特异性促进NKX6-1⁺祖细胞从限定性内胚层的发育。例如，烟酰胺的包含提高从不同hPSC细胞系的NKX6-1⁺胰腺祖细胞的可重复和有效产生。

Exendin-4和其活性缀合物和片段还能够用于诱导胰腺祖细胞分化。实施例13还说明了包含Exendin-4的组合诱导至少30％的内胚层细胞群的分化。

因此，在一个实施方案中，所述至少一种Noggin组分、至少一种EGF 组分和至少一种烟酰胺组分的组合还包含Exendin-4组分。

本文使用的术语“Exendin-4组分”是指激活GLP-1(胰高血糖素样肽-1) 受体从而增加细胞内cAMP的多肽和化合物，例如包括但不限于Exendin-4 (西格玛公司(SIGMA)7144)和其活性缀合物及片段，GLP-1和其活性缀合物及片段，例如人胰高血糖素样肽-1(西格玛公司G3265)和胰高血糖素样肽Amide Fragment 7-36Human(西格玛公司G8147)以及其活性缀合物及片段，包括自然存在的活性缀合物及片段。

还可以使用变体，例如保守的突变变体和每个多肽的激活突变变体。例如，还可包括GLP-1的激活突变体如GLP-1(7-37)A8G。

本文使用的术语“Exendin-4”是指39个氨基酸的肽和其活性缀合物及片段，其激活GLP-1(胰高血糖素样肽-1)受体从而增加细胞内cAMP(西格玛公司7144)。

本文使用的术语“活性片段”是具有这样的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与其作为其中的片段的多肽相比，大小上要较小，但是与该多肽基本上同源，并且其中所述活性片段多肽的生物学作用的有效性与其作为其中的片段的多肽相比，为约至少50％、或60％或70％或80％或90％或100％或高于100％，例如1.5倍、2倍、3倍、4倍或高于4倍。实例包括结合并激活 EGF受体的EGF片段，和人胰高血糖素样肽Amide Fragment 7-36(GLP-17-36酰胺)(西格玛公司G8147)，所述人胰高血糖素样肽Amide Fragment 7-36(GLP-1 7-36酰胺)(西格玛公司G8147)类似GLP-1 7-37，同样有效刺激胰岛素产生，但不是如GLP-1 9-37的非活性片段。

在一个实施方案中，所述至少一种Noggin组分、至少一种EGF组分和至少一种烟酰胺组分的组合还包含至少一种Exendin-4组分，包含Noggin、 EGF、烟酰胺和Exendin-4(例如NENAEx)。

在一个实施方案中，使所述内胚层细胞群与至少一种Noggin组分、至少一种EGF组分、至少一种烟酰胺组分和任选的至少一种Exendin-4组分的组合接触至少或约3天，至少约4天，至少约5天，至少约6天，至少约7 天，至少约8天，至少约9天或至少约10天。在另一个实施方案中，使所述内胚层细胞群与所述组合接触至少约11天，至少约12天，至少约13天，至少约14天，或至少约15天。发现，在培养的细胞中，NKX6-1阳性和/ 或生成胰岛素产生细胞的能力能够保持例如至少30天或更多。

内胚层细胞群的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％或至少60％或至少70％或至少 80％、至少90％的分化诱导分化为NKX6-1+胰腺祖细胞。

通过测定胰腺祖细胞标志物的水平可以检测分化。例如，NKX6-1、 PDX1、PTF1A和SOX9为胰腺组细胞标志物，该标志物的mRNA表达可以通过例如RT-PCR检测。还可以利用识别胰腺祖细胞的抗体来检测分化。如本文所述，已经被证实与成人胰腺外分泌细胞的细胞表面标志物反应的抗 -HPx1及抗-HPx2抗体与例如抗CD142抗体(Kelly等，2011)相类似，还可以被用于监控NKX6-1+胰腺祖细胞的发育。

在一个实施方案中，所述内胚层细胞群是从多能干细胞(PSC)例如胚胎干细胞(ESC)或诱导性多能干细胞(iPSC)分化的。

在一个实施方案中，所述多能干细胞来自哺乳动物如人。在一个实施方案中，所述多能干细胞为人ESC(hESC)或人iPSC(hiPSC)。

本文使用的术语“iPSC”和“诱导性多能干细胞”可以互换使用，是指从非多能细胞人工得到的多能干细胞(例如诱导或通过完全逆转)，所述非多能细胞典型地为人体细胞，例如通过诱导一种或多种基因(包括POU4F1/OCT4(基因ID：5460)，与以下组合但不限于以下：SOX2(基因 ID：6657)，KLF4(基因ID：9314)，cMYC(基因ID：4609)，NANOG(基因ID：79923)，LIN28/LIN28A(基因ID：79727))的表达。

在一个实施方案中，所述方法包括用于获得内胚层细胞群的步骤。例如，如本文所述，从多能干细胞例如ESC或iPSC分化为内胚层细胞涉及一系列步骤，表征于图1中包括阶段1至3。阶段1还被分为几个子阶段，例如包括例如第0～5天的三个子阶段。阶段2可以包括例如2～3天，阶段3可以包括例如1～4天。如Nostro等人(2011)和本文所述，阶段1可以包括在第0 天使多能干细胞群与ActA(或其它Nodal激动剂)和Wnt3a接触，第1天使所述细胞群与Act A，bFGF和任选的Wnt3a接触，和第2天使所述细胞群与ActA和bFGF接触，以产生阶段1分化的细胞。阶段2例如可以包括使要被分化的细胞群(例如阶段1分化的细胞)与成纤维细胞生长因子10 (FGF10)、任选的无翅-型MMTV整合位点家族成员3A(Wnt3a)和任选的Dorsomorphin接触，以产生阶段2分化的细胞。阶段3例如可以包括使要被分化的细胞群(例如阶段2分化的细胞)与Noggin、任选的环巴胺-KAAD (Cyc)(或任何其它刺猬(hedgehog，HH)信号传导抑制剂)、维甲酸(RA)、任选的FGF10和/或任选的Exendin-4接触，以提供内胚层细胞群。 Dorsomorphin能够被例如其它noggin组分例如chordin LDN 193189和BMPR 代替；ActA能够被其它Nodal激动剂代替，Wnt 3a能够被其它Wnt信号传导激动剂例如或其它wnt/β连环蛋白激动剂例如CHIR9902代替。同样地， bFGF和FGF10能够被其它FGF或分别激活与bFGF或FGF10相同受体的化合物代替。维甲酸能够被例如维甲酸类似物代替。所述方案可以例如为前述的方案(Nostro等人，2011)和/或修改过的方案(例如在第1天添加Wnt3a，从第5天至第7天添加Exendin-4，Ex-4)。变动包括例如从方案中省略了 FGF10和/或Exendin-4，以及利用例如CHIR99021(Stemgent 04-0004)替换Wnt3a。用于生成阶段3细胞的方案例如美国专利7,989,204、7,993,916、 8,129,182和8,187,878中所述，所述专利中的每一个通过引用并入本文。其中所述的方法可以用于获得阶段3的细胞，所述细胞还可以利用本文所述阶段4的任一方法分化(例如ENA、NENA、NExENA等)。

ActA为nodal激动剂。本文使用的术语“nodal激动剂”意为激活nodal 信号传导如“nodal”(例如人nodal，如基因ID：4338)或“激活素(activin)”的任意分子。本文使用的术语“激活素”或“ActA”是指“Activin A”(例如，基因ID：3624)，例如人激活素，以及其活性缀合物及片段，任选地包括自然存在的活性缀合物和片段，其例如可以激活nodal信号传导，以及其活性缀合物及片段，包括自然存在的活性缀合物及片段。

Wnt3A为wnt信号传导激动剂。本文使用的术语“wnt信号传导激动剂”意为激活肝细胞中wnt/β-连环蛋白受体信号传导的任意分子，包括例如 Wnt3a以及GSK3选择性抑制剂如CHIR99021(StemoleculeTMCHIR99021 Stemgent)，6-BromoIndirubin-3’-Oxime(BIO)(Cayman Chemical(货号： 13123))，或来自Stemgent(货号：04003)的StemoleculeTMBIO。CHIR99021 为GSK3的选择性抑制剂。设想的GSK3选择性抑制剂例如为在Wnt信号传导通路中GSK-3α/β的选择性抑制剂。

FGF10和bFGF为激活FGF受体信号传导的FGF成员。

本文使用的术语“FGF激动剂”是指例如细胞因子的分子，包括例如 FGF，或者是指激活FGF信号传导通路的小分子，例如结合和激活FGF受体。本文使用的术语“FGF”是指任意的成纤维细胞生长因子，例如人FGF1 (基因ID：2246)，FGF2(还被称为bFGF；基因ID:2247)，FGF3(基因 ID：2248)，FGF4(基因ID：2249)，FGF5(基因ID：2250)，FGF6(基因 ID：2251)，FGF7(基因ID：2252)，FGF8(基因ID：2253)，FGF9(基因 ID：2254)和FGF10(基因ID：2255)，任选地包括其活性缀合物及片段，包括自然存在的活性缀合物及片段。在某些实施方案中，FGF为bFGF、 FGF10、FGF4和/或FGF2。

如前述(Nostro等，2011)提供用于使多能干细胞分化至阶段3(例如第7天)而添加的组分的示例范围，和/或可以在下述浓度下使用的细胞因子和小分子：Activin A(Act1：10-1000ng/ml)，Wnt3a(阶段1：25ng/ml)， CHIR99021(阶段1：0.1-3μM)，bFGF(0.1-50ng/ml)，FGF10(5-500ng/ml)， Wnt3a(阶段2：3ng/ml)，Dorsomorphin(DM：0.25-0.75μM)，Noggin(NOG：1-500ng/ml)，环巴胺-KAAD(Cyc：0.5-2.5μM)，维甲酸(RA：0.02-2μM)，Exendin-4(Ex-4：5-500ng/ml)，EGF(1-500ng/ml)，烟酰胺(NA：1-100mM)。

也可以使用其它分化细胞而获得内胚层细胞群的方法。

因此，另外一个方面包括一种从多能干细胞细胞群产生NKX6-1+胰腺祖细胞的方法，所述方法包括步骤(或子步骤)a、b和c中的一个或多个和 d，所述步骤包括：

A)使多能干细胞群与以下的组合接触：

I)nodal激动剂(任选为ActA)和wnt信号传导激动剂(任选为 Wnt3a或CIHR99021)，

b)使阶段1分化的细胞与FGF激动剂(任选为FGF10)、和任选的wnt 信号传导激动剂(任选为Wnt3a)和/或noggin组分(任选为Dorsomorphin) 接触，以产生阶段2分化的细胞；

c)使阶段2分化的细胞与Noggin组分(任选为Noggin)、维甲酸(RA) 或RA类似物、和任选的环巴胺-KAAD(Cyc)、FGF激动剂(任选为FGF10) 和/或Exendin-4组分(任选为Exendin-4)接触，以提供内胚层细胞群；和

d)使内胚层细胞群与EGF组分、烟酰胺组分和/或Noggin组分接触，任选地与包含至少一种EGF组分和至少一种烟酰胺组分的组合接触，所述组合的量足以诱导内胚层细胞群的至少一部分分化为NKX6-1+胰腺祖细胞。

在一个实施方案中，阶段2(任选地代替Dorsomorphin)和/或还包括使所述细胞群与至少一种Noggin组分接触。

在一个实施方案中，所述步骤包括步骤a、b和c中的两个或更多个步骤。例如，本领域技术人员能够确认，要应用于阶段2细胞的方法或其等效方法还包括步骤c)和d)。类似地，取决于起始细胞群的子阶段，能够进行和/或排除a)的一个或多个子步骤。

本文使用的术语“阶段1细胞”意为这样的内胚层细胞，其至少表征为，如Nostro等人(2011)所述，人多能干细胞(hESC和hiPSC)以2D或3D 格式在体外分化后生成的包含SRY-盒的基因17(SOX17)(基因ID：64321) 和趋化因子(C-X-C基序)受体4(CXCR4)(基因ID：7852)的表达。

本文使用的术语“阶段2细胞”意为这样的内胚层细胞，其至少表征为，例如如Nostro等人(2011)所述，人多能干细胞(hESC和hiPSC)以2D 或3D格式在体外分化后生成的叉头框A2(FOXA2)(基因ID：3170)的表达和HNF1同源盒B(HNF1B)(基因ID：6928)的表达。

本文使用的术语“阶段3细胞”意为这样的内胚层细胞，其至少表征为，例如如Nostro等人(2011)所述，人多能干细胞(hESC和hiPSC)以2D 或3D格式在体外分化后生成的叉头框A2(FOXA2)(基因ID：3170)的表达。

本文使用的术语“阶段4细胞”意为这样的内胚层细胞，其至少表征为，例如如实施例1所述，人多能干细胞(hESC和hiPSC)在体外分化后生成的NK6同源盒1(NKX6-1)(基因ID：4825)的表达和胰腺与十二指肠同源盒1(PDX1)(基因ID：3651)的表达。

NKX6-1阳性祖细胞可以例如被用于在体内和/或体外生成产生胰岛素的细胞。

例如，根据本文所述方法产生的移植的NKX6-1阳性祖细胞分化为产生胰岛素的细胞，如本文实施例3证实。

在一个实施方案中，采用PKC激活剂如indolactam V和/或PDBu培养细胞，例如阶段3细胞。其它化合物可以包括ITS(即胰岛素硒转铁蛋白，其与采用B27补充剂类似)；CYP26A抑制剂，任选为N-{4-[2-乙基 -l-(lH-1,2,4-三唑-l-基)丁基)]苯基}-l,3-苯并噻唑-2-胺。

另一个方面，还提供一种从阶段3内胚层细胞和/或从阶段4胰腺前体细胞产生产生胰岛素的细胞的体外方法，所述方法包括将阶段3和/或阶段4 细胞与内皮细胞共培养。在一个实施方案中，所述方法包括：在CD34+内皮细胞的存在下培养内胚层细胞。

所述共培养例如在补充了bFGF(如50ng/ml)和VEGF(100ng/ml) 的NENA和/或NENaEx培养基中进行，但还可以在任意培养基中进行，其培养基可以为允许胰腺和内皮细胞存活的，如EndoGRO(Millipore)、MV2 培养基(Promocell)、BD内皮细胞培养基。所述培养基任选地包含以下中的一种或多种：Noggin组分，EGF组分，烟酰胺组分和Exendin-4组分，以及一种或多种bFGF(或其它FGF)和VEGF(或通过VEGF受体KDR激活信号传导的其它化合物)。在一个实施方案中，所述培养基包含Noggin组分、 EGF组分、烟酰胺组分、bFGF和VEGF。在一个实施方案中，胰腺祖细胞被聚集。为了聚集胰腺祖细胞，单层培养物可以通过移液管机械分开，或者可以酶促解离然后通过在低附着板中孵育或通过摇动细胞群聚集。

在一个实施方案中，NKX6-1阳性胰腺祖细胞被聚集，所述聚集体与 CD34+内皮细胞共培养。所述聚集体可以直接接种在CD34+内皮细胞上或被允许扩散的生物材料分离，所述生物材料如膜或其它装置。所述培养物能够保持例如另外的7、8、9、10或更多的天数，任选地在包含NENAEx的培养基中，任选地具有5ng/ml bFGF和100ng/ml VEGF。

内皮细胞可以例如为源自hESC的。例如，用BMP4、bFGF和VEGF 中的一种或多种的组合能够诱导培养物中的hESC。在足够的时间后，例如 6天，可以在适合的培养基中，如在补充了例如bFGF和VEGF的EGM-2 培养基(Lonza)中，进行CD34+细胞的分选和培养。足够的时间例如包含长为足以诱导KDR、CD31、VE-钙粘蛋白、VEGF受体和vWF中的一种或多种和/或包含摄取乙酰化LDL的能力的诱导时间，例如图8所示。

在一个实施方案中，从H1hESC细胞系得到内皮细胞。所述方案能扩展至任何的hESC细胞系和hiPS细胞系。

在一个实施方案中，内皮细胞在EGM-2培养基中培养。其它任何市售的内皮细胞培养基均为适合的。

检测产生胰岛素的细胞可以包括例如使用流式细胞术检测c-肽阳性和/ 或胰岛素和/或采用例如RT-PCR检测胰高血糖素表达。

在一个实施方案中，例如与内皮细胞共培养后所生成的产生胰岛素的细胞为单激素的。

本文使用的术语“产生胰岛素的细胞/胰岛素产生细胞”是指从分泌胰岛素的胰腺前体分化的细胞。产生胰岛素的细胞包含功能性胰腺β细胞，以及胰腺β-样细胞，所述胰腺β-样细胞以构成型和诱导型方式合成、表达、或分泌胰岛素。根据本文所示的方法例如通过使内皮细胞分化为胰腺前体且随后分化为产生胰岛素的细胞的胰岛素产生细胞群，可以为功能性胰腺β-细胞或β-样细胞(例如具有内源功能性β细胞至少两个特征的细胞)。还可以预期的是，例如通过本文所揭露的方法产生的胰岛素产生细胞群，可以包含胰腺β-细胞或胰腺β-样细胞，还可以包含非产生胰岛素的细胞(例如具有β细胞样表型、但例外的是不产生或分泌胰岛素的细胞)。

本发明还在另一个方面提供内皮细胞，其可用于在体外促进NKX6-1⁺胰腺前体的成熟用。这可用于确定生成的产生胰岛素的细胞是否是功能性的或是否预期是功能性的(例如，这些产生胰岛素的细胞是否共表达任何其它胰腺基因，如PDX1和NKX6-1)。本申请所公开的方法中，使用人内皮细胞 (或其组分)与胰腺祖细胞共培养，产生共表达PDX1和NKX6-1的胰腺细胞系。预期本文所公开的细胞是功能性的。如本发明所示，源自hESC的内皮细胞代表了适合的细胞群，其从hPSC诱导产生胰岛素的细胞并使所述细胞成熟。

因此，在一个实施方案中，所述方法从内皮层细胞群诱导高于约10％、 20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、 80％、85％、90％或约95％的NKX6-1阳性胰腺祖细胞的产生，和/或例如从 NKX6-1阳性胰腺祖细胞诱导高于约5％、10％、15％、20％、25％、30％、 35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或约95％的产生胰岛素的细胞。

所述细胞可以收获为混合细胞培养物(例如在适合的稀释剂向下旋转或悬浮)

在某些实施方案中，所述方法还包括富集和/或分离例如NKX6-1阳性胰腺祖细胞和/或NKX6-1阳性胰腺β细胞。

在一个实施方案中，所述分离步骤包括使细胞群结合NKX6-1阳性细胞的特异试剂接触。

还被证实的是，例如在实施例4中，定向于HPx1和HPx2的抗体可以被用于富集NKX6-1阳性细胞。具体而言，HPx1和HPx2抗体被证实为允许富集NKX6-1阳性胰腺祖细胞。

因此，在一个实施方案中，所述方法包括使含有NKX6-1阳性细胞的细胞群与HPX表位检测抗体接触。

本文所用的“HPX表位检测抗体”包括例如指定为HPx1和HPx2的抗体以及识别与HPx1或HPx2相同表位的抗体，所述指定为HPx1和HPx2的抗体可以从例如俄勒冈健康与科学大学(Oregon Health&Science University) (HPx2＝OHSU#1038I)、β-细胞生物学协会(Beta Cell Biology Consortium) (HPx2＝AB2195和HPx1＝AB2194)、Novus Biologicals(Hpx1＝NBP1-18951， HPx2＝NBP1-18952)获得。例如，包含与HPx1和/或HPx2抗体相同CDR序列的抗体，包括例如人源化和嵌合形式，检测与HPx1和/或HPx相同的表位。

本文还证实了，NKX6-1阳性祖细胞表达SOX9、PTF1a和SOX9，还被称为SRY盒9，为一种转录因子；PTF1a，还被称为胰腺特异性转录因子1a。

在一个实施方案中，所述方法包括分离/富集NKX6-1⁺胰腺前体，包括使包含胰腺祖细胞的细胞群与HPx1和/或HPx2的抗体接触，和分离或部分纯化HPx1和/或HPx2结合的细胞亚群。

在另一个实施方案中，所述方法包括分离/富集NKX6-1⁺胰腺前体，包括使包含胰腺祖细胞的细胞群与HPx1和/或HPx2的抗体接触，并与CD142 的抗体组合分离或部分纯化HPx1和/或HPx2和CD142结合的细胞亚群。

在一个实施方案中，所述HPx1和/或HPx2和/或CD142抗体缀合至珠子，例如磁珠。在一个实施方案中，所述富集包括细胞分选例如通过荧光激活细胞分选(FACS)。

实施例4例如示出了，在第13天，HPx染出了近于60％的NENA诱导的NKX6-1GFP阳性细胞。

对于染出NKX6-1⁺前体细胞群的两个抗体(HPx1和HPx2)的鉴别有利于例如监测、量化和纯化源自hPSC的胰腺祖细胞。

本文披露之前，已知抗体HPx1和HPx2抗体(本文统称为“HPx”)检测成人外分泌细胞(Dorrell等，2008)，但并未有指示或证据显示这些抗体识别胰腺前体。这些抗体的使用有利于鉴别、监测、和分离胰腺祖细胞，该胰腺祖细胞源于例如hESC/hiPSC或来自其它来源，其方式为各种下游应用保持了它们的活力。

所述HPx抗体例如可以与其它抗体如CD142组合，以任选地进一步增加了在富集的和/或分离的细胞群中的NKX6-1阳性细胞的数量。

因此，在一个实施方案中，所述方法包括富集和/或分化NKX6-1阳性胰腺祖细胞群，其中，在分离的细胞群中至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多的总细胞为NKX6-1阳性胰腺祖细胞。

所述分离/富集方法还可以包括例如利用其他试剂，如其它胰腺前体表面标志物如CD142的抗体。

在一个实施方案中，所述包含NKX6-1阳性细胞的细胞群为根据本文所述方法产生的NKX6-1阳性细胞群。

本文使用的术语“分离的细胞群”是指已从混合或杂合的细胞群中取出和分离的细胞群。在一些实施方案中，与所述细胞从其分离或富集的杂合的细胞群相比较，分离的细胞群为基本上纯的细胞群。

关于特定细胞群的术语“基本上纯的”是指，关于构成总细胞群的细胞，至少约65％、优选地至少约75％、至少约85％、更优选地至少约90％、和最优选地至少约95％纯的细胞群。同样地，关于“基本上纯的”NKX6-1阳性胰腺祖细胞群是指包含的为非本文所定义的NKX6-1阳性胰腺祖细胞或其后代的细胞少于约30％、少于约20％、更优选少于约15％、10％、8％、7％、最优选少于约5％、4％、3％、2％、1％、或少于1％的细胞群。在一些实施方案中，本发明涵盖的方法还扩展NKX6-1-阳性胰腺祖细胞群，其中，所述扩展的NKX6-1-阳性胰腺祖细胞群为基本上纯的NKX6-1-阳性胰腺祖细胞群。

术语“富集”或“富集的”可在本文互换使用，意为相比于在起始培养物或制备物的一种细胞类型的级分，所述细胞类型的产量(级分)增加了至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约 60％。可以互换使用富集和部分纯化。

组合物和试剂盒

如上文所述，可以分离NKX6-1胰腺祖细胞和分化的产生胰岛素的细胞。因此另一个方面包括例如根据本文所述方法产生的富集的、纯化的或分离的 NKX6-1胰腺祖细胞群的细胞群和/或分化的产生胰岛素的细胞。另一个方面包括一种组合物，其包含富集的、纯化的或分离的NKX6-1胰腺祖细胞群的细胞群和/或分化的产生胰岛素的细胞；以及适合的稀释剂。

适合的稀释剂包括例如适合的培养基，或冷冻培养基，所述冷冻培养基包含例如血清、血清替代物或血清补充剂和/或适合的冷冻保护剂，如二甲基亚砜(DMSO)、甘油甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮。

另外一个方面包括培养基补充组合物，该组合物包含EGF组分、烟酰胺组分和/或Noggin组分，可以用作细胞培养基础培养基的补充剂。所述补充剂还可以包含如本文所述的其它组分，如抗坏血酸、L-谷氨酰胺和B27。在一个实施方案中，所述补充剂包含的活性成分为：Noggin，EGF，烟酰胺， (例如NENA补充剂)和任选的抗坏血酸、L-谷氨酰胺和B27中的一种或多种。在其它实施方案中，所述补充剂包括例如Exendin-4组分(例如 NENAEx补充剂)。

用于从内胚层细胞分化NKX6-1+细胞的组分可以包含作为单一补充剂以被加入至基础培养基如DMEM(或例如IMDM、RPMI、CMRL)中。在一个实施方案中，所述补充剂包含以下活性成分：Noggin，EGF，烟酰胺，抗坏血酸，L-谷氨酰胺和B27。

另外一个方面是培养基组合物，其适用于使细胞从一个阶段分化为另一个阶段。例如，适合的阶段4培养基组合物可以包含例如EGF组分和/或烟酰胺组分、任选的Noggin组分、和/或另外其它生长因子等，本文所述任选的Exendin-4组分，例如其可以促进阶段4分化。

本文提及的术语“细胞培养基”(这里还被称之为“培养基”)是指用于培养细胞的培养基，其包含保持细胞活力和支持增殖以及任选的分化的营养物。所述细胞培养基可以包含下述任意适合的组合：一种或多种盐，一种或多种缓冲剂，氨基酸，葡萄糖或其它一种或多种糖，抗生素，血清或血清替代物，以及其它组分如肽生长因子，维生素等。本领域技术人员已知，细胞培养基通常用于特定细胞类型。

所述适合的培养基可以包括适合的基础培养基，包括例如DMEM(生命科技公司(Life Technologies))、IMDM、RPMI、CMRL，和/或支持内胚层细胞生长的任意其它培养基，以提供例如可以向其添加组分和任选的其它试剂的基础培养基组合物(例如，以提供适合的阶段4培养基组合物)。

可以制备阶段特定培养基，例如阶段4培养基(例如NENA或NENAEx 培养基)。所述培养基可以例如用于培养内胚层细胞群以诱导NKX6-1阳性分化。

因此，另一个方面是培养基组合物，包含：

细胞基础培养基；和

以下中的一种或多种：i)EGF组分；

ii)烟酰胺组分，和

iii)Noggin组分，和

iv)任选的Exendin-4组分。

所述培养基组合物(或基础培养基)还可以包含一种或多种抗生素如青霉素和链霉素；一种或多种氨基酸如L-谷氨酰胺(生命科技公司)、血清替代物B27补充剂(生命科技公司)和/或一种或多种维生素如L-抗坏血酸(西格玛公司)。例如实施例8所提供的适合的配方。

所述补充剂中的组分的量可以例如为，当其稀释于培养基中(例如当稀释于450m的基础培养基中)，导致如本文所述用于使例如内胚层细胞群分化的浓度的量。同样地，所述培养基中组分的浓度可以是本文所述用于使例如内胚层细胞群分化的浓度。

还有一个方面包括一种试剂盒，其包含：

EGF组分，

烟酰胺组分，和/或

Noggin组分和/或

任选的Exendin-4组分。

如上文所述，所述组合物和试剂盒组分可以包括本文其它部分所述的任意组分和任选的使用说明。例如，在一个实施方案中，所述试剂盒包括补充剂，所述补充剂包含组分等，以如本文所述诱导一个或多个阶段的分化(例如阶段4的补充剂)。在一个实施方案中，所述试剂盒包含基础培养基，任选为本文所述的基础培养基。

用途

所述源自HPSC的NKX6-1+胰腺前体(例如富集的HPx1/2)和它们的β细胞生成物(derivative)可以用于多种应用。

例如，所述NKX6-1胰腺祖细胞可以被用于预测药物毒理学和药物发现。

因此，在一个实施方案中提供了试验，其包括：使由本文所述方法生成的表达NKX6-1的细胞群与试验化合物接触，并确定所述试验化合物与对照比较，是否：1)刺激扩展，2)触发细胞凋亡，和/或3)诱导NKX6-1表达细胞分化为产生胰岛素的β-样细胞，分化为其它激素分泌细胞(例如生长抑素、胰高血糖素、胰腺多肽和ghrelin)、腺泡或导管细胞。本领域已知的试验可以用于例如评估细胞凋亡和/或细胞扩展。通过测量激素产生，任选为激素分泌，或通过评估mRNA水平，可以评估至产生激素的细胞的分化。

通过提供用于与试验化合物接触的更均匀细胞群，HPX抗体的用途可以有利于化合物的筛选。此外，通过与内皮细胞共培养富集产生的胰岛素+细胞的细胞群可以用于测试能触发增殖或凋亡的化合物，以及测试能促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌的化合物。

例如实施例3所示，所述细胞还能用于细胞移植。例如，混合细胞群、富集的和/或分离的NKX6-1阳性胰腺祖细胞和/或NKX6-1阳性的胰岛素产生细胞可以被引入有此需要的受试者中，例如用于治疗糖尿病和/或糖尿病前期病症。

因此一个方面包括根据本文所述方法获得细胞和/或制备胰腺祖细胞和/ 或产生胰岛素的细胞，以及将所述细胞施用至有此需要的受试者中，例如患有糖尿病的受试者。

还包括所述细胞和包含所述细胞的组合物在移植和/或治疗有此需要的受试者的用途，例如用于移植和/或治疗患有糖尿病的受试者。

在一个实施方案中，所述糖尿病为I型糖尿病。在另一个实施方案中，所述糖尿病为II型糖尿病。

在一个实施方案中，所述NKX6-1阳性胰腺祖细胞和/或β细胞在组织工程中使用。例如，获得纯化的胰腺细胞群将使得能够生成具有限定的胰腺细胞数的工程化构建体。

在一个实施方案中，所述方法应用于患者特异性hiPSC和用于例如糖尿病建模。例如，患有糖尿病的患者的胰腺细胞或其它细胞可以被分离，经处理后获得hiPSC，所述hiPSC然后可以经培养和诱导而分化为NKX6-1胰腺祖细胞。这些细胞能被用于评估所述疾病的特征，如所述疾病或对患者的免疫细胞的响应中所涉及的基因。

例如，正常细胞和患者特异性疾病hiPSC能够被诱导为NKX6-1阳性胰腺细胞和内皮细胞，并进行比较。例如，可以进行来自正常细胞和患者特异性hiPSC的胰腺前体和β细胞的基因分析，表观遗传分析和蛋白质组学分析。这些详细分析能够导致发现信号传导途径、转录调控网络和/或调节正常人胰腺发育的细胞表面标志物以及在疾病中具有作用的那些。

本文使用的术语“受试者”包括所有动物界成员，包括哺乳动物，适合地指人。

术语“治疗”、“处理”等，如应用于分离的细胞，包括使细胞经受任何种类的过程或条件，或在细胞上进行任何种类的操作或程序。如应用于受试者，所述术语是指给个体提供药物或手术关注、护理或管理。

本文使用的术语“治疗”或“处理”，如应用于受试者，是指以获得有益或预期效果包括临床效果为目标的方法，所述方法包括医疗程序和应用，包括例如药物干预、手术、放疗和自然疗法干预以及试验处理，以用于治疗糖尿病。有益或预期临床效果包括但不限于，缓解或改善一种或多种症状或病症，减小疾病程度，稳定(例如不再恶化)疾病状态，防止疾病蔓延，延迟或延缓疾病进展，改善或缓解疾病状态，以及缓解(全部或部分)，无论可检测或无法检测的。“治疗”或“处理”可还意为，如果不能治愈，相对于预期生存来说延长生存。

本文使用的术语“施用”、“引入”和移植”在将细胞(例如NKX6-1阳性胰腺祖细胞，或其分化的后代(例如产生胰岛素的细胞如胰腺β-细胞)) 递送至受试者的上下文中可互换使用，其通过导致所引入细胞在所需部位至少部分定位的方法或途径进行。可以将细胞直接植入胰腺，或通过任何适合的途径施用，所述途径导致递送至受试者中的所需位置，在该处，至少一部分植入的细胞或细胞组分保持活力。

此外，在特定部分所述的定义和实施方案预期可应用到本文所述的它们适合地其它实施方案中，如本领域技术人员理解的。例如，以下段落中，详细解释本发明的不同方面。对每个方面的解释可以结合任何其它一个或多个方面，除非清楚指明相反情况。特别地，任何表示为有利或优选的特征可以结合表示为有利或优选的任何其它一个或多个特征。

上述内容概述了本申请。通过引用下述具体实施例，能够获得更全面理解。所述实施例仅仅为示例性说明而进行描述，其不意在限制本发明的范围。形式变化和等同物替换预期为可以得到或可以接受的情况。虽然本发明使用了特定术语，这样的术语意在描述性说明，并非用于限制目的。

以下非限制性实施例是本发明的示例。

实施例1

Noggin、EGF、烟酰胺和Exendin-4在源自hESC的内胚层细胞中诱导NKX6-1表达。

具备生成功能性β细胞潜力的胰腺祖细胞的特征在于以下关键转录因子的表达：PDX1，SOX9，NKX6-1和PTF1A。NKX6-NKX6-11有特殊意义，因为其对于功能性β细胞群的发育必不可少(Sander等，2000)。目前为止，对来自PDX1胰腺内皮层的这些前体的发育进行调节的因子还是未知的。

本文所述的一个稳健的方法是从具有生成功能性β细胞的潜力的hPSC 生成NKX6-1+内胚层细胞。利用hESC-受体细胞系(其中通过同源重组使 GFP靶向NKX6-1基因座)，可以鉴别能够诱导NKX6-1-GFP⁺细胞群发育的因子。采用这种方法，经过7天，hPSC分化为“胰芽期”(PDX1⁺表达细胞)，其中利用之前公开的方案(Nostro等，2011，这里通过引用并入)。然后这些细胞在一种或多种组分中培养，所述组分任选地为BMP抑制剂(Noggin 或其它BMP激动剂)、EGF(或EGF相关因子)、烟酰胺和Exendin-4 (NENAEx)(图1)的组合，在不同时间分析所述细胞的NKX6-1-GFP表达。在NENAEx中在3天培养物内，使用流式细胞术测量出NKX6-1-GFP 表达(图2)。

图1示意性显示出，根据前述方案(Nostro等，2011)，HPSC被分化为阶段3(第7天)，其中对前述方案做了细微修改(在第1天添加了Wnt3a，第5～7天添加了Exendin-4，Ex-4)。使用的细胞因子和小分子的浓度为： Activin A(Act1：100ng/ml)，Wnt3a(阶段1：25ng/ml)，bFGF(5ng/ml)， FGF10(50ng/ml)，Wnt3a(阶段2：3ng/ml)，Dorsomorphin(DM：0.75μM)，Noggin(NOG：50ng/ml)，环巴胺-KAAD(Cyc：2.5μM)，维甲酸(RA： 2μM)，Exendin-4(Ex-4：50ng/ml)，EGF(50ng/ml)，烟酰胺(NA：10mM)。

图2证实了Noggin、EGF、烟酰胺和Exendin-4在源自hESC的内胚层细胞中诱导NKX6-1:GFP表达。在NKX6-1^GFP/w hESC系胰腺分化的过程中动力学分析GFP(第7～17天，T7-T17)。根据出版的方案(Nostro等，2011)， NKX6-1^GFP/w细胞分化至阶段3，然后用Noggin(50ng/ml)、EGF(50ng/ml)、烟酰胺(10mM)和Exendin-4(50ng/ml)处理11天。使用流式细胞术测量GFP，在第10天开始被检测出，在第13天达到分化的最高表达。误差线代表平均值计算的标准误差(n＝3)。

在接下来的3天(例如培养第11～13天)，NKX6-1-GFP+细胞的比例急剧增加，到第13天，显示大于整个培养物的60％。在接下来的2天， NKX6-1-GFP水平保持不变，到培养的第17天略有下降。

分子分析(RT-qPCR)显示，在第9～11天NKX6-1表达上调，然后为至第17天的稳定下降(图3)。

图3表明，NKX6-1诱导与PDX1、PTF1A和SOX9表达相一致。 NKX6-1^GFP/w hESC细胞系的胰腺分化过程中，动力学分析GFP(第7～17天， T7-T17)期间QPCR分析NKX6-1、PDX1、PTF1A和SOX9。根据公开的方案(Nostro等，2011)，NKX6-1^GFP/w细胞分化至阶段3，然后采用Noggin (50ng/ml)、EGF(50ng/ml)、烟酰胺(10mM)和Exendin-4(50ng/ml) 处理11天。将表达水平相对于看家基因TBP归一化，并与成人胰腺(AP，灰色条)表达水平比较。误差线表示平均值的标准误差(n＝2)。

mRNA动力学和GFP表达的差别可以反映转基因表达的延迟，还可以反映NKX6-1信息和GFP蛋白质稳定性的差别。PDX1在前几天，第7～8天，表达上调(图3)。PDX1表达水平在第10天达到最高，随后的7天内减少。 PTF1A的表达模式是短暂的，在分化的第10～14天被检测出。SOX9在第8～10 天表达上调，随后在整个实验期间保持相对稳定。这些研究结果综合起来证实了，NENAEx的组合诱导了从胰腺内胚层的内分泌祖细胞的发育。

实施例2

Noggin、EGF和烟酰胺(NENA)的组合在源自hESC的内胚层细胞中诱导NKX6-1表达。

为进一步确定哪种NENAEx因子的组合对于NKX6-1⁺祖细胞的生成必不可少，在报告NKX6-1-GFP hESC上以及在第二未经处理的hESC细胞系 H1上测试不同组合(WA01)。利用细胞内流式细胞术评估NKX6-1⁺细胞在源自H1的细胞群中的比例。图4表明，Noggin、EGF和烟酰胺(NENA) 的组合与以下的4因子即Noggin、EGF、烟酰胺和Exendin-4的组合相比，诱导NKX6-1的效果相同。EGF和烟酰胺(ENA)的组合确实诱导NKX6-1 表达(46.9±7.4％)，然而表达水平相较于3因子(NENA)的组合而言较低 (图4A)。H1(WA01)分化显示了非常类似的响应NENA处理(图4)的模式。使用H9细胞系已获得类似的数据，这证实了这个诱导方案不是细胞系依赖性的，而是可广泛地用于源自hPSC的NKX6-1前体的生成。

图4A证明，使用NKX6-1^GFP/w HESC细胞系，当在Noggin、EGF、烟酰胺(含有或不含有Exendin-4)的存在下培养内胚层细胞时，与没有处理或上述化合物的各种组合相比较，NKX6-1:GFP+细胞的百分比最高。

图4B的图显示，使用H1(WA01)HESC细胞系，当在Noggin、EGF、烟酰胺(含有或不含有Exendin-4)的存在下培养内胚层细胞时，与没有处理或上述化合物的各种组合相比较，NKX6-1+细胞的百分比最高。

实施例3

利用所述“NENA处理”生成的NKX6-1细胞具有生成胰岛素产生细胞的潜力。

为建立富集的源自hPSC的NKX6-1细胞群的发育潜能，将5-10x10⁶ NENA-诱导的细胞移植入(分化第14天)免疫功能低下的小鼠的乳腺脂肪垫。移植后4周的移植分析显示出导管样结构(例如CK19+)的出现，该导管样结构维持了PDX1和NKX6-1表达。在这个阶段，移植物含有很少的胰高血糖素⁺细胞并且几乎不含胰岛素⁺细胞(图5A)。移植后6周，所述移植物含有大量NKX6-1⁺细胞(图5B)。所述6周的移植物相较于4周的移植物而言含有较高百分比的胰岛素⁺细胞(图5B)。这些胰岛素⁺细胞均共表达 NKX6-1(图5B)。为了证明移植物中存在的胰岛素⁺细胞代表了源自hPSC 的胰岛素产生细胞，利用抗-人-c-肽抗体进行免疫组织化学。如图5B所示，所述移植物确实包含有c-肽+细胞，从而证实所述胰岛素正在被所述人细胞产生而并非从血液中摄取。此外，与抗胰高血糖素抗体共染显示出，c-肽⁺细胞不表达胰高血糖素，从而指明这些肽+细胞不是多激素的(图5B)。在这些移植研究中的发现证实，，NENA诱导的前体能够移植后在体内分化为产生胰岛素的细胞和导管细胞。

实施例4

HPx抗体标记NKX6-1+前体

近期的研究发现，表面标志物CD142作为潜在表位，能够用于从源自 hPSC的培养物中分离出多能胰腺前体(Kelly等，2011)。通过对不同抗体的文库的分析，发现前述两个抗体HPx1和HPx2染色了一部分NKX6-1⁺祖细胞群。如图6所示，在培养的第13天，HPx(例如HPx1和/或HPx2)染出了近60％的NENA诱导的NKX6-1-GFP⁺细胞群。HPx还染出了 NKX6-1-GFP^-阴性细胞群。在没有被处理的培养物中，检测到很少量的HPx⁺细胞，从而证实HPx染色与NKX6-1⁺前体的出现良好相关。如Kelly等(Kelly 等，2011)报道，所述抗-CD142抗体标记了显著部分的NKX6-1-GFP细胞群(图6C)。但是，尽管存在在这些条件下检测到很少NKX6-1⁺细胞的事实，未经诱导的培养物还包含了大量的CD142细胞群(图6C)。这些研究表明， CD142的表达与NKX6-1⁺前体的发育未良好相关。HPx的染色模式表明，其为用于监测NKX6-1⁺前体发育和用于从混合细胞培养物中分离NKX6-1⁺前体的优良试剂。

实施例5

HPx抗体可以用于纯化富集NKX6-1阳性细胞的细胞群。

实施两个试验来比较HPx(例如可互换使用HPx、HPx1、HPx2、Px、 Px1和Px2：HPx1和HPx2识别相同的细胞群，并且可互换使用HPx1和HPx2，和/或一起使用)相对于CD142抗体(图7)。

将对于所述两个抗体呈阳性和阴性的细胞从第14天NENA分化的细胞中分离，并且测定表达最高水平NKX6-1的级分(图7A和10)。

这些结果表明，HPx可以用于富集NKX6-1阳性细胞。CD142+和Px2+ 级分显示NKX6-1表达水平的增长为分选前(PS)细胞群的2倍。虽然两个抗体可以用于富集NKX6-1阳性细胞，HPx显示较高的特异性(见图6C) 并且提供较高的细胞产量(在相同的时间框架中，利用HPx相较于利用 CD142，可以分离近3倍更多的细胞)。

所述两个抗体(CD142和HPx)还可以组合用于从第14天NENA分化的细胞中分选Px2+和CD142+细胞，并且在不同级分中评估NKX6-1的表达水平：分选前(PS)，Px2-CD142-，Px2+CD142-，Px2+CD142+，Px2-CD142+ 分选的细胞群(图7B)。NKX6-1在Px2+CD142+双阳性细胞群的表达水平最高，然而，超过PS的增长倍数与单一CD142+或单一Px2+细胞群相同，这表明双重分选的优势不大。

图7显示，在分选前(PS)、从第14天NENA分化的H1(WA01)细胞Px2+、Px2-、CD142+、CD142-分选的细胞群中，定量PCR(QPCR)分析NKX6-1。(B)在分选前(PS)、从第14天NENA分化的H1WA01)细胞Px2-CD142-、Px2+CD142-、Px2+CD142+、Px2-CD142+分选的细胞群中，定量PCR(QPCR)分析NKX6-1。误差线代表平均值的标准误差(对于A， n＝2；对于B，n＝3)。将NKX6-1表达相对于看家基因TBP(TATA-结合蛋白)归一化。

实施例6

能够促进c-肽⁺细胞成熟的内皮细胞的生成。

利用H1hESC细胞系，通过用BMP4、bFGF、VEGF的组合的诱导，生成源自HES的内皮细胞。在第6天，分选CD34⁺并且在EGM-2培养基 (Lonza)中进行培养，所述培养基补充了bFGF50ng/ml和VEGF 100ng/ml。第6天CD34⁺细胞的分析显示，其表达KDR、CD31和vWF，并显示出摄取乙酰化LDL的能力(图8)。

可以使用任何内皮细胞群，特别是源自胚胎干细胞的内皮细胞。

实施例7

共培养源自hESC的内皮细胞和胰腺前体，增加NKX6-1+祖细胞群并促使其成熟为产生胰岛素的细胞。

为了这些研究，在培养的10天，从NKX6-1-GFP报告细胞系生成的 NENAEx诱导的前体被聚集，然后这些聚集体被接种于汇合的源自hESC的 CD34+内皮细胞上。在含有NENAEx的培养基中，这些培养物再保持7天，所述培养基具与bFGF 5ng/ml和VEGF 100ng/ml。作为对照，在不含内皮细胞的情况下，将细胞保持为单层，或将聚集置于胶原涂层的培养皿上培养。如图9A所示，与培养为单层的那些细胞或作为胶原上的聚集体相比较，在内皮细胞上培养的细胞保持了更高比例的NKX6-1-GFP+细胞。针对不同细胞群分析胰岛素产生细胞的存在，显示出显著差异。只有与内皮细胞共培养的聚集体生成了显著数量的c-肽+细胞。近33％的NKX6-1-GFP+为c-肽+，为全部聚集体细胞群的17％(53％GFP细胞中的33％)。RT-qPCR分析证实了流式细胞术分析并表明只有与内皮细胞共培养的细胞群表达了胰岛素和胰高血糖素信息二者(图9B)。这些发现证实，源自hESC的内皮细胞能够支持来自NKX6-1+前体的c-肽+细胞的成熟。c-肽+细胞共表达NKX6-1-GFP 的事实明显说明了其为单激素β细胞。

实施例8

表1：阶段4MEDIUM组合物的示例性制剂

*DMEM可以被其它基础培养基如IMDM、RPMI、CMRL、或者任何其它支持内胚层细胞生长的培养基替代。基础培养基包含抗生素：青霉素/ 链霉素(生命科技公司)。

**Exendin-4并非NKX6-1诱导的必要成分。

与内皮细胞共培养以生成胰岛素+细胞通过添加bFGF和VEGF(安迪生物科技公司)得到支持。

实施例9

后前肠(阶段3)细胞群的标志物。阶段3内胚层细胞必须至少表达 FOXA2，且可以为PDX1阳性或PDX1阴性的(其它因子如HNF1β，肝细胞核因子4，α(HNF4A)基因ID：3172和一个切割同源盒1(ONECUT1/HNF6) 基因ID：3175也可以例如被表达)。

胰腺祖细胞群(阶段4)的标志物。分化为NKX6-1+胰腺前体的细胞，除了能够表达NKX6-1，还可以表达FOXA2、PDX1、SRY(性别决定区Y) -盒9(SOX9)基因ID 6662和胰腺特异性转录因子，1a(PTF1A)基因ID： 256297。

实施例10

Noggin组分的实例：

·Noggin

·BMPR1A

·BMPR1B

·Dorsomorphin

·LDN 193189

·CHORDIN

·或上述的组合

实施例11

EGF组分的实例：

·EGF

·双调蛋白(AR)

·转化生长因子α(TGFα)

·Betacellulin(BTC)

·肝素结合EGF(HB-EGF)

·Epiregulin(EPR)

·神经调节蛋白(NRG1、NRG2、3NRG4)

或者上述的组合，和EGF因子，其可以影响下游信号传导分子包括例如MAPK或PI3-激酶激活剂。

实施例12

烟酰胺组分的实例：

·聚(ADP-核糖)合成酶抑制剂，例如苯甲酰胺和3-氨基苯甲酰胺 (Otonkoski等，1993)；

·Sir-2抑制剂，例如sirtinol、M15、splitomicin(Bitterman等， 2002)；

·其它HDAC抑制剂，包括例如AN-9、CI-994、FK228、LAQ-824、 MS275、SAHA、丙戊酸、TSA、丁酸钠(Bitterman等，2002)。

实施例13

表2：采用人ES细胞系H9(WA09)，分化第13天的NKX6-1+细胞的百分比

实施例14

源自HPSC的胰腺前体(富集的HPx1/2)和其β细胞生成物能够被用于预测药物毒理学和药物发现。

具体来说，利用本文所述培养条件生成的NKX6-1表达细胞群可以被用于鉴定化合物是否：1)刺激扩展，2)触发细胞凋亡，3)诱导NKX6-1表达细胞分化为β-样细胞，以及分化为其它激素产生细胞(生长抑素、胰高血糖素、胰腺多肽和ghrelin)、腺泡或导管细胞。HPX抗体的使用可以通过提供同质细胞群而有利于化合物筛选。此外，通过与内皮细胞共培养生成的富集了胰岛素+细胞的细胞群能够用于测试能触发增殖或凋亡的化合物，以及用于测试能促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌的化合物。

实施例15

1)细胞移植入糖尿病动物模型，以测试体外生成的NKX6-1阳性和/或胰岛素阳性细胞的有效性和功能性。简言之，向不同的免疫缺陷动物模型中移植细胞，其中可以遗传诱导糖尿病或通过药物处理诱导糖尿病(例如链唑霉素处理)，然后通过在动物血清中测定血糖浓度和人C-肽水平来评估源自人-PSC的胰腺细胞(NKX6-1阳性和/或胰岛素阳性)的功能性。

2)细胞移植：a)移植前体细胞群相对于移植功能性β细胞的效果比较， b)移植HPx1/2富集的胰腺前体相对于移植由确定数目的胰腺细胞和其它包含内皮细胞和成纤维细胞的细胞类型组成的混合细胞系群的效果比较。

实施例16

按照实施例1所述，利用NENA制备胰腺祖细胞。如图10所示，利用荧光激活细胞分选(FACS)分离HPx1+细胞，并且富集与HPx1细胞和分选前细胞(PS)相比较表达较高水平NKX6-1/TBP、SOX9/TBP、和PTF1a/TBP mRNA的细胞群。

实施例17

如实施例1所述，使用“NENA”处理生成NKX6-1+胰腺细胞，并将该 NKX6-1+胰腺细胞移植入免疫功能低下小鼠中。这些细胞根据响应于葡萄糖挑战的人C-肽分泌所指示，生成产生胰岛素的功能细胞。在H1(WA01)第 13天分化的细胞移植入免疫功能低下小鼠后第6、12、18周，利用ELISA 测量响应于葡萄糖挑战的人C-肽分泌水平(图11)。进行5次移植(标记为 1，2，3，4和5)加上移植对照细胞(标记为“对照”)。小鼠1、3、4和5 的血清c-肽水平明显升高。

虽然本发明已引用目前被认为是优选实施例的内容进行描述，但是可以理解的是，本申请不限于所公开的实施例。相反地，预期本申请涵盖包括在所附权利要求书的精神和范围内的各种改变和等同设置。

本文通过引用全文并入所有的出版物、专利和专利申请，其程度与每个个别出版物、专利或专利申请具体且个别说明为通过引入全文并入相同。具体而言，与每个本文提供的登录号相关的序列，包括例如在表中或别处提供的登录号和/或生物标志物序列(例如蛋白质和/或氨基酸)，通过引用全文并入。

说明书中引用的参考文献

Bitterman,K.J.,Anderson,R.M.,Cohen,H.Y.,Latorre-Esteves,M.andSinclair,D.A.2002Inhibition of Silencing and Accelerated Aging byNicotinamide,a putative negative regulator of yest Sir2and Human SIRT1.JBC277(47):45099

Dorrell,C.,Abraham,S.L.,Lanxon-Cookson,K.M.,Canaday,P.S.,Streeter,P.R.,and Grompe,M.2008.Isolation of major pancreatic cell types and long-termculture-initiating cells using novel human surface markers.Stem cell Res 1(3):183-194.

Jaramillo,M.and Banerjee,I.2012.Endothelial Cell Co-culture MediatesMaturation of Human embryonic Stem cell to Pancreatic Insulin Producing Cellsin a Directed Differentiation Approach.J Vis Exp(61).

Kelly,O.G.,Chan,M.Y.,Martinson,L.A.,Kadoya,K.,Ostertag,T.M.,Ross,K.G.,Richardson,M.,Carpenter,M.K.,D'Amour,K.A.,Kroon,E.,Moorman,M., Baetge,E.E.,and Bang,A.G.2011.Cell-surface markers for the isolation of pancreaticcell types derived from human embryonic stem cells.Nat Biotechnol 29(8):750-756.

Lammert,E.,Cleaver,O.,and Melton,D.2001.Induction of pancreaticdifferentiationby signals from blood vessels.Science 294(5542):564-567.

Nostro,M.C.,Sarangi,F.,Ogawa,S.,Holtzinger,A.,Corneo,B.,Li,X.,Micallef,S.J.,Park,I.H.,Basford,C.,Wheeler,M.B.,Daley,G.Q.,Elefanty,A.G.,Stanley,E.G.,and Keller,G.2011.Stage-specific signaling through TGFbetafamily members and WNT regulates patterning and pancreatic胰腺 specificationof human pluripotent stem cells.Development 138(5):861-871.

Otonkoski,T.,Beattie,G.M.,Mally,M.I.,Ricordi,C.,and Hayek,A.1993.Nicotinamide is a potent inducer of endocrine differentiationin culturedhuman fetal pancreatic cells.J Clin Invest 92(3):1459-1466.

Sander,M.,Sussel,L.,Conners,J.,Scheel,D.,Kalamaras,J.,Dela Cruz,F.,Schwitzgebel,V.,Hayes-Jordan,A.,and German,M.2000.Homeobox gene NKX6-1 liesdownstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in thepancreas.Development 127(24):5533-5540.

Yoshitomi,H.and Zaret,K.S.2004.Endothelial cell interactions initiatedorsal pancreas development by selectively inducing the transcription factorPtf1a.Development 131(4):807-817.

Claims

1.一种从内胚层细胞群产生NKX6-1+胰腺祖细胞的方法，所述方法包括使所述内胚层细胞群与至少一种EGF组分和至少一种烟酰胺组分的组合接触至少3天，以诱导所述内胚层细胞群的至少一部分分化为NKX6-1+胰腺祖细胞，并且富集或分离NKX6-1阳性细胞群，

其中所述EGF组分包含Betacellulin和/或其活性变体和/或活性片段；

其中所述烟酰胺组分包含烟酰胺、其盐、溶剂化物和缀合物；聚ADP-核糖合成酶抑制剂；和/或其两种或更多种的组合；

其中所述内胚层细胞群不是从人胚胎获得的；和

所述富集或分离步骤包括使所述细胞群与HPx表位检测抗体接触，和分离或部分地纯化与HPx1和/或HPx2结合的细胞亚群。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合还包含至少一种Noggin组分，所述至少一种Noggin组分包含以下中的一种或多种：Noggin和/或其活性缀合物和/或活性片段；BMPR1A和/或其活性缀合物和/或活性片段；BMPR1B和/或其活性缀合物和/或活性片段；Dorsomorphin和/或其盐或溶剂化物；LDN 193189和/或其盐或溶剂化物；CHORDIN和/或其活性缀合物和/或活性片段；和/或其两种或更多种的任意组合。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述Noggin组分为Noggin。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述聚ADP-核糖合成酶抑制剂包含苯甲酰胺、3-氨基苯甲酰胺和/或其两种或更多种的组合。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述烟酰胺组分为烟酰胺和/或其盐、溶剂化物和/或缀合物。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，还包含Exendin-4组分，所述Exendin-4组分包含以下中的一种或多种：Exendin-4和/或其活性缀合物和/或活性片段；GLP-1和/或其活性缀合物和/或活性片段；和/或其两种或更多种的任何组合。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述Exendin-4组分为Exendin-4。

8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述内胚层细胞群在基本上同时的处理中用所述组合组分处理至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天或至少15天。

9.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述内胚层细胞群分化成NKX6-1+胰腺祖细胞的部分为至少30%。

10.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其还包括将NKX6-1阳性胰腺祖细胞与CD34+内皮细胞共培养。

11.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述内胚层细胞群分化自多能干细胞（PSC）。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述PSC为胚胎干细胞（ESC）或诱导性多能干细胞（iPSC）。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述多能干细胞为人ESC（hESC）或人iPSC（hiPSC）。

14.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，首先包括产生内胚层细胞群。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述产生内胚层细胞群的方法包括：

a）使多能干细胞群与以下的组合接触：

I）nodal激动剂和wnt信号传导激动剂，

II）nodal激动剂、FGF激动剂和任选的wnt信号传导激动剂；和

III）nodal激动剂和FGF激动剂；

以产生阶段1分化的细胞；

b）使所述阶段1分化的细胞与FGF激动剂和任选的wnt信号传导激动剂和/或noggin组分接触，以产生阶段2分化的细胞；和

c）使所述阶段2分化的细胞与Noggin组分、维甲酸RA或RA类似物和任选的环巴胺-KAAD、FGF激动剂和/或Exendin-4组分接触，以提供内胚层细胞群。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，在步骤a）I）中，所述nodal激动剂包含ActA，和/或所述wnt信号传导激动剂包含Wnt3a或CIHR 99021；在步骤a）II）中，所述nodal激动剂包含ActA，所述FGF激动剂包含bFGF，和/或所述wnt信号传导激动剂包含Wnt3a或CIHR 99021；在步骤a）III）中，所述nodal激动剂包含ActA，和/或所述FGF激动剂包含bFGF；在步骤b）中，所述FGF激动剂包含FGF10，所述wnt信号传导激动剂包含Wnt3a，和/或所述noggin组分包含Dorsomorphin；和/或，在步骤c）中，所述Noggin组分包含Noggin，所述FGF激动剂包含FGF10，和/或所述Exendin-4组分包含Exendin-4。

17.一种用于生成胰岛素产生细胞的方法，所述方法包括：

a. 生成包含NKX6-1阳性胰腺祖细胞的细胞群；

b. 将所述NKX6-1阳性胰腺祖细胞与CD34+内皮细胞共培养，

其中，根据权利要求1至16中任一项所述的方法产生所述包含NKX6-1阳性胰腺祖细胞的细胞群。

18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述HPx表位检测抗体为HPx1和/或HPx2。

19.药物毒理学和/或药物发现的方法，所述方法包括：

产生包含NKX6-1阳性胰腺祖细胞的细胞群；和，根据权利要求1至18中任一项所述富集或分离NKX6-1阳性细胞群；

使所述NKX6-1阳性细胞群与试验化合物接触；和

确定所述试验化合物与对照比较，是否：1)刺激扩展，2)触发细胞凋亡，和/或3)诱导所述NKX6-1阳性细胞群分化为β-样细胞或其他产生激素的细胞、腺泡或导管细胞。