CN107995926B - 嵌合抗原受体和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含两种多肽的嵌合抗原‑受体多肽异二聚体，其中，所述第一多肽包含主要组织相容性复合体Iα链的胞外部分，且所述第二多肽包含β2‑微球蛋白结构域，或者所述第一多肽包含主要组织相容性复合体IIα链的胞外部分，且所述第二多肽包含主要组织相容性复合体IIβ链。所述多肽中的一个进一步包含T细胞受体α链的跨膜结构域、铰链区和胞内结构域，且另一个包含T细胞受体β链的跨膜结构域、铰链区和胞内结构域，及共价连接到所述胞外MHC结构域的另外的抗原‑肽。本发明进一步涉及使用本发明的异二聚体鉴定TCR可识别肽序列的方法。

Description

嵌合抗原受体和使用方法

大部分T细胞表达αβT细胞受体(TCR)，并识别在其他细胞上的以由主要组织相容性复合体(MHC)呈递的肽(表位)的形式的抗原。细胞毒性T淋巴细胞的TCR识别在体内几乎每个细胞表面上的由MHC I类分子展示的表位。辅助T细胞的TCR识别在抗原-呈递免疫细胞表面上的由MHC II类分子展示的表位，所述抗原-呈递免疫细胞包括巨噬细胞、树突细胞和B细胞。通过T细胞有效识别表位涉及另外的T细胞表面糖蛋白：在细胞毒性T淋巴细胞上的CD8(CD8⁺T细胞)，和在辅助T细胞上的CD4(CD4⁺T细胞)，它们分别结合MHC I类和MHC II类分子。TCR与表位的结合可导致信号被发送到T淋巴细胞的细胞核以诱导T细胞应答。

T细胞抗原特异性的明确和有效的鉴定对于开发有效的免疫疗法和诊断工具是非常有希望的。特别是：

-它可以有助于评估过继性T细胞疗法的安全性，

-它可以使治疗自身免疫性疾病、癌症和新疫苗开发的新方法成为可能。

然而，TCR以低亲和力结合MHC-肽复合体，这使得噬菌体展示方法和酵母展示方法无效。替代方法，如位置扫描组合性肽文库的筛选，利用TCR的交叉反应性的优点并使用肽库来定义导致T细胞激活的基序。除了类似的亲和力约束之外，这些繁琐的方法遭受高比例的假阳性结果。由于询问随机肽序列，所鉴定的肽基序是不明确的或与天然蛋白质没有明显的同源性。

本发明的潜在问题是提供用于在体外和体内使用的CD4⁺和CD8⁺T细胞的抗原肽特异性的直接和灵敏、无偏差的鉴定的手段。此问题通过独立权利要求的主题解决。

术语和定义

氨基酸序列从氨基到羧基末端给出。序列位置的大写字母指单字母代码中的L-氨基酸(Stryer，Biochemistry，第3版，第21页)。氨基酸序列位置的小写字母指相应的D-或(2R)-氨基酸。

在本发明的背景下，术语同一性或序列同一性以其在遗传学和生物信息学领域中已知的含义使用；它们是指表示通过逐个位置的序列比对结果的单个定量参数。序列比对方法是本领域已知的；公共可获得的BLAST算法是一个实例。

用于氨基酸序列比对的一个所述实例是使用默认设置的BLASTP算法，如：期望阈值：10；字长：3；查询范围内的最大匹配：0；矩阵：BLOSUM62；空位代价：存在11，延伸1；组成调整：条件性组成得分矩阵调整。在没有进一步细节的情况下，这些设置用于确定以下给出的氨基酸序列同一性值。

用于核酸序列比对的一个所述实例是使用默认设置的BLASTN算法：期望阈值：10；字长：28；查询范围内的最大匹配：0；匹配/不匹配得分：1.-2；空位代价：线性。在没有进一步细节的情况下，这些设置用于确定以下给出的核酸序列同一性值。

在本说明书的背景下，术语主要组织相容性复合体(MHC)以其在细胞生物学和生物化学领域中已知的含义使用；它是指以适合于被T细胞受体识别的方式展示肽、蛋白质的一部分的细胞表面分子。在本说明书的背景下，被免疫系统识别的肽被称为表位或抗原肽或寡肽。

存在两个主要类别的MHC分子：I类和II类。

MHC I类作为由α1、α2、α3三个结构域组成的α链存在。α3结构域与非MHC分子β2-微球蛋白相互作用。被展示或呈递的肽在α1/α2异二聚体的中心区域被肽-结合槽保持。α3亚基包含将MHC I类分子锚定在细胞膜上的跨膜结构域。

MHC II类由α和β两条链形成，其分别各自具有α1和α2及β1和β2两个结构域，肽-结合槽(由呈递或展示肽表位的MHC II类分子形成的结构元件)由α1和β1的异二聚体形成。α2和β2亚基包含将MHC II类分子锚定在细胞膜上的跨膜结构域。

与大部分去往分泌途径的新合成的蛋白质类似，MHC I类和II类分子在其未成熟的形式中包含信号肽。MHC信号肽序列位于MHC mRNA分子上的MHC α1结构域的上游(5’)。在切割信号肽后，MHC分子被称为成熟MHC分子。

在本说明书的背景下，术语β2-微球蛋白结构域以其在细胞生物学和生物化学领域中已知的含义使用；它是指作为MHC I类异二聚体分子一部分的非MHC分子。换句话说，它组成MHC I类异二聚体的β链。

在本说明书的背景下，术语T细胞受体(TCR)以其在细胞生物学和生物化学领域中已知的含义使用；它是指在T细胞表面上发现的能够识别与主要组织相容性复合体分子结合的抗原的分子。TCR是由高度可变的α和β链组成的二硫键连接的膜锚定异二聚体。各链由可变(V)区和恒定(C)区两个胞外结构域组成。可变区结合至肽-MHC复合体；恒定区靠近细胞膜细胞膜，其后是铰链区、跨膜区和短胞质尾区。

在本说明书的背景下，术语T细胞受体复合体以其在细胞生物学和生物化学领域中已知的含义使用；它是指异二聚体TCRα/β的八聚复合体，具有两个异二聚体信号模块CD3ε/δ和CD3γ/ε及同源二聚体CD247ζ/ζ(也被称为TCRζ-链或zeta-链)。各亚基的跨膜结构域中的可离子化残基形成将所述复合体保持在一起的极性相互作用网络。因为TCRα/β的胞质尾区极其短，使得其不太可能参与信号传导，这些信号传导分子在将信号从触发的TCR传播到细胞中是至关重要的。用于激活和调节质膜下分子的最常见机制是通过蛋白激酶的磷酸化/去磷酸化。CD3和CD247ζ的胞内部分包含由酪氨酸激酶Src家族靶向的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。

在本说明书的背景下，术语功能上关联的是指两个不同功能的活性状态的关联。例如，受体多肽(功能1)可以是与报告基因及其启动子(功能2)功能上关联的；然后，如果受体改变其活性状态(例如激活)，报告基因的启动子也将改变其活性状态(例如激活)，并且报告基因被转录。一个所述非限制性实例为本领域已知的信号传导途径的激活T细胞的核因子(NFAT)。T细胞中天然TCR(功能1)的激活导致蛋白激酶和磷酸酶的激活，其启动转录因子NFAT的核进入，引起NFAT靶基因的表达(功能2)。换句话说，TCR与NFAT靶基因的表达是功能上关联的。

在本说明书的背景下，术语报告基因的激活是指报告基因活性状态的改变。所述活性状态的改变的一个实例是报告基因启动子的激活。其导致报告基因转录/翻译的增加。另一个实例是报告蛋白抑制子的切割，其导致活性报告蛋白量的增加。

在本说明书的背景下，术语转基因以其在细胞生物学领域已知的含义使用；它是指将外源核酸序列引入活生物体，使得该生物体显示出其内源性不具有的新特性。

在本说明书的背景下，术语抗原受体以其在细胞生物学和免疫学领域已知的含义使用；它是指能够结合抗原或表位的表面受体。抗原受体的实例是B细胞受体和T细胞受体。

在本说明书的背景下，术语嵌合抗原受体是指包含部分抗原受体的人工工程受体。其非限制性实例是包含与MHC结构域和/或抗原肽序列融合的T细胞或B细胞受体的结构域的杂合受体。

在本说明书的背景下，术语寡肽或寡肽序列专门指T细胞反应性寡肽，当在细胞上的MHC分子的背景下出现时，如果被同源T细胞受体识别，其可以引起T细胞应答。当提及包含在本发明(较长)的多肽中的寡肽序列时，技术人员将会理解，这是指当呈递在MHC分子上时可被TCR识别的寡肽序列。除了MHC呈递的T细胞反应性表位外，寡肽序列还包含几个氨基酸的接头序列，其允许T细胞反应性表位适合于MHC分子。接头序列的长度和序列的实例如下。

根据本发明的第一方面，提供了一种用于鉴定TCR可识别肽序列的方法，其包括以下步骤：

i.提供多个哺乳动物细胞，其中，

-多个哺乳动物细胞中的每一个表达文库的成员，

-文库的各成员编码转基因抗原受体分子，

-所述转基因抗原受体分子包含

·MHC1或MHC2的胞外结构域，

·包含在胞外结构域序列的多肽序列内的寡肽(术语是意在表示寡肽可以包含在胞外结构域序列的N和C边界之间的任意位置，或其任意相应的末端)，

其中，所述寡肽对于文库的各成员是不同的，并且其中，所述寡肽以适于被T细

胞受体识别的方式呈递，

·T细胞受体(TCR)的跨膜结构域，及

·TCR的胞内结构域，

-所述转基因抗原受体分子与报告蛋白是功能上关联的，由此，同源T细胞受体与转基因抗原受体的结合导致报告基因的激活。

ii.通过T淋巴细胞表面上表达的T细胞受体，使多个哺乳动物细胞与能够结合至包含在转基因抗原受体中的寡肽序列的T淋巴细胞的制备物接触。

iii.根据可检测报告蛋白的水平，从所述多个哺乳动物细胞分离具有可检测报告蛋白的细胞，从而获得激活细胞。

iv.从所述激活细胞分离编码已表达的文库成员的DNA。

v.对包含在于所述激活细胞中表达的转基因抗原-受体中的寡肽序列进行测序。寡肽的确定序列是TCR可识别肽序列。

换句话说，本发明的方法允许评估寡肽的抗原潜力，或者更准确地说，特定寡肽序列作为触发同源TCR应答的MHC呈递表位的潜力。为了完成此评估，需要包含潜在抗原寡肽的转基因抗原受体的文库。文库的成员在多个细胞的每个哺乳动物细胞中表达，其中，寡肽序列对于文库的各成员可以不同。寡肽以适合于被T细胞受体识别的方式由转基因抗原受体呈递。抗原寡肽被所提供的T淋巴细胞经其T细胞受体结合激活与转基因抗原受体功能上关联的报告蛋白。然后根据可检测的报告基因的水平分离哺乳动物细胞。从经分离的哺乳动物细胞中分离DNA，并对包含的寡肽DNA进行测序。通过此方法检索的每个寡肽都被T细胞受体识别。

所述转基因抗原受体包含以适合于被T细胞受体识别的方式呈递的寡肽、MHC1或MHC2的胞外结构域、T细胞受体的跨膜结构域和T细胞受体的胞内结构域。所述寡肽和不同的结构域共价连接以形成单个多肽链(胞外-跨膜-胞内)。在某些实施方式中，所述转基因受体另外包含位于胞外结构域和跨膜结构域之间的T细胞受体的铰链区。

在本说明书的背景下，术语表达及其等同形式以其在细胞生物学和分子生物学领域已知的含义使用；它们是指DNA序列和所衍生的mRNA的转录和翻译。

在某些实施方式中，如步骤iii所述根据可检测报告蛋白的水平从多个哺乳动物细胞分离具有可检测报告蛋白的细胞至少进行1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次。如果使用高复杂性的文库，此实施方式是特别有利的。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于鉴定TCR可识别肽序列的方法。所述方法包括：

i.提供哺乳动物细胞，其中

-所述哺乳动物细胞表达转基因抗原受体分子；

-所述转基因抗原受体分子包含

·包含以适合于被T细胞受体识别的方式呈递的寡肽的MHC1或MHC2的胞外结构域，

·T细胞受体(TCR)的跨膜结构域，及

·TCR的胞内结构域，

-所述转基因抗原受体分子与报告蛋白是功能上关联的，由此，T细胞受体与转基因抗原受体的结合导致所述报告基因的激活。

ii.通过T淋巴细胞表面上表达的T细胞受体，使哺乳动物细胞与能够结合至包含在转基因抗原受体中的寡肽的T淋巴细胞的制备物接触。T细胞受体与转基因抗原受体的结合激活报告基因，产生激活的哺乳动物细胞。

iii.从所述激活的哺乳动物细胞分离编码所表达的文库成员的DNA。

iv.对包含在转基因抗原-受体中的寡肽序列进行测序。

在某些实施方式中，所述转基因抗原受体另外包含铰链区。

在某些实施方式中，根据本发明的第一和第二方面，所述转基因抗原受体是本领域已知的转基因抗原受体。本领域已知的适合的转基因抗原受体的实例在以下文献中公开：Jyothi等.，Nat Biotechnol 20，1215–1220(2002)；Geiger等.，Blood 98(8)2364-2371(2001)；US2008286312A1；Mekala等.，PNAS 102(33)，11817-11822，(2005)；.Moisini等.，JImmunol(2008)，180：3601-3611；Scott等.，J Autimm 35，390-397(2010)。

在本发明的上述方面中任一项所述的某些实施方式中，所述转基因抗原受体是包含第一多肽和第二多肽的嵌合抗原-受体多肽异二聚体，并且

a.所述第一多肽包含主要组织相容性复合体I(MHC I类)α链的胞外部分，且所述第二多肽包含β2-微球蛋白结构域，或者

b.所述第一多肽包含主要组织相容性复合体II(MHC II类)α链的胞外部分，且所述第二多肽包含主要组织相容性复合体II(MHC II类)β链的胞外部分。

第一和第二多肽链中的至少一个另外包含与胞外MHC结构域共价连接的寡肽，其中，寡肽可被T细胞受体识别。

在某些实施方式中，所述寡肽序列进一步包含长度为4～16个氨基酸，特别是6个、8个、10个、12个或14个氨基酸的接头序列。在某些实施方式中，接头序列主要由丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸中的一种和甘氨酸组成。在某些实施方式中，接头序列仅包含甘氨酸和丝氨酸。

第一多肽和第二多肽中的一个进一步包含T细胞受体α链的铰链区、跨膜结构域和胞内结构域或胞内尾区，并且第一多肽和第二多肽中的另一个包含T细胞受体β链的铰链区、跨膜结构域和胞内结构域。

在某些实施方式中，所述寡肽序列和甘氨酸-丝氨酸接头序列插入到MHC信号/前导肽的最后一个氨基酸和MHC α1结构域或β1结构域的第一氨基酸之间。

在某些实施方式中，所述寡肽序列和接头序列插入到MHC α1结构域序列或β1结构域序列的第1、2、3、4或5个氨基酸后。肽对β链的附着(β1结构域)将肽以最常见的方向插入到MHC中。肽对链的附着将肽以相反的方向插入。

在某些实施方式中，MHC分子的胞外部分选自专业数据库中本领域技术人员可得的的人类主要组织相容性复合体基因家族HLA，例如IMGT/HLA(http：//www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)。作为另一种选择，HLA序列源自从患者血液或组织样品提取的RNA。

在某些实施方式中，所述寡肽的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或40个氨基酸(AA)。大多数MHC I类肽长度为8～10个氨基酸，而MHC II类可以呈表现为长的多的肽，因为结合裂隙是开放的，然而，实际表位在10～12个AA的范围内。在本文公开的方法中，所述肽甚至可能长于20(参见图3，通过本发明的方法发现的LCMV肽包含24个AA)。在某些实施方式中，采用较大的寡肽，因为这允许在一个肽上筛选更多结合登记。

在某些实施方式中，第一和/或第二多肽中的转基因抗原-受体的铰链区、跨膜和胞内部分不来源于同一TCR链。换句话说，TCRα-链的铰链区或跨膜结构域可以与TCRβ-链的跨膜或胞内结构域连接，反之亦然。

在某些实施方式中，根据本发明的第二方面的嵌合抗原-受体多肽异二聚体包含具有与SEQ ID NO 007具有至少≥80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的第一多肽和具有与SEQ ID NO 008具有至少≥80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的第二多肽。

根据本发明的第三方面，提供了包含第一多肽和第二多肽的嵌合抗原-受体多肽异二聚体。所述第一多肽通过一个或几个二硫键与第二多肽连接，并且

a.所述第一多肽包含主要组织相容性复合体I(MHC I类)α链的胞外部分，且所述第二多肽包含主要组织相容性复合体I(MHC I类)相关β2-微球蛋白结构域，或者

b.所述第一多肽包含主要组织相容性复合体II(MHC II类)α链的胞外部分，且所述第二多肽包含主要组织相容性复合体II(MHC II类)β链。

第一多肽和第二多肽中的一个进一步包含T细胞受体(TCR)α链的铰链区、跨膜结构域(和胞内结构域或尾区)，并且第一多肽和第二多肽中的另一个包含T细胞受体β链的铰链区、跨膜结构域(和胞内结构域或尾区)。

换句话说，所述嵌合抗原-受体多肽异二聚体能够在MHC背景下呈递寡肽(表位)，以便寡肽(表位)被其同源TCR识别并结合。其同源TCR的结合导致与嵌合抗原-受体多肽异二聚体相连的CD3和CD247分子的胞内结构域激活，这导致NFAT的激活。

在某些实施方式中，MHC分子的胞外部分包含

i.第一多肽上的MHC I类α1和α2和α3结构域(除了作为第二多肽的β-2微球蛋白之外)，或

ii.第一多肽上的MHC II类α1和α2结构域，和第二多肽上的MHC II类β1和β2结构域。

在某些实施方式中，第一多肽基本上包含主要组织相容性复合体I(MHC I类)α链的整个胞外部分。在某些实施方式中，第一多肽是主要组织相容性复合体I(MHC I类)α链的胞外部分。

在某些实施方式中，第二多肽基本上包含主要组织相容性复合体I(MHC I类)相关β2-微球蛋白结构域的的整个胞外部分。在某些实施方式中，第二多肽是主要组织相容性复合体I(MHC I类)相关β2-微球蛋白结构域。

在某些实施方式中，第一多肽基本上包含主要组织相容性复合体II(MHC II类)α链的整个胞外部分。在某些实施方式中，第一多肽是主要组织相容性复合体II(MHC II类)α链的胞外部分。在某些实施方式中，第二多肽基本上包含整个主要组织相容性复合体II(MHC II类)β链。在某些实施方式中，第二多肽是主要组织相容性复合体II(MHC II类)β链。

在某些实施方式中，第一和第二多肽链中的至少一个另外包含与胞外MHC结构域共价连接的抗原-肽，其中，所述寡肽可被T细胞受体识别。

在某些实施方式中，所述抗原-肽序列和甘氨酸-丝氨酸接头序列插入到MHC信号/前导肽的最后一个氨基酸和MHC α1结构域或β1结构域的第一氨基酸之间。

在某些实施方式中，所述抗原-肽序列和接头序列插入到MHC α1结构域序列或β1结构域序列的第1、2、3、4或5个氨基酸后。

在某些实施方式中，MHC分子的胞外部分选自专业数据库中可得的人类主要组织相容性复合体基因家族HLA，例如IMGT/HLA(http：//www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)。作为另一种选择，HLA序列源自从患者血液或组织样品提取的RNA。

在某些实施方式中，所述寡肽的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或40个氨基酸。大多数MHC I类肽长度为8～10个氨基酸，而MHC II类可以表现为长的多的肽，因为结合裂隙是开放的，然而，实际表位在10～12个AA的范围内。在本文公开的方法中，所述肽甚至可能长于20(参见图3，通过本发明的方法发现的LCMV肽包含24个AA)。具有较大的寡肽可以是有利的，因为这允许在一个肽上筛选更多结合登记。

在某些实施方式中，第一和/或第二多肽中的嵌合抗原-受体多肽的铰链区、跨膜和胞内部分不来源于同一TCR链。换句话说，TCR α-链的铰链区或跨膜结构域可以与TCR β-链的跨膜或胞内结构域连接，反之亦然。

根据本发明的第四方面，提供了编码本发明第三方面的嵌合抗原-受体多肽异二聚体的核酸分子，特别是具有在哺乳动物宿主细胞中可操作的启动子序列的核酸分子。

根据本发明的第五方面，提供了包含或表达本发明第四方面的核酸分子的细胞，特别是哺乳动物细胞。

根据本发明的第六方面，提供了细胞，特别是哺乳动物细胞，更特别是哺乳动物T淋巴细胞，所述细胞包含：

i.本发明第一方面的嵌合抗原-受体多肽，及

ii.与嵌合抗原-受体多肽异二聚体功能上关联的效应子功能。

在某些实施方式中，效应子功能是：

i.报告蛋白，和/或

ii.在结合至嵌合抗原-受体多肽异二聚体的细胞中诱导细胞死亡、特别是凋亡的能力。

在某些实施方式中，报告蛋白选自：

i.荧光蛋白，

ii.荧光素酶蛋白，

iii.抗生素抗性基因，

iv.Cre重组酶，

v.CAS-9核酸酶，或

vi.CAS-9嵌合转录抑制剂或激活剂。

根据本发明的第七方面，提供了一种用于获得对抗原反应性降低的T淋巴细胞的制备物的方法。所述方法包括：

i.提供获自患者的T-淋巴细胞的制备物，

ii.使所述T-淋巴细胞的制备物与本发明第五或第六方面的哺乳动物细胞接触，

其中，所述哺乳动物细胞的特征在于，所述效应子功能能够在结合至嵌合抗原-受体多肽异二聚体的细胞中诱导细胞死亡，特别是凋亡。

换句话说，能够结合至在哺乳动物细胞的嵌合抗原-受体多肽异二聚体内提供的寡肽序列的特异性T淋巴细胞，将经历细胞死亡，特别是凋亡。

根据本发明的第八方面，提供了一种在有需要的患者中使用的用于消除(depletion)具有抗特异性抗原活性的T淋巴细胞的方法。所述方法包括以下步骤：

i.提供本发明第四方面所述的哺乳动物细胞的制备物，

ii.向患者施用所述哺乳动物细胞，

其中，所述哺乳动物细胞的特征在于，所述效应子功能能够诱导结合至嵌合抗原-受体多肽异二聚体的细胞的细胞死亡，特别是凋亡。

换句话说，能够与在嵌合抗原-受体多肽异二聚体内展示的寡肽序列结合的T淋巴细胞，被选择性消除。其例如可以用于在有需要的患者中减少或去除自身反应性T淋巴细胞。

在某些实施方式中，该方法用于治疗诸如过敏等自身免疫疾病。在某些实施方式中，该方法用于预防和治疗移植后的器官排斥。

根据本发明的第九方面，提供本发明第四方面所述的哺乳动物细胞，其用于治疗或预防自身免疫疾病、移植排斥或免疫功能障碍，包括但不限于1型糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、克罗恩氏病和炎性肠综合征。换句话说，所述哺乳动物细胞用于消除具有抗特定疾病相关抗原的活性的T淋巴细胞。

根据本发明的第十方面，提供了一种用于检测患者对寡肽的免疫应答的方法。所述方法包括以下步骤：

i.提供本发明第四方面所述的哺乳动物细胞，其中，所述细胞包含与所述嵌合抗原-受体多肽异二聚体功能上关联的报告蛋白，

ii.提供包含参与免疫应答的T淋巴细胞的患者的离体血液样品，

iii.在允许效应子功能操作的条件下使哺乳动物细胞与血液样品接触，及

iv.检测哺乳动物细胞中的报告蛋白。

换句话说，如果在个体血液中能够与所使用寡肽结合的T淋巴细胞被富集，导致强的报告蛋白表达，则其表明针对寡肽的免疫应答。

在某些实施方式中，此方法中使用的寡肽来源于病毒、细菌、真菌或寄生虫。

在某些实施方式中，本发明第九方面的方法进一步包括以下步骤：

i.根据报告蛋白的表达，分离哺乳动物细胞，

ii.从经分离的哺乳动物细胞中分离DNA，及

iii.对在本发明第一方面的嵌合抗原-受体多肽异二聚体中编码的寡肽进行测序。

换句话说，使用许多具有嵌合抗原-受体多肽异二聚体中的不同寡肽的本发明第四方面的哺乳动物细胞。这些寡肽中的每一个均来源于某种病原体、过敏原、肿瘤或发炎组织(在自身免疫患者的情况下)。其允许同时测试许多不同的免疫应答。一个非限制性实例是作为诊断工具的用途。

在本文的任何位置将例如接头序列、接头长度等单个可分离特征的替代方式作为“实施方式”列出时，应当理解的是，这些替代方式可以自由组合以形成本文公开的本发明的离散实施方式。本领域技术人员理解的是，作为特定实施方式提及的本发明的独立特征可以与所提及的任何其他特征组合。

本发明通过以下实施例和附图进一步说明，从中可以得出其他实施方式和优点。这些实施例意在说明本发明，但不限制本发明的范围。

附图说明

图1显示MCR2感受器(具有来自MHC II的胞外部分的嵌合抗原-受体多肽异二聚体)的结构和抗原-特异性反应性。(a)MCR2和其与肽-特异性TCR的相互作用的示意图。(b)MCR2(gp61)在BEKO胸腺瘤细胞上的表面表达。(c)MCR2(gp61)(左图)或MCR2(OVA)(右图)在与gp61-特异性Smarta或OVA-特异性OT-II TCR转基因CD4+T细胞共培养的BEKO细胞中的下调的时间进程。值显示以共培养开始时的平均荧光强度的百分比描述的MCR2水平。(d)在用与Smarta或OT-II CD4+T细胞共培养的MCR2(gp61)或MCR2(OVA)转导的H18.3.13细胞中，肽-特异性NFAT激活(GFP表达)的时间进程。直方图显示在指定时间点的MCR2(gp61)+细胞中NFAT激活测量的实例。(e)肽-特异性报告细胞的灵敏度。MCR2(gp61)+H18.3.13细胞在MCR2(OVA)+H18.3.13细胞中稀释，并且在未处理的细胞中(三角形)或在与Smarta CD4+T细胞共培养后(正方形)测量NFAT激活。该图显示GFP+H18.3.13细胞的百分比与携带MCR2(gp61)的细胞的百分比之间的线性(R>0.99)相关性。(f)能够在MCR2+报告细胞中触发强烈的NFAT激活的肽-特异性T细胞的最小频率。将来自Smarta和OT-II转基因小鼠的脾细胞以不同的比例混合，并且用于刺激MCR2(gp61)+或MCR2(OVA)+H18.3.13细胞。该图显示在8小时的共培养后，在MCR2(gp61)+H18.3.13或MCR2(OVA)+H18.3.13细胞中的GFP+细胞百分比，其作为肽-特异性CD4+T细胞百分比的函数。(g)能够触发报告细胞中的应答的肽-特异性T细胞的最小数量。在与不同数量的Smarta或OT-II CD4+T细胞共培养过夜后，在MCR2(gp61)+(左)和MCR2(OVA)+(右)H18.3.13细胞中的NFAT激活。h)通过MCR2(gp61)+H18.3.13细胞的激活检测的感染小鼠血液中的LCMV-特异性CD4+T细胞扩增的动力学。显示与在感染后的不同天数采集的血液共培养过夜后的GFP+报告细胞的百分比。使用来自天然Smarta小鼠的血液作为阳性对照。

图2显示gp61模拟表位(mimotope)的筛选。(a)RAG-介导的肽随机化方案，基于其产生MCR2(gp61-RSS)模拟表位文库(参见材料和方法)，RSS-重组信号序列。(b)文库中发现的已改变的gp61序列的实例(新氨基酸以灰色显示)。(c)用MCR2(gp61-RSS)文库或用MCR2(OVA)或MCR2(gp61)作为对照转导携带NFAT-FT报告基因的16.2c11细胞，并将其与Smarta或OT-II CD4+T细胞杂交瘤共培养。与gp61-特异性Smarta杂交瘤共培养9小时后(右上图)，分选显示NFAT激活(蓝色-FT荧光)的单个MCR2(gp61-RSS)+细胞并扩增。(d)与Smarta杂交瘤共培养的MCR2(gp61)+、MCR2(gp61S)+和MCR2(gp61N)+16.2c11细胞的激活。(e)原始gp61和在MCR2(gp61-RSS)文库中发现两个新gp61模拟表位的序列。(f)在与以不同浓度的gp61模拟表位(直方图)和浓度为100nM的细胞因子(点图)产生进行脉冲的树突细胞共培养3天后，在Smarta CD4+T细胞中的CFSE稀释。

图3显示新LCMV表位的搜索。(a，b)从腹膜内注射(p.i.)5天和8天后的脾脏纯化来自感染有LCMV的小鼠的CD4+T细胞，并与携带NFAT-GFP报告基因的BW5147细胞融合。与LCMV或gp61脉冲的树突细胞共培养后，通过GFP的表达来确定所得杂交瘤的反应性。直方图(a)显示不同类型的反应性(LCMV开放或gp61-填充的深灰色)的实例和表。(b)数据的总结。(c)用于构建富集天然存在的肽(NPL)的文库的克隆策略方案。ORF-开放阅读框指明天然蛋白序列。(d)MCR2(LCMV-NPL)+16.2c11报告细胞与肽特异性未知的LCMV-反应性杂交瘤(H2、H3、H14和H30)共培养。分选被激活的报告细胞，扩增，并与相应的杂交瘤再次共培养。为了获得足够的富集，重复此过程三次。点图显示两轮或三轮共培养后的NFAT激活实例。(e)在第三轮富集后，分选单个细胞，扩增，并通过与杂交瘤共培养来验证其反应性(直方图显示NFAT反应性实例)。右表显示反应性克隆的频率。来自MCR2构建体的肽序列如下所示，代表主要的NP311表位和新型NP547表位。

图4显示转导到H18.3.13报告细胞系中的MCR1(具有来自MHC I的胞外部分的嵌合抗原-受体多肽异二聚体；gp33/H2-Kb)分子的功能测试。(A)在包被有αMHC-I抗体的孔中过夜培养后，在MCR1转导的细胞中诱导NFAT激活，而在对照细胞中不诱导NFAT激活。

图5显示a)通过与杂交瘤H3和H4共培养在一、二和三轮富集后，MCR2(LCMV-NPL)+16.2c11细胞的激活。b)在最终共培养后源自用杂交瘤H9筛选随机肽MCR2文库的MCR2+16.2c11克隆的激活实例。显示从H9反应性肽富集前后，从文库中回收的序列的实例。

图6显示MCR2感受器的肽-特异性反应性和灵敏度。a)在与OT-II CD4+T细胞或作为对照的Smarta CD4+T细胞共培养的MCR2(OVA)+H18.3.13细胞中肽-特异性NFAT激活(GFP报告基因表达)的时间进程。直方图显示在指定时间点的MCR2(OVA)+细胞中的NFAT-激活测量的实例。b)肽-特异性报告细胞的灵敏度。MCR2(OVA)+H18.3.13细胞在MCR2(gp61)+H18.3.13细胞中稀释，在与OT-II CD4+T细胞共培养后测量NFAT激活。该图显示GFP+H18.3.13细胞的百分比与携带MCR2(OVA)的细胞的百分比之间的线性(R>0.99)相关性。

实施例

实施例1：使用所公开的嵌合抗原-受体多肽异二聚体在哺乳动物细胞中筛选T细 胞表位

目前用于鉴定同源T细胞表位的方法原则上基于两种主要方法。第一种方法依赖于通过用MHC-四聚体对T细胞进行染色或通过对展示具有重组TCR的肽-MHC复合体的噬菌体、酵母或昆虫细胞进行染色来检测物理性MHC-TCR相互作用。第二种方法依赖于用呈递肽库或位置扫描组合性肽文库的树突细胞(DC)在共培养物中测量T细胞激活。MHC-四聚体文库的筛选对于定义已知或预测抗原识别的精细特异性是有效的，但由于并非所有的肽-MHC四聚体以相等的强度结合，所以可能容易错过低亲和力相互作用(例如，对于OVA-特异性OT-II和gp61-特异性Smarta2T细胞的类似染色，分别需要比gp66-I-A^b四聚体高400倍以上的OVA-I-A^b四聚体)。应用于目前的肽-MHC展示法的类似亲和力约束使用可溶性TCR。此外，MHC分子必须被诱变以允许在噬菌体或酵母细胞上的有效表面表达。位置扫描组合性肽文库的筛选利用了TCR的交叉反应性的优点，并使用肽库来限定导致T细胞激活的基序。虽然已经用这种方法发现类似于天然存在的肽的T细胞表位，但是所鉴定的肽通常与已知蛋白质没有明确的同源性，并且需要依靠生物信息学方法。

本发明的发明人在本文公开了允许在哺乳动物细胞中进行直接、无偏差、灵敏和有效的表位筛选的通用系统的开发。所述方法应该：i)提供APC的复合体混合物，所述APC各自呈递一种独特的天然存在的序列的肽；ii)提供有效的手段来鉴定和分离呈递同源肽的APC；iii)提供迭代重复该过程的可能性及iv)通过克隆使肽序列容易恢复。为了产生满足第一标准的APC，本发明的发明人遵循用于产生“单肽”小鼠的方法，并构建不同的肽-MHC展示系统。通过重组DNA技术的手段，将肽直接连接到MHC分子上，形成稳定的复合体并防止其他肽结合。转染到MHC缺陷型细胞中的这种肽-MHC复合体文库产生细胞池，各细胞呈递独特的肽(详见材料和方法)。理想的是，一旦其肽-MHC复合体被特异性T细胞的TCR结合，携带特定T细胞的同源肽的APC的鉴定将涉及能够容易测量的信号。因此，肽-MHC融合分子与TCR复合体连接，TCR复合体是定制用于感受低亲和力相互作用。直接ζ链(CD247)融合已成功地用于构建各种嵌合抗原受体。然而，为了尽可能地创建类似天然TCR复合体的分子感受器，将肽MHC复合体融合到由铰链区、跨膜(TM)和胞内(IC)结构域组成的截短的TCRα和TCRβ链。肽-MHC与整个TCR信号传导机制的关联提供更多的生理信号。在本说明书的背景下，此MHC-TCR嵌合体被称为MCR。这种分子在转染到TCR缺陷型T细胞杂交瘤中时，允许使用NFAT-EGFP报告基因系统直接监测通过特异性T细胞的TCR的肽-MHC增大(图1a)。携带具有抗原-特异性T细胞克隆或杂交瘤的肽-MCR分子文库的细胞的共培养允许在哺乳动物细胞中通过大量平行、功能性筛选来直接鉴定T细胞的同源肽特异性。

因此，设计和克隆MCR用于筛选MHC II类限制性T细胞的同源肽，从而筛选MCR2。MCR2由两条链组成：由与截短的TCRα连接的I-A^b MHC II类α-链的胞外结构域组成的α-链；和由肽(主要的LCMV衍生表位，gp61)和与截短的TCRβ连接的I-A^b MHC II类β-链的胞外结构域组成的β-链(图1a)。还克隆了携带OVA-肽的第二MCR2，且这两种MCR2分别被命名为MCR2(gp61)和MCR2(OVA)。在将MCR转导到MHC-II-TCR-BEKO胸腺瘤细胞系中后，通过用抗MHC-II抗体染色证实其表达。如图1b所示，MCR2在细胞表面上有效表达，表明它与TCR复合体的CD3组分组装。为了验证其特异性，表达MCR2(gp61)或MCR2(OVA)的BEKO细胞与纯化的Smarta2或OT-II CD4⁺T细胞共培养。观察到表面上非常快速的肽特异性MCR2下调，其动力学与常规TCR相同。MCR2(gp61)在具有Smarta2T细胞而不存在OT-IIT细胞的共培养中下调(图1c，左图)。MCR2(OVA)的情况相反，这突出MCR2系统的特异性(图1c，右图)。通过将其转导到携带NFAT-EGFP报告基因(H18.3.13)的TCR缺陷型T细胞杂交瘤中，我们进一步评估了MCR2触发NFAT激活的能力。再次，NFAT应答仅在携带MCR2的杂交瘤与肽-特异性T细胞共培养时才被触发(图1d)。2小时后，应答强烈并且能够容易测量(图1d最右侧)。

本发明的发明人通过以不同比例混合MCR2(gp61)⁺和MCR2(OVA)⁺报告细胞并在与Smarta2或OT-II CD4⁺T细胞共培养后测量NFAT激活来测试MCR系统的灵敏度。如图1e所示，可以在以高于1/10000的频率呈递的细胞中直接检测特异性NFAT-报告物(reporter)表达。重要的是，观察到检测到的表达NFAT-EGFP的细胞的百分比与携带“T细胞/个体型(idotype)特异性”MCR2的细胞的百分比之间的线性相关性，表明以低于1/10000的频率呈递的特异性细胞仍然是NFAT-EGFP⁺，即使它们不能与背景区分开。也确定了异种群体中肽特异性T细胞的最低频率，其能够在MCR2⁺细胞中触发稳健的NFAT激活。将来自Smarta2和OT-II小鼠的分选CD4⁺T细胞(图1f，顶图)或未分选脾细胞(图1f，底图)以不同比例混合并用于刺激MCR2(gp61)⁺或MCR2(OVA)⁺细胞。即使只有1％的肽-特异性CD4⁺T细胞，当过量提供T细胞时，在MCR2⁺细胞中触发最大NFAT激活的50％。值得注意的是，如图1g(左图)所示，即使是单个Smarta2CD4⁺T细胞也能够在MCR2(gp61)⁺细胞中触发显著的NFAT-EGFP激活，而在MCR2(OVA)⁺细胞的情况下，需要5个细胞，这可能是由于较低的相互作用亲和力(图1g右图)。这些结果表明，MCR-技术可用作监测获自患者的血液中的T细胞特异性的灵敏诊断工具。实际上，MCR2(gp61)⁺报告细胞可用于有效追踪LCMV感染动物血液中的抗原-特异性CD4⁺T细胞扩增(图1h)。这些结果证明了MCR-方法的极大灵敏度。

为了所公开的发明应用在复杂文库中发现罕见的特异性肽，需要共培养的多次迭代循环和NFAT-EGFP⁺报告细胞的分选。因为在随后轮的刺激中NFAT-激活的有效检测取决于前几轮触发的NFAT报告信号的快速消失，用慢荧光计时器(sFT)代替非常稳定的EGFP。mChe rry的这种突变体随着时间改变“颜色”，使得能够区分最近的(蓝色mCherry)和过去的NFAT-激活(红色mCherry)，因此使得随后轮的刺激之间的间隔更短。

首先所公开的发明应用于在MCR2(gp61-RSS)文库中搜索gp61的模拟表位，其通过RAG介导重排将gp61中心残基随机化而产生(图2a和M&M)。随机挑选的克隆始终含有gp61-序列的独特突变体(图2a)。将该文库转导到携带报告细胞(16.2c11)的NFAT-sFT中，分选MCR2⁺细胞，扩增，并与gp61-特异性或OVA-特异性T细胞杂交瘤共培养(图2b)。当与gp61-特异性杂交瘤共培养时，约10％的MCR2(gp61-RSS/I-A^b)⁺16.2c11细胞显示出蓝色的NFAT-报告基因激活。将这些细胞分选为单细胞，扩增并重新筛选(图2c)。所有24个测试的克隆都对利用gp61-特异性杂交瘤的再刺激应答。来自这些克隆的MCR的肽部分的PCR扩增和测序揭示了两个新型模拟表位和原始的gp61肽(图2c)。gp61第9位的赖氨酸突变为丝氨酸(gp61S)或天冬酰胺(gp61N)，表明对于Smarta2 T细胞激活而言其不是绝对必需的。然而，NFAT激活的水平表明Smarta2 TCR以较低的亲和力结合新型模拟表位(特别是gp61S)(图2c中的直方图)。在T细胞与树突细胞的共培养物中，两个模拟表位都诱导了稳健的Smarta2T细胞应答。有趣的是，虽然与原始肽类似，gp61N诱导增殖和Th1样细胞因子的产生，但是次优的gp61S在驱动增殖方面的效率要低得多，但诱导强烈的Th2样细胞因子应答(图2d)。

最后，在源自感染后5天和8天的LCMV感染的动物的CD4⁺T细胞杂交瘤的帮助下进行新型LCMV表位的筛选(图3a和b)。杂交瘤携带NFAT-EGFP报告物，这允许验证其对LCMV的反应性，并挑选gp61非反应性杂交瘤进行进一步分析(图3b)。使用5种这样的杂交瘤(强烈应答的H30、H14、H2和每周应答的H4，H3)筛选用携带LCMV糖蛋白(GP)和核蛋白(NP)的所有可能的重叠肽的MCR2分子文库转导的16.2c11报告细胞。通过将编码GP和NP的cDNA随机片段克隆到MCR2载体(图3c)中产生此“真正的肽文库”(GPL)，并且与随机或组合性肽文库相比具有显著的优点，因为许多(1/6)回收的肽代表天然蛋白。实际上，对于5种杂交瘤中的4种，直接鉴定了LCMV-特异性靶肽。杂交瘤中的3种(H30、H14和H2)识别已知的主要LCMV表位NP311，并且H3与新型表位NP547反应(图3d)。即使在3轮迭代筛选后，第5种杂交瘤(H4)也没有产生反应性报告细胞的任何富集。在该杂交瘤上测试了TCR的表面表达，发现其为TCR-阴性。在最初的LCMV特异性筛选后，TCR可能在扩增过程中丢失。该结果进一步验证本公开方法的TCR-特异性。使用一个另外的杂交瘤(H9)筛选携带随机肽的MCR2文库，并发现几个强反应性表位，但它们不与任何LCMV肽类似。这进一步支持使用GPL而不是随机肽库进行T-细胞表位筛选的策略。

本文公开了一种新型分子感受器，其允许以高特异性、灵敏度和快速动力学感受在APC侧的肽-MHC-TCR相互作用。使用此报告基因，建立了一种用于无偏差、功能性筛选T细胞表位的新方法。它将表达克隆的多功能性与荧光激活细胞分选的灵敏度和高通量能力相结合，并且允许有效地迭代筛选在哺乳动物细胞中的肽文库。所有这些都提供了比本领域已知的方法显著的优点。首先，由于MCR和TCR之间的多种相互作用，高亲和力和低亲和力结合产生类似的NFAT报告信号(图1d)，因此低亲和力配体不太可能被遗漏。实际上，尽管已经广泛研究了LCMV表位，仍可以鉴定出新型表位-NP547。第二，因为在哺乳动物细胞表面表达的天然TCR和MHC分子的背景下筛选肽，不需要单个重组TCR的工程化或MHC的诱变。第三，如LCMV病毒肽筛选所示，MCR-技术有助于高效地筛选高度富集源自被感兴趣的T细胞靶向的病原体/细胞/组织的肽的文库。

基于MCR的方法提供了一种多功能、易于使用和强大的方式来鉴定T细胞的抗原特异性。因此，它可能会影响到几个领域的基础和临床研究。限定调节性和效应性肿瘤浸润性T细胞的特异性能够发现新型肿瘤抗原。限定自身反应性组织浸润性T细胞的特异性有助于开发自身免疫疾病的抗原特异性疗法。在这方面，MCR还可以允许将T细胞效应子功能有效地重定向到肽特异性T细胞，使得能够从不期望的特异性中清除所有组成成分(repertoire)。此外，模拟表位文库的筛选将导致发现高亲和力肽变体和开发基于患者血液中循环的T细胞的抗原反应性的灵敏流式细胞术测试。

材料和方法

小鼠

C57/Bl6，小鼠购自Charles River。Smarta2和OT-II小鼠在ETH小鼠设施中饲养。

细胞系

Beko是源自TCRβ缺陷型小鼠的自发性胸腺瘤细胞系。H18.3.13报告细胞系通过逆转录病毒转导NFAT-EGFP报告物(携带最小人类IL-2启动子的四个拷贝，各含3个NFAT结合位点ACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCC(SEQ ID NO 001)，EGFP编码序列的插入上游)到TCR^-B6T细胞杂交瘤中产生。16.2c11报告细胞系通过用NFAT-sFT报告物构建体和编码鼠类嗜亲性逆转录病毒受体Slc7a1的载体转染16.2T细胞杂交瘤产生。

杂交瘤产生

在小鼠IL-2存在下，用塑料结合的抗CD3ε和抗CD28抗体激活分选的T细胞或胸腺细胞2天～3天。使用PEG-1500融合相等数量的激活T细胞和TCRα^-β^-BW5147融合伴侣，并在100mM次黄嘌呤、400nM氨基喋呤和16mM胸苷(HAT)的存在下以极限稀释法铺板。

MCR2的克隆

MCR2 α和β链通过标准技术克隆，并且包含以下部分：

MCR2 α链：通过GGSGGSAQ(SEQ ID NO 002)接头序列连接到TCRα链恒定区残基87-137的MHC-II I-A^bα链残基1-208。

MCR2 β链：通过AQSGGSGGSAQ(SEQ ID NO 003)接头序列连接到TCRβ链恒定区(C1)残基123-173的MHC-II I-A^bβ链残基1-217。在MCR2(gp61)残基中，MHC-II部分第29和30位的DS被氨基酸序列SGLNGPDIYKGVYQFKSVGSGGSGGSGDS(SEQ ID NO 004；含有gp61肽)代替。在MCR2(OVA)中，相同的残基被氨基酸序列SISQAVHAAHAEINEAGRGSGGSGGSGDS(SEQ ID NO005；含OVA肽)代替。

报告细胞系和分选的胸腺细胞的逆转录病毒转导

将MCRα和MCRβ克隆到pMYiresGFP逆转录病毒载体中，使得MCRβ取代GFP。在整个研究中，我们使用该载体(pMY-MCRαiresMCRβ)来产生含有各种肽的MCR，并将其称为MCR(“肽”/“MHC单体型”)。在嗜亲性Phoenix包装细胞系中产生含有逆转录病毒的上清液，并将其用于感染报告细胞系和分选细胞。

RAG-介导的模拟表位文库的产生

为了产生gp61模拟表位文库，通过在MCR2(gp61)构建体中将含EGFP和RAG重组信号序列(RSS)的填充片段插入到gp61肽的中间，构建MCR2(gp61-RSS-EGFP-RSS/I-A^b)(图2a)。将该构建体转导到在Tst-4/DLL1³²上培养的分选的CD4^-CD8^-双阴性(DN)胸腺细胞中。培养一周后(在此期间，通过RAG介导的重排，DN细胞发育成CD4⁺CD8⁺双阳性(DP)细胞，并重组其TCR基因，及RSS-EGFP-RSS填充片段)，分选表达低水平EGFP的细胞并制备cDNA。从cDNA对重组MCR2(gp61-RSS-EGFP-RSS/I-A^b)构建体的肽-编码部分进行PCR扩增，并克隆到空的MCR2(I-A^b)载体中，产生MCR2(gp61-RSS/I-A^b)模拟表位文库。

真正和随机的肽文库的产生和筛选

为了产生MCR2-LCMV真正重叠的肽文库，将编码GP和NP蛋白质的DNA消化有限的时间(Takara DNA片段化试剂盒)。将片段用与侧接克隆位点的载体序列同源的接头序列连接，PCR扩增，通过Gibsson装配克隆到pMY-MCR2载体中，并转染到细菌中，产生超过2×10⁶个克隆的。用该文库转导16.2c11细胞，分选0.5×10⁶个MCR^低和2.2×10⁴个MCR^高细胞。

通过使用上述策略将寡核苷酸(GGTNNNNNNTWCNNNNNNBCCNNNSCCNNNNNNKCCNNNGGA)(SEQ ID NO 006)克隆到MCR2载体中来制备MCR2随机肽文库。该寡核苷酸在面向TCR的位置处编码随机氨基酸，而锚定残基被部分固定以确保良好的呈递。复杂度为5.5×10⁶个细菌克隆，转导后，分选11.5×10⁶个个体MCR2+细胞。

MCR下调检验

如果没有另外说明，MCR2⁺Beko细胞与来自指定供体小鼠的5倍过量的分选CD4⁺T细胞共培养。

刺激MCR⁺H18.3.13或16.2c11细胞

如果没有另外说明，将MCR2+细胞与来自指定供体小鼠的5倍过量的分选CD4⁺T细胞或CD4⁺T细胞杂交瘤共培养8小时～12小时。

实施例2：嵌合抗原-受体多肽异二聚体

第一多肽，α链(SEQ ID NO 007)：

MPRSRALILGVLALTTMLSLCGGEDDIEADHVGTYGISVYQSPGDIGQYTFEFDGDELFYVDLDKKETVWMLPEFGQLASFDPQGGLQNIAVVKHNLGVLTKRSNSTPATNEAPQATVFPKSPVLLGQPNTLICFVDNIFPPVINITWLRNSKSVADGVYETSFFVNRDYSFHKLSYLTFIPSDDDIYDCKVEHWGLEEPVLKHWEPEGGSGGSAQSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

氨基酸1-208源自MHC2α。氨基酸209-216是接头序列。氨基酸217-267源自TCRα。

第二多肽，β链(SEQ ID NO 008)：

MALQIPSLLLSAAVVVLMVLSSPRTEGGSGGSGGSGDSERHFVYQFMGECYFTNGTQRIRYVTRYIYNREEYVRYDSDVGEHRAVTELGRPDAEYWNSQPEILERTRAELDTVCRHNYEGPETHTSLRRLEQPNVVISLSRTEALNHHNTLVCSVTDFYPAKIKVRWFRNGQEETVGVSSTQLIRNGDWTFQVLVMLEMTPRRGEVYTCHVEHPSLKSPITVEWRAQSGGSGGSAQGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS

氨基酸1-26是前导肽。氨基酸27和28之间是待展示的寡肽的插入位点。氨基酸29-36是接头序列。氨基酸37-228源自MHC2β。氨基酸229-236是接头序列。氨基酸237-287来源于TCRβ。

肽插入到SEQ ID NO 008的氨基酸27和28(GG)之间：

Gp61(SEQ ID NO 009)：

LNGPDIYKGVYQFKSV

OVA(SEQ ID NO 010)：

ISQAVHAAHAEINEAGR

Claims (20)

1.一种用于鉴定TCR可识别肽序列的方法，其包括：

i.提供多个哺乳动物细胞，其中

-所述多个哺乳动物细胞中的每一个细胞，表达文库的成员；

-所述文库的各成员编码转基因抗原受体；

-所述转基因抗原受体包含：

·MHC1或MHC2的胞外结构域，

·包含在所述胞外结构域内的寡肽，其中，所述寡肽对于文库的各成员而言是不同的，并且其中，所述寡肽以适于被T细胞受体识别的方式呈递，

·TCR的跨膜结构域，及

·TCRα或TCRβ链的胞内结构域；

-所述转基因抗原受体与报告蛋白是功能上关联的，由此，同源T细胞受体与所述转基因抗原受体的结合导致所述报告基因的激活，

ii.使所述多个哺乳动物细胞与T淋巴细胞的制备物接触，

iii.根据可检测报告蛋白的水平，从所述多个哺乳动物细胞中分离显示可检测报告蛋白的细胞，产生激活细胞，

iv.从所述激活细胞中分离DNA，及

v.对编码包含在所述转基因抗原-受体中的所述寡肽序列的分离的DNA进行测序。

2.一种用于鉴定TCR可识别肽序列的方法，其包括：

i.提供哺乳动物细胞，其中

-所述哺乳动物细胞表达转基因抗原受体；

-所述转基因抗原受体分子包含

·包含以适合于被T细胞受体识别的方式呈递的寡肽的MHC1或MHC2的胞外结构域，

·TCR的跨膜结构域，及

·TCRα或TCRβ链的胞内结构域，

-所述转基因抗原受体与报告蛋白是功能上关联的，由此，同源T细胞受体与所述转基因抗原受体的结合导致所述报告基因的激活，

ii.使所述哺乳动物细胞与T-淋巴细胞的制备物接触，从而激活所述报告基因，产生激活的哺乳动物细胞，

iii.从所述激活的哺乳动物细胞中分离DNA，及

iv.对编码包含在所述转基因嵌合抗原-受体中的所述寡肽序列的分离的DNA进行测序。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述转基因抗原受体是包含第一多肽和第二多肽的嵌合抗原-受体多肽异二聚体，其中

a.所述第一多肽包含MHC I类α链的胞外部分，且所述第二多肽包含β2-微球蛋白结构域，或者

b.所述第一多肽包含MHC II类α链的胞外部分，且所述第二多肽包含MHC II类β链的胞外部分，

其中，所述第一多肽和所述第二多肽链中的至少一个另外包含与所述胞外MHC结构域共价连接的寡肽；

所述第一多肽和所述第二多肽中的一个进一步包含T细胞受体α链的铰链区、跨膜结构域和胞内结构域或胞内尾区，并且所述第一多肽和所述第二多肽中的另一个包含T细胞受体β链的铰链区、跨膜结构域和胞内结构域。

4.一种包含第一多肽和第二多肽的嵌合抗原-受体多肽异二聚体，其中

a.所述第一多肽包含MHC I类α链的胞外部分，且所述第二多肽包含β2-微球蛋白结构域，或者

b.所述第一多肽包含MHC II类α链的胞外部分，且所述第二多肽包含MHC II类β链的胞外部分，

所述第一多肽和所述第二多肽中的一个进一步包含T细胞受体α链的铰链区、跨膜结构域和胞内结构域或胞内尾区，并且所述第一多肽和所述第二多肽中的另一个包含T细胞受体β链的铰链区、跨膜结构域和胞内结构域。

5.如权利要求4所述的嵌合抗原-受体多肽异二聚体，其中，所述第一多肽和所述第二多肽链中的至少一个另外包含能够被T细胞受体识别的寡肽，所述寡肽与所述胞外MHC结构域共价连接。

6.如权利要求4或5所述的嵌合抗原-受体多肽异二聚体，其中，MHC分子的胞外部分包含

i.所述第一多肽的MHC I类α1和α2和α3结构域形成部分中的每一个，或

ii.所述第一多肽的MHC II类α1和MHC II类α2结构域形成部分，及所述第二多肽的MHCII类β1和MHC II类β2结构域形成部分，

和/或

iii.其中，所述MHC分子的胞外部分选自在IMGT HLA数据库中阐明的人类主要组织相容性复合体基因家族HLA的成员。

7.如权利要求5所述的嵌合抗原-受体多肽异二聚体，其中，所述寡肽序列

a.插入到MHCα1结构域序列的第1、2、3、4或5个氨基酸后

和/或

b.所述寡肽的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或40个氨基酸。

8.如权利要求4所述的嵌合抗原-受体多肽异二聚体，其包含氨基酸序列为SEQ ID NO007的第一多肽和氨基酸序列为SEQ ID NO 008的第二多肽。

9.一种核酸分子，其编码如权利要求4～8中任一项所述的嵌合抗原-受体多肽异二聚体。

10.一种细胞，其包含

i.如权利要求4～8中任一项所述的嵌合抗原-受体多肽异二聚体，及

ii.与所述嵌合抗原-受体多肽异二聚体功能上关联的效应子功能。

11.如权利要求10所述的细胞，其中，所述效应子功能是：

i.报告蛋白，和/或

ii.在结合至嵌合抗原-受体多肽的细胞中能够诱导细胞死亡的一种蛋白或多种蛋白。

12.如权利要求11所述的细胞，其中，所述报告蛋白选自：

iii.荧光蛋白，或

iv.荧光素酶蛋白，或

v.由抗生素抗性基因编码的蛋白，或

vi.Cre重组酶，或

vii.CAS-9核酸酶，或

viii.CAS-9嵌合转录抑制蛋白或激活蛋白。

13.如权利要求10所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

14.如权利要求13所述的细胞，其中所述哺乳动物细胞是哺乳动物T淋巴细胞。

15.一种用于获得对抗原反应性降低的T淋巴细胞的制备物的方法，所述方法包括以下步骤：

i.提供获自患者的T淋巴细胞的制备物，

ii.使所述T淋巴细胞的制备物与权利要求10～14中任一项所述的细胞的制备物接触，所述细胞是哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包含嵌合抗原-受体多肽异二聚体，

其中，所述哺乳动物细胞的特征在于，所述效应子功能能够在结合至嵌合抗原-受体多肽异二聚体的细胞中诱导细胞死亡。

16.如权利要求10～14中任一项所述的细胞，所述细胞是哺乳动物细胞，其应用于治疗或预防自身免疫疾病或免疫功能障碍。

17.如权利要求16所述应用的细胞，其中所述自身免疫疾病T细胞介导的自身免疫疾病。

18.如权利要求17所述应用的细胞，其中，所述T细胞介导的自身免疫疾病是移植排斥、1型糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、克罗恩氏病和炎性肠综合征。

19.一种用于检测患者对抗原肽的免疫应答的方法，所述方法包括以下步骤：

i.提供权利要求10～14中任一项所述的细胞，所述细胞是哺乳动物细胞，其中，所述细胞包含与所述嵌合抗原-受体多肽异二聚体功能上关联的报告蛋白，

ii.提供所述患者的离体血液样品，

iii.使所述哺乳动物细胞与所述血液样品接触，及

iv.检测在所述哺乳动物细胞中的所述报告蛋白。

20.如权利要求19所述的方法，其进一步包括以下步骤：

i.根据所述报告蛋白的表达，分离所述哺乳动物细胞，

ii.从经分离的哺乳动物细胞中分离DNA，及

iii.对在权利要求4～8中任一项所述的嵌合抗原-受体多肽异二聚体中编码的抗原-肽进行测序。

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